UNIVERSITÀ POLITECNICA DELLE MARCHE
DOTTORATO DI RICERCA IN “ALIMENTAZIONE E
SALUTE”
Coordinatore: Chiar.mo Prof. Antonio Benedetti
IX ciclo nuova serie
Triennio Accademico 2007-2010
Studio della composizione polifenolica, della
capacità antiossidante e dell’ effetto protettivo
contro lo stress ossidativo di mieli monofloreali
di Cuba.
Dottorando:
Tutor:
Dott. JOSÉ MIGUEL ALVAREZ SUÁREZ
Prof. MAURIZIO A. BATTINO
Ochún egúa Iyá mío, Iguá Iyá mío
Ico bo si Iyá mi guasi Iyá mi mó
Yalode aguidó abalá abé de bu
omí male adó Elegüeni kikiríso kede
Miel para Oshún
________________________________________________________________________ABSTRACT
Several monofloral Cuban honeys were analyzed to determine their total phenolic, flavonoid,
ascorbic acid, amino acid, protein and carotenoid contents as well as their radical-scavenging
activity and their free radical formation capacity. The total phenolic, flavonoid and carotenoid
contents varied considerably, and the highest values were obtained for Linen vine (Govania
polygama (Jack) Urb) honey. The highest amino acid content was found in Morning glory
(Ipomoea triloba L.) while Liven vine had the highest protein content. Similarly Linen vine honey
had the highest antioxidant activity while the lowest was found in Christmas vine (Turbina
corymbosa (L.) Raf). Ascorbic acid was absent. A significant (positive) correlation was found
between the results of TAC obtained by parallel FIA-ABTS system and ORAC assay (r =
0.9565, p < 0.001). Similar correlations were also established between total phenolics and TAC,
determined by either the ORAC (r = 0.9633; p < 0.001) or the TEAC assay (r = 0.9582; p <
0.001). A correlation between radical-scavenging activity and total phenolic content was found.
Correlation existed also between color vs phenolics content, vs flavonoid content or between
phenolic vs flavonoid. The scavenging and formation capacities of hydroxyl radical were
determined using electron paramagnetic resonance (spin trapping), while superoxide radical
scavenging were determined by the hypoxanthine/xanthine oxidase assay. Liven vine and Singing
bean presented the highest scavenging capacity towards the hydroxyl radical. Liven vine and
Morning glory also presented the highest values of superoxide radical scavenging activity, while
the lowest values were found in Christmas vine honey. Hydroxyl radical formation was found in
all honeys tested, Christmas vine honey showing the highest values. Identification and
quantification of phenolics were carried out by HPLC-DAD-ESI/MS. Fourteen phenolic
compounds could be identified (eight phenolic acids and six flavonoids), including three
glycosylated derivatives. Similar contents of total phenolics were found in the different honeys,
although they differed in their qualitative profiles. Honeys were fractionated by solid-phase
extraction into four fractions, and the relative contribution of each fraction to TAC was
calculated. Phenolic compounds were significant contributors to the antioxidant capacity of the
honeys, but they were not uniquely responsible for it. The antioxidant activity appeared to be a
result of the combined activity of a range of compounds including phenolics and other minor
components. Honeys and their phenol extracts separated on the base of their hydrophobicity
were evaluated for the ability to inhibit oxidative damage induced by radical species generated in
the membrane of human erythrocytes and in the Wistar rat liver homogenates. In this study it
was determined that honey and their phenolic fractions protect erythrocytes against 2,2’azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride-induced lysis. In this study we also found that Liven
vine and Christmas vine honey has the capacity to decrease significantly the concentration of
lipid hydroperoxides and malondialdehyde, produced during the lipid peroxidation process in rat
liver homogenates and in membrane of human erythrocytes, showing that the ability to modulate
production and scavenging of free radicals may contribute to the ability of some Cuban honeys
to help in resolving some inflammatory diseases in which oxidative stress is involved.
_______________________________________________________________________ RIASSUNTO
Diversi mieli uniflorali cubani sono stati analizzati per determinare il loro contenuto totale di
fenoli, flavonoidi, acido ascorbico, aminoacidi, proteine e carotenoidi, così come la loro attività
radical- scavenging e la loro capacità di formare radicali liberi. Il contenuto totale di fenoli,
flavonoidi e carotenoidi varia considerevolmente: i valori più alti sono stati ottenuti nel miele
Linen vine (Govania polygama (Jack) Urb). Il più alto contenuto di aminoacidi è stato trovato
invece nel miele Morning glory (Ipomoea triloba L.), mentre nel miele Liven vine è stato
riscontrato il più alto contenuto proteico. Allo stesso modo il miele di Linen vine ha mostrato la
maggiore attività antiossidante (TAC), mentre la più bassa è stata trovata in Christmas vine
(Turbina corymbosa (L.) Raf). L'acido ascorbico non è stato trovato in nessun campione
analizzato.
Una correlazione significativa (positiva) è stata rilevata tra i risultati della TAC ottenuti in
paralello con i saggi FIA-ABTS e ORAC (r = 0.9565, p < 0.001). Una correlazione simile è stata
anche stabilita tra i fenoli totali e la TAC,determinata sia dall’ ORAC (r = 0.9633; p < 0.001) che
dal saggio TEAC (r = 0.9582; p < 0.001). E’ stata inoltre trovata una correlazione significativa
tra l'attività radical-scavenging e il contenuto fenolico totale e tra il colore vs i fenoli totali, vs il
contenuto di flavonoidi e tra i fenoli vs i flavonoidi. Le capacità di radical- scavenging e la
formazione di radicali ossidrili sono state determinate mediante risonanza paramagnetica
elettronica (spin trapping), mentre la capacità di scavenging del radicale superossido è stata
determinata mediante il saggio della ipoxantina / xantina ossidasi. Il miele Liven vite e Singing
bean hanno presentato la più alta capacità antiossidante nei confronti del radicale ossidrile. Liven
vite e Morning Glory hanno anche presentato i valori più elevati di attività scavenging del
radicale superossido, mentre i valori più bassi sono stati trovati nel miele Christmas vine. La
formazione dei radicali ossidrili è stata trovata in tutti i mieli esaminati, con il miele Christmas
vine che mostra i valori più alti. L’ identificazione e la quantificazione dei composti fenolici
sono state eseguite mediante HPLC-DAD-ESI/MS: quattordici composti fenolici sono stati
identificati (otto acidi fenolici e sei flavonoidi), di cui tre sono derivati glicosilati. Contenuti
simili di polifenoli totali sono stati riscontrati in tutti i tipi di miele, ma la differenza più
importante è stata dal punto di vista del profilo qualitativo. Ogni campione è stato suddiviso
mediante estrazione in fase solida in quattro frazioni ed è stato calcolato il contributo relativo di
ciascuna frazione alla TAC. I composti fenolici sono stati trovati come importanti contributori
alla capacità antiossidante del miele, ma non sono gli unici responsabili. La capacità
antiossidante sembra essere infatti il risultato dell'attività combinata di una gamma di composti
fenolici e di altre componenti minori.
Inoltre, il miele e i suoi estratti fenolici, separati in base alla idrofobicità, sono stati valutati per la
capacità di inibire il danno ossidativo indotto da radicali e generato sia nella membrana degli
eritrociti umani che nell’ omogenato di fegato di ratto Wistar. In questo studio si è stabilito che il
miele e le sue frazioni fenoliche sono in grado di proteggere gli eritrociti contro il danno
ossidativo indotto dall’ AAPH (2,2 '-azobis (2-amidinopropane) dicloridrato). In questo studio
abbiamo anche scoperto che i mieli Liven vine e Christmas vine hanno la capacità di diminuire
significativamente la concentrazione di idroperossidi lipidici e di malondialdeide, prodotti
durante il processo di perossidazione lipidica in omogenati di fegato di ratto e nella membrana
degli eritrociti umani, mostrando che la capacità di modulare la produzione e lo scavenging dei i
radicali liberi possono contribuire alla capacità di alcuni mieli cubani di aiutare a risolvere
alcune malattie infiammatorie in cui è coinvolto lo stress ossidativo.
Premessa ..........................................................................................................................................
Capitolo I: Introduzione
I.1. La vità e il “Paradosso dell`Ossigeno” .......................................................................
I.2. Radicali liberi e antiossidanti ....................................................................................
I.2.1. Radicali liberi generati nei sistemi biologici. Fonti, meccanismo generatore
e effetti....................................................................................................................
I.2.2. Antiossidanti: Equilibrio tra le specie reattive e meccanismi antiossidanti..........
I.3. Stress ossidativo .............................................................................................................
I.3.1. Stress ossidativo: definizione e strategie per la sua determinazione .....................
I.4. Contributo del miele alla nutrizione e alla salute umana. Il miele di api come fonte
naturale di composti biologicamente attivi..................................................................
I.4.1. Composizione biochimica del miele di api...........................................................
I.4.2. Metaboliti responsabili dell’ attività antiossidante nel miele d'api........................
I.4.3. Effetti fisiologici del miele ed sulla salute umana..................................................
I.4.3.1. Attività antibatterica....................................................................................
I.4.3.2. Attività antiossidante...................................................................................
I.4.3.3. Attività antimutagenica, antitumorali e anti-infiammatori..........................
I.5- Scopo dello studio..........................................................................................................
Capitolo II: Materiali e Metodi
II.1. Animali da laboratorio, reagenti e campioni di miele ..................................................
II.1.1. Animali da laboratorio ..........................................................................................
II.1.2. Reagenti ...............................................................................................................
II.1.3. Campioni di miele ...............................................................................................
II.2. Preparazione della soluzione di miele artificiale .........................................................
II.3. Studio dei composti antiossidanti nel miele ................................................................
II.3.1. Determinazione del contenuto totale di polifenoli ..............................................
II.3.2. Determinazione del contenuto totale di flavonoidi .............................................
II.3.3- Determinazione del contenuto totale di aminoacidi liberi ..................................
II.3.4- Determinazione delle proteine totali ...................................................................
II.3.5- Determinazione del contenuto di caroteni totali..................................................
II.3.6- Analisi del contenuto totale di Acido Ascorbico ................................................
II.3.7- Determinazione di metalli pesanti .......................................................................
II.3.8- Separazione, identificazione e quantificazione degli acidi fenolici e dei
flavonoidi .............................................................................................................
II.3.8.1- Panoramica del frazionamento del miele in Colonna Cromatrografica
di Amberlite XAD-2 ....................................................................................
II.3.8.2- Identificazione e quantificazione degli acidi fenolici e flavonoidi
tramite il sistema HPLC-DAD-ESI-MS-Mn ...................................................
II.3.8.3- Quantificazione degli acidi fenolici e dei flavonoidi mediante HPLCDAD ....................................................................................................................
II.3.8.4- Calibrazione, limite di rilevamento e recupero degli standard utilizzati
con il metodo di frazionamento per colonna cromatografica di Amberlite........
II.3.8.5- Recupero del Metodo .............................................................................
II.4- Caratterizzazione in vitro della attività antiossidante totale del miele: studio della
capacità di scavenger dei radicali liberi
II.4.1- Determinazione della capacità di assorbimento dei radicali liberi dell'ossigeno
(ORAC) ................................................................................................................
II.4.2- Test di attività antiossidante totale utilizzando la capacità di ferro riduzione
del composto 2,4,6-tripyridyl-s-triazina (Fe3+- TPTZ)(FRAP) ..................................
II.4.3- Determinazione della TAC secondo metodo FIA – ABTS..................................
II.4.3.1- Principi del metodo TEAC (Trolox Equivale Antioxidant capacity).....
II.4.4- Determinazione della capacità di scavenger dei radicali OH• .............................
II.4.5- Determinazione della capacità di scavenger dei radicali O2•...............................
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II.5- Caratterizzazione in vitro dell’ attività antiossidante totale del miele e delle sue
frazioni fenoliche: valutazione dell'attività inibitoria della perossidazione lipidica in
omogenati di fegato di ratto ........................................................................................
II.5.1. Preparazione di omogenati di fegato di ratto ..............................................
II.5.2. Determinazione dell’ inibizione della formazione di sostanze reattive dell’
acido tiobarbiturico (TBARS) nel modello della perossidazione lipidica spontanea.....
II.5.3. Determinazione dell’ inibizione della formazione di TBARS nel modello della
perossidazione lipidica indotta dal sistema FeSO4 e acido ascorbico........................
II.5.4. Studio della formazione d`idroperossidi lipidici..........................................
II.6- Studio del miele e dei suoi flavonoidi come agenti di protezione contro il danno
ossidativo nei confronti dei globuli rossi umani..................................................................
II.6.1- Globuli rossi Collection.......................................................................................
II.6.2- Studio dell effetto protettivo contro l`emolisi......................................................
II.6.3- Preparazione del Ghost di membrana da Globuli rossi........................................
II.6.4- Studio della suscettibilità dei lipidi di membrana eritocitaria alla
perossidazione ......................................................................................................
II.7- Analisi statistica ..........................................................................................................
Capitolo III: Risultati e Discussione
III.1- Studio degli antiossidanti nel miele, altri composti bioattivi e il contenuto di
minerali........................................................................................................................
III.1.1- Identificazione e quantificazione degli acidi fenolici e dei flavonoidi
mediante il sistema HPLC-DAD-ESI-MS-Mn .........................................................
III.1.2. Studio dei minerali nel miele .............................................................................
III.2. Caratterizzazione in vitro dell’ attività antiossidante totale del miele: capacità di
scavengin dei radicali liberi e inibizione della perossidazione lipidica
III.2.1. Determinazione della capacità antiossidante totale tramite il test della capacità
di assorbimento dei radicali liberi dell'ossigeno (ORAC), scavenger dei radicali
ABTS.+ e attività antiossidante totale utilizzando la capacità di riduzione del ferro
del composto 2,4,6-tripyridyl-s-triazina (Fe3+- TPTZ) (FRAP) ..................................
III.2.2. Studio della capacità di scavenger dei radicali O2• e OH• .................................
III.2.3. Valutazione dell'attività inibitoria della perossidazione lipidica in omogenati
di tessuto epatico di ratto .......................................................................................
III.4- Studio del miele e dei suoi flavonoidi come agenti di protezione contro il danno
ossidativo nei globuli rossi umani ..............................................................................
III.5. Suscettibilità alla perossidazione dei Ghost degli eritrociti..................................
Capitolo IV: Conclusioni ...............................................................................................................
Bibliografia .....................................................................................................................................
Ringraziamenti ...............................................................................................................................
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_________________________________________________________________PREMESSA
Oggigiorno è impressionante il numero di studi che sostengono un coinvolgimento dello
stress ossidativo in varie malattie ad elevata incidenza nella popolazione mondiale, come il
cancro,
le
malattie
cardiovascolari,
quelle
neurodegenerative,
il
diabete,
l’ischemia/riperfusione e vari processi infiammatori (Simonian & Coyle, 1996; Gilgun-Sherki et
al., 2002). In particolare, è stata proposta una serie di teorie che spiegano gli eventi biochimici
coinvolti nel danno cellulare nel caso delle malattie infiammatorie e degenerative, nelle quali i
radicali liberi contribuiscono in modo decisivo al loro sviluppo (Wang et al., 1996; Bravo, 1998;
Vieira et al., 1998; Yan et al., 1998; Tapiero et al., 2002; Havsteen, 2002; Valko et al., 2007).
Tali scoperte hanno fornito nuove possibilità terapeutiche contro queste patologie, per mezzo di
composti che aiutano a prevenire o a ridurre il danno ossidativo.
Negli ultimi anni, l'uso di antiossidanti di origine sintetica per scopi terapeutici è stato messo
in discussione a causa della loro possibile genotossicità (Rauha, 2001). Per questo motivo, la
ricerca si è interessata soprattutto ai composti antiossidanti naturali, tanto che attualmente a
livello mondiale si tende ad incrementare lo studio e l' utilizzo di fonti naturali, al fine di ottenere
farmaci efficaci contro le varie patologie (Raskin et al., 2002).
Tra i vantaggi degli antiossidanti naturali possiamo indicare un’elevata diversità molecolare e
un’alta funzionalità biologica, che si esplicano mediante varie azioni di modulazione nella
cellule che portano ad interagire con una vasta gamma di molecole (Aruoma, 1998; Bastianetto
& Quirion, 2002; Aruoma et al., 2003). A questo si aggiunge che molti di questi composti non
presentano tossicità e quindi il loro uso è sicuro; ciò purtroppo non è vero per tutti poiché alcuni
antiossidanti naturali possono essere tossici (Kagan et al., 2002). È per questo che oggi queste
sostanze, fitochimiche o chemioprotettori, sono sotto i riflettori dei laboratori di ricerca delle
industrie farmaceutiche e alimentari in tutto il mondo.
Basandosi su questi precedenti, oggi è stato proposto l´uso di estratti di piante e di altre fonti
naturali come agenti di protezione contro il danno cellulare e a biomolecole; tali estratti
contengono, infatti, una miscela di composti antiossidanti, con diverse modalità di azione e di
effetto protettivo contro il danno mediato da radicali liberi (Kagan et al., 2002). Tra tutte le fonti
naturali possibili, il miele delle api, in particolare il tipo uniflorale, offre valide opzioni per la
ricerca di nuovi composti bioattivi, in particolare di antiossidanti, a scopi alimentari e
farmaceutici.
Il miele è il principale composto naturale prodotto dalle api della specie Apis mellifera; ha
proprietà stimolanti, nutrienti e terapeutiche che lo rendono un prodotto ad alta domanda nel
1
_________________________________________________________________PREMESSA
mercato internazionale. Il suo utilizzo come fonte naturale di composti bioattivi è garantito per
diverse ragioni: da un punto di vista generale possiamo dire che il miele è una fonte di composti
bioattivi che hanno una base rinnovabile ed è facilmente ottenibile.
Inoltre Cuba è in grado di produrre diversi tipi di miele uniflorale, grazie alla varietà e alla
ricchezza della sua flora silvestre, che mette a disposizione una grande diversità e una grande
quantità di diverse specie floreali. Le piante da cui si ottiene il miele cubano sono soprattutto
piante selvatiche; ciò è dovuto alle condizioni climatiche favorevoli, che fanno si che quasi tutto
l'anno esista una graduale e continua fioritura, con ampie aree caratterizzate da un determinato
tipo di fioritura (Pérez, 2000).
La ricerca di composti antiossidanti nel miele di api si basa sul fatto che numerosi studi
epidemiologici suggeriscono che i composti fitochimici presenti in frutta e verdura hanno un
effetto protettivo contro le malattie croniche e degenerative (Heinonen et al., 1998; De Ruvo et
al., 2000; Yi-Fang et al., 2002; Johnsen et al., 2003; Smith-Warner et al., 2003; Smith-Warner et
al., 2003) e che studi paralleli hanno dimostrato che il miele di api possiede la stessa capacità
antiossidante di molta frutta e verdura fresca; inoltre è documentata, in questo composto
naturale, una forte correlazione tra la capacità antiossidante totale e i contenuti totali di polifenoli
(Greldof et al., 2002; Meda et al., 2005; Vela et al., 2007). Infine, il suo uso come parte
integrante della dieta di alcune popolazioni umane è stato associato ad una varietà di effetti
benefici sulla salute umana (Bogdanov et al., 2008). Tutto questo suggerisce quindi che, in
generale, il miele contenga composti biologicamente attivi, in grado di modulare diverse
funzioni fisiologiche.
Per quanto esposto sopra, negli ultimi anni numerose pubblicazioni hanno stimolato l'interesse
della comunità scientifica internazionale per ciò che riguarda la caratterizzazione e la
differenziazione dei mieli uniflorali, specifici di ogni Regione e di ogni Paese. Sono stati
identificati diversi composti con un’ importante attività antiossidante in differenti tipi di miele
uniflorali. Questi studi hanno identificato composti fenolici, amminoacidi e alcuni enzimi
responsabili dell'attività antiossidante presente nel miele di api (Martos et al., 2000; Gheldof et
al., 2003; Bogdanov et al., 2004; Huidobro et al., 2005; Henriques et al., 2006; Fiorani et al.,
2006; Gómez et al., 2006; Pérez et al., 2007; Michalkiewicz et al., 2008). Tuttavia, a prescindere
dal progresso che esiste su questo tema a livello mondiale, i risultati ottenuti in una determinata
Regione non possono essere in alcun modo estrapolati e adeguati alle condizioni presenti in altri
Paesi, come nel caso di Cuba. Sono pertanto necessari ulteriori studi per caratterizzare la
composizione chimica e l'attività biologica del miele delle api di Cuba.
2
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
I. Introduzione
I.1. La vità e il “Paradosso dell`Ossigeno”
Il paradosso della vita aerobica, o “Paradosso dell’Ossigeno”, si basa sul concetto che gli
organismi eucarioti aerobi non possono sopravvivere in assenza di ossigeno, nonostante questo
elemento sia pericoloso per la loro stessa esistenza (Davies, 1995; Davies & Ursini, 1995).
Questa dicotomia trova spiegazione nella chimica dell’ossigeno: ogni atomo ha un elettrone non
appaiato ed è quindi un radicale libero, così come l’ossigeno molecolare presenta due elettroni
non appaiati ed è da considerare quindi un diradicale. Nella catena di trasporto elettronico
mitocondriale, la riduzione dell’ossigeno molecolare in acqua dovrebbe essere un processo
relativamente sicuro, ma l’ambiente cellulare riducente provoca la formazione di intermedi
reattivi, comuni prodotti della vita aerobica, che sono però responsabili della tossicità
dell’ossigeno.
Per sopravvivere in un ambiente ricco di ossigeno, gli organismi sono in grado di produrre o
di assorbire una varietà di composti antiossidanti solubili in acqua o nei lipidi; inoltre
sintetizzano una serie di enzimi capaci di intercettare ed inattivare gli intermedi reattivi
dell’ossigeno. Nonostante siano fondamentali, i composti e gli enzimi antiossidanti non sono
completamente efficienti nel prevenire il danno ossidativo: a questo scopo vengono sintetizzati
degli enzimi di riparo o di rimozione del danno che operano a livello delle proteine, dei lipidi e
del DNA che risultano danneggiati. Essendo questo insulto ossidativo variabile nel tempo, gli
organismi possono adattarsi a queste fluttuazioni di stress inducendo la sintesi sia degli enzimi
antiossidanti, sia di quelli preposti al riparo del danno.
Tra le risposte cellulari, uno dei processi più comuni è quello di indurre la morte cellulare
programmata o apoptosi che elimina le cellule danneggiate e permette al tessuto di rigenerarsi
con una nuova popolazione sana. Oppure la cellula può entrare in uno stato di arresto della
crescita, alterando le proprie funzioni (Krtolica et al., 2001; Ben-Porath & Weinberg, 2005).
La senescenza cellulare sembra sia proprio un meccanismo di soppressione della
carcinogenesi e una delle cause dell’invecchiamento: le cellule senescenti rispondono agli
stimoli ambientali e sono metabolicamente attive per lunghi periodi, ma sono incapaci di
replicarsi in quanto sono irreversibilmente bloccate nella fase G1 e, allo stesso tempo, diventano
resistenti all’apoptosi (Campisi, 2005).
Nonostante tutte queste strategie protettive, i componenti vitali delle cellule subiscono
comunque
danni
ossidativi.
Secondo
Sies
“uno
sbilanciamento
nel
sistema
pro3
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
ossidante/antiossidante a favore delle specie ossidanti potrebbe causare uno stress ossidativo”
(Sies, 1985). Quindi una situazione di stress ossidativo può risultare dall’aumentata esposizione
di ossidanti o da una diminuita protezione contro gli stessi ossidanti, o da entrambe le possibilità.
Nel lungo periodo questa situazione di stress può intaccare profondamente la funzionalità e la
sopravvivenza dell’organismo stesso.
Un aiuto sostanziale potrebbe arrivare dal condurre una vita sana e regolare: una dieta
contenente sufficienti livelli di vitamine, minerali, cofattori e un moderato esercizio fisico
possono minimizzare il danno ossidativo che le difese antiossidanti endogene devono sostenere.
Negli ultimi anni l’attenzione si è sempre più rivolta verso aspetti salutari e nutrizionali: una
dieta ricca in frutta e verdura può offrire protezione contro diverse patologie, come malattie
cardiovascolari, cancro e altre degenerazioni legate all’invecchiamento. La frutta e la verdura in
particolare sono considerate ricche di effetti benefici per la salute grazie al loro alto contenuto di
antiossidanti che possono proteggere l’organismo dalle reazioni di ossidazione a livello cellulare
(Wang et al., 1996).
I.2. Radicali liberi e antiossidanti
I.2.1. Radicali liberi generati nei sistemi biologici. Fonti, meccanismo generatore e
effetti.
