Preparazione Dei
Campioni
per l'Analisi Istologica
Come si preparano le sezioni
istologiche per la microscopia
ottica.
Preparazione di un Campione
Biologico per la Microscopia
Ottica
•
Acquisizione del
campione e taglio in pezzi
(1cm3)
– Biopsia, intervento chirurgico,
autospia postmortem.
– Prelevato rapidamente
utilizzando strumenti adatti
(bisturi).
• Fissaggio del campione
(immobilizzare,
"uccidere" e preservare)
– generalmente per mezzo di aldeidi reattive
(formaldeide);
– cross-link delle macromolecole, in
particolare le proteine;
– si ottiene un effetto indurente sui tessuti
"molli";
– deve essere fatto rapidamente per evitare
che gli enzimi persenti degradino il tessuto.
• Disidratazione del campione
attraverso passaggi in soluzioni a
concentrazione crescente di etanolo
– Paraffina (materiale usato per l'inclusione)
non è solubile in H2O.
• Eliminazione dell'etanolo e
passaggi in xilene
– Paraffina non è solubile nemmeno
nell'etanolo
• Inclusione del campione in in
mezzo appropriato paraffina o
resina
– Tessuti sono "molli" e fragili
– Diversi passaggi in paraffina calda
– La paraffina occupa lo spazio
precedentemente occupato dall'H2O
– La paraffina fredda si indurisce e permette
di sezionare il campione
• Taglio per mezzo
di un microtomo, che
produce sezioni dello
spessore di 1-10 µm
• Montaggio delle
sezioni su vetrini per
microscopia.
Sezione non colorata
• Colorazione delle sezioni con il
metodo più appropriato.
– I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina
lo xilene attraverso passaggi in etanolo.
Colorazione automatizzata
Colorazioni
• Colorazione
– Un colore brillante di certe
componenti del tessuto.
• Contro colorazione
– Resto del tessuto con un colore
contrastante.
Ematossilina/Eosina
Ematossilina ha affinità per le molecole
cariche negativamente (DNA, RNA ed
alcune proteine).
Eosina ha affinità per le molecole cariche
positivamente (proteine del citosol).
Perchè questa "slide" è blu …
• Se una porzione di
tessuto o di una cellula
si colora di blu/porpora,
viene detta Basofila
• È colorata
dall'ematossilina
• Nuclei e ribosomi
generalmente sono
basofili
… e questa rossa ?
• Se una porzione si
colora in rosso
/arancio /rosa, viene
detta Acidofila o
eosinofila
• È colorata dall'eosina
• Sono proteine del
citosol
• PAS
Altre colorazioni
– Per sostanze ricche in
zuccheri (muco)
• Tricromica
– Per i tessuti connettivi
– Le fibre si colorano in
blu
• Con E&E sono rosa.
• Osmio o Sudan black
– Per grasso/lipidi/mielina
– I lipidi non incorporano
coloranti acquosi
Mielina
• Argento ed oro
– Per fibre delicate e
processi cellulari
• Giemsa
Cellule nervose
– Per le cellule del sangue
– Simile ad E&E
Cellule del sangue
E le aree "bianche"?
• I fluidi presenti nei
tessuti o negli spazi
interstiziali non si
colorano con E&E
– Sangue, linfa etc.
• Si riconoscono come ampi
spazi bianchi
• Anche i lipidi ed il grasso
non si colorano.
Mesenchima
Come si osserva il campione?
• Attraverso un buon
microscopio ottico
• Fotografandolo
• Misurandolo
Per avere un'idea delle
dimensioni delle
strutture osservate si
può usare come
riferimento un eritrocita
(˜ 8 micron)
Interpretate il campione !!!
Artefatti
• Shrinkage
• Lascia dello spazio
aggiuntivo
• Disidratazione e
fissaggio
• Fratture al piano di
taglio
• Tagli netti e ben visibili
• Lama deteriorata
• Colorante precipitato
• Macchie di colore a
"grano di pepe"
• Tessuto "pinzato"
• Strumento per l'excisione
deteriorato
• Durante o dopo il
sezionamento
• Pieghe
• Durante il montaggio