I radicali liberi (RL) sono definiti come quelle molecole o frammenti di queste che
contengono uno o più elettroni spaiati nei loro orbitali atomici e molecolari, il che li rende
composti estremamente instabili e fugaci, con grande capacità di formare altri radicali liberi
prodotti dalle reazioni chimica a catena. Tra questi, i radicali derivati dell’ ossigeno
rappresentano la classe più importante di specie radicaliche generate nei sistemi viventi
(Halliwell, 1999; Dröge, 2002).
La vita aerobica richiede ossigeno per ossidare le sostanze nutrienti della dieta e quindi per
ottenere energia. "Specie reattive dell'ossigeno" e "specie reattive dell’ azoto " (le loro sigle in
inglese: ROS e RNS, rispettivamente) sono i termini con cui sono stati chiamati i radicali liberi
derivati dal`ossigeno e azoto, rispettivamente.
Per Specie Reattive dell’Ossigeno si intendono tutte le specie radicaliche e non, derivanti da
reazioni di ossido-riduzioni dell’ossigeno. I principali rappresentanti sono l’anione superossido
(O2), il perossido di idrogeno (H2O2) e il radicale idrossile (OH), capaci di interagire a vari
livelli e con diversa efficacia all’interno dei sistemi biologici (Dröge, 2002).
4
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
L’anione superossido è considerato il precursore di tutte le specie radicaliche perché, nella
maggior parte dei casi, è il primo radicale che viene prodotto dalle ossidasi (Ardanaz & Pagano,
2006). Si forma dalla riduzione dell’ossigeno per trasferimento di un singolo elettrone e può
comportarsi sia da agente riducente, cedendo a sua volta un elettrone ad una molecola di
ossigeno, sia da agente ossidante, con la formazione di perossido di idrogeno.
Questa reazione è nota come reazione di dismutazione, che può avvenire in modo spontaneo
ma estremamente lento (2×105 m/sec) oppure può essere catalizzata dal sistema enzimatico della
superossido dismutasi, capace di velocizzare il processo di 104 volte. L’anione superossido è in
grado di ossidare molti composti biologicamente importanti, come catecolamine, polifenoli,
leucoflavine, mentre riduce il citocromo c, il tetranitrometano ed il nitroblu di tetrazolio
(Fridovich, 1986).
Il perossido di idrogeno, grazie alle piccole dimensioni e alla mancanza di carica, è molto più
stabile ed ha un maggior raggio di diffusione rispetto all’anione superossido. Viene considerato
tossico all’interno di un sistema biologico per la sua capacità di convertirsi in radicale idrossile,
reputato il più reattivo e dannoso tra i radicali dell’ossigeno, attraverso l’esposizione alla luce
ultravioletta o attraverso l’interazione con ioni metallici (reazione di Fenton) (Ardanaz &
Pagano, 2006).
L’anione superossido può collaborare con il perossido di idrogeno nella formazione del
radicale idrossile. Questa reazione, conosciuta con il nome di Haber-Weiss, avviene sia in vitro
che in vivo (Liochev & Fridovich, 1994).
Il radicale idrossile può essere prodotto, oltre che attraverso le due reazioni appena citate,
anche dalla reazione fotochimica dell’acqua, in cui una molecola di acqua viene scissa
omoliticamente con la formazione di due specie radicaliche.
Come detto sopra, il radicale idrossile è considerato il più tossico fra i ROS in quanto è
capace di interagire indiscriminatamente con tutte le macromolecole biologiche ed è talmente
reattivo che non diffonde più di uno o due diametri molecolari prima di reagire con un
componente cellulare (Pryor, 1986).
Nel suo stato elettronico basale l’ossigeno è un tripletto (3O2) e, poichè ha due elettroni
spaiati con stesso spin, è anche un diradicale (Pryor et al., 2006). L’appaiare i due elettroni
dando loro spin diversi porta alla formazione del cosiddetto ossigeno singoletto (1O2), una forma
a più alta energia rispetto allo stato basale. L’ossigeno singoletto non viene prodotto
dall’ossigeno tripletto attraverso semplici processi termici, ma richiede l’intervento di molecole
5
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
altamente energetiche. È presente in diversi processi fisiologici, ma non è ancora chiaro quale sia
la sua funzione. Ricopre però un importante ruolo nella terapia fotodinamica delle neoplasie: le
cellule tumorali vengono irradiate in modo da eccitare le molecole fotosensibili endogene, come
ad esempio le porfirine, coinvolte nella formazione di ossigeno singoletto che può così innescare
la morte cellulare.
Figura 1. Processo di riduzione dell`ossigeno molecolare.
Accanto alle specie reattive dell’ossigeno, presentano un’importante rilevanza biologica
anche le specie reattive dell’azoto (RNS).
In particolare l’ossido nitrico (NO), tossico a moderate concentrazioni, ricopre diversi ruoli
fisiologici: è un importante vasodilatatore, inibisce l’adesione e l’aggregazione piastrinica, viene
prodotto a livello cerebrale come neurotrasmettitore, è coinvolto nelle risposte immunitarie ed ha
un effetto protettivo durante il processo di ischemia/riperfusione (Wink, 1993; Ignarro, 2000).
L’NO viene sintetizzato dall’ossidazione della L-arginina da una famiglia di sintasi (NOS) di
cui si conoscono principalmente tre isoforme (Stuehr, 1999). È ritenuto tossico perché capace di
reagire con l’anione superossido e generare il perossinitrito, un potente ossidante .
Un concetto interessante è che l’ossido nitrico, attraverso questa reazione, neutralizza in
parte la tossicità dell’anione superossido trasformandolo in ONOO, che in parte si decompone
in NO3 .
6
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
Esistono diverse fonti di generazione di RL e ROS, potendo differenziarsi in endogene e
esogene.
La produzione endogena
di ROS segue diverse vie
metaboliche (Sauer, 2001);
il
maggior
sito
di
formazione è rappresentato
dalla catena di trasporto
degli
elettroni
nei
(Beal,
2005)
mitocondri
(Figura 2).
Figura 2. Rappresentazione della formazione endogena di
ROS nei mitocondri.
Negli animali, circa l’85% dell’ossigeno inspirato è utilizzato dai mitocondri, interagendo in
particolare con la citocromo ossidasi, presente nella membrana interna di questi organelli,
capace, a sua volta, di legare stabilmente le specie di ossigeno parzialmente ridotte, fino alla loro
conversione in acqua.
A livello della membrana del reticolo endoplasmatico liscio è situata un’altra citocromo
ossidasi, coinvolta in un trasporto elettronico: si tratta della famiglia multienzimatica del
citocromo P450, deputato alla detossificazione dell’organismo, oltre che ad altre importanti
funzioni (Zangar et al., 2004). Senza entrare nel dettaglio del meccanismo enzimatico, è noto che
la produzione di ROS a questo livello avviene durante l’ossidazione di acidi grassi insaturi e la
bioattivazione di xenobiotici, come farmaci, droghe, idrocarburi aromatici, pesticidi, ecc.
In caso di ischemia, invece, la principale fonte di ROS è il sistema Xantina OssidasiLipogenasi-Cicloossigenasi, che presiede il metabolismo delle purine. Questo sistema enzimatico
è presente nelle cellule endoteliali dei piccoli vasi e nelle cellule epiteliali del tessuto mammario.
Generalmente esiste sottoforma di xantina deidrogenasi ma in certe condizioni, come appunto
l'ischemia, può essere convertita in xantina ossidasi che, in presenza di substrati murinici, è in
grado di produrre velocemente grandi quantità di anione superossido e perossido di idrogeno
(Rieger et al., 2002).
Il complesso multienzimatico più importante coinvolto nella generazione di ROS, in
particolare durante la trasduzione di segnali intracellulari, è la NADPH Ossidasi. Questa è
costituita da un citocromo b, presente nella membrana citoplasmatica, e da proteine leganti
gruppi GTP (GTP binding proteins), riscontrabili a livello citoplasmatico. Quando il sistema
7
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
viene attivato, le costituenti citoplasmatiche vengono fosforilate e traslocano sulla membrana
dove si legano al citocromo b, permettendo il trasferimento di un elettrone all’ossigeno
molecolare con conseguente produzione di superossido. L’attivazione della NADPH ossidasi
richiede anche la partecipazione di due proteine a basso peso molecolare, Rac2, facente parte di
un dimero citoplasmatico con Rho-GDI, e Rap1A, membro della famiglia Ras situato a livello
della membrana citoplasmatica in intimo contatto con il citocromo (Babior, 1999; Li et al.,
2001).
Questo complesso è ben caratterizzato nelle cellule fagocitiche, dove è fondamentale la
funzione battericida svolta dai ROS (O2, H2O2 e HOCl) prodotti dalle reazioni respiratorie, che
rappresentano un meccanismo di difesa contro l'invasione di microorganismi. Attraverso studi
biochimici è stato messo in evidenza un sistema funzionalmente simile anche in cellule non
deputate alla fagocitosi, in cui i ROS agirebbero da secondo messaggero nelle cascate di segnali
intracellulari. L’esatta composizione della NADPH ossidasi in cellule non fagocitarie non è
ancora chiara, ma è stata dimostrata l’essenzialità del reclutamento di Rac1 nell’attivazione del
sistema enzimatico. Questa proteina a basso peso molecolare potrebbe mediare l’interazione fra i
prodotti di PI3K e la NADPH ossidasi (Sundaresan, 1996).
Inoltre, numerose sono le fonti esogene di produzione dei ROS. Tra gli agenti ambientali
ritroviamo le radiazioni elettromagnetiche, quali i raggi x e i raggi ɤ, e le radiazioni ultraviolette,
che producono radicali liberi per trasferimento della loro energia a componenti cellulari o a
molecole di acqua. Anche pesticidi, fumo di tabacco, solventi, anestetici e in generale tutti gli
agenti facenti parte degli idrocarburi aromatici possono essere responsabili di uno stress
ossidativo (Pagano, 2000).
Infine molti agenti chemioterapici e gli antibiotici devono parte del loro effetto citolitico e
quindi antineoplastico, così come ai loro ingenti effetti collaterali, alla capacità di generare
radicali liberi (Murrel, 1993).
Attualmente, ci sono prove sufficienti per sostenere la teoria del danno in vivo prodotto dai
radicali liberi sugli acidi nucleici, lipidi e proteine (Valko et al., 2006) (Figura 3). Il danno
ossidativo agli acidi nucleici è mediato principalmente dai radicali OH che generano prodotti di
diversi tipi e rotture di singoli e doppi legami sullo scheletro di carbonio. È noto che questo
radicale reagisce con tutti i componenti della molecola del DNA, danneggiando sia le basi
puriniche sia quelle pirimidiniche che lo scheletro degli zuccheri. Inoltre si possono riscontrare
danni a livello genomico, come la formazione di interruzioni per la rimozione di basi, con
8
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
conseguente frammentazione della doppia elica, o come l’ossidazione delle basi, con effetti
mutagenici sia a livello del DNA nucleare sia in quello mitocondriale (Wagner, 1992; Marnett,
2000). Quest’ultimo è maggiormente interessato dagli effetti dello stress ossidativo, in quanto è
in intimo contatto con la primaria sorgente di ROS ed è dotato di una scarsa capacità di
protezione e di riparo, a differenza del DNA nucleare (Ritcher et al., 1988).
Figura 3. Sintesi dei danni a diverse strutture e molecule cellulari provocati dai radicali liberi.
I ROS interagiscono con le membrane, nei
confronti della loro componente proteica e
lipidica,
alterando
irreversibilmente
la
permeabilità e la funzionalità della membrana
stessa. In particolare i lipidi sono uno dei target
più sensibili all’ossidazione da parte dei ROS.
L`incorporazione di ossigeno molecolare nelle
strutture degli acidi grassi avvia una reazione a
catena, attraverso la quale si formano vari tipi di
specie reattive (RO2 e RO). Questo evento,
noto come perossidazione lipidica, produce una
progressiva perdita dell'integrità delle membrane
distruttiva Figura 4. Processo di perossidazione
lipidica e conseguente formazione di
(Simonian & Coyle, 1996) (Figura 4).
biologiche
ed
è
quindi
molto
idroperossidi.
9
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
Una volta iniziata, la perossidazione lipidica, se non neutralizzata dai sistemi difensivi,
termina solo con la formazione dei prodotti finali, quali malondialdeide (MDA), 4-idrossi-2nonenolo (4-HNE) e gli F2-isoprostani, che vengono accumulati nell’organismo (Kregel &
Zhang, 2007).
Nel caso delle proteine, è noto che i ROS e RNS sono in grado di ossidare i loro gruppi –SH;
ciò può causare frammentazione della catena polipeptidica e modifiche di aminoacidi che
possono sia attivare che disattivare queste molecole. Gli amminoacidi più sensibili sono il
triptofano, la tirosina, la fenilalanina, la metionina e la cisteina. In particolare, l'OH interagisce
con gli amminoacidi generando un danno specifico nei confronti di proteine legate ai metalli di
transizione (Dalle et al., 2003; Stadtman, 2004; Dalle et al., 2005).
Un’altra conseguenza allo stress ossidativo sono i cambiamenti funzionali in vari tipi di
proteine (Stadtman, 1992). Ad esempio, gli enzimi danneggiati possono perdere o modificare la
loro attività, le proteine strutturali o le chaperonine possono aggregarsi fra di loro, mentre i
fattori di trascrizione possono aumentare o diminuire la loro capacità di legarsi al DNA,
modulando cambiamenti dell’espressione genica che decidono della sopravvivenza, della morte
o del processo di invecchiamento cellulare (Greer & Brunet 2005).
I.2.2. Antiossidanti: Equilibrio tra le specie reattive e meccanismi antiossidanti.
Negli organismi aerobi la produzione di ROS e RNS è inevitabile e, entro certe
concentrazioni, fondamentale (Feher, 1985). Per poter sopravvivere, però, questi sistemi
biologici hanno dovuto mettere a punto un complesso sistema di difese antiossidanti, prevenendo
così la generazione dei radicali più reattivi e la loro neutralizzazione una volta formatisi.
Per antiossidante si intende ogni sostanza che, presente a concentrazioni comparabili con
quelle di un substrato ossidabile, ritarda o evita l’ossidazione di quel substrato (Halliwell &
Gutteridge, 1989). Successivamente, sono stati definiti da una prospettiva più generale, come
"tutti quei composti che proteggono i sistemi biologici contro l'effetto dannoso della generazione
eccessiva di ossidanti," e questa definizione è attualmente la più utilizzata (Krinsky, 1992).
Non esiste un antiossidante universale od ottimale: le difese contro lo stress ossidativo non
sono in grado di evitare completamente tutti i danni. In un sistema biologico, la funzione di
antiossidante dipende da vari parametri, come il tipo di ROS generato, il modo e il luogo in cui si
è formato, l’entità del danno riportato.
Ogni cellula è caratterizzata da una particolare concentrazione di elettroni (stato redox)
conservati in vari costituenti cellulari, che insieme con le loro variazioni determinano le funzione
10
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
cellulari (Schafer & Buettner, 2001). L'equilibrio stabilito tra i sistemi ossidanti e antiossidanti è
essenziale per lo sviluppo degli organismi viventi. Questo equilibrio redox è fissato a un livello
fisiologico, è essenziale per la regolazione metabolica, l'attivazione e la disattivazione di
biomolecole, la trasduzione del segnale, l'ottenimento di energia metabolica e le attivazioni
cellulari (Cadenas, 1997). Il corpo umano è dotato di un ampio gruppo di composti antiossidanti,
alcuni endogeni sintetizzati e altri ottenuti attraverso la dieta, chiamati esogeni (Ames et al.,
1995).
I meccanismi di difesa del corpo contro i danni mediati da radicali liberi sono: i) i
meccanismi di prevenzione, ii) meccanismi di riparazione, iii) le difese fische e iv) le difese
antiossidanti (Valko et al., 2007). Inoltre, secondo la loro modalità di azione nel corpo gli
antiossidanti sono classificati come primari, secondari e terziari.
Gli antiossidanti primari sono quelli che convertono i ROS in molecole meno dannose prima
di reagire con le strutture vitali, o impediscono la loro produzione. In queste gruppo ci sono: la
superossido dismutasi (SOD, SOD Mn, SOD CuZn), la glutatione perossidasi dipendente dal
selenio (GPx Se), la glutatione reduttasi (GR), la perossidasi, la catalasi, la glutaredoxina, la
tioredoxina (Trx), e proteine come la ferritina e la ceruloplasmina (Dröge, 2002).
Gli antiossidanti secondari, invece, quando reagiscono con i radicali liberi si ossidano e
diventano radicali liberi deboli e non tossici. Esempi di questi sono: le vitamine C ed E, βcarotene, acido urico (UA), bilirubina, albumina (Alb), ubichinone e selenio e all'interno del
gruppo di composti fenolici (CF) sono gli acidi fenolici, fenoli non carbossilici e flavonoidi (Carr
& Frei, 1999; Catani et al., 2001; El-Agamey et al., 2004; Landis & Tower, 2005; Miller et al.,
2005; Schrauzer, 2006).
Esiste infine un sistema
di
antiossidanti
terziari,
composto
principalmente da
macroxiproteinasi, fosfolipasi A2 e C, endo e esonucleasi, DNA glicosilasi, perossidasi e
metionina solfossido reduttasi (Sahnoun et al., 1997), le cui funzioni includono:

Riparazione diretta dei danni alle proteine, lipidi e carboidrati, DNA, RNA.

Degradazione delle molecole ossidate con il mantenimento delle strutture di base non
danneggiate ( amminoacidi, nucleotidi e acidi grassi).

Eliminazione dei prodotti danneggiati irreversibilmente.
Gli antiossidanti possono essere anche classificati come non enzimatici idrosolubili e
liposolubili (Fridovich, 1989). Gli “scavengers” idrosolubili sono molecole a basso peso
11
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
molecolare, localizzate in vari distretti della cellula, che interagiscono direttamente con i ROS,
neutralizzandoli e ossidandosi (Figura 5). Tra questi possiamo citare l’acido ascorbico (vitamina
C), l’acido urico, ma soprattutto il più conosciuto Glutatione (GSH), capace di ossidarsi
direttamente in GSSG ma anche di fungere da cofattore fondamentale in numerosi sistemi
enzimatici glutatione-dipendenti (Valko et al., 2007).
Le molecole liposolubili, come le vitamine, invece, sono situate a livello delle membrane e
sono adibite alla neutralizzazione della perossidazione lipidica; un esempio sono l’α-tocoferolo
(vitamina E) e i β-caroteni. Il Coenzima Q10 o ubichinone è una componente mitocondriale
essenziale e un antiossidante liposolubile situato in ogni membrana cellulare. Esso può agire
indipendentemente neutralizzando specie radicaliche a livello di membrana o agendo
sinergisticamente con la vitamina E (Catani et al., 2001; El-Agamey et al., 2004; Miller et al.,
2005) .
Figura 5: Principale processo di funzionamento degli antiossidanti a basso peso molecolare. Le specie
radicaliche che si formano nell’area lipofilica della cellula sono ridotte dal tocoferolo localizzato nelle
membrane, con la formazione del radicale tocoferile. Questo può essere ridotto di nuovo a tocoferolo da
un altro antiossidante liposolubile come l’ubichinolo, o da un antiossidante citoplasmatico come
l’ascorbato. Il deidroascorbato può essere riconvertito, a sua volta, nella sua forma ridotta dal glutatione
(GHS) e infine dal NADPH.
In questo contesto, è stato ipotizzata l'esistenza di vere e proprie “reti” di antiossidanti, dove
alcuni antiossidanti interagiscono con gli altri per rigenerare le loro corrispondenti forme ridotte
in un processo altamente coordinato e controllato, che solo ora si sta iniziando a comprendere nel
dettaglio (Sen et al., 2000). Per un loro studio, le difese antiossidanti sono raggruppate secondo
12
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
schemi diversi, uno dei quali le classifica come molecole enzimatiche o non enzimatica, indicato
nella Tabella 1.
Tabella 1. Classificazione generale degli antiossidanti nei sistemi biologici.
Antiossidanti
Esempi piú rilevanti
Superossido
dismutasi
(SOD)
(E.C. 1.15.1.6)
Catalasi
(E.C. 1.11.1.6)
Enzimatici
Glutatione perossidasi
(GSH-Px)
(E.C. 1.11.1.9)
Idrosolubili
Acido L-ascorbico
(vitamina C)
Riferimenti
Catalizza la conversione dell’ O2 a H2O2
secondo la reazione:
Valko et al.,
2 O2 + 2H+  H2O2 + 1O2
2007
È l`unico enzima nel corpo che ha come substrato un
radicale libero
È un emoenzima capace di trasformare l’ H2O2 in
H2O, secondo la reazione:
Valko et al.,
2007
Catalasi-Fe3+ + H2O  Composto I
Composto I + H2O2  catalasi-Fe3+ + H2O + O2
È attiva sia sull’ H2O2 come sui perossidi lipidici,
a scapito dell’ossidazione del glutatione ridotto
(GSH) a glutatione ossidato (GSSG) secondo la
reazione:
ROOH + 2GSH  ROH + GSSG + H2O
Agisce come cofattore di numerosi enzimi disintossicanti
dello stress ossidativo.
Il glutatione ossidato si accumula all`interno delle cellule e la
percentuale di GSH/GSSG è un ottimo indicatore dello stato
ossidativo nel corpo (omeostasi redox).
Jones et al.,
(2000)
Dröge (2002)
Nogueira et al.,
(2004)
Masella et al.,
(2005)
Il suo effetto antiossidante è dovuto al fatto che
reagisce direttamente con i ROS (es. come
scavenger di OH) e indirettamente, attraverso la Cooper &
sua partecipazione nelle reazioni redox catalizzate
Kristal, (1997)
da enzimi (es. nella reazione di GSH-Px). Agisce
sinergicamente per favorire l`attività antiossidante
delle vitamine E e C.
Si tratta di un composto che in virtù del suo basso
potenziale redox può agire come scavenger “ad
ampio spettro” contro i radicali RO2 OH, O2
nonchè contro ONOO e 1O2
Rice, (2000)
Agisce anche in sinergia con altri antiossidanti
non enzimatici.
Può agire come pro-ossidante in determinate circostanze
fisiologiche
Liposolubili
Non Enzimatici
Glutatione
Funzione come antiossidanti
-tocoferolo
È il principale antiossidante “residente” nelle
membrane biologiche. La sua funzione è quella di
eliminare i radicali RO2 generati durante la
perossidazione dei lipidi secondo la reazione:
RO2 + -tocoferolo- OH 
ROOH + -tocoferolo- O
Beckman &
Ames, (1998)
Il tocoferolo radicalico è relativamente stabile e in
circonstanze normali non può avviare il processo di
ossidazione delle membrane biologiche
13
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
E' stato accertato che l'espressione di enzimi antiossidanti umani è indotta a livello genico da
livelli moderati di ROS (Esposito et al., 2002). Nella maggior parte dei casi la molecola
antiossidante non enzimatica è in grado di sopprimere il potere ossidante dei radicali di donare
elettroni. Pertanto, a seguito della loro attività, queste molecole dovrebbero formare radicali più
stabili di quelle ossidanti iniziali. Successivamente, i radicali delle molecole antiossidanti devono
essere riciclati e cosi la loro funzione antiossidante viene ristabilita (Khanna, 2000).
Gli antiossidanti possono essere classificati anche tenendo conto delle funzioni svolte; a tal
proposito possiamo distinguere tra:
i)
antiossidanti indiretti: sono quelli che inibiscono la formazione di radicali liberi,
attraverso la chelazione di metalli come il Fe2+;
ii)
antiossidanti diretti: agiscono attraverso la cattura di ROS e RNS una volta che sono stati
generati;
iii)
un ampio gruppo di molecole che modulano positivamente non solo la capacità cellulare
di far fronte alla generazione di elevati livelli di ROS e RNS (compresa la capacità
enzimatica), ma anche la capacità di promuovere la riparazione delle biomolecole
ossidate dai radicali liberi (Aruoma, 1996). In questo senso, il concetto di capacità
antiossidante di un determinato prodotto è più ampio ed è legato non solo agli effetti per
diminuire la generazione di radicali liberi (funzioni i e ii), ma anche alla prevenzione del
danno ossidativo e delle affezioni letali nelle funzioni cellulari che possono essere
stimolate da questi reattivi chimici (funzione iii) (Aruoma, 1998).
Gli antiossidanti diretti sono i più studiati e come esempi classici si possono citare tutti quelli
presentati nella Tabella 1 (Jones et al., 2000; Kagan et al., 2002).
Anche sul funzionamento delle difese antiossidanti è stato ipotizzato che, in generale,
agiscano in parallelo (diversi antiossidanti possono svolgere ruoli simili) e in modalità seriale
(enzimi antiossidanti operano in tandem durante la loro azione catalitica), che ben illustra la
complessità di questo sistema di molecole (Beckman & Ames, 1998).
L'interazione sinergica tra gli antiossidanti è anche favorita dalla "protezione" che si verifica
tra ogni enzima: ad esempio, l'enzima SOD "protegge" il GSH-Px e la catalasi dai danni prodotti
dal radicale O2, mentre il GSH-Px e la catalasi "proteggono" la SOD dall’ inattivazione causata
dagli idroperossidi e dal perossido di idrogeno H2O2 (Chaudieáre & Ferrari-Iliou, 1999).
14
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
I.3. Stress ossidativo
I.3.1. Stress ossidativo: definizione e strategie per la sua determinazione
Lo stress ossidativo è stato originariamente definito da Sies (1986) come una situazione
estrema dell`organismo in termini ossidativi, nella quale si verifica un’alterazione nel bilancio tra
la generazione di ossidanti e il controllo da parte dei antiossidanti. L`equillibrio ossidativo nel
corpo umano può essere rotto da un aumento della generazione di radicali liberi, una
diminuzione delle difese antiossidanti o anche una combinazione di entrambi gli eventi.
Attualmente, a questa tesi viene aggiunto che lo stress ossidativo deve essere inteso come uno
stato di deregolamentazione, che non si verifica in modo invisibile nel corpo (Dröge, 2002). In
base a ciò, è stata definita l`esistenza di 3 stati fondamentali correlati con la generazione dei
radicali liberi nell’ organismo umano, come mostra la Figura 6.
Nello stato I, che corrisponde alle
condizione basali, esiste un equilibrio tra
I- libello base
II- squilibrio regolato
III- squilibrio non transciente
(stress ossidativo)
la produzione e lo scavenger dei radicali
concentrazione
che le loro
rimangano
basse
costanti. In questo stato
e
possono
verificarsi cambiamenti in grado di
portare ad un aumento moderato delle
Concentrazione di
ROS e RNS
liberi, in maniera tale
III
II
I
specie ossidanti (Stato II); inoltre i
tempo
composti antiossidanti del corpo possono
essere
regolate
a
livello
genetico, Figura 6. Stati coinvolti nella produzione di radicali
ristabilendo l`equilibrio iniziale.
liberi nel corpo umano (Dröge, 2002).
Questi meccanismi, a lungo termine, tendono a mantenere l’omeostasi redox nel corpo (Dröge,
2002); tuttavia in determinate condizioni, può aumentare la generazione di radicali liberi e se la
risposta antiossidante non è sufficiente a ristabilire l`equilibrio iniziale si genera lo stato che è
stato già definito come stress ossidativo (stato III nella Figura 6). In tali casi, il corpo può
raggiungere un nuovo stato di “equilibrio” caratterizzato da concentrazioni più elevate di radicali
liberi e diversi modelli di espressione genica. Tali concentrazioni elevate spiegano i danni
osservati nello stress ossidativo. D`accordo con i precedenti approcci, il concetto di stress
ossidativo viene definito quindi come una situazione in cui le cellule sono esposte ad un
15
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
ambiente pro-ossidante e i meccanismi di difesa antiossidanti sono superati in un modo da
incidere direttamente sullo stato redox cellulare (Valko et al., 2007).
Lo stato di stress ossidativo può essere caratterizzato da:
i)
aumento della formazione di ROS e RNS;
ii)
diminuzione dei livelli di molecole antiossidanti non enzimatiche idrodolubili e
liposolubili.
iii)
aumento del
danno ossidativo nei confronti delle biomolecole cellulari (lipidi,
proteine e DNA principalmente) (Khanna, 2000).
Per misurare la formazione di ROS e RNS vengono generalmente usati composti esogeni che
vengono specificamente trasformati dai radicali, in modo tale che le molecole ottenute possono
essere considerate una misura quantitativa e selettiva delle specie reattive studiate (Ischiropoulos
et al., 1999). In particolare, per gli studi svolti nei sistemi cellulari, è necessario che questi
composti esogeni possiedano un'adeguata permeabilità attraverso le membrane cellulari, che le
loro forme ossidate vengano sequestrate all’interno delle cellule e che abbiano una bassa tossicità
(Royall & Ischiropoulos, 1993). Tra i composti più utilizzati per misurare i livelli intracellulari di
radicali liberi ci sono le sonde fluorescenti diacetato di 2', 7'- diclorofluoresceina (DCFH2-DA) e
diidrorrodamina 123 (DHR 123). In generale, è accettato che l`uso di queste sonde è appropriato
per determinare la produzione globale di specie reattive, tenendo sempre in considerazione che
possono reagire con diversi tipi di ROS e RNS (Ischiropoulos et al., 1999).
Diversi metodi sono stati utilizzati per la quantificazione delle variazione delle
concentrazione degli antiossidanti non entimatici come l`acido ascorbico, la vitamina E e GSH.
Ai fini della determinazione dei livelli di GSH, per esempio, sono stati applicati diversi
procedimenti tra cui gli studi con sonde fluorescenti come il monoclorobinano (MBCl). Questo
composto è stato ampliamente utilizzato per la quantificazione dei livelli di GSH in diversi
sistemi neuronali in condizione di stress ossidativo (Sarafian et al., 1994; Loikkanen et al., 1998;
Lievre et al., 2001). Tuttavia, l`esaurimento dei livelli di antiossidanti non enzimatici in sistemi
biologici non è sempre una conseguenza diretta dello stress ossidativo e la loro misurazione
dovrebbe pertanto essere sempre accompagnata dalla misura di altri marcatori (Khanna, 2000).
In generale, la determinazione in vivo di molecole ossidate dai ROS e RNS è complicata
perchè, oltre ad altri fattori, si trovano in concentrazioni molto basse nelle cellule. D`altra parte,
l`ossidazione delle biomolecole può verificarsi anche come conseguenza di altri processi
cellulari non ossidativi (Khanna, 2000). In ogni caso, la strategia di maggior successo
16
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
sperimentale per l`analisi di ogni situazione di stress ossidativo dovrebbe essere la combinazione
degli indicatori discussi in precedenza (Azzi et al., 2004).
I.4. Contributo del miele alla nutrizione e alla salute umana. Il miele di api come
fonte naturale di composti biologicamente attivi.
Il miele ha suscitato un crescente interesse nella ricerca di nuovi composti biologicamente
attivi: ciò è dovuto principalmente alla diversità molecolare e alla funzionalità dei composti
ottenuti dalle fonti naturali (Raskin et al., 2002). A tutto questo si aggiunge il fatto che il miele è
una fonte di composti bioattivi con un carattere rinnovabile ed è facilmente ottenibile, dal
momento che si può reperire durante tutto l’anno grazie alle caratteristiche tropicali di Cuba
(Pérez, 2000). Inoltre, il miele di api è poco tossico e ciò facilita il suo utilizzo nell’ industria
alimentare, farmaceutica e cosmetica (Manrresa, 2005).
I.4.1. Composizione biochimica del miele di api.
Il miele ha una composizione chimica che gli permette di avere non solo un alto valore
nutritivo, ma anche interessanti proprietà biologiche (Molan & Betts, 2004). Questo potrebbe
spiegare l`effetto benefico sulla salute umana osservata nei soggetti che hanno consumato
regolarmente il miele come parte integrante della loro dieta, suggerendo quindi che contenga
composti biologicamente attivi in grado di modulare diverse funzioni fisiologiche del corpo
(Khan et al., 2007).
La composizione del miele è variabile a seconda della fonte da cui si ottiene, così come da
fattori esterni, che includono le condizioni ambientali e il processamento.
Il nettare, da cui proviene il miele, è ricco in saccarosio ed ha un basso contenuto di zuccheri
semplici; è attraverso la reazione dell’ enzima invertasi che il saccarosio diventa fruttosio e
glucosio, con la conseguente formazione di una miscela equimolare di questi due zuccheri con
una elevata percentuale, conferendo al miele la proprietà di essere una soluzione soprassatura di
zuccheri, dove il fruttosio occupa il 38% e il glucosio il 31%, (Pérez, 2002; Terrab et al., 2003).
Tra i composti presenti in concentrazione minore nel miele ci sono gli amminoacidi. La presenza
di questi nel miele è imputabile per prima cosa proprio alle api, poi alla fonte vegetale da cui
viene prodotto il miele: infatti si hanno amminoacidi comuni a molti tipi di miele, mentre altri
dipendono soltanto dalla sua origine botanica (González et al., 2006). Secondo quanto riportato,
il totale degli aminoacidi liberi nel miele è pari a 10-200 mg/100 g (Patzold & Bruckner, 2006);
17
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
in particolare la prolina si presenta come l’ aminoacido in maggior percentuale, circa il 50% del
totale degli aminoacidi liberi (Iglesias et al., 2004; Meda et al., 2005; Carter et al., 2006).
Inoltre, è stato individuato nel miele di api un gran numero di aminoacidi e in molti casi sono
considerati come marcatori dell’ origine botanica del miele stesso (Hermosín et al., 2003;
Iglesias et al., 2004; Pérez et al., 2007). D'altra parte, il contenuto di proteine nel miele è
variabile e dipende sempre in gran parte dall'origine botanica. Attualmente sono state utilizzate
diverse metodologie per lo studio del contenuto totale di proteine nel miele, come il metodo
Lorry e il metodo Bradford, grazie ai quali sono stati identificati valori superiori a 1000 mg · g-1
(Azeredo et al ., 2003; Molan & Betts, 2004).
Le sostanze minerali nel miele derivano principalmente dal nettare da cui proviene il miele e
quindi dalla sua origine botanica e geografica. Sono stati identificati diversi tipi di minerali, sia
in traccia (Al, Ba, Sr, Bi, Cd, Hg, Pb, Sn, Te, Tl, W, Sb, Cr, Ni, Ti, V, Co, Mo) che in maggior
quantità (P, S, Ca, Mg, K, Na, Zn, Fe, Cu, Mn), sempre in relazione con l’ origine del miele
(Conti, 2000; Stocker et al., 2005). In studi recenti su mieli cubani sono stati individuati il Ca,
Mg, Fe, Na come i macroelementi piu comuni e in maggiore concentrazione, compresa tra le
24.47 a 72.03 ppm (Manrresa, 2005).
I.4.2. Metaboliti responsabili dell’ attività antiossidante nel miele d'api.
Sono stati purificati e identificati diversi composti e le loro strutture sono stati chiarite e
riconosciute come responsabili dell’ attività antiossidante del
miele. Questi compendono i
composti fenolici (acidi fenolici e flavonoidi) (Martos et al., 2000; Barberán et al., 2001;
Gheldof et al., 2002; Henrriques et al., 2006; Fiorani et al., 2006; Dimitrova et al., 2007; Vela et
al., 2007) e in misura minore gli aminoacidi (González et al., 2006; Patzold & Bruckner, 2006;
Hermosín et al., 2003; Iglesias et al., 2004; Pérez et al., 2007), gli enzimi glucosio-ossidasi,
invertasi, diastasi e catalasi (Huidobro et al., 2005), acido ascorbico, sostanze non enzimatiche
come gli acidi organici, carotenoidi (β-carotene, - tocoferolo) e composti fenolici. Nel caso dei
polifenoli, il contenuto può essere elevato in alcuni tipi di miele sempre a seconda della fonte
botanica; tali composti hanno proprietà antiossidanti molto ben definite e sono tra i maggiori
responsabili della capacità antiossidante del miele (Martos et al., 2000; Barberán et al., 2001).
I composti fenolici (CF) rappresentano un grande gruppo di metaboliti secondari con attività
antiossidante. Questa proprietà è associata principalmente alla capacità di scavenger dei radicali
liberi attraverso la formazione del radicale fenosilico (ArO), che è molto stabile. I composti
fenolici stabilizzano i radicali liberi quando cedono un idrogeno da uno dei loro gruppi
18
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
idrossilici, formando un legame tra i due composti. Il grado di attività dei CF e di molti altri
antiossidanti è correlato al numero di gruppi idrossilici che la molecola presenta. Inoltre, è stata
ipotizzata la loro capacità di chelare ioni metallici (come il Fe2 ) e quindi di impedire la loro
partecipazione nelle reazioni di ossidazione (Rice-Evans et al., 1996).
Il gruppo più importante di composti fenolici sono gli acidi fenolici e i flavonoidi, che sono
particolarmente abbondanti nel miele di api (Martos et al., 2000; Tomás-Barberán et al., 2001).
Questo gruppo di composti è suddiviso in 13 classi con più di 5000 composti, di cui citeremo
solo quelli che sono di interesse particolare per questo lavoro:
-
Flavonoidi: flavoni (luteolina, apigenina e Chrysin), Flavonoli (miricetina, fisetina,
quercetina, kaempferol, isorhamnetin e galangina), flavononi (Pinocembrina) e
diidroflavonolo (pinobanksina).
-
Acidi fenolici: l’acido idrossibenzoico (acido siringico) e l'acido idrosicinnamico
(caffeico, cumarico e suoi isomeri orto, meta e para) e felúrico.
I flavonoidi sono composti a basso peso molecolare che condividono uno scheletro comune
di difenilpirano (C6-C3-C6), formati da due anelli di fenilico (A e B) collegati tramite un anello
C di pirano (eterociclici) (Martínez-Florez et al., 2002). Questi composti hanno generalmente
almeno tre gruppi ossidrilici fenolici e di solito sono combinati con zuccheri per formare
glicosidi, sebbene si possano trovare anche come agliconi liberi. Il glucosio è lo zucchero
residuo più comune, ma è possibile trovare anche il galattosio, il ramnosio e lo xiloso. Le
differenze all`interno delle classi di flavonoidi sono dovute principalmente alla variazione del
numero e della posizione dei gruppi idrossili (Rice-Evans et al., 1996).
All'interno di questo gruppo
A
ci sono i flavonoli e flavoni,
molto abbondanti nel regno
vegetale.
I
caratterizzati
flavonoli
sono
da
una
insaturazione tra i carboni C2 e
C3 dell'anello C, da un gruppo
19
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
chetonico a livello del C4 e
B
dalla presenza di un gruppo
idrossile
in
posizione
3
dell'anello, mentre i flavoni, non
presentano quest’ultimo gruppo
OH (Rice-Evans et al., 1995;
Havsteen, 2002). La struttura di
entrambi i gruppi è mostrata
nelle Figure 7 A e 7 B,
rispettivamente.
Figura 7. Strutture chimiche dei flavonoli (A) e flavoni
(B) (Rice-Evans et al., 1995).
Questi flavonoidi possono apparire in forma O - glicosilata, in cui uno o più idrossili sono
legati ad uno zucchero formando quindi un legame O - C. La glicosilazione può verificarsi anche
per un legame diretto tra lo zucchero ed il nucleo di flavonoidi, formando quindi un forte legame
C – C con la formazione dei C - glicosidi. Questo tipo di glicosilazione si verifica solo nelle
posizioni C6 e / o C8. L'obiettivo della glicosilazione è quello di formare un flavonoide meno
reattivo e più solubile in acqua, tanto che la glicosilazione può essere vista come una forma
essenziale di protezione delle piante per evitare il danno citoplasmatico e accumulare i flavonoidi
nei vacuoli (Cuyckens & Claeys, 2004). La maggior parte dei flavonoli si presenta in forma di O
- glicosidi e raramente di C – glicosidi, mentre i flavoni si trovano spesso in natura, sia come O glicosilati che come C –glicosilati (Iwashina, 2000).
I flavonoidi possono interferire con almeno tre diversi sistemi di produzione di radicali liberi.
A causa del loro basso potenziale redox, sono in grado di ridurre i radicali liberi ossidati e così
prevenire la perossidazione lipidica, una delle conseguenze più importanti prodotte dai radicali
liberi che determina danni alla membrana cellulare fino alla morte delle cellule stesse (Cuyckens
& Claeys, 2004). Possono anche legarsi ai polimeri biologici, come gli enzimi, i trasportatori di
ormoni e il DNA; chelare gli ioni metallici, come il Fe
2+
, Cu2+, Zn2+ e catalizzare il trasporto
degli elettroni. Proprio per questa loro caratteristica sono stati segnalati effetti protettivi contro
alcune malattie come il diabete mellito, il cancro, le malattie cardiache, le infezioni virali,
l’ulcera dello stomaco e del duodeno e di stati di infiammazione (Havsteen, 2002).
20
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
I criteri chimici per stabilire la capacità antiossidante dei flavonoidi (Havsteen, 2002) sono i
seguenti:
- Presenza di una struttura O - diidrossi nell’ anello B, che conferisce una maggiore stabilità
alla forma radicale e partecipa alla delocalizzazione degli elettroni;
- Doppio legame, combinato con la funzione 4-oxo dell’ anello C41-42;
- Gruppi 3- e 5-OH con funzione 4-oxo negli anelli A e C, necessari per l'effetto del più alto
potenziale antiossidante.
Numerosi studi dimostrano la presenza dei flavonoidi nel miele di api; sono stati indicati
come i principali responsabili dell'attività antiossidante del miele (Gheldof et al., 2002; Gheldof
& Engeseth, 2002; Meda et al., 2005; Vela et al., 2007), ma anche come marker della sua
origine botanica (Ferreres et al., 1992; Ferreres et al., 1993; Ferrer al., 1994; Ferreres et al.,
1996; Ferreres et al., 1998; Tomás-Barberán et al., 1993; Tomás-Barberán et al., 1993; Martos
et al., 2000; Tomás-Barberán et al., 2001).
In generale, la concentrazione dei flavonoidi nel miele è di circa 20 mg / kg. Tra i flavonoidi
più frequentemente individuati ci sono principalmente i flavonoli (miricetina, fisetina,
quercetina, kaempferol, isorhamnetin e galangina), i flavononi (Pinocembrina) e i
diidroflavonolo (pinobanksina) (Ferreres et al., 1992; Gil et al., 1995; Vela et al., 2007;
Michalkiewicz et al., 2008; Truchado et al., 2008).
Gli acidi fenolici sono composti derivati dall’ acido benzoico, fenilacetico e cinnamico, come
viene mostrato nella Figura 8 A, B e C, rispettivamente. In questi, il gruppo OH può essere un
sostituente in diverse posizioni sull’anello aromatico. Tra gli acidi fenolici, i derivati monoidrossi dell’ acido benzoico agiscono come antiossidanti molto deboli. Tuttavia, l'attività
antiossidante aumenta notevolmente nel caso dei derivati degli diidrossilati o triidrossilati e il
loro effetto antiossidante dipende inoltre dalla posizione relativa dei gruppi OH nell'anello
aromatico. Così, l`acido gallico (acido 3,4,5-triidrossibenzoico) è considerato l'antiossidante più
potente tra tutti gli acidi idrossibenzoici (Rice Evans et al., 1996).
Gli acidi cinnamici sono abbondanti nelle fonti naturali e sono stati identificati anche nel
miele di api (Gheldof et al., 2002; Dimitrova et al., 2007). I più abbondanti sono: l'acido
caffeico, felúrico e cumarico (e suoi isomeri orto, meta e para) le cui strutture sono mostrate
nella Figura 8 C.
21
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
in C:
i)
ii)
iii)
iv)
v)
R2,R3,R4-H,R1-OH o-cumarico
R1,R3,R4-H,R2-OH m-cumarico
R1,R2,R4-H,R3-OH  p-cumarico
R1,R4-H, R2,R3-OH caffeico
R1,R4-H,R2-OCH3,R3-OHferulico
Figura 8. Strutture di acido benzoico (A), fenileacetico (B) e cinnamico (C) (Rice-Evans et al.,
1995). Le strutture dei vari acidi cinnamici sono mostrati in 8 C.
Rispetto ai loro omologhi derivati dall’ acido benzoico o fenilacetico, gli acidi cinnamici
hanno una maggiore capacità di catturare i radicali liberi e questo sembra essere correlato alla
presenza della catena insatura legata al gruppo carbossilico, che conferisce stabilità per risonanza
al radicale fenossile (ArO) (Kikuzaki et al., 2002). Inoltre, l'esistenza di diversi gruppi donatori
di elettroni nella struttura dell’ anello benzenico (come i gruppi idrossili o metossi nella strutture
iv e v della Figura 8 C) fornisce anche il maggior numero di strutture di risonanza e aumenta la
stabilità del radicale ArO negli acidi cinnamici, favorendone così le proprietà antiossidanti
(Graf, 1992; Kanski et al., 2002).
L'identificazione degli acidi fenolici e le loro caratteristiche antiossidanti nel miele sono
state segnalate da diversi autori. Nel miele di Leptospermum scoparium della Nuova Zelanda,
Yao et al. (2003) ha dimostrato che l'acido gallico è il principale costituente, come nel caso del
miele di eucalipto dell'Australia (Yao et al., 2004). Inoltre, lo stesso autore ha evidenziato la
presenza di acido gallico e acido cumarico nei campioni di Leptospermum polygalifolium, dove
ha anche identificato l'acido ellagico, clorogenico, caffeico, siringico e felurico (Yao et al.,
2003). Gheldof et al. (2002) hanno trovato cinque acidi fenolici (acido vinile, siringico, pcumarico, cinnamico, p-idrossibenzoico) come agenti responsabili della attività antiossidante
esibita da estratti di miele provenienti da diverse origini botaniche (Epilobium angustifolium;
Nyssa aquatica; Schinus terebinthifolius; Glycine max; Melilotus spp y Robinia pseudoacacia).
Oltre ai composti fenolici, è stata recentemente prestata attenzione ai carotenoidi, come
potenziali agenti che contribuiscono all’ attività antiossidante, in particolare nei mieli scuri. In
questi composti, il sistema di doppi legami coniugati funge da substrato per l'attacco di radicali
liberi, conferendo la capacità di intrappolare le specie ossidanti (Krinsky, 1993). Nei mieli del
Portogallo, è stata studiata la composizione dei carotenoidi, constatando che il miele classificato
come miele scuro (scala Pfund) risulta essere quello con la più alta concentrazione di carotenoidi
22
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
totali, nonché quello con la più elevata capacità di intercettare il radicale 1 ,1-difenil-2picrylhidracyl (DPPH •) (Ferreira et al., 2008).
I.4.3. Effetti fisiologici del miele ed sulla salute umana.
I.4.3.1. Attività antibatterica.
I fattori responsabili dell’ attività antimicrobica del miele sono l´osmolarità, l' elevata acidità
e, soprattutto, il perossido di idrogeno (Bogdanov, 1997) che si forma dall’ ossidazione del
glucosio da parte dell'enzima glucosio ossidasi, durante la maturazione del miele (Weston et al.,
1998). Ê stato dimostrato recentemente che quando il perossido di idrogeno viene rimosso con
l'aggiunta di una catalasi, alcuni mieli mostrano ancora una significativa attività antibatterica
(D'Arcy, 2005) e questa capacità è stata definita come attività antibatterica non mediata dal
perossido, legata invece alla presenza di “fattori non-perossido” come acidi fenolici e flavonoidi
(Taormina et al., 2001). Bogdanov (1997) ha suggerito che la maggior parte dell’ attività
antibatterica non-perossidica del miele può essere dovuta all’operosità delle api, mentre una
parte può anche essere dovuta all’ origine vegetale; Wahdan (1998) inoltre ha suggerito che i
flavonoidi e gli acidi fenolici potrebbero anche essere una parte importante dell’ attività
antibatterica del miele.
L'attività antibatterica mediata dai fattori non-perossidi è meno sensibile al calore e alla luce
rispetto al perossido di idrogeno e quindi rimane invariata dopo la conservazione del miele per
lunghi periodi. Di conseguenza, alcuni autori hanno trovato che l'attività antibatterica mediata
dai composti non-perossidi è più importante rispetto a quella del perossido di idrogeno proprio in
termini di effetti antibatterici (Taormina et al., 2001). Tuttavia, il contributo alle propietà
antibatteriche dei composti non-perossidi alla attività antibatterica totale del miele può esssere
inferiore a quella del perossido di idrogeno (Weston et al., 2000). Così, per ottimizzare l`attività
antibatterica, viene consigliato di conservare il miele in un luogo fresco, al buio e da consumare
preferibilimente quando il prodotto è ancora fresco.
Diversi studi hanno riportato una significativa attività antibatterica del miele contro vari
agenti patogeni coinvolti nelle varie infezioni, in relazione alla loro origine floreale. Il miele di
Manuka (Leptospermum scoparium), proveniente dalla Nuova Zelanda, ha dimostrato un’
elevata capacità antibatterica, attribuibile interamente alla presenza dei composti non-perossidi
(Russell et al., 1990; Weston, 2000). Pertanto, l'attività antibatterica del miele sembra essere
fortemente influenzata dalla sua composizione, dall’attività dell'ape e dall’ origine floreale.
23
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
I.4.3.2. Attività antiossidante.
L’ attività antiossidante, o più semplicemente capacità antiossidante, è la capacità presente
nel miele di ridurre le reazioni ossidative nei sistemi alimentari e nella salute umana. In
particolare, queste reazioni di ossidazione possono causare danni nocivi nei prodotti alimentari
(ad esempio, l'ossidazione dei lipidi nella carne e la degradazione enzimatica di frutta e verdura)
e per la salute, come le malattie croniche e tumori (Gheldof et al., 2002; Gheldof et al., 2003).
Gli antiossidanti che si trovano naturalmente nel miele, come flavonoidi, acidi fenolici, alcuni
enzimi (ad esempio, glucosio ossidasi, la catalasi), acido ascorbico, carotenoidi, acidi organici,
prodotti di reazione di Maillard, aminoacidi e proteine (Frankel et al., 1998; Gheldof &
Engeseth, 2002; Aljadi & Kamaruddin, 2004; Vela et al., 2007; Estevinho et al., 2008) possono
contribuire alla sua capacità antiossidante.
L'influenza del miele sulla capacità antiossidante nel plasma è stata evidenziata in numerosi
lavori. Uno studio recente ha sottolineato che il consumo di miele di diversa origine floreale con
diversa capacità antiossidante, in una dose di 1.5 g/kg di peso corporeo, è in grado di provocare
un aumento della capacità antiossidante nel siero dei soggetti con dieta arricchita di miele,
rispetto ai controlli che consumavano solo zucchero. Un secondo studio riporta che il consumo
giornalero di 1.2 g/ Kg di miele in volontari sani ha aumentato la concentrazione plasmatica del
β-carotene del 3% e della glutatione reduttasi del 7% (Al-Waili, 2003). Questi dati supportano
l'ipotesi che gli antiossidanti fenolici del miele sono biodisponibili e capaci di aumentare
l'attività antiossidante del plasma.
D’ altra parte, è stata studiata anche l'attività protettiva del miele proveniente da diverse fonti
floreali in una linea di coltura di cellule endoteliali (EA.hy926) sottoposte a stress ossidativo. I
risultati riportati da questo studio mostrano che il miele provoca una significativa
soppressione/prevenzione del danno cellulare, un’inibizione totale dell’ ossidazione delle
membrane cellulari, della produzione di ROS intracellulari e del recupero di GSH intracellulare
(Beretta et al., 2007). Può essere quindi ipotizzato che le sostanze fitochimiche presenti nel miele
potrebbero aumentare le difese contro lo stress ossidativo e potrebbero anche essere in grado di
proteggere l'uomo, creando così una barriera antiossidante potenzialmente protettiva. Dato che
l'assunzione media di dolcificante è stimata oltre 70 kg all'anno, la sostituzione di dolcificanti
tradizionali con il miele in alcuni alimenti potrebbe portare ad un miglioramento del sistema di
difesa antiossidante negli adulti sani (Al-Waili, 2003).
24
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
I.4.3.3. Attività antimutagenica, antitumorali e anti-infiammatori.
E' stato dimostrato che il miele riduce l'infiammazione della pelle, l’edema e l’ essudazione,
favorisce la guarigione delle ferite, riduce le dimensioni della cicatrici e stimola la rigenerazione
dei tessuti (Molan, 2001).
La sua attività antimutagenica è stata riportata in passato da diversi autori. Hamzaoglu et al.
(2000) hanno riferito che in ratti la presenza di tumori è stata notevolmente ridotta mediante
l`applicazione di miele prima e dopo l’operazione, suggerendo quindi che l`azione chimico-fisica
(diminuzione di ossigeno nella zona del tumore, cioè l èffetto anti-angiogenico) e l`effetto degli
antiossidanti presenti possano prevenire la diffusione delle cellule metastatiche (Hamzaoglu et
al., 2000). Fino al 1990, l'azione chemiopreventiva del miele è stata attribuita al suo contenuto in
perossido di idrogeno, attraverso l'induzione dell’ apoptosi delle cellule, ma recentemente è stato
scoperto un ruolo importante anche per i fitochimici con azione antiossidante, che possono agire
in sinergia o indipendentemente dal contenuto di H2O2 (Bang et al., 2003). Il miele, come
esposto precedentemente, contiene una serie di sostanze chimiche dotate di un’ importante
capacità antiradicalica/antiinfiammatoria, che sono in grado di svolgere un ruolo rilevante, da
sole o in combinazione, nella capacità antitumorale e antiinfiammatoria del miele (Facino, 2001).
Gli effetti antitumorali sembrano essere dovuti ad un processo multifattoriale, che comprende: (i)
produzione di H2O2 citotossica (e dei radicali HO dopo reazione di Fenton) (Facino, 2001); (ii)
inibizione diretta della COX-2 da parte di alcuni componenti specifici (crisina e l`acido caffeico,
CAPE) (Michaluart et al., 1999); e (iii) azione di scavenger nei confronti di diverse specie
reattive dell'ossigeno (ROS) responsabili di indurre l’ infiammazione (Greten et al., 2004).
Composti con un importante effetto nutrizionale sulla salute sono i carboidrati, che ne fanno
una fonte eccellente di energia, specialmente per i bambini e gli sportivi. Oltre alle sue
componenti principali, fruttosio e glucosio, il miele contiene anche un gran numero di altri
componenti in piccole quantità, con importanti effetti nutrizionali e biologici: attività
antimicrobica, antiossidante, antivirale, antiparassitarie, antinfiammatorie, antimutagenica,
antitumorali ed immunosoppressivi. Tutte queste qualità rendono il miele un alimento da
approfondire, soprattutto per quanto concerne il suo effetto potenziale sulla salute e sulla
nutrizione umana: è proprio questo che abbiamo voluto esaminare con il presente lavoro.
25
_______________________________________________CAPITOLO I: INTRODUZIONE
I.5- Scopo dello studio
Il primo obiettivo dello studio è stato valutare e confrontare la qualità nutrizionale di cinque
tipi di miele uniflorale cubano, mediante diversi tipi di tecniche che misurano parametri standard
di valore nutritivo (polifenoli totali, flavonoidi, proteine, caroteni, acido ascorbico, etc.), così
come identificare e quantificare gli acidi fenolici e flavonoidi, potenzialmente responsabili
dell’effetto antiossidante del miele .
Inoltre ne è stata determinata l’attività antiossidante totale in vitro utilizzando vari metodi;
parallelamente a ciò è stata anche studiata la capacità del miele di scavenger i radicali OH e il
radicale O2 , al fine di approfondire questo lavoro per quanto riguarda i meccanismi molecolari.
Come secondo obiettivo, e anche come complemento allo studio in vitro dell’ attività
antiossidante, è stato condotto un esperimento in modelli più complessi, per determinare se il
miele e i suoi flavonoidi siano in grado di proteggere contro lo stress ossidativo.
A tal fine è stato scelto l`omogenato di fegato di ratto con lo scopo di determinare la
capacità di protezione nei confronti di biomolecole (lipidi) contro il danno ossidativo. In questa
sezione sono stati condotti tre studi:
(i) Determinazione dell’ inibizione della formazione di sostanze reattive di acido
tiobarbiturico (TBARS), nel modello della perossidazione lipidica spontanea;
(ii) Determinazione dell’ inibizione della formazione di TBARS, nel modello della
perossidazione lipidica indotta dal sistema FeSO4 e acido ascorbico;
(iii) Studio della formazione degli idroperossidi lipidici.
Parallelamente sono stati anche selezionati i globuli rossi umani come modello cellulare, per
indagare il possibile effetto protettivo contro lo stress ossidativo del miele e i suoi flavonoidi
sulla struttura delle membrane cellulari.
In questo caso sono stati condotti due studi:
(i)
Studio dell’ effetto protettivo contro l`emolisi spontanea e indotta dalla presenza di
un ossidante (AAPH);
(ii)
Studio della suscettibilità dei lipidi di membrana eritocitaria alla perossidazione.
Pertanto, riteniamo che gli obiettivi proposti in questa ricerca, sebbene in maniera
relativamente semplificata, potrebbero soddisfare i requisiti di base per la ricerca rivolta alla
valutazione della attività antiossidante di un particolare prodotto naturale (Aruoma, 2003).
26
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
II.1- Animali da laboratorio, reagenti e campioni di miele
II.1.1- Animali da laboratorio
Per la preparazione di omogenati di tessuto epatico (punto II.5) sono stati utilizzati ratti
maschi Wistar con un peso medio di 190 g. Gli animali sono stati ottenuti dal Servizio di
Allevamento e Sperimentazione Animale dell’I.N.R.C.A. di Ancona. I ratti sono stati tenuti in
condizioni sperimentali controllate con cicli di 12 ore di luce e 12 ore di buio, ad una
temperatura costante di 25 ºC e umidità del 60%; sono stati adattati alla struttura per almeno 7
giorni prima dell`esperimento ed alimentati ad libitum (mangime 25/18 CR GLP, Italia e acqua).
Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le regole di lavoro con gli animali da esperimento
contenute nel Codice di Pratica per l'uso di animali da esperimento utilizzato dall’ I.N.R.C.A.
II.1.2- Reagenti
L´AAPH (2,2'-azobis (2-amidinopropano) idrocloruro), MeOH, (+)-catechina, acido gallico,
Folin-Ciocalteau, Na2CO3, saccarosio, maltosio, fruttosio, glucosio, L-leucina, ninidrina, cadmio,
Coomassie Brilliant G-250, albumina sierica bovina (BSA), β-carotene, Amberlite XAD-2,
l´acido p-coumarico, quercetina, fluoresceina, acido 6-idrossi-2,5,7,8-tetramethylchromane
acido-2-carbossilico (Trolox), 2,4,6-tripyridyl-s-triazina (TPTZ), acido 3-ethylbenzothiazoline-6solfonico (ABTS), ipoxantina, xantina ossidasi, EDTA-Na, superossido dismutasi, Xylenol
Orange sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Chemical Co. (Milano). 5,5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide (DMPO) é stato acquistato da Enzo Life Science AG (Lausen, Svizzera) mentre il
KH2PO4 e l´ammonio solfato ferroso sono stati acquistati da Fluka Biochemie (Svizzera).
II.1.3- Campioni di miele
Cinque tipi di mieli uniflorali provenienti dalla regione centrale di Cuba sono stati ottenuti
tramite il Centro Nazionale di Ricerca sull’Apicoltura di Cuba. Le fonti floreali e il numero di
campioni prelevati sono stati: (18) Christmas vine (Turbina corymbosa (L.) Raf), (16) Morning
glory (Ipomoea triloba L.), (16) Black mangrove (Avicennia germinans Jacq.), Linen vine
(Govania polygama (Jack) Urb), Singing bean (Lysiloma latisiquum (L.) Benth). Questi
campioni sono stati raccolti tenendo presente il periodo dell'anno e i luoghi in cui ogni campione
di miele è stato preso; sono stati poi certificati come uniflorali dal Centro Nazionale di Ricerca
della Apicoltura di Cuba. L`analisi quantitativa e la determinazione della frequenza e del tipo di
grani di polline sono state eseguite come descritto in precedenza da Louveaux et al. (1970).
Le diverse morfologie polliniche sono state confrontate con le diapositive di riferimento nell’
Istituto di Ecologia e di Sistematica dell’ Università dell'Avana, Cuba. Inoltre, a confermare che
27
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
tutti i parametri si trovavano entro i valori ammissibili secondo le norme internazionali di qualità
(EU, 2001; Codex Alimentarius, 2001), i campioni sono stati testati per le loro caratteristiche
organolettiche (sapore e profumo) ed i test fisico-chimici di routine [ceneri (%), conducibilità
elettrica (mS / cm), colore (mm Pfund), pH, acidità libera (meq / kg) e umidità (%)] (AAOC,
1990). Inoltre, sono stati effettuati il test per la valutazione dell’ indice di diastasi (U Schade),
per la quantificazione della autenticità, e il test di HMF (mg/Kg) per la qualità. I campioni (250
grammi) sono stati sigillati in bottiglie di vetro ambrato e conservati a 4 ºC al buio. Prima di ogni
esperimento, essi sono stati lasciati a temperatura ambiente per una notte.
II.2- Preparazione della soluzione di miele artificiale
Per valutare ed eliminare le interferenze causate dagli zuccheri predominanti nel miele
(punto II.4) è stata preparata una soluzione chiamata "miele artificiale" in base alla metodologia
descritta da Cooper et al. (2002). A tal fine, 1.5 g di saccarosio, 7.5 g maltosio, 40.5 g di
fruttosio e 33.5 g di glucosio sono stati disciolti in 17 ml di H2O deionizzata. La soluzione è
stata allestita all’ inizio delle analisi e tenuta al buio a 4 ° C per tutto il periodo dello studio, alle
stesse condizioni dei campioni.
II.3- Studio dei composti antiossidanti nel miele
II.3.1- Determinazione del contenuto totale di polifenoli
La concentrazione totale di fenoli è stata misurata attraverso il metodo spettrofotometrico
Folin- Ciocalteau descritto da Singleton et al. (1994). Ogni campione di miele è stato sciolto in
H2O distillata (1g in 10 ml) e filtrato attraverso una membrana Minisart (PBI International) di 45
µm di diametro di poro. La miscela di reazione consisteva di 2.5 ml di 0.2 N del reagente FolinCiocalteu, a cui sono stati aggiunti 0.5 ml di soluzione di miele. Dopo 5 minuti di incubazione a
T = 37 °C, sono stati uniti 2 ml di soluzione di Na2CO3 0.7 M e quindi una seconda incubazione
per 2 ore a T = 37° C al buio. In questo esperimento è stata utilizata una soluzione di miele
artificiale (punto II.2) alla stessa concentrazione dei campioni analizzati, al fine di eliminare le
interferenze che potrebbero provocare gli zuccheri predominanti nel miele. Infine, l'assorbanza è
stata monitorata a 760 nm in uno spettrofotometro Beckman DU-640 (Beckman Instruments,
Fullerton, CA, USA), utilizzando una curva di calibrazione di acido gallico (GA) come standard
(50-300 mg/L). I risultati sono stati espressi in milligrammi equivalenti di acido gallico per
kilogrammo di miele (mg GAE/kg).
28
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
II.3.2- Determinazione del contenuto totale di flavonoidi
Il contenuto totale di flavonoidi è stato determinato tramite il metodo colorimetrico proposto
da Chia-Chi et al. (2002). A tal fine, sono stati utilizzati 125 μl della soluzione di miele in H2O
distillata (50% w/v). In seguito sono stato aggiunti 1.25 ml di H2O distillata e 75 ml di soluzione
di NaNO2 al 5%. La miscela è stata lasciata ad incubare a T = 37 °C per 6 minuti e poi sono stati
uniti 150 ml di soluzione AlCl3. 6H2O al 10%; a questo punto è stata effettuata una seconda
incubazione per 5 minuti, alle stesse condizioni di cui sopra. Successivamente, è stato aggiunto
0.5 ml di NaOH 1 mol/L, ed infine la miscela di reazione è stata riportata ad un volume finale di
2.5 ml con H2O distillata . L'assorbanza è stata misurata immediatamente ad una lunghezza
d'onda di 510 nm in uno spettrofotometro Beckman DU-640 (Beckman Instruments, Fullerton,
CA, USA) contro un bianco costituito da una miscela di reagenti di cui sopra in proporzioni
uguali, tranne per il campione di miele, nel cui caso è stato sostituito interamente con H2O
distillata. La curva di calibrazione è stata eseguita utilizzando uno standard di (+)-catechina
(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germania) (5-50 mg/L). I risultati sono stati espressi in
milligrammi equivalenti di catechina per kilogrammo di miele (mg CE/Kg).
II.3.3- Determinazione del contenuto totale di aminoacidi liberi
Il contenuto totale di amminoacidi liberi (azoto amino) è stato determinato utilizzando il
metodo colorimetrico con il reagente ninidrina-cadmio descritto da Doi et al. (1981). La
soluzione di reazione consisteva di 0.8 g di ninidrina disciolta in una soluzione di 80 ml di
etanolo al 99.5 % e di 10 ml di acido acetico, a cui è stato aggiunto di 1.24 g di CdCL2 · H2O in
1 ml di acqua distillata. Ogni campione di miele (1.25 g) è stato sciolto in 25 ml di H2O
distillata;
1 ml di questa soluzione è stato poi unito alla miscela di reazione (per un volume
finale di 2 ml), quindi prima riscaldato a T = 84 °C per 5 minuti e poi raffreddato su ghiaccio.
Successivamente è stata monitorata l'assorbanza a 507 nm in uno spettrofotometro Beckman
DU-640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) contro un bianco costituito da H2O +
reattivo. La curva di calibrazione è stata eseguita utilizzando uno standard di L-leucina (SigmaAldrich Chemie GmbH, Germania) (2.4-42 mg/L). Il contenuto totale di azoto amino è stato
espresso come mg equivalenti Leucina/100 g di miele (EL/100 mg/g).
II.3.4- Determinazione delle proteine totali
La determinazione delle proteine totali è stata effettuata secondo il metodo descritto da
Bradford (1976), utilizzando il reagente Coomassie Brilliant G-250 (CB G-250), basato sul
cambiamento di colore dal rosso al blu del CB G-250, una volta legato alle proteine nel
29
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
campione ed il cui prodotto è monitorato spettrofotometricamente alla lunghezza d'onda di 595
nm. La miscela reagente consisteva di una soluzione di 100 mg di CB-250 g in 50 ml di etanolo
al 95%, a cui sono stati aggiunti 100 ml di acido fosforico 85% (H3PO4); la soluzione risultante è
stata portata a volume finale di 1 L con l`aggiunta di acqua distillata. A questo reagente (5 ml) è
stato poi unito 0,1 ml di soluzione di miele (50% w/v, in H2O distillata). La miscela finale è
stata incubata per 2 minuti a T = 37 °C e l' assorbanza è stata determinata a 595 nm in uno
spettrofotometro Beckman DU-640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) contro un
bianco costituito da H2O + reattivo. La calibrazione del metodo è stata eseguita utilizzando la
curva standard di albumina sierica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germania)
(10-100 µg/0.1 ml) in una soluzione di NaCl 0.15 mol/L. Il contenuto totale di proteine del miele
è stato espresso in mg equivalenti BSA/100 g di miele (mg eq BSA/100 g).
II.3.5- Determinazione del contenuto di caroteni totali
La metodologia di estrazione e di quantificazione spettrofotometrica utilizzata per questi
composti è simile a quella descritta da Ferreira et al. (2009) con alcune modifiche. Per
l'estrazione dei caroteni 1 grammo di miele è stato aggiunto ad una soluzione di n-esano-acetone
(50:25 v/v), il tutto centrifugato a 200 giri/min per 10 minuti; il supernatante è stato poi rimosso
e filtrato attraverso un filtro di carta Whatman n. 4. L'assorbanza del filtrato è stato misurata a
450 nm in un spettrofotometro Beckman DU-640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA),
contro un bianco composto dallo stesso solvente usato per l'estrazione. La curva di calibrazione è
stata eseguita utilizzando uno standard di -carotene (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germania)
(0.015-0.6 mg/ml). Il contenuto totale di caroteni è stato espresso come mg equivalenti di carotene /Kg di miele (CE/kg).
II.3.6- Analisi del contenuto totale di Acido Ascorbico
Il contenuto di vitamina C nei mieli è stato analizzato tramite il sistema HPLC in fase
inversa, come riportato in precedenza dal nostro gruppo (Tulipani et al., 2008). Il campione di
miele (5g) è stato sciolto in 10 ml della soluzione di ditiotreitolo (4.2 mM in 0.1 M K2HPO4, pH
7.0) e mescolato accuratamente. Un millilitro di estratto è stato mescolato ad 1 ml di acido mfosforico al 4.5% e 20 μL sono stati iniettati nell’ HPLC. L'HPLC (Zhimadzu Coorpotation,
Kyoto, Japan) consiste in un controllatore Waters 600, un rivelatore a fotodiodi (PDA) Waters
996 fissato all' assorbanza di 262 e 244 nm ed un incubatore di colonna a T= 30 º C. La colonna
HPLC utilizzata è stata una YMC Pack Pro, 150x4.6 mm. Il gradiente lineare è stato generato
30
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
utilizzando 50 mM KH2PO4 (pH 4.5) (solvente A) e metanolo (solvente B) a partire dal 100% e
con un calo al 70% di A in 8 min. Il flusso è stato fissato a 0.8 ml/min.
II.3.7- Determinazione di metalli pesanti
Per la determinazione di metalli pesanti, i campioni di miele sono stati preparati utilizzando
aliquote pari a 500 mg, le quali sono state addizionate con 2 ml di H2O2 e 5 ml di HNO3
(puriss.p.a. plus 65%) in appositi contenitori per la mineralizzazione sotto pressione in forno a
microonde e lasciati riposare per 15 minuti. La mineralizzazione è stata condotta con un forno a
microonde Mars 5 CEM Corporation.
I campioni sono stati lasciati raffreddare fino a temperatura ambiente e portati a volume (10
ml) con acqua ultrapura. La prova del bianco reagenti è stata effettuata ad ogni ciclo di
mineralizzazione su soluzioni composte dai soli reagenti puri (2 ml di H2O2 + 5 ml di HNO3) e
processate con le stesse modalità operative utilizzate per la mineralizzazione dei campioni.
L’accuratezza delle determinazioni è stata controllata analizzando, con le stesse procedure
analitiche, materiale certificato standard di riferimento (NIST 2977, DORM-2). Le
concentrazioni degli elementi esaminati sono state quantificate in riferimento a curve di
calibrazione standard ottenute durante ciascuna sessione analitica, con soluzioni di standard puri.
I contenuti di arsenico (As), cadmio (Cd), cromo (Cr), rame (Cu), ferro (Fe), mercurio (Hg),
manganese (Mn), nichel (Ni), piombo (Pb) selenio (Se), vanadio (V) e zinco (Zn), sono stati
determinati
utilizzando
tecniche
di
spettrofotometria
ad
assorbimento
atomico.
La
strumentazione utilizzata è stata uno spettrofotometro ad assorbimento atomico con
atomizzazione elettrotermica ed effetto Zeeman (Varian, SpectrAA-300), spettrofotometro ad
assorbimento atomico con atomizzazione a fiamma (Varian, SpectrAA 220FS) e sistema per la
generazione di vapori freddi di mercurio ed idruri (Varian, VGA-76, Vapor Generator
Accessory). I risultati sono stati espressi come nanogrammi per grammo di peso secco, i valori
ottenuti dal materiale standard di rifermento sono sempre stati nell’ intervallo di confidenza del
95 % in confronto ai valori certificati.
II.3.8- Separazione, identificazione e quantificazione degli acidi fenolici e dei flavonoidi
II.3.8.1- Panoramica del frazionamento del miele in Colonna Cromatrografica di Amberlite
XAD-2
Il miele è stato frazionato secondo le metodologie descritte da Ferreres et al. (1991) per
questo tipo di matrice biologica, che viene presentata nella Figura 9.
31
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
Campione di miele (50 g)
Scioglere in H2O acida
(pH 2.1 HCl )
Cromatografia in Colonna di
Amberlite XAD-2
+ H2O acida
Zuccheri e composti polari
Frazione 1
+ H2O neutra
+ MeOH
nennenenenene
nenneutraneutra
l
Frazione 2
Composti fenolici meno polare
Estrazione
ether + etere/MeOH
neutral
Frazione 3
con etere
+ H2O
Frazione 4
Figura 9. Schema generale del frazionamento del miele in Colonna Cromatografia di Amberlite
XAD-2.
È stata utilizzata una colonna cromatografica di Amberlite XAD-2 (Sigma-Aldrich, Italia;
9 nm dimensione dei pori, 0.3-1.2 mm dimensione delle particelle), di 25 cm di lunghezza e 2 cm
di diametro come dimensione. La colonna è stata inizialmente lavata con MeOH, MeOH: H2O
(3:1), MeOH: H2O (1:1) e H2O, con l`obiettivo di stabilizzarla. Ogni campione di miele (50 g) è
stato sciolto in 250 ml di H2O acida (pH 2 con HCl) e filtrato attraverso il cotone, per rimuovere
le particelle solide, e poi caricato sulla colonna cromatografica. Quest’ultima è stata lavata con
una soluzione di H2O acida (pH 2 con HCl, 250 ml) (Frazione 1) e poi con acqua neutra
distillata (300 ml) (Frazione 2), in cui i composti fenolici sono stati conservati, mentre gli
zuccheri e altri composti sono stati eluiti con il solvente polare acquoso. In seguito, la frazione
fenolica è stata eluita con ~ 300 ml di metanolo, fino ad ottenere un eluato incolore privo di
fluorescenza ai raggi UV della lunghezza d'onda di 340 nm. Successivamente, questa frazione è
stata concentrata a pressione ridotta (0.8 Mpa, 40 °C) in un evaporatore rotante Büchi R-114
(Donau, Flawil, Svizzera). Il residuo risultante è stato dissolto di nuovo in 5 ml di H2O distillata
ed estratto per tre volte con etere etilico (5 ml), al fine di purificare i composti fenolici. Gli
estratti eterei sono stati raccolti, concentrati a pressione ridotta, dissolti in 0,5 ml di metanolo e
conservati a -80 °C, fino al momento dell'analisi. Le frazioni rimanenti raccolte [H2O acida
32
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
((Frazione 1), H2O neutra (Frazione 2) e la fase acquosa dopo l'estrazione con etere etilico] sono
state conservate a -20 ° C per le analisi successive. Per determinare il recupero del metodo è stata
eseguita la metodologia descritta da Tomas-Barberán et al. (1993) e Ferreres et al. (1994) con
l`utilizzo di uno standard interno (hesperetina) indicato nel punto II.3.8.4. Ogni campione di
miele è stato frazionato in triplicato.
II.3.8.2- Identificazione e quantificazione degli acidi fenolici e flavonoidi tramite il sistema
HPLC-DAD-ESI-MS-Mn
L'analisi della composizione polifenolica del miele è stata eseguita tramite una doppia
rilevazione on-line, mediante cromatografia liquida ad alta pressione collegata alla spettrometria
di massa (HPLC-DAD-ESI-MSn), in base alla metodologia descritta da Ferreres et al. (1991) con
alcune modifiche.
Per la separazione cromatografica è stato utilizato un HPLC (Hewlett-Packard 1100, Series
Instrument) dotato di una pompa quaternaria (HP G1312A), degasser (HP G1322A), iniettore
automatico (HP G1313A), sistema di termostatazione di colonna e un sistema rilevatore di diodi
integrato (HP G1315A), dotato di una cella di flusso ad alta pressione con collegamento ad uno
spettrometro di massa. Il sistema è stato accoppiato ad una stazione di controllo e di elaborazione
di dati Hewlett-Packard HP Chemstation (Rev. A.05.04) per cromatografia liquida. Come fase
stazionaria è stata utilizzata una colonna C18 LiChroCART, (Merck, Darmstadt, Alemania) (RP18e, 250 mm × 4 mm; 5 μm di dimensione dei pori), termostatata a 35 ºC. Come fase mobile è
stato utilizzato un gradiente binario composto da H2O/acido formico (99:1 v/v) (solvente A) e
metanolo/isopropanolo (90:10 v/v) (solvente B). Il gradiente di eluizione è stato stabilito a
partire da 10% B in A per arrivare a 30% B in A a 20 min, 40% B in A a 30 min, 60% B in A a
40 min, 80% B in A a 45 min e infine isocratico per 5 min. Sono state iniettate 100 µL del
campione ad un flusso continuo di 1 ml/min. I cromatogrammi sono stati registrati a 290, 320,
340 e 360 nm.
L´analisi di spettrometria di massa è stato effettuata su uno spettrometro LCQ (Thermoquest,
San José, USA) dotato di una sorgente di ionizzazione a pressione atmosferica (API), utilizzando
un’ interfacccia di ionozzazione per electrospray (ESI) e un rivelatore a trappola ionica,
collegato ad un stazione di trattamento di dati X-caliburTM (versione 1.2). Le condizioni del
metodo sono state ottimizzate usando lo standard di acidi fenolici e di flavonoidi. La temperatura
e il voltaggio del capillare sono stati 225 °C e 10 kV, rispettivamente. Come sheath e auxiliary
gas è stato utilizzato azoto, ad un flusso di 6 L/min e 1.2 L/min, rispettivamente. Il gas di
33
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
collisione è stato l´elio e l’ energia di collisione normalizzata è stata del 45%. Gli spettri di
massa sono stati registrati in modalità sia ion positiva che negativa nell'intervallo di m/z
compreso tra 100 e 800. Il rivelatore è stato programmato per eseguire una serie di tre scansioni
consecutive, la prima in modalità full scan, la seconda MS2 ed infine la terza MS3. Inoltre, lo
strumento è stato programmato con il metodo di esclusione dinamico, in maniera tale che dopo
che lo ione molecolare più abbondante viene frammentato per tre volte, vengano selezionati gli
ioni molecolari successivi, secondo la loro abbondanza.
L'identificazione degli acidi fenolici e dei flavonoidi è stata effettuata dal confronto dei tempi
di ritenzione, dagli spettri UV-Vis e dagli spettri MS (positive e negative mode) rispetto a
standard esterni, che sono stati preparati ad una concentrazione di 1 mg/ml.
II.3.8.3- Quantificazione degli acidi fenolici e dei flavonoidi mediante HPLC-DAD
Gli acidi fenolici e i flavonoidi presenti nel miele sono stati quantificati per mezzo del
confronto con gli standard esterni di quercetina (per i flavonoidi) e di acido p-coumarico (per gli
acidi fenolici). La quantificazione di ciascuno dei composti è stata effettuata mediante
l’integrazione dei picchi cromatografici ottenuti a 290 nm, nel caso degli acidi fenolici e a 360
nm per i flavonoidi e la sostituzione dei valori dell’ area nella retta di calibrazione.
La soluzione madre degli standard utilizzati per la quantificazione è stata preparata ad una
concentrazione iniziale di 1 mg/ml; da qui è stata allestita una soluzione multicomponente nel
range di 20-120 µg/ml per ciascun composto. La costruzione delle curva standard è stata eseguita
utilizzando la versione del software SPSS 13.0 per Windows, ottenendo in tutti i casi i
coefficienti di regressione sopra 0.99. I risultati sono stati espressi in µg/100 g di miele.
II.3.8.4- Calibrazione, limite di rilevamento e recupero degli standard utilizzati con il
metodo di frazionamento per colonna cromatografica di Amberlite.
Il limite di rilevamento è definito come la più piccola quantità di analita presente in un
campione che può essere identificata, ma non necessariamente quantificata con un valore esatto.
Per calcolare i limiti di rilevamento è stata eseguita la procedura descritta da Glaser et al. (1981).
A tal fine, è stata analizzata una soluzione multicomponente in concentrazione da due a cinque
volte il limite previsto di rilevamento, almeno sette volte consecutive. Il calcolo del limite di
rilevamento viene fatto moltiplicando il valore statistico del test ¨t¨ studente, per 6 gradi di
libertà e di un livello di confidenza del 99%, con la deviazione standard di sette determinazioni
analitiche, come illustra la seguente equazione:
L.R = t x (D.E)
34
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
Dove:
L.R = limite de rilevamento
t = 3.14 (per sette determinazioni)
D.E = deviazione standard
Nella tabella 2 sono mostrati i valori di linearità ed i limiti di rilevamento degli standard utilizzati.
Tabella 2. Calibrazione e limiti di rilevamento degli standard utilizzati.
Standard
Limiti di
calibrazione (µg/ml)
Retta di calibrazione
R2
L.R. (µg/100g
miele)
Ácido p-cumárico
20 - 150
y = 370.58 + 54.454
0.9986
0.27
Quercetina
20 - 120
y = 58.285 – 533.71
0.9994
0.50
II.3.8.5- Recupero del Metodo
Il recupero di un metodo viene definito come la capacità di determinare esattamente la
quantità di una specie chimica che è stata aggiunta al campione. Per determinare la possibile
perdita dei composti di interesse durante il processo di frazionamento è stato eseguito il metodo
descritto da Tomas-Barberán et al. (1993) e Ferrero et al. (1994). Per questo scopo, ad ogni
campione da analizzare è stato introdotto, prima del processo di frazionamento, uno standard
interno di esperetina della concentrazione nota di 1 mg/ml; in tal modo è stato raggiunto un tasso
di recupero del 95% della stessa (tale percentuale è valida per questa metodologia secondo gli
autori di cui sopra). Questo valore di recupero è stato preso in considerazione al momento di
quantificare i composti identificati nella sezione II.3.8.3.
II.4- Caratterizzazione in vitro della attività antiossidante totale del miele: studio
della capacità di scavenger dei radicali liberi
II.4.1- Determinazione della capacità di assorbimento dei radicali liberi dell'ossigeno
(ORAC)
Il metodo si basa sulla generazione di radicali liberi per mezzo di 2-diazobis-2'dihydrochloride (2-amidinopropano) (AAPH) e la fluorescenza emessa dalla fluoresceina una
volta ossidata da questi (Figura 10).
La capacità del campione di intrappolare i radicali liberi dell'ossigeno è calcolata in base alla
fluorescenza emessa dall’ indicatore, una volta ossidato. Lo studio è stato condotto in conformità
35
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
con la metodologia proposta da Gillespie et al. (2007) utilizzando una piastra da 96 pozzetti.
Tutti i reagenti sono stati preparati in tampone fosfato (pH 7; 75 mM).
Figura 10. Reazione di ossidazione della fluoresceina
Il campione di miele è stato opportunamente diluito in tampone fosfato, in modo da raggiungere
una concentrazione finale di 1 mg/ml. La miscela di reazione consisteva in 150 µL di
fluoresceina (0.08 micromol/L) e 25 µl di soluzione di miele, preincubata per 10 minuti a 37 °C;
successivamente sono stati aggiunti 25 µL di AAPH 150 mmol/L. Una volta che l’ AAPH è stato
unito, la piastra è stata agitata per 3 secondi e subito dopo è stata misurata la fluorescenza ogni 2
min per 120 min a lunghezze d'onda di emissione e di eccitazione di 565 nm e 540 nm,
rispettivamente, da un lettore fluorescenza micro-plate ( Synergy TM Multi-Detection Microplate
Reader, Bio-Tek ®, Instruments, Inc., USA), mantenuto a 37 °C e controllato dal software
BioTek Gen5 ™. Il metodo di taratura è stato eseguito utilizzando il Trolox come standard (6.2550 µM). Le misure della fluorescenza sono state normalizzate rispetto al bianco (tampone
fosfato, 75 mmol/L); la curva di decadimento della fluorescenza è stata quindi calcolata in base
alla stessa area. I valori ORAC sono stati espressi come micromoli di Trolox equivalente per
grammo di miele (TE µmol/g).
II.4.2- Test di attività antiossidante totale utilizzando la capacità di ferro riduzione del
composto 2,4,6-tripyridyl-s-triazina (Fe3+- TPTZ)(FRAP)
Lo studio è stato condotto seguendo il protocollo descritto da Benzie & Strain (1996). Il
principio del metodo si basa sulla riduzione di composti di ferro 2,4,6-tripyridyl-s-triazina (Fe3 +TPTZ) nella loro forma colorata (Fe2 +-TPTZ) in presenza di un antiossidante; tali composti
presentano il loro massimo assorbimento alla lunghezza d'onda di 593 nm. Il reagente (FRAP) è
stato preparato quotidianamente e conservato a temperatura ambiente e al buio. Lo stesso è stato
per 2.5 ml di una soluzione composta da TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazina) 10 mmol/L in HCl 40
mmol/l, 2.5 ml di FeCl3 20 mmol/l e 25 ml di tampone acetato 0.3 mol/l (3.1 g NaC2H3O2, 16 ml
36
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
di CH3-COOH, pH 3.6). Ogni campione di miele è stato sciolto in acqua distillata, a questa
soluzione sono stati aggiunti 100 μl della miscela di reazione, fino alla concentrazione di 10
mg/ml. Dopo 10 minuti d`incubazione a T = 37 °C al buio, l'assorbanza della miscela è stata
determinata in uno spettrofotometro Beckman DU-640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA,
USA) a 593 nm contro un bianco costituito da acqua distillata + reagente. Il metodo di taratura è
stato eseguito utilizzando il Trolox come standard (Fluka Chemie, Svizzera) (50-200
micromoli/L) e l’ ammonio solfato ferroso (Fluka Biochemie, Svizzera) (50-250 micromoli/L).
I risultati sono stati espressi come micromoli equivalenti di Trolox e ammonio solfato ferroso
in100 g di miele, rispettivamente.
II.4.3- Determinazione della TAC secondo metodo FIA - ABTS
II.4.3.1- Principi del metodo TEAC (Trolox Equivale Antioxidant capacity)
Il saggio TEAC si basa sull’abilità di molecole antiossidanti di estinguere il radicale catione
ABTS.+, un cromoforo di colore blu-verde, prodotto dalla reazione della forma cromogena
incolore ABTS con un agente ossidante (soluzione acquosa di K2S2O8).
La soluzione radicalica ABTS.+ mostra tre massimi di assorbimento: a 660, 734 e 820 nm
(caratteristico assorbimento valutato a 734 nm). Gli antiossidanti presenti nel campione da
analizzare, se aggiunti ad una soluzione preformata e stabile del radicale catione, riducono il
radicale alla corrispondente molecola neutra non radicalica, ABTS, mediante una reazione di
elettron-donazione o idrogeno-donazione. Ne deriva un processo di decolorazione della soluzione
ABTS.+ , che potrà essere letto e quantificato a 734 nm e che risulta proporzionale alla quantità di
antiossidanti presenti ed efficienti nel campione in studio.
La capacità antiossidante totale del nostro campione biologico è stata valutata rispetto al
Trolox (standard), un analogo idrosolubile della vitamina E, con il quale si costruisce la curva di
calibrazione.
-O 3S
S
S
N N
N
Et
SO 3-
-O3S
-e
N
Et
ABTS
max342nm
S
N N
N
Et
S
+.
N
Et
SO3-
ABTS radicale catione
max734nm
Figura 11. Reazione di radicalizzazione dell’ABTS
37
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
Il metodo “classico” della colorazione dell`ABTS.+ è stato migliorato da Bompadre et al.
(2004), abbinandolo ad un sistema FIA (Flow Injection Analysis), proprio per renderlo più adatto
all`analisi dei campioni biologici.
Il sistema FIA assomiglia ad un sistema HPLC in cui la colonna di separazione viene
sostituita da un circuito composto da un tubo metallico di 1 mm di diametro e lungo 100 cm,
avvolto a serpentina, così da ottimizzare il mescolamento tra campione e reagente, oltre al
controllo costante della temperatura e del tempo di dispersione, durante il processo di
mescolamento.
Il campione di miele (ne sono sufficienti pochi microlitri) viene iniettato direttamente nel
flusso della soluzione radicalizzata, generato da idonee pompe (peristaltiche, HPLC, FPLC); la
miscela eluente raggiunge un detector adeguato, per terminare in un contenitore di scarico.
L`iniezione del campione può essere effettuata manualmente, caricandolo in una siringa che
viene poi introdotta nella valvola di iniezione, in modo da non interrompere la continuità del
flusso. Il loop istallato nella parte rotante del sistema di iniezione consente di introdurre un
volume preciso di campione, scartando il volume in eccesso.
Inoltre, attraverso il monitor del computer collegato al sistema, è possibile seguire, in tempo
reale, la variazione dell`assorbanza letta dal detector. L`effetto di scavenger del campione sulla
soluzione di ABTS.+ viene visualizzata da un picco “in negativo”, integrando le aree dei vari
picchi si ottengono i valori quantitativi della TAC del campione, confrontabili poi con la TAC di
soluzione standard di Trolox a concentrazione nota.
L`Apparato è stato constituito da una pompa Beckman modello 126 HPLC, un detector
Beckman UV/VIS modello 166, un iniettore manuale Rheodyne modello 7125 con valvola a
volume di campionamento fisso, un fornetto modello Beer 1000 P fornito dalla ditta Eurisco
Diagnostica srl (T° fornetto: 35°C) ed una serpentina per la reazione (Sigma- Aldrich) di
lunghezza 1 metro e di diametro 1 mm. Il Loop utilizzato è stato da 10 µL. Il sistema è collegato
ad un PC Olidata con una scheda di acquisizione analogica–digitale integrata e un software
SERIES 800 HRLC System v2.30a, Bio-Rad Laboratories che permette:
i)
il controllo e l’ integrazione dei parametri dello spettrofotometro;
ii)
la visione dei cromatogrammi e i dei valori delle aree sottese ai picchi.
Come reagenti sono stati utilizzati l’acqua bidistillata con valore di resistenza ~ 16–18
mΩ/cm, prodotta dallo strumento Elgastad UHQ PS della Elga e una soluzione di ABTS.+ (7
mM) radicalizzata con una soluzione di K2S2O8 (140 mM). Il rapporto stechiometrico tra ABTS
e K2S2O8, per ottenere la radicalizzazione completa, è 1:0.5. Si sceglie, tuttavia, di raggiungere
38
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
una radicalizzazione non completa (60%), al fine di ottenere una soluzione di lavoro più stabile.
Il radicale catione dell’ABTS si prepara, pertanto, facendo reagire circa 20 ml della soluzione
ABTS con 352 μl di soluzione K2S2O8: in queste condizioni il rapporto molare tra ABTS e
K2S2O8 è di 1:0.5, così da ottenere una radicalizzazione del 60%. L’ossidazione dell’ABTS
inizia immediatamente, ma si stabilizza dopo circa 12-16 ore; deve essere conservato al buio e a
temperatura ambiente. Pertanto la soluzione radicalizzata viene solitamente preparata il giorno
precedente l’analisi e risulta stabile per circa 48 ore.
Come fase mobile (soluzione di lavoro) è stata utilizzata una soluzione di tampone fosfato
salino 5 mM pH 7.4 (PBS), dove sono diluiti circa 9-10 ml della soluzione di ABTS.+, preparata
il giorno prima, e portati a un volume di 500 ml. La soluzione viene mantenuta al buio e posta in
ghiaccio; l’assorbanza dovrebbe stabilizzarsi intorno a 1-1.16.
I campioni di miele sono stati diluiti in H2O distillata (5 mg/ mL) e filtrata attraverso una
membrana Minsart (PBI International) 45 µm di diametro di poro. Sono stati iniettati poi 10 µL
di questa soluzione (5 mg/ml), che ha reagito con l' •ABTS+ soluzione, spinta nella pompa a un
tasso di flusso continuo fissato a 1,2 ml/min: ciò ha permesso un tempo di contatto di 1 minuto
tra il campione e la fase mobile; la lettura è stata effettuata alla lunghezza d'onda di 734 nm. Il
metodo di taratura è stato eseguito utilizzando Trolox come standard (Fluka Chemie, Svizzera)
(50-250 micromoli/L) ed i risultati sono stati espressi come micromoli equivalenti Trolox/100 g
di miele (micromol TE/100 g).
II.4.4- Determinazione della capacità di scavenger dei radicali OH
La capacità del campione di scavenger i radicali OH è stata testata attraverso
il sistema di generazione dei radicali ossidrili tramite la reazione di Fenton, seguendo il
protocollo descritto da Henriques et al. (2006) con l’ uso della tecnica EPR-spin trapping.
La miscela di reazione preparata in una provetta eppendorf consisteva in 150 μL di 0.1 M
DMPO (in acqua), 38 µl di miele opportunamente diluito in acqua (10 % w/v), in modo da
raggiungere una concentrazione finale di 3.8 mg/ml. La miscela è stata in seguito delicatamente
mescolata con una pipetta. A questa soluzione sono stati aggiunti 2 μl al 30% (v/v) di
H2O2 seguiti da 10 μl 0.05 M FeSO4, preparato al momento e matenuto sotto un flusso costante
di azoto, in modo da fare iniziare la reazione. La miscela di reazione è stata immediatamente
trasferita in una provetta e le misure sono stati effettuate 60 secondi dopo l'aggiunta del
FeSO4. Gli spettri EPR sono stati registrati su uno EPR spettrometro Bruker EMK (Bruker,
Karlsruhe, Germania), operato a X-Band, dotato di un misuratore delle frequenze di microonde
39
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
XL, con le seguenti impostazioni: frequenza 9,78 GHz, potenza 25 MW, modulazione di
ampiezza 0.5 G (Gauss), gain 5 x 105, campo di larghezza 100 G, costante di tempo 0.64 ms e un
tempo di scansione di 21 s. Come controllo positivo è stato utilizzato lo spettro EPR ottenuto da
una miscela di reazione contenente DMPO, H2O2 e FeSO4 analizzati alle stesse condizioni e
confrontato con quelli registrati dal composto addotto DMPO-OH in presenza del miele. I
risultati sono stati analizzati in relazione alla diminuzione dell’ ampiezza del segnale del
campione, in confronto con il controllo, in relazione all’ attività antiradicalica.
II.4.5- Determinazione della capacità di scavenger dei radicali O2
L'attività di scavenger dei radicali O2 è stata determinata attraverso il sistema ipoxantina/
xantina ossidasi (HX/XO) e la capacità del miele di inibire la produzione degli ioni nitrito
prodotti dall’ ossidazione dell’idrossilamina a ioni nitrito da parte della ipoxantina/xantina
ossidasi (HX/XO) a pH 8.2 (Oyanagui, 1984). Le condizioni dell’ esperimento sono state simili a
quelle proposte da Oyanagui (1984). Il miele è stato diluito in H2O distillata a diverse
concentrazione ((1%, 1.5%, 2.5%, 5%, 10%, 15% e 25%) e filtrato attraverso una membrana
Minisart (PBI International) di 45 mm di diametro di pori e aggiunto alla miscela di reazione in
modo che la concentrazione finale fosse compresa tra 0.4 e 1.1 mg / ml.
La miscela di reazione (0.4 ml) consisteva in 4.2 mol/L di idrossilammina e 1,9 mol/L
ipoxantina, a cui sono stati aggiunti 10 µl di soluzione di miele. Successivamente è stato
incorporato 0,1 ml di reagente composto da fosfato di potassio (KH2PO4) 104 mmol/l, borato di
sodio (Na2B4O7 • 10H2O) 78 mmol/l, EDTA-Na 0,1 mmol/l e xantina ossidasi 0,05 U/ml. Lo
studio è stato condotto a pH 8.2. La miscela è stata incubata poi a T = 37 °C per 30 minuti e la
reazione è stata fermata con l'aggiunta di 1 ml di reattivo composto da acido solfanilico
(C6H7NO3S) 1.2 mmol/L, N-(1-naftil) etilendiammina dicloridrato (C12H16Cl2N2) 1.44 mol/l e
acido acetico (HCH2COOH) 2 mmol/l; in seguito è stata effettuata una seconda incubazione a T
= 37 °C per 20 minuti. Infine, l`assorbanza del complesso colorato provocata dall’ inibizione
della produzione di ioni nitriti prodotta dal miele è stata rilevata a 550 nm in un lettore di micropiastra (SynergyTM Multi-Detection Microplate Reader; Bio-Tek®, Instruments, Inc., USA), a 37
ºC e controllata dal software BioTek Gen 5 ™. In questo esperimento è stato incluso un controllo
positivo rappresentato dalla superossido dismutasi (1000 U/ml) e un controllo negativo di H2O
distillata. Le percentuali di inibizione (PI) della generazione di ioni nitrito prodotti dal miele
sono state calcolate dai valori di assorbimento spettrofotometrico del campione (Am) rispetto al
campione di riferimento (Ab, con H2O distillata). La concentrazione del miele che provoca il
40
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
50% di inibizione della produzione di ioni nitrito (IC50), è stato calcolato mediante la seguente
equazione: PI = (Ab- Am)/ Ab
II.5- Caratterizzazione in vitro dell’ attività antiossidante totale del miele e delle sue
frazioni fenoliche: valutazione dell'attività inibitoria della perossidazione lipidica in
omogenati di fegato di ratto
II.5.1- Preparazione di omogenati di fegato di ratto
Il metodo utilizzato è stato simile a quello riportato da Ohkawa et al., (1979). Gli animali,
tenuti costantemente nelle condizioni esposte nel paragrafo II.1.1, sono stati uccisi per eccesso di
anestetico (isofluorano). I fegati sono stati rimossi immediatamente e lavati con acqua fredda e
NaCl 0,9%. Durante tutta la manipolazione sperimentale, questi organi sono stati mantenuti in
ghiaccio per evitare eventuali processi di autossidazione. I fegati sono stati omogeneizzati con un
omogeneizzatore IKA-Werk (Janke e Kunkel, UE) mantenendo un rapporto 1:9 (w/v: peso in
grammi di tessuto/ volume in ml di tampone fosfato a pH 7,4, 50 mmol/l) . L'omogenato è stato
centrifugato a 800 rpm, ad una temperatura di +4 °C per 15 minuti, poi il supernatante è stato
conservato a - 80 °C, fino alle analisi successive. Gli omogenati ottenuti sono stati utilizzati per
gli esperimenti descritti nei punti II.5.2, II.5.3 e II.5.4.
II.5.2- Determinazione dell’ inibizione della formazione di sostanze reattive dell’ acido
tiobarbiturico (TBARS) nel modello della perossidazione lipidica spontanea
Questo saggio si basa sulla quantificazione spettrofotometrica dei TBARS che nelle
condizioni del test si formano spontaneamente dalla perossidazione dei lipidi del tessuto epatico
e il possibile effeto inibitorio della loro formazione da parte della porzione fenolica del miele
ottenuta dopo il frazionamento in Colonna Cromatrografica di Amberlite XAD-2 (come esposto
nella sezione II.3.8.1).
Il saggio è stato condotto secondo la metodologia descrita da Ohkawa et al. (1979).
Inizialmente l`omogenato di fegato di ratto è stato incubato in un bagno in agitazione (Julabo,
Germany) e mantenuto a T= 30 °C per 60 min con l'obiettivo di determinare la massima
perossidazione lipidica spontanea nei tessuti utilizzati. Il miele è stato diluito in tampone fosfato
(pH 7.4, 50 mmol/l), filtrato attraverso una membrana Minisart (PBI International) di 45 µm di
diametro di poro e aggiunto alla miscela di reazione, in modo che la sua concentrazione finale
fosse compresa tra 1 e 5 mg/ml. Nel caso della frazione fenolica, precedentemente sottoposta
allo studio di HPLC-MS per l`identificazione e quantificazione dei componenti della frazione
polifenolica (sezione II.3.8.2), di qui state fatte diverse soluzioni in tampone fosfato (pH 7.4, 50
41
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
mmol/L) e poi aggiunti alla miscela di reazione in modo che le loro concentrazioni finali sono
compresi tra 20 e 80 µg/ml. Il Trolox, sciolto in precedenza in una soluzione di NaHCO3 all’ 1%,
è stato utilizzato come controllo positivo e valutato in una concentrazione di 200 µmol/l, che
rappresenta la dose che mostra la massima protezione contro la perossidazione lipidica spontanea
nei tessuti utilizzati; tale dose è stata stabilita in esperimenti preliminari alle nostre condizioni di
studio. La miscela di reazione è stata incubata in un bagnetto ad agitazione (Julabo, Germany)
mantenuto a T= 30 °C per 60 min; subito dopo, l`incubazione è stata interrotta con HAc freddo
20% (pH 3.5) ed è stata aggiunta una soluzione di TBA 0.5% in HAc 20% (pH 3.5). Questa
miscela di reazione è stata mantenuta a T= 90 ºC per altri 60 minuti, poi lasciata raffreddare per
5 minuti con ghiaccio e quindi è stato aggiunto il SDS al 10%. Infine, le provette sono state
centrifugate a 500 rpm, T= 25 ºC per 15 minuti. La formazione dei TBARS è stata misurata
tramite l`assorbanza dei surnatanti, misurata a 532 nm in uno spettrofotometro Beckman DU-640
(Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).
In questo studio abbiamo anche incluso due campioni di controllo:
i)
per stimare la perossidazione lipidica basale esistente nel tessuto (C0);
ii)
per stimare la massima perossidazione prodotta durante ogni prova (C60).
L'attività antiossidante dei campioni è stata espressa in termini di percentuale di inibizione (PI)
della formazione di TBARS prodotta dai campioni, dal loro valore di assorbanza registrato (Am)
rispetto al controllo e calcolato mediante l’ equazione: PI = 1-(Am -C0)/(C60-C0) x 100.
I risultati sono stati espressi come la concentrazione di miele o della frazione fenolica che
provoca il 50% di inibizione della massima formazione di TBARS (IC50) nei tessuti studiati.
II.5.3- Determinazione dell’ inibizione della formazione di TBARS nel modello della
perossidazione lipidica indotta dal sistema FeSO4 e acido ascorbico
In questo saggio sono stati quantificati spettrofotometricamente i TBARS formati dalla
perossidazione dei lipidi del tessuto epatico indotta dal sistema FeSO4 / acido ascorbico.
A differenza della metodologia descritta nel paragrafo II.5.2, nella miscela di incubazione
iniziale sono stati aggiunti FeSO4 50 mol/l e acido ascorbico 400 mol/l. Questa miscela è stata
mantenuta per 30 minuti a T= 25 ºC in agitazione continua e subito dopo interrotta con HAc
freddo 20% (pH 3.5). Per valutare l`effetto antiossidante, il miele è stato aggiunto a diverse
concentrazioni nel range tra 1 e 15 mg/ml, mentre le frazione fenoliche sono stati aggiunte a una
concentrazione finale di 20 e 120 µg/ml. In questo studio è stato utilizzato anche come controllo
42
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
positivo il Trolox, alle stesse condizioni descritte nel punto II.5.2. Le altre parti della metodica
sono state eseguite come nel precedente paragrafo.
L'attività antiossidante dei campioni è stata espressa in termini di percentuale di inibizione
(PI) della formazione di TBARS prodotta dai campioni e calcolata a partire del valore di
assorbanza registrato (Am) rispetto al bianco (C, tampone fosfato, pH 7.4, 50 mmol/L) con
l`equazione:
PI = (C- Am)/ C x 100.
L'IC50, è stata definita allo stesso modo della sezione precedente (II.5.2) e i risultati sono
stati espressi come la concentrazione di miele e delle sue corrispondente frazione fenoliche che
provoca il 50% di inibizione della massima formazione di TBARS (IC50).
II.5.4– Studio della formazione d`idroperossidi lipidici
In seguito allo studio della capacità del miele e delle sue corrispondenti frazioni fenoliche
nell’ inibire la formazione di sostanze reattive di acido tiobarbiturico (TBARS) nel modello della
perossidazione lipidica spontanea e indotta chimicamente è stata valutata anche la produzione di
idroperossidi totali negli omogenati studiati in precedenza.
La valutazione della concentrazione di idroperossidi totali derivati dalla perossidazione
lipidica è stata condotta tramite il saggio denominato FOX (Ferrous Oxidation-Xylenol Orange
assay) previamente descrito da Jiang et al. (1992). Il reagente (FOX) è stato preparato
mescolando in 90 ml di metanolo 88 mg di butilato idrossitoluene (BHT), 10 ml 250 mM di
H2SO4, 9,8 mg di ammonio solfato ferroso esaidrato, e 7.6 mg del reattivo Xylenol Orange. La
miscela di reazione consisteva quindi in 100 µl di omogenato di tessuto, precedentemente
sottoposto allo stress (sezione II.5.2 e II.4.5.3), e 900 µl di reattivo FOX. La soluzione è stata
poi incubata a T= 37 ºC per 30 minuti in agitazione moderata e, dopo una breve centrifugazione
ad alta velocità (14000 rpm per 1 minuto), l`assorbanza è stata letta a 560 nm contro un bianco
composto da tampone fosfato (pH 7.4, 50 mmol/L) e il reagente FOX. Per la quantificazione
degli idroperossidi, diluizioni seriali dello standard di perossido d`idrogeno (H2O2) (4.5 – 100
μM) sono state trattate e lette, insieme con i campioni.
In questo studio abbiamo anche incluso due campioni di controllo:
i)
per stimare i livelli di idroperossidi totali basali esistenti nel tessuto (ITbasale 0)
ii)
per stimare la massima produzione di idroperossidi totali prodotta durante ogni prova
(IT massima 60).
43
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
II.6- Studio del miele e dei suoi flavonoidi come agenti di protezione contro il danno
ossidativo nei confronti dei globuli rossi umani.
II.6.1- Globuli rossi Collection
Eritrociti (RBCs) sono stati ottenuti da sangue umano di volontari sani dopo la rimozione del
plasma e il buffy coat per aspirazione. Il pellet di RBCs è stato lavato una volta con 0.9% NaCl,
poi tre volte con tampone fosfato (PBS, contenente 150 mM NaCl, 1.9 mM di fosfato di sodio Na2HPO - e 8.1 mM di sodio diidrogeno fosfato -NaH2PO4-, pH 7.4) a temperatura ambiente.
II.6.2- Studio dell effetto protettivo contro l`emolisi
Dopo i lavaggi seriali, il pellet di RBCs è stato risospeso in tampone PBS (10% v/v) (pH 7.4,
50 mmol/L), per stimare la massima emolisi spontanea (RBCS + PBS), o in una soluzione di
AAPH (50 mM, concentrazione finale) in PBS (pH 7.4, 50 mmol/L), per stimare la massima
emolisi indotta (RBCS + AAPH). La capacità protettiva del miele e dei suoi estratti fenolici
contro l’emolisi spontanea e indotta è stata valutata con l’ aggiunta di questi nella miscela di
reazione. Il miele è stato diluito in tampone fosfato (pH 7.4, 50 mmol/l) alle concentrazione di 2
e 5 %, filtrato attraverso una membrana Minisart (PBI International) di 45 µm di diametro di
poro e aggiunto alla miscela di reazione. Nel caso delle frazioni fenoliche sono state fatte
diverse soluzione in tampone fosfato (pH 7.4, 50 mmol/L) e poi aggiunti alla miscela di reazione
in modo che le loro concentrazioni finali sono compresi tra 5 e 70 µg/ml. In entrambi i casi il
miele e i suoi estratti di flavonoidi sono stati aggiunti alla miscela prima dell'agente ossidante. La
miscela è stata incubata per 5 ore a T= 37 ºC, in agitazione delicata. La percentuale di emolisi è
stato registrata dopo 1, 3 e 5 ore di incubazione (Cesquini et al, 2003; Suwalsky et al, 2007).
II.6.3- Preparazione del Ghost di membrana da Globuli rossi
Per indurre una emolisi completa, una provetta di ogni tempo dell`esperimento precedente
(II.6.2), è stata centrifugata a 13500 rpm per 20 minuti a 8 °C e poi il pellet di RBCs è stato
risospeso 20 volte il loro volume (1:20) in 5 mM tampone fosfato ipotonica contenente 2.2 mM
EDTA, pH 8, e la miscela è stata mantenuta a 4 °C per 30 minuti. Poi è stata centrifugata a
13500 rpm per 20 minuti a 8 °C, il surnatante scartato e di nuovo il pellet risospeso in tampone
fosfato 2.5 mM ipotonico (2.2 mM EDTA), pH 8 (1:20). La procedura è stata ripetuta e 1.25 mM
tampone fosfato a pH 8 è stato aggiunto come ultimo passo per completare l'emolisi. Dopo
centrifugazione a 13500 rpm per 20 minuti a 8 °C, la membrana eritrocitaria nel pellet è apparsa
del tutto chiara e risospesa in PBS 2.2 mM EDTA (1:5) e conservata a -80 °C fino all'analisi.
44
_______________________________________CAPITOLO II: MATERIALI E METODI
II.6.4- Studio della suscettibilità dei lipidi di membrana eritocitaria alla perossidazione
Il giorno delle analisi, le soluzioni contenenti i ghost delle membrane di globuli rossi sono
state scongelate. Il buffer di conservazione è stato rimosso dopo centrifugazione a 13500 rpm per
20 minuti a 8 °C, e il pellet lavato due volte in 0.9% NaCl. I ghost sono stati poi risospesi in
0.9% NaCl. Il saggio FOX (Ferrous Oxidation-Xylenol Orange assay) è stato effettuato secondo
la metodologia precedentemente descritta da Jiang et al. (1992). L`agente (FOX) è stato
preparato come precedentemente esposto nella sezione (II.5.4). La miscela di reazione
consisteva quindi in 320 µl della sospensione di ghost in 0.9% NaCl, e 680 µl di reattivo FOX.
La soluzione è stata poi incubata a T= 37 ºC per 30 minuti in agitazione moderata e dopo una
breve centrifugazione ad alta velocità (14000 rpm per 1 min), è stata letta l`assorbanza a 560 nm
contro un bianco composto da tampone fosfato (pH 7.4, 50 mmol/L) e il reagente FOX. Per la
quantificazione degli idroperossidi, diluizioni seriali dello standard di perossido d`idrogeno
(H2O2) (4.5 – 73 μM) sono state trattate e lette, insieme con i campioni.
II.7- Analisi statistica
L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software STATISTICA (StatSoft Inc.,
Tulsa, OK). I dati sono stati sottoposti ad una analisi della varianza One-way per il confronto
delle medie e le differenze significative inter-miele sono state calcolate secondo il test HSD
Tukey's range.In tutti i test i risultati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). I
risultati sono espressi come media di tre analisi. Le correlazioni sono state calcolate sulla media
dei risultati secondo il test di Pearson. Le differenze p ≤ 0.05 sono state considerate
statisticamente significative.
45
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Gli antiossidanti multifunzionali sono diventati una promettente strategia terapeutica per la
cura delle malattie causate dallo stress ossidativo (Gilgun-Sherki et al., 2002). È stato infatti
suggerito che la molteplicità delle funzioni consenta un’ azione più efficace delle molecole
antiossidanti e che ciò porti ad un aumento della capacità protettiva nei confronti di diverse
patologie. In questo senso, per la ricerca di agenti protettivi contro malattie che coinvolgono lo
stress ossidativo, è stato proposto lo studio di questi in estratti di piante o altre fonti naturali,
dal momento che contengono composti che possono agire come antiossidanti con diversi
meccanismi di azione. Questi prodotti possono influenzare infatti i percorsi che coinvolgono i
radicali liberi nelle malattie degenerative e quindi offrire una protezione (Youdim et al.,
2002). Inoltre, negli estratti naturali sono presenti anche altri composti bioattivi che possono
agire favorevolmente in modi non correlati allo stress ossidativo in tali patologie (GilgunSherki et al., 2002).
Attualmente, insieme con altri prodotti naturali, il miele ha suscitato un crescente interesse
nella ricerca di nuovi composti biologicemante attivi ed è stato l'obiettivo principale di questo
lavoro di ricerca.
Lo studio dell’ attività antiossidante in vitro del miele è stato condotto tenendo conto delle
strategie sperimentali proposte per la caratterizzazione degli effetti antiossidanti in vitro di
prodotti naturali (Aruoma, 2003). Questi includono:
i) l`identificazione di noti composti con attività antiossidanti (acidi fenolici e flavonoidi),
ii) lo studio della capacità di reagire con diversi tipi di ROS e RNS in diverse condizioni
(meccanismo antiossidante diretto)
iii) lo studio della capacità di proteggere le biomolecole contro i danni causati dai radicali
liberi (Aruoma, 2003).
Nella presente ricerca è stata progettata una serie di test che, in modo relativamente
semplificata, potrebbe anche soddisfare i requisiti di base proposti da Aruoma (2003) e
Verhagen et al., (2003) per la ricerca dedicata alla valutazione della attività antiossidante di un
particolare prodotto i cui risultati sono presentati di seguito.
In questo contesto, la presente ricerca è stata indirizzata a valutare l'attività antiossidante e
protettiva in vitro contro lo stress ossidativo di cinque tipi di mieli monofloreali da Cuba e
l'individuazione e la quantificazione dei composti chimici presumibilmente responsabili di tali
proprietà.
46
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
III.1- Studio degli antiossidanti nel miele, altri composti bioattivi e il contenuto di
minerali
I polifenoli costituiscono un importante gruppo di composti per quanto riguarda l'aspetto e
le proprietà funzionali del miele. Sono membri di una classe di composti naturali,
recentemente ritenuti di elevato interesse scientifico e terapeutico. Nella lunga tradizione
umana, il miele è stato utilizzato non solo come una sostanza nutritiva, ma anche come una
medicina. Nonostante la rilevante importanza dei composti fenolici come promotori della
salute, un interesse effettivo ed efficace è stato sollevato solo recentemente, tanto da spingere
ulteriori analisi per quantificare e identificare il contenuto fenolico del miele in maniera
precisa (Bogdanov et al., 2008).
Il contenuto fenolico totale (TPC) dei cinque tipi di miele in studio è stato determinato
tramite il test Folin-Ciocalteu ed i valori medi e la deviazione standard sono mostrati nella
Figura 12 A. I risultati evidenziano che il TPC ha mostrato differenze significative tra i
diversi gruppi. In base a questi risultati, Linen vine, che di solito è classificato come un miele
ambrato, ha i valori più alti di TPC (595.8 ± 6.8 mg GAE/kg di miele), mentre i valori più
bassi sono stati misurati nei mieli di Black mangrove e Christmas vine (233.6 ± 5.5 e 213.9 ±
4.5 mg GAE/kg di miele, rispettivamente), che di solito sono classificati come un miele bianco
e extra bianco. I valori medi di TPC trovati sono simili ai quelli valori riportati in diversi tipi
di mieli uniflorali, dove i mieli di colore chiaro hanno mostrato bassi valori di composizione
fenolica (226.1 ± 0.2 mg GAE/kg), mentre il miele di colore ambra i valori più alti (406.2 ±
17.2 mg GAE/kg) (Gheldof & Engeseth, 2002; Gheldof et al., 2002; Meda et al., 2005;
Ferreira et al., 2009).
Inoltre, i valori del contenuto totale di flavonoidi (TFC) sono mostrati nella Figura 12 B. Il
miele di Linen vine ha il maggiore contenuto di flavonoidi (25.2 ± 0.3 mg CE/kg), mentre i
valori più bassi sono stati identificati nei miele di Christmas vine (10.9 ± 0.3 mg CE/kg).
Questi valori sono simili alla media dei valori trovati da alcuni Autori in diversi tipi di mieli,
come nel miele di eucalipto (20–25 mg CE/kg), girasole (15–20 mg CE/kg), abete, lavanda,
edera, acacia (5–10 mg CE/kg), corbezzolo e miele di castagno (meno di 5 mg CE/kg), come è
stato riportato precedentemente da vari Autori (Meda et al., 2005; Ferreira et al., 2009).
È stata trovata anche una correlazione tra il contenuto di TPC e TFC (r = 0.8310, p ≤ 0.05,
e anche tra il contenuto di TFC e il colore (r = 0.9730, p ≤ 0.001). Frankel et al. (1998) hanno
suggerito che l'intensità del colore del miele è legata alla presenza di pigmenti (carotenoidi,
flavonoidi, ecc): l'aumento dell'intensità del colore, infatti, sembra essere legato ad un
47
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
aumento della concentrazione di tali composti. Pertanto, i risultati del nostro studio sembrano
confermare che il contenuto di TPC e di TFC possano influenzare direttamente il colore del
miele. Risultati simili sono stati riportati in precedenza anche da altri autori (Frankel et al.,
1998; Meda et al., 2005).
Figura 12. (a) Contetuno totale di polifenoli (TPC) e (b) contenuto di flavonoidi totali (TFC)
dei cinque tipi di mieli studiati.
a
b
700
30
a
a
25
500
b
400
c
d
300
d
200
mg CE/kG of honey
mg GAE/Kg of honey
600
c
20
b
b
d
15
10
5
100
0
0
Linen vine
Morning glory
Singing bean
Black
mangrove
Christmas vine
Honey Type
Linen vine
Morning glory Singing bean
Black
mangrove
Christmas vine
Honey type
a) Contetuno totale di polifenoli (TPC). I risultati sono espressi in milligrammi equivalenti di acido gallico per
kilogrammo di miele (mg GAE/kg). b) Contenuto di flavonoidi totali (TFC). I risultati sono espressi in milligrammi
equivalenti di catechina per kilogrammo di miele (mg CE/Kg).
Le colonne appartenenti alla stessa serie di dati con lettere diverse sono significativamente diversi (p ≤ 0.05, n = 3 analisi). Le
barre di errore fanno riferimento alla variabilità biologica.
Le proprietà antiossidanti dei composti fenolici, sia per quanto riguarda l'intrappolamento
dei radicali liberi, come la chelazione del Fe2+, sono state ben documentate (Rice-Evans et al.,
1996; Bravo, 1998). In realtà, tra tutti i componenti antiossidanti del miele, quantificati in
questo studio, i composti fenolici sono stati tra i più ampiamente associati alla propietà
antiossidanti del miele in diversi modelli sperimentali in vitro e in vivo (Gheldof et al., 2002;
Vela et al., 2007; Estevinho et al., 2008; Ferreira et al., 2008). Questo giustifica l’analisi
dettagliata dei composti fenolici nei cinque tipi di miele in studio indicati nella sezione III.1.1.
Molti autori hanno studiato il contenuto dei fenoli e dei flavonoidi del miele per
determinare il loro effetto benefico sulla salute umana e se esiste una correlazione con le
origini floreali (Ferreres et al., 1991; Ferreres et al., 1992; Ferreres et al., 1993; Ferreres et al.,
1994; Ferreres et al., 1996; Ferreres et al., 1998; Gheldof & Engeseh, 2002; Gheldof et al.,
2002; Meda et al., 2005). Gli effetti benefici dei polifenoli sulla salute umana sono stati
48
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
ampiamente documentati;nello specifico, le azioni di flavonoidi come modulatori immunitari,
attività radical-scavenger, sono attualmente di particolare interesse per medici e nutrizionisti e
possono essere di interesse anche per giustificare il consumo di prodotti naturali ricchi di
questi composti fitochimici (Havsteen, 2002). I nutrizionisti ritengono infatti che l'assunzione
media di flavonoidi negli esseri umani per mezzo di una dieta normale è di 1-2 grammi al
giorno (De Vries et al., 1997). Il miele, secondo i nostri dati, potrebbe essere quindi
considerato tra le fonti naturali di flavonoidi ottimali per l’ alimentazione umana.
Inoltre, è stato studiato anche il contenuto di carotenoidi (TCC). Questi composti sono noti
per essere potenti antiossidanti e la loro capacità di neutralizzare l`ossigeno singoletto è stato
studiata e ampiamente rivista (Hix et al., 2004; Chen et al., 2007;; McNulty et al., 2008). I
valori totali di carotenoidi presenti nei mieli in studio sono indicati nella Figura 13. I mieli di
Linen vine e Morning glory hanno il più alto contenuto di carotenoidi (5.57±1.02 mg
βcarotE/kg ; 4.89±1.87 mg βcarotE/kg di miele, rispettivamente), mentre il più basso
contenuto è stato misurato nel miele di Singing bean (1.17±1.22 mg βcarotE/kg di miele);
questo miele è classificato come bianco.
Nel caso del miele di Christmas vine
i valori non si trovano entro il limite di
quantificazione del metodo usato. Questo
miele è stata classificato come un miele
c
8
7
a
b
confermare che i carotenoidi totali,
analogamente a quanto avviene con TFC
e TPC, possano influenzare direttamente
il colore del miele. Nel caso del miele di
mg BCarotE/Kg of honey
extra bianco e tali risultati sembrano
6
5
4
c
2
Christmas vine i valori non si trovano
1
entro il limite di quantificazione del
0
metodo usato. Questo miele è stata
c
3
**
Und
**
Linen vine
Morning glory
Singing bean
Black
mangrove
Christmas vine
Honey Type
classificato come un miele extra bianco e
tali risultati sembrano confermare che i
Figura 13. Contetuno totale di caroteni nei cinque
tipi di mieli studiati.
carotenoidi totali, analogamente a quanto
avviene con TFC e TPC, possano
influenzare direttamente il colore del
miele.
I risultati sono stati espressi in milligrammi di equivalenti di
appartenenti alla stessa serie di dati con lettere diverse sono
significativamente diverse (p ≤ 0.05, n = 3 analisi). Le barre di errore
fanno riferimento alla variabilità biologica.
** valori fuori della sensibilità del metodo utilizzatto.
49
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Nel caso del miele di Christmas vine i valori non si trovano entro il limite di quantificazione
del metodo usato. Questo miele è stata classificato come un miele extra bianco e tali risultati
sembrano confermare che i carotenoidi totali, analogamente a quanto avviene con TFC e TPC,
possano influenzare direttamente il colore del miele.
Nel nostro studio è stata trovata una correlazione tra TCC e il colore (r = 0.9178, p ≤
0.05). Una correlazione significativa è stata anche riscontrata tra TCC e TFC (r = 0,8154, p ≤
0,05) e anche tra TCC e TFC (r = 0,8915, p ≤ 0.05) (Tabella 7).
La presenza di carotenoidi nel miele è stata segnalata anche da altri autori (Ferreira et al.,
2009). Tuttavia, il tenore di carotene nel miele è basso, in confronto ad altri prodotti naturali
come nelle fragole. Questo potrebbe essere relazionato alle caratteristiche del nettare dal quale
viene prodotto il miele, che di solito ha un basso contenuto di tali composti; comunque, anche se
in basse concentrazioni, non può essere ignorato il loro contributo alla proprietà biologiche del
miele.
E' noto che la capacità nutrizionale e biologica del miele è il risultato dell'attività combinata
di una vasta gamma di composti. Oltre ai caroteni e ai polifenoli, il miele contiene un certo
numero di composti noti per agire come antiossidanti, come l'acido ascorbico e gli enzimi
(glucosio ossidasi e catalasi), ma anche piccoli peptidi ed enzimi (Bogdanov et al., 2008).
Nei campioni in studio il contenuto di acido ascorbico è stato valutato mediante HPLC.
L'acido ascorbico non è stato trovato nei nostri campioni e simili risultati sono stati ottenuti
anche da Gheldof et al. (2002) mediante l`uso dell’ HPLC. Ciò è probabilmente dovuto alla
lavorazione e conservazione dei mieli: è noto infatti che durante lo stoccaggio, diversi composti
possono soffrire modifiche; questo riguarda principalmente l'acido ascorbico ed alcuni enzimi
(Wang et al., 2006).
Gli aminoacidi sono tra i composti in minor concentrazione nel miele. La loro presenza è
imputabile da un lato al lavoro delle api e, dall'altro, alla fonte vegetale da cui viene prodotto il
miele, in quanto alcuni sono comuni a molti tipi di miele, mentre altri dipendono soltanto
dall'origine botanica (González et al., 2006). D'altra parte, il contenuto di proteine nel miele è
variabile e dipende sempre in gran parte dall'origine botanica; da ciò deriva anche la presenza di
enzimi introdotti dalle api stesse e altri derivati dal nettare (Azeredo et al., 2003).
Le proteine totali e il contenuto in aminoacidi liberi sono stati studiati e i risultati sono
mostrati nella Tabella 3. I valori più elevati di amminoacidi liberi sono stati trovati in Morning
Glory, mentre i valori più bassi nel miele di Mangrovie Black. Per quanto riguarda il più alto
50
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
contenuto di proteine, esso è stato riscontrato nel miele di Liven vite, mentre il miele di
Christmas vine presenta il contenuto più basso. Valori di proteine simili a quelli da noi riportati
sono stati precedentemente segnalati (Azeredo et al., 2003). Secondo questi Autori un basso
contenuto proteico può considerarsi di circa 30 mg BSA/100g di miele, un contenuto medio di
40-100 mg BSA/100g di miele e un elevato contenuto di circa 200 mg BSA/100g di miele. I
nostri risultati sono stati simili a quelli riportati da tali autori.
Tabella 3. Contenuto totale di acido ascorbico, aminoacidi e proteine nei miele in situdio.
Tipo di miele
Contenuto totale di
aminoacidi liberi
(mg LE/100 g di miele)
Linen vine
79.3 ± 10.4 a
Contenuto totale di
proteine
(mg BSA/100 g di
miele)
92.3 ± 12.3 a
Acido
ascorbico
(µg/100 g di
miele)
--nd
Morning glory
146.4 ± 12.3 b
52.7 ± 10.4 b
--nd
Singing bean
142.2 ± 12.3 b
26.8 ± 9.6 c
--nd
Black mangrove
15.3 ± 2.9 c
36.9 ± 11.3 d
--nd
Christmas vine
44.6 ± 9.6 d
12.0 ± 14.3 e
--nd
Il contenuto totale di amminoacidi liberi (azoto amino) è stato determinato utilizzando il metodo colorimetrico con il reagente
ninidrina-cadmio descritto da Doi et al. (1981). La determinazione delle proteine totali è stata effettuata secondo il metodo
descritto da Bradford (1976) utilizzando il reagente Coomassie Brilliant G-250, mentre la Vitamina C è stata studiata mediante
HPLC. I risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard. Tra i valori medi all'interno di una colonna che
condividono la stessa lettera non ci sono differenze statisticamente significative (p ≤ 0.05) (Test di Tukey). Ogni campione è stato
analizzato in triplicato. –nd non è stato rilevato.
III.1.1- Identificazione e quantificazione degli acidi fenolici e dei flavonoidi mediante il
sistema HPLC-DAD-ESI-MS-Mn
I fenoli contenuti nel miele sono stati identificati sulla base delle loro caratteristiche UV-vis e
degli spettri di massa ottenuti con HPLC-DAD-ESI/MS in modo negativo, nonché sul loro
comportamento cromatografico rispetto a standard esterni, quando disponibili. Il miele è stato
precedentemente frazionato utilizzando una Colonna Cromatrografica di Amberlite XAD-2 da
cui sono stati ottenute quattro frazioni; poi la frazione fenolica è stata sottoposta ad analisi con
HPLC-DAD-ESI/MS, procedura già utilizzata nello studio dei composti fenolici contenuti nel
miele d'api (Ferreres et al., 1991). Nella Figura 14 sono rappresentati i cromatogrammi relativi
ad ogni tipo di miele. Invece, gli spettri UV, le caratteristiche di massa e le identità dei picchi
sono indicati nella Tabella 4, mentre la loro quantificazione nella Tabella 5.
51
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Sono stati individuati in totale quattordici picchi assegnati a composti fenolici. Il picco 1 è
stato identificato come floroglucinolo, i picchi dal 2-5 come acidi fenolici e come flavonoidi i
picchi dal 8-15. Tutti i flavonoidi scoperti appartenevano al gruppo dei flavonoli. Otto composti
sono stati identificati in tutti i campioni: acido vanillico, acido caffeico e p-cumarico, e anche i
flavonoli quercetina, isoramnetina, metossikaemferolo, kaemferolo e kaemferolo-7-O-ramnoside
(Tabella 4). Un altro picco è stato trovato in tutti i campioni (picco 7), anche se potrebbe non
corrispondere a un composto fenolico.
Tabella 4. Tempo di retenzione ((Rt), UV e MS caratteristiche (–MS: [M – H] –, –MS2 M – H] –)
dei diversi composti fenolici identificati nei diversi tipi di miele.
*
Picco
Composto
Rt (min)
UV (nm)
[M-H]-
- MS2 [M-H]-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Floroglucinolo
Acido vanillico
Acido caffeico
Acido siringico
Acido p-cumarico
Acido felurico
Non identificato
Miricetina
Quercetina-diglycoside
Quercetina- O- ramnoside
Quercetina
Kaemferolo-7-0-ramnoside
Kaemferolo
Isoramnetina
8- metossikaemferolo
4.80
5.85
7.0
8.45
11.10
13.35
20.45
22.00
23.10
27.85
28.20
32.75
33.65
34.55
35.20
255
260, 294
298sh, 324
274
232, 310
296, 322
260, 354, 387sh
255, 286sh, 308sh, 374
232, 256, 278sh, 350
256, 268sh, 296sh, 350
255, 300sh, 370
263, 320sh, 367
266, 320sh, 366
255, 267sh, 301sh, 370
268, 292sh, 340
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
241
317
625
447
301
431
285
315
315
213
-301
301
-285
267
300
285
I composti sono stati identificati sulla base della loro UV e MS spettrum mediante HPLC-MS, nonché sul loro comportamento
cromatografico rispetto a standard esterni.
L'identità del floroglucinolo, degli acidi fenolici e degli agliconi flavonoli sono stati
confermati positivamente mediante standard esterni, mentre l'identità dei picchi 9, 10, e 12, resta
ancora dubbiosa. Tra gli acidi fenolici, gli acidi idrossicinamici, cioè l`acido caffeico (picco 3),
l’ acido p-coumarico (picco 5) e l`acido felurico (picco 6) sono predominanti. Questi composti
si pensa che gsiano derivati dal propoli (Andrade et al., 1997; Gheldof et al., 2002; Truchado et
al., 2008) e che l'ape trasferirebbe direttamente nel miele attraverso le sue secrezioni.
52
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Figura 14. Cromatogrammi HPLC-DAD della frazione fenolica del miele a 290 nm per i acidi
fenolici e 360 nm per flavonoidi.
(A) Singing bean; (B) Linen vine; (C) Morning glory; (D) Christmas vine; (E) Black mangrove. Picchi: 1,
floroglucinolo; 2, acido vanillico; 3, acido caffeico; 4, acido siringico; 5, acido p-cumarico; 6, acido ferulico; 7,
composti non identificati; 8, miricetina; 9, quercetina-diglycoside; 10, quercetina-O-rhamnoside; 11, quercetina; 12,
kaempferol-7-O-rhamnoside; 13, kaempferol; 14, isorhamnetin; 15, 8-methoxykaempferol. Hesperetina è stato
utilizzato come standard interno.
53
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Tra tutti gli acidi fenolici individuati nei campioni di miele, l`acido p-coumarico è stato il
più abbondante (Tabella 5). Questo viene considerato un metabolita intermediario nella sintesi
di altri composti fenolici più complessi nelle piante (Pryce, 1972). Può essere ottenuto
direttamente dalla tirosina o dall’ acido trans-cinnamico, che è a sua volta un precursore della
fenilalanina. Una volta generato, l'acido p-cumarico serve come precursore di acido ferulico,
acido caffeico e altri composti fenolici (Grace & Logan, 2000).
Le proprietà antiossidanti degli acidi cinnamici (le cui strutture sono indicate nella
Figura 8, in particolare l'acido ferulico, possono essere alla base delle proprietà del miele
dimostrate in questo studio. Rispetto all’ acido p-cumarico, l'acido ferulico ha presentato una
maggiore capacità di scavenger dei radicali liberi, misurata attraverso diversi test in vitro (RiceEvans et al., 1996; Kanski et al., 2002); quindi la sua presenza nel miele di ape può anche essere
correlata con le proprietà biologiche dimostrati nel nostro lavoro.
È stato proposto che l'interazione dell’ acido ferulico con un radicale libero risulta nell’
astrazione dell'atomo di idrogeno del gruppo 4-idrossi per formare il radicale fenossile (ArO).
Questo elettrone spaiato può stare delocalizzato in tutta la molecola di acido ferulico, in modo
che il radicale ArO formato possa essere stabilizzato per risonanza, come si mostra nella Figura
15. La presenza del gruppo 3-metossi nell'anello aromatico, essendo un gruppo donatore di
elettroni, favorisce l'ulteriore stabilizzazione del radicale ArO e questo spiega l`elevata attività
antiossidante dell’ acido ferulico in confronto con l'acido p-cumarico (Graf, 1992). Per la sua
stabilità, il radicale dell’ acido ferulico, una volta generato, non partecipa nell'avvio o nella
propagazione di nuove reazioni ossidative. Più probabilmente, questo radicale reagisce con un
altro radicale di acido ferulico a formare una struttura dimerica, noto come curcumina (Graf,
1992; Rice-Evans et al., 1996).
Figura 15. Strutture risonanti proposte per la stabilizzazione del radicale ArO dell`acido
felurico (Graf, 1992).
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH


OCH3
O

OCH3
O

OCH3
O
OCH3
O
OCH3
O
54
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Tuttavia, come l'acido ferulico, l'acido trans-cinnamico e p-cumarico hanno una catena
insatura legato al gruppo carbossilico, che può fornire i siti per l'attacco dei radicali liberi e,
probabilmente, consentire l'ancoraggio di questi composti al doppio strato lipidico (Kanski et al.,
2002; Kikuzaki et al., 2002). È stato proposto che la presenza di questa struttura specifica negli
acidi cinnamici potrebbe proteggere le membrane biologiche dai danni ossidativi (Kanski et al.,
2002) e quindi spiegare l'attività di inibizione della perossidazione lipidica rilevata in questa
ricerca da parte del miele. E 'importante far notare che l'attività antiossidante riscontrata nei
nostri campioni di miele potrebbe essere anche il risultato dell'interazione degli acidi cinnamici
con altri composti fenolici, come i flavonoidi.
La presenza dei flavonoidi nel miele è stata ampiamente documentata; tali composti sono
stati correlati alle proprietà antiossidanti del miele e utilizzati anche come potenziali marcatori
dell’origine botanica (Ferreres et al., 1991; Ferreres et al., 1992; Ferreres et al., 1993; Ferreres et
al., 1994; Ferreres et al., 1996; Ferreres et al., 1998; Gheldof et al., 2002).
Nel presente studio è stato constatato che il miele di ape può essere considerato come una
fonte importante di questi composti naturali e le concentrazioni trovate (Tabella 5) suggeriscono
che possano avere un effetto importante sulla salute umana.
Nei cinque tipi di mieli studiati, cinque picchi (8, 11, 13, 14, 15) sono state assegnati agli
agliconi flavonoli, un tipo di composti ampiamente riportati nel miele. Quercetina e kaemferolo
sono stati trovati in molti tipi di mieli uniflorali (Martos et al., 2000; Truchado et al., 2008) e
sono stati suggeriti come idonei marcatori floreali per il miele di eucalipto (Martos et al., 2000).
Il kaemferolo è stato anche proposto come possibile marker botanico per il miele di rosmarino
(Gil et al., 1995). D’ altra parte è stata identificata la presenza di isorhamnetina in diversi tipi di
mieli uniflorali italiani da Fiorani et al. (2006). Un altro picco che potrebbe essere assegnato ad
un aglicone flavonolo è il picco 15. Questo composto ha mostrato uno ione molecolare in
negativo [M-H]- di 315 m/z, rilasciando un frammento importante MS2 di 285 m/z attribuito alla
possibile perdita di un gruppo metossi (-30 amu); ciò ha consentito l'identificazione come un
derivato di metossikaempferolo. Il suo spettro UV-vis e il suo tempo di ritenzione sono stati in
linea con quello del 8-metossikaemferolo usato come standard esterno. La presenza di
metossikaemferolo nel miele è gia stata documentata precedentemente in diversi studi (Gil et al.,
1995; Martos et al., 1997; Fiorani et al., 2006). Nei nostri campioni, questi quattro flavonoli
sono stati rilevati in tutti i mieli analizzati, innalzando così i dubbi che potrebbero essere
indicativi di una determinata origine floreale. D'altra parte, la myricetina (picco 8) è stata rilevata
55
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
soltanto nel miele di Singing bean, anche se la natura diffusa di questo flavonolo rende il dubbio
che possa essere considerato come un marcatore floreale per tale miele.
Nei primi lavori pubblicati sul miele sono stati identificati solo flavonoidi sotto la forma di
agliconi e quindi questo ha portato a pensare che solo questi derivati fossero presenti nel miele,
dal momento che i flavonoidi glicosidi sono completamente idrolizzati dagli enzimi delle api
(Ferreres et al., 1993; Gil et al., 1995). Tale ipotesi è stata poi respinta in seguito alla rilevazione
di alcuni glicosidi nei diversi mieli (Truchado et al., 2008; Truchado et al., 2009). Nei nostri
campioni, tre composti (picchi 9, 10 e 12) sono stati identificati come glucosidi flavonoli
(flavonolo glicoside). Il composto identificato come picco 9 è stato riscontrato solo nel miele di
Singing bean, che è anche il più ricco di flavonoidi. Questo composto ha mostrato uno spettro
UV-vis caratteristico di un flavonolo derivato della quercetina: è uno ione molecolare in
negativo [M-H]- di 625 m/z, rilasciando un frammento importante MS2 [M-H]- di 301 m/z e
quindi identificato come il flavonolo quercetina. La perdita di -324 amu viene interpretata come
corrispondente a due residui di esosi. D'altra parte, il fatto che un solo frammento MS2 venga
rilasciato sottolinea che gli zuccheri costituiscano un disaccaride non legato in posizioni diverse
della struttura della molecola di quercetina, in questo caso più di un frammento sarebbe da
aspettarsi dalla scissione di ogni zucchero residuo permettendo così di identificare tale composto
come quercetina-diglycoside. La natura degli esosi non è stata stabilita (per esempio, glucosio,
galattosio), né la posizione di attacco alla quercetina.
Il composto 10 è stato rilevato in tre dei mieli uniflorali studiati (Line vine, Black mangrove,
Singing bean). Questo prodotto ha mostrato uno ione molecolare in negativo [M-H]- di 447 m/z;
liberando un frammento MS2 di 301 m/z (quercetina); la perdita di un frammento con -146 amu,
insieme al fatto che il suo spettro UV-vis non è stato modificato nella regione dell’ultravioletto,
permette di escludere la presenza di un sostituente p-coumaroil, consentendo così di identificare
il composto come quercetina – rhamnoside.
Il picco 12 ha mostrato uno spettro UV-vis con una lunghezza d`onda massima di 263, 320
sh e 367 nm, caratteristico di un composto con un ossidrile libero in posizione C-3. Il suo ione
negativo molecolare è stato di [M-H]- 431 m/z liberando un frammento MS2 di 285 m/z
(kaemferolo) dalla perdita di un residuo di ramnosio (-146 amu). Questo ci ha permesso di
identificare questo composto come kaemferolo-7-O-ramnoside. Il kaemferolo glicoside
contenente ramnosio ed esosi è stato recentemente identificato come componente importante nel
miele di acacia da Truchado et al. (2008).
56
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Un fatto interessante è stata la presenza del
picco 7 in tutti i campioni analizzati. Il suo
spettro UV a 360 nm è mostrato nella Figura
16. Questo composto ha presentato uno spettro
mA
U
1400
1200
UV-vis di 260, 354, 387sh e uno ione
1000
molecolare in negativo [M-H]- di 241 m/z;
800
liberando un frammento MS2 di 213 m/z
600
(relativo alla perdita di C=O -28 amu). Queste
400
caratteristiche di UV-vis e di massa sono simili
200
al composto riportato in precedenza da
0
Truchado et al. (2009), che hanno denominato
CH5 e proposto come un possibile marker
300
350
400
450
500
550 nm
Figura 16. Spettro UV-vis misurato a 360 nm
floreale del miele di castagno.
Tale composto non è stato ancora identificato, ma è stato provvisoriamente assegnato come
un intermedio possibile della via del metabolismo del triptofano (Truchado et al., 2009). Non è
stato possibile effettuare nessun ulteriore contributo all’ identificazione di questo composto nel
nostro studio e, quindi, il composto resta ignoto.
In questo studio sono stati identificati importanti flavonoidi in forma glicosidica, suggerendo
che ciò potrebbe essere una caratteristica della loro origine, sia geografica che floreale. Ulteriori
studi sono però necessari per confermare questa proposta, così come una più dettagliata analisi
dei composti fenolici, al fine di confermare la loro identità e la loro associazione con il tipo di
miele unifloreale.
L'influenza dei flavonoidi sulla salute umana è stata dimostrata da diversi Autori e questo è
strettamente correlato all’ azione diretta o indiretta nei meccanismi biochimici che si verificano
nell'uomo (Havsteen, 2002). Una delle proprietà più importanti è la loro eccellente capacità
antiradicalica. E’ anche un aspetto importante per quanto riguarda le loro applicazioni
terapeutiche e profilattiche, per esempio, dopo infezioni, infiammazioni, bruciature o danni
prodotti da radiazioni (Calzada et al., 1999). Come è stato esposto precedentemente da vari
Autori, la capacità antiradicalica è intimamente connessa con il potenziale di ossidazione /
riduzione e con l`energia di attivazione per trasferimento elettronico della sostanza (Havsteen,
2002).
57
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
I flavonoidi, in particolare, rimuovono l`ossigeno reattivo sottoforma di anioni superossido,
radicali idrossilici, perossidi lipidici o idroperossidi. In questo modo bloccano l`azione deleteria
di queste sostanze sulle cellule. I loro effetti citoprotettivi sono stati ben evidenziati nei
fibroblasti della pelle umana, nei cheratinociti e nelle cellule endoteliali. Molti flavonoidi hanno
mostrato la loro efficacia nell’ inibire i processi di perossidazione lipidica dell`acido linoleico o
dei fosfolipidi di membrana, la perossidazione dei globuli rossi e l’ autossidazione in omogenati
cerebrali (Laughton et al., 1989; Ursini et al., 1994).
Inoltre, i flavonoidi come la quercetina e il kaempferolo sono importanti per il controllo dei
livelli del glutatione intracellulare: sono in grado di agire a livello del gene regolatore e di
aumentare il livello di espressione del 50 %, inducendo il sistema antiossidante cellulare e
contribuendo in tal modo alla prevenzione di diverse malattie (Havsteen, 2002). Come è stato
dimostrato nel nostro studio, il miele presenta una ampia varietà di flavonoidi e quindi la loro
presenza può essere correlata con le proprietà biologiche del miele dimostrata nel nostro lavoro.
È importante notare anche che il contenuto totale dei composti fenolici e dei flavonoidi,
determinato tramite il metodo modificato di Folin-Ciocalteu (Singleton et al., 1999) e dal cloruro
di alluminio, metodo spettrofotometrico (Chia-Chi et al., 2002), sono stati straordinariamente
superiori al contenuto fenolico quantificato per HPLC (Tabella 5). Osservazioni simili sono state
riportate nella valutazione dei composti fenolici nel miele (Gheldof et al., 2002) e in altri
prodotti alimentari e bevande. In un primo luogo, questo può essere dovuto al fatto che non
siamo stati in grado di identificare tutti i composti tramite HPLC e che alcuni fenoli potrebbero
essere stati eluiti nella prima fase di estrazione (frazione 1) e quindi essere sfuggiti all’
identificazione, come è stato precedentemente esposto da Truchado et al. (2009). Inoltre, il
metodo di Folin-Ciocalteu potrebbe avere sovrastimato il totale di composti fenolici, anche se è
stata utilizzata una soluzione di miele artificiale per eliminare le interferenze svolte dagli
zuccheri, come proposto da Singleton et al. (1999).
58
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Tabella 5. Contenuto dei diversi composti fenolici identificati nei diversi tipi di miele.
Picco
1
2
3
4
5
6
8
9
10
11
12
13
14
15
Phenolic
compound
Floroglucinolo
Acido vanillico
Acido caffeico
Acido siringico
Acido p-cumarico
Acido felurico
Miricetina
Quercetinadiglycoside
Quercetina-Orhamnoside
Quercetina
Kaemferolo-7-0ramnoside
Kaemferolo
Isoramnetina
8metossikaempferolo
22.87 ± 4.08
35.20 ± 3.17
33.94 ± 4.40
36.14 ± 5.27
107.94 ± 3.42
50.08 ± 2.58
--b
--b
Morning
glory
21.59 ± 5.91
29.66 ± 4.08
25.17 ± 5.59
26.07 ± 4.13
63.85 ± 4.29
55.10 ± 5.75
--b
--b
Floral source
Black
mangrove
14.84 ± 3.41
21.74 ± 4.63
23.23 ± 3.14
15.77 ± 5.63
155.82 ± 3.64
--b
--b
--b
22.71 ± 2.09
--b
39.71 ± 8.99
23.43 ± 4.07
Linen vine
--b
24.40 ± 4.25
22.06 ± 5.32
--b
74.23 ± 4.42
--b
30.27 ± 6.39
79.25 ± 5.32
Christmas
vine
--b
15.22 ± 4.19
23.47 ± 5.23
--b
25.82 ± 5.78
23.06 ± 5.54
--b
--b
27.96 ± 5.05
36.39 ± 6.16
--b
23.28 ± 1.15
17.32 ± 4.53
30.21 ± 8.41
22.30 ± 2.12
95.35 ± 5.72
19.27 ± 0.75
24.84 ± 2.93
19.19 ± 0.68
32.46 ± 6.64
32.90 ± 7.01
20.99 ± 2.27
19.59 ± 6.32
21.34 ± 5.32
16.76 ± 3.21
35.08 ± 8.61
34.57 ± 6.48
19.01 ± 1.11
47.78 ± 7.29
26.13 ± 4.00
19.90 ± 1.58
24.47 ± 3.30
26.87 ± 3.98
19.27 ± 0.86
458.37 ± 25.71
319.73 ±
18.46
98.29 ±
10.38
400.53 ± 38.51
475.03 ±
29.69
354.34 ± 28.41
202.21 ± 11.23
Contenuto fenolico totale
172.20 ± 14.70
Contenuto total di flavonoidi
169.13 ± 14.16
Singing bean
114.64 ± 12.16
I dati sono espressi come media (µg/100 g di miele) ± D.S. (Deviazione standard) –b Non rilevato –c Non quantificati.
III.1.2. Studio dei minerali nel miele
Come è stato precedentemente esposto, la composizione di minerali del miele è piuttosto
variabile e dipende soprattutto dalla fonte floreale e dalla zona geografica (González-Paramás et
al., 2000). La quantità e la varietà dei minerali presenti nei mieli variano a seconda delle
sostanze nutritive che sono state assorbite dalle piante e dalla loro disponibilità nel suolo. In tal
modo, l'eccesso o la carenza di alcune sostanze chimiche nel suolo o nell’ acqua avrà
ripercussioni sulla composizione chimica delle piante e quindi nel nettare (Sanz et al., 1995). In
questo progetto, abbiamo studiato i minerali che possono essere correlati al mantenimento del
bilancio ossidativo intracellulare.
Nell'analisi del contenuto individuale di minerali, otto minerali sono stati individuati e
quantificati come segue: cadmio (Cd), cromo (Cr), rame (Cu), nichel (Ni), ferro (Fe), manganese
(Mn), piombo (Pb) e zinco (Zn). La Figura 17 mostra la media e deviazione standard per i
contenuti di minerali per ogni tipo di miele. Il ferro è stato l’ elemento più abbondante presente
in tutti i campioni, mentre il cadmio è presente in quantità più bassa.
I valori più bassi di ferro sono stati osservati nel miele di Christmas vine (4038 ng/g), mentre i
valori più alti (10237 ng/g) sono stati trovati nel miele di Linen vine. Altri minerali individuati
59
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
come più abbondanti sono stati manganese e zinco; in entrambi i casi sono stati riscontrati i
valori più alti nel miele di Liven vine (Figure 17). La concentrazione di manganese varia da 481
ng/g in Black mangrove e 1512 ng/g in Liven vite, mentre i valori nel miele di Christmas vine
non sono all'interno del limite di quantificazione del metodo (˂ 100 ng/g). Inoltre, i valori di
zinco variano da 908 ng/g in Singing bean a 1714 ng/g in Linen vine; in questo caso i livelli di
zinco del miele di Black mangrove e Christmas vine non sono all'interno del limite di
quantificazione del metodo (˂ 200 ng/g). Inoltre, i livelli minimi e massimi di rame sono stati
nel range di 43.7 ng/g e 590 ng/g nel miele di Black mangrove e Liven vine, rispettivamente.
Il tenore di piombo nei campioni di miele di Morning Glory (76.6 ng/g) è stato il più basso,
mentre il più alto contenuto è stato trovato nei campioni di Liven vine (102 ng/g). Il contenuto di
nichel più alto è stato trovato nel miele di Liven vine (193 ng/g) mentre il più basso nel miele di
Singing bean (86.2 ng/g); invece, i livelli di cromo variano tra i 28 ng/g in Christmas vine a
56.9 ng/g in Singing bean.
Il cadmio è stato trovato solo nel miele di Liven vine (0.50 ng/g), in altri casi questo composto
non era entro il limite di quantificazione del metodo (˂ 0.1 ng/g). Sono stati studiati anche
arsenico (As), mercurio (Hg), selenio (Se) e vanadio (V), ma i valori non erano nel limite di
quatificazione del metodo utilizzato (˂ 10 ng/g).
Nei mieli studiati il contenuto di Fe è stato trovato in quantità che sono paragonabili a quelle
riscontrate in mieli di altre fonte floreale e regioni geografiche (Al-Khalifa & Al-Arify, 1999;
Nanda et al., 2003; Hernandez et al., 2005; Tuzen et al, 2007). D'altra parte, i valori di Mg, Zn,
Cu, Pb, Ni e Cr sono stati trovati in concentrazioni più basse rispetto a quelli precedentemente
indicate da vari autori (Conti, 2000; Nanda et al., 2003; Tuzen et al., 2007). E questo
comportamento, come è stato detto prima, evidentemente ha una profonda relazione con la fonte
e la zona geografica in cui viene prodotto ogni tipo di miele.
60
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
0,8
80
0,6
60
0,4
0,2
< 0.1
0,0
S. bean
< 0.1
B
.
mangrove
p < 0.0001
Cr
ng/g
ng/g
Cd
< 0.1
< 0.1
M. glory
C. vine
b
b
b
a
40
20
L. vine
0
S. bean
B . mangro ve
p < 0.0001
Cu
b
M . glo ry
C. vine
p < 0.0001
Fe
c
15000
600
12000
ng/g
ng/g
c
800
400
b
200
a
b
ab
M . glo ry
C. vine
b
a
6000
3000
0
S. bean
B.
mangro ve
2000
1600
S. bean
L. vine
a
ng/g
a
800
400
< 100
0
S. bean
B.
mangro ve
M . glo ry
C. vine
a
120
2400
90
1800
ng/g
3000
M . glo ry
C. vine
L. vine
M . glo ry
C. vine
L. vine
p < 0.05
a
a
1200
< 200
0
B.
mangro ve
B . mangro ve
b
600
S. bean
a
a
Zn
150
0
p < 0.0001
a
n.s.
30
L. vine
0
L. vine
60
C. vine
b
300
250
200
150
100
50
S. bean
Pb
M . glo ry
Ni
b
1200
B.
mangro ve
p < 0.0001
c
Mn
ng/g
c
b
9000
0
ng/g
L. vine
S. bean
B.
mangro ve
< 200
M . glo ry
C. vine
L. vine
Figura 17. Contenuto totale di minerali presente nei cinque tipi di miele studiati
Sono stati studiati i minerali del miele che possono essere correlati al mantenimento del bilancio ossidativo intracellulare. I
contenuti di cadmio (Cd), cromo (Cr), rame (Cu), ferro (Fe), manganese (Mn), nichel (Ni), piombo (Pb) e zinco (Zn), sono stati
determinati utilizzando tecniche di spettrofotometria ad assorbimento atomico. I risultati sono stati espressi come nanogrammi
per grammo di peso secco di miele. I valori ottenuti dal materiale standard di rifermento sono stati sempre nell’ intervallo di
confidenza del 95 % in confronto ai valori certificati. Le colonne appartenenti alla stessa serie di dati con lettere diverse sono
significativamente diverse (p ≤ 0.05 o p < 0.0001, n = 3 analisi). Le barre di errore fanno riferimento alla variabilità biologica.
61
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
È stato evidenzato precedentemente che i minerali possono avere un effetto nel mantenimento
del bilancio ossidativo intracellulare. Il Fe e il Cu sono i principali metalli catalizzatori delle
reazioni che generano radicali liberi e il loro coinvolgimento come mediatori di morte cellulare è
stato riconosciuto in diverse malattie degenerative come l'ischemia (Shoham & Youdim, 2000).
Nei campioni di miele studiati, il valore massimo di ferro trovato è stato di circa 0.18 µM e
circa di 9.28 µM nel caso del Cu, concentrazioni molto basse in confronto ai valori citotossici
riportati in colture cellulari di fibroblasti umani (Shoham & Youdim, 2000). Pertanto utilizzando
concentrazioni inferiori si garantisce che il miele non provochi stress ossidativo mediato dal Fe o
Cu.
A differenza del Fe e Cu, sono necessarie concentrazioni ancora più elevate di Ni (10 mM) per
causare danni di tossicità nelle cellulare (Shoham & Youdim, 2000). Nei campioni di miele
studiati, il valore massimo di nichel trovato è stato di circa 3.28 mM; la presenza di Ni può
essere attribuita anche alla contaminazione da parte dei contenitori usati per la raccolta del miele.
Nonostante ciò, i valori trovati non risultano essere tossici.
Il basso contenuto degli altri minerali identificati fa si che le concentrazioni usate nel modello
con fibroblasti della pelle siano all'interno di un range che non causa nessun coinvolgimento di
tali elementi nel bilancio ossidativo intracellulare.
III.2. Caratterizzazione in vitro dell’ attività antiossidante totale del miele: capacità
di scavengin dei radicali liberi e inibizione della perossidazione lipidica
III.2.1. Determinazione della capacità antiossidante totale tramite il test della capacità di
assorbimento dei radicali liberi dell'ossigeno (ORAC), scavenger dei radicali ABTS.+ e
attività antiossidante totale utilizzando la capacità di riduzione del ferro del composto
2,4,6-tripyridyl-s-triazina (Fe3+- TPTZ) (FRAP)
Nel contesto della salute umana e in particolare della protezione cellulare, la presenza di
molecole antiossidanti nel miele che mostrano la capacità di catturare radicali è particolarmente
utile e giustifica l'uso di questo prodotto come fonte naturale di tali composti. L'influenza di
miele sullo stato della salute umana è stato testato da molti autori. Alcuni studi hanno dimostrato
che l'ingestione di miele ha un'influenza sulla capacità antiossidante del plasma (Al-Waili, 2003).
Questi risultati supportano l'idea che i fitochimici con proprietà antiossidanti presenti nel miele
sono biodisponibili e che contribuiscono ad aumentare l'attività antiossidante nel plasma umano.
Con lo scopo di studiare questa capacità sono stati eseguiti tre studi in parallelo con tecniche che
62
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
valutano la capacità antiossidante totale mediante differenti meccanismi d'azione (ORAC, FRAP,
TEAC).
I risultati dei test effettuati sono riportati nella Tabella 6 e constatano che il miele presenta
una importante capacità di catturare i radicali dell'ossigeno, radicali ABTS.+ e capacità di
riduzione del ferro, caratteristiche che possono essere collegate direttamente con la protezione
contro il danno ossidativo, mediato da radicali liberi, alle biomolecole e alle strutture cellulari.
Tabella 6. Capacità antiossidante totalenei cinque miele uniflorali cubani studiati.
FRAP
ORAC
µmol di TE/g di
miele
µmol TE/ g di
miele
µmol Fe(II)/ g di
miele *
Linen vine
12.89 ± 0.28 a
0.96 ± 0.01 a
1.96 ± 0.20 a
2.94 ± 0.23 a
Morning glory
9.26 ± 0.46 b
0.53 ± 0.07
b
1.17 ± 0.17 b
2.01 ± 0.21 b
Singing bean
8.12 ± 0.23 c
0.72 ± 0.06 c
1.53 ± 0.18 c
1.95 ± 0.14 b
Black mangrove
7.45 ± 0.37 d
0.39 ± 0.09 d
0.72 ± 0.01 d
1.22 ± 0.24 c
Christmas vine
4.59 ± 0.51 e
0.27 ± 0.06 e
0.54 ± 0.05 e
1.03 ± 0.28 d
Artificial honey
1.09 ± 0.10 f
0.06 ± 0.01 f
0.13 ± 0.01 f
0.21 ± 0.01 e
Tipo di miele
TEAC
µmol TE/ g di
miele
I risultati sono stati espressi come media ± desviazione standard. Tra i valori medi all'interno di una colonna che condividono la
stessa lettera non ci sono differenze statisticamente significative (p ≤ 0.05) (Test di Tukey). Ogni campione è stato analizzato in
triplicato. * La capacità di ferro riduzione del solfato di ammonio ferroso è stato circa due volte quella di Trolox.
Una correlazione significativa è stata trovata tra i valori di TAC (Tabella 7). I risultati
suggeriscono quindi che i saggi sono comparabili e intercambiabili, quando sia necessaria una
valutazione delle caratteristiche della TAC nel miele.
Tabella 7: Matrice di correlazione (Coefficienti di correlazione Pearson) per le determinazioni
quantitative nei cinque cubani mieli uniflorali.
Variabile
TCC
TFC
TPC
FRAP
TEAC
ORAC
COLOR
COLOR
0.91*
0.97**
0.95**
0.94**
0.91*
0.89*
--
ORAC
0.84*
0.91*
0.93*
0.95**
0.96**
--
TEAC
0.85*
0.83*
0.95**
0.96**
--
FRAP
0.66*
0.89*
0.89*
--
TPC
0.89*
0.83*
--
TFC
0.81*
--
TCC
--
Ad eccezione della diagonale, i valori e livello di significatività sono segnalati, in un intervallo di confidenza del 95%. *
Significatività con p ≤ 0.05, ** significativo al p ≤ 0,001. TCC, contenuto totale di carotenoidi; TPC, contenuto fenolico
totale; TFC, contenuto totale di flavonoidi, TEAC, Capacità antiossidante equivalente (Trolox equivalenti); FRAP, potere di
riduzione del ferro
63
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
I valori della TAC si
12.89 µmol di TE/g di miele
nell’ ORAC, 0.27 – 0.96
µmol di TE/g e 0.54 – 1.96
µmol Fe(II)/g di miele nel
FRAP, ed, infine, tra 1.03 –
2.93 nel saggio del`ABTS.
In tutti e tre i test il miele
di
Linen
vine
è
Fluorescenza relativa della fluoresceina
trovano nel range tra 4.59 –
1.2
Trolox
Blanco
Miele artificialle
Liven vine
Morning glory
Singing bean
Black mangrove
Christmas vine
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
20
la
capacità
60
80
100
120
140
Tempo di Incubazione (min)
stato
identificato come quello che Figura 18.
possiede
40
Curva di decadimento della fluorescenza della
maggiore fluoresceina nel saggio ORAC.
antiossidante,
mentre i valori più bassi sono
Curve rappresentative di decadimento della fluorescina nel saggio ORAC, in presenza
di ogni miele in studio (1 mg/mL), miele artificiale (1 mg/mL), e Trolox (50 µM) come
controllo positivo.
stati riscontrati nel miele di
Christmas vine.
Tuttavia, i valori netti ottenuti da ORAC, TEAC e FRAP sono molto diversi, con i valori
ORAC almeno tre volte superiori ai valori TEAC e FRAP. Questo è dovuto molto probabilmente
alle differenze intrinseche esistenti tra i meccanismi di azione dei tre saggi. Il metodo TEAC
misura la capacità del campione in esame nel ridurre un solo tipo di radicale, l’ ABTS •+, mentre
nel FRAP si misura la capacità di ferro riduzione del composto Fe3+- TPTZ. Nel test ORAC,
invece, si misura la capacità del campione di intrappolare una varietà di radicali inizialmente
innescati dai radicali al carbonio generati dalla decomposizione dell’ AAPH, e quindi il
campione reagisce con un numero elevato di radicali liberi. Nella Figura 18 è raffigurata come
esempio la curva di decadimento della fluorescenza della fluoresceina nel saggio ORAC in
presenza di un miele selezionato, Trolox e di miele artificiale. Nel caso del miele artificiale, i
valori della capacità antiossidante sono notevolmente inferiori (p ≤ 0.05) a quelli trovati nei
campione di miele studiati e simili a quelli riportati in precedenza (Gheldof et al., 2002); ciò
suggerisce l'importante azione antiossidante dei composti precedentemente identificati.
I valori della capacità antiossidante totale trovati da noi sono molto simili a quelli
precedentemente riportati da altri tipi di miele in bibliografia. Gheldof et al. (2002) hanno
riportato valori di ORAC compresi tra 3 e 9 micromoli TE/g in diversi mieli commerciali
64
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
provenienti dagli Stati Uniti. Per quanto riguarda il test ABTS, valori TEAC tra 0.62 e 1.14
micromoli TE/g sono stati riportati da Zalibera et al. (2008) in diversi mieli della Slovacchia,
mentre Baltrušaité et al. (2007) hanno riportato una percentuale di decolorazione del catione
radicale ABTS·+ tra 76.5 % e 81.9 %. In tutti i casi, gli intervalli di valori TAC riportati in
bibliografia sono vicini a quelli trovati nei nostri campioni, suggerendo che i mieli uniflorali
cubani si confrontano favorevolmente con mieli provenienti da altre aree geografiche, per
quanto riguarda l'attività antiossidante.
E 'stato anche riportato che la capacità antiossidante del miele è paragonabile a quella di
frutta e verdura sulla base del peso fresco (Gheldof & Engeseth, 2002; Gheldof et al., 2002; Vela
et al., 2007; Estevinho et al., 2008). I nostri risultati supportano anche questa ipotesi. Ad
esempio, i valori ORAC nei mieli analizzati (4-13 micromoli TE/g) si trovano nel range dei
valori trovati in molti frutti e verdure (0.5-19 mmol TE/g di peso fresco) (Cao et al., 1996; Wang
et al., 1996). Anche se il miele non viene consumato in quantità equivalenti a quelle di frutta e
verdura, può essere utilizzato come sana alternativa allo zucchero in molti prodotti e quindi
servire come fonte supplementare di antiossidanti alimentari (con un'azione importante nella
prevenzione di malattie legate allo stress ossidativo).
Tabella 8. Attività antiossidante totale nelle quattro frazioni ottenute dalla colonna di
frazionamento di Amberlite XDA-2.
Valori d`ORAC espresso in µmol of TE/g
Tipo di miele
ORAC Totale
a
Frazione
acqua
acidificata
Frazione
acqua
neutra b
b
Estratto
etereo
della fase
metanolica
b
Frazioe
acuosa
dopo
l´strazione
con etere b
Somma di
ORACs dei
quattro
frazioni c
Linen vine
12.89 ± 0.28 a
4.65 ± 0.12
1.30 ± 0.02
1.17 ± 0.09
2.36 ± 0.24
9.48 ± 0.24
Morning glory
9.26 ± 0.46 b
3.24 ± 0.16
0.94 ± 0.06
1.22 ± 0.04
1.58 ± 0.37
6.58 ± 0.17
8.12 ± 0.23
c
3.62 ± 0.21
0.72 ±0. 02
0.86 ± 0.02
1.74 ± 0.12
6.16 ± 0. 26
Black mangrove
7.45 ± 0.37
d
2.08 ± 0.14
0.76 ± 0.04
0.83 ± 0.01
0.95 ± 0.25
4.62 ± 0.32
Christmas vine
4.59 ± 0.51 e
1.92 ± 0.11
0.26 ± 0.01
0.43 ± 0.01
0.73 ± 0.13
3.21 ± 0.20
Singing bean
a
Valori totale di ORAC dei miele, b valori di ORAC individuali delle quattro frazioni raccolte dopo l'eluizione dalla resina XAD-
2 Amberlite. c ORAC totale è significativamente più alto rispetto alla somma dell’ ORAC delle quattro frazioni con il Tukey’s
multiple range test (p ≤ 0.05). I valori medi all'interno di una colonna con stessa lettera non sono significativamente diversi (p ≤
0.05). Ogni campione è stato analizzato in triplicato.
65
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Inoltre, dopo che i campioni sono stati frazionati sulla resina di amberlite XAD-2, le quattro
frazioni ottenute sono state testate per la loro attività antiossidante, mediante l`ORAC, in modo
da determinare il loro contributo relativo alla TAC. I risultati sono riportati nella Tabella 8. In
tutti i mieli, la somma delle attività ORAC delle frazioni è stata significativamente inferiore all’
attività ORAC totale del miele (p ≤ 0.001). Ciò può essere dovuto alla complessa composizione
del miele, dove le interazioni tra i diversi componenti antiossidanti sono probabilmente
importanti in termini di attività antiossidante totale; quindi questa capacità antiossidante inferiore
delle frazioni rispetto alla somma potrebbe suggerire interazione sinergica tra le componenti
antiossidanti delle diverse fasi. Tuttavia, la perdita di alcuni antiossidanti nel corso della
procedura di frazionamento non può essere trascurata come spiegazione.
Per tutti i cinque mieli, la fase di acqua acidificata (frazione 1) ha avuto la più alta attività
ORAC, seguito dallo strato di acqua ottenuta dopo l'estrazione con etere della frazione fenolica
(frazione 4), seguita dall`estratto di etere della frazione fenolica (frazione 3) e infine, dalla fase
di acqua neutra (frazione 2). Risultati simili sono stati riportati anche da Gheldof et al. (20002), i
quali hanno ottenuto valori ORAC tra 1.87 e 4.78 µmol TE/g nella fase di acqua acidificata, tra
0.29 e 1.77 µmol TE/g nella strato di acqua (frazione 4) e nella frazione fenolica (frazione 3)
valori tra 0.11 e 0.90 µmol TE/g.
È interessante notare che la frazione solubile in acqua acida presenta la maggiore capacità
antiossidante (Gheldof et al., 20002), anche se la frazione metanolica avrebbe dovuto contenere
la maggior parte dei composti fenolici (Truchado et al., 2009). Il contributo relativo di questa
frazione (frazione 3) all'attività ORAC totale del miele variava da 9,35% (Singing bean) al
13,17% (Morning glory). Si deve tener conto che la maggior parte dei carboidrati sono presenti
nella prima frazione solubile in acqua e dovrebbero quindi contribuire in qualche misura
all'attività antiossidante. Tuttavia, la soluzione di miele artificiale che contiene gli zuccheri
predominanti nel miele ha presentato un basso valore ORAC (1.09 ± 0.10 µmol TE/g),
suggerendo che nella frazione esistano altri composti antiossidanti che contribuiscono all'attività
antiossidante. Una possibile spiegazione potrebbe essere la presenza di flavonoidi glicosidici
polari che eluiscono in questa frazione, come è stato riportato da Truchado et al. (2009). Infatti,
come è stato discusso in precedenza, sono stati trovati in diversi campioni alcuni composti di
questo tipo, anche se non è stato possibile verificare se essi siano effettivamente presenti in
questa frazione. Ulteriori studi sono, quindi, necessari per verificare questo punto.
Un altro aspetto interessante è che lo strato di acqua ottenuto dopo l'estrazione con etere
della frazione fenolica (frazione 4) ha mostrato valori più elevati di ORAC dell`estratto di etere
66
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
della frazione fenolica (frazione 3). L’ estrazione in etere è un passo in più nella purificazione di
questa frazione fenolica, che lascia polimeri fenolici e qualche possibile residuo di zuccheri nello
strato acquoso come è stato riportato da Ferreres et al. (1991). Ciò suggerisce che i polimeri
fenolici potrebbero contribuire di più all'attività antiossidante rispetto ad altri composti fenolici
presenti nella frazione metanolica. Tutti questi risultati indicano che l'attività antiossidante del
miele sembra essere un risultato dell'attività combinata di una serie di composti fenolici e di
componenti minoritari, che contribuiscono insieme all’ attività antiossidante del miele.
III.2.2. Studio della capacità di scavenger dei radicali O2 e OH
Con lo scopo di approfondire le proprietà antiossidanti, è stata studiata la capacità del miele
di reagire con diversi tipi di radicali in modelli semplificati. A questo scopo, abbiamo
inizialmente valutato la capacità del miele di interagire con i radicali O2 attraverso il sistema
ipoxantina/xantina ossidasi (HX/XO) mediante la sua capacità di inibire la produzione di ioni
nitrito prodotti dall’ ossidazione dell’idrossilammina a ioni nitrito da parte dell’
ipoxanhine/xantina ossidasi (HX/XO).
I risultati di questo esperimento sono riportati nella Figura 19 e dimostrano che tutti i mieli
studiati hanno la capacità di reagire con i radicali superossido in un modo dipendente dalla sua
concentrazione, anche se non sono state trovate differenze significative tra loro. I risultati sono
presentati come valori di IC50 (mg/mL), che viene definita come la quantità di sostanza che ha la
capacità di inibire la velocità di produzione degli ioni nitrito.
La percentuale d´inibizione della produzione di ioni nitrito ha mostrato una relazione
sigmoidale con il logaritmo della concentrazione di miele (R2 = 0.989) e il valore IC50 è
diminuito nei diversi mieli nel seguente ordine: Linen vine (0.31 mg/mL) > Morning glory (0.38
mg/mL) > Black mangrove (0.44 mg/mL) > Singing bean (0.47 mg/mL) > Christmas vine (0.52
mg/mL). Non è stato possibile calcolare la costante di velocità di reazione con i radicali O2
perché il miele è un composto grezzo costituito da una miscela di composti di natura chimica
diversa.
67
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
In tutti i campioni testati, è stata trovata una significativa correlazione diretta tra la
concentrazione del miele e la sua attività di scavenger dei radicali O2 (Linen vine, r = 0.912;
Morning glory, r = 0.934; Black mangrove, r = 0.934; Singing bean, r = 0.920 e Christmas vine,
r = 0.942), confermando che questa proprietà è strettamente dipendente dalla concentrazione.
1.0
0.9
0.8
mg/mL
0.7
0.5
0.4
*
*
0.6
*
*
*
IC50 mg/mL
0.3
0.2
0.1
0.0
Linen vine
Mornig
glory
Black
mangrove
Singing
bean
Christmas
vine
Artificial
honey
Honey type
Figura 19. Capacità di scavenger del radicalo superossido del mieli in studio.
Lo studio è stato condotto attraverso il sistema ipoxantina/ xantina ossidasi (HX/XO) e la capacità del miele di inibire la
produzione di ioni nitrito prodotti della ossidazione dell’ idrossilammina a ioni nitrito generata della ipoxanhine/xantina ossidasi
(HX/XO) a pH 8.2. I risultati sono stati espressi come la concentrazione del miele che provoca il 50% di inibizione della
produzione di ioni nitrito (IC50). n = 3 analisis. Le barre di errore fanno riferimento alla variabilità biologica rappresentata come
SD. * p ≤ 0.05 significativamente diversa dal miele artificiale.
Inoltre, una soluzione di miele artificiale è stata inclusa nel test, al fine di valutare il
contributo degli zuccheri predominanti nel miele sull'attività studiata. I risultati hanno dimostrato
che gli zuccheri del miele hanno una bassa attività di scavenger di radicali O2; la loro IC50
infatti è notevolmente inferiore (0.89 mg/mL) a quella riportata nei mieli studiati ed è
statisticamente significativa (p <0.05). Questo fatto suggerisce che i composti precedentemente
studiati sono i mediatori di tale attività.
D'altra parte, la capacità di interagire con i radicali OH è stata determinata attraverso la
tecnica EPR-spin trapping. Gli spettri EPR registrati per i controlli positivi e negativi, miele
artificiale e i diversi mieli uniflorali sono mostrati nella Figura 19.
68
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
b)
a)
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
0
0
-5000
-5000
-10000
-10000
-15000
-15000
-20000
-20000
20000
c)
d)
15000
20000
15000
10000
10000
5000
5000
0
0
-5000
-5000
-10000
-10000
-15000
-15000
-20000
-20000
e)
f)
Unità arbitrarie
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
0
0
-5000
- 5000
-10000
- 10000
-15000
- 15000
-20000
- 20000
h)
g)
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
0
0
-5000
- 5000
-10000
- 10000
-15000
- 15000
-20000
3300
3320
3340
Gaus
3360
3380
3400
3420
- 20000
3300
3320
3340
3360
3380
3400
3420
Gauss
Figura 19. Intensità del segnale EPR nello studio dell’ attività di scavenger del radicale OH•
nei cinque tipi di miele studiati.
La capacità del campione di scavenger i radicali OH è stata studiata con l’ uso della tecnica EPR-spin trapping è stata testata
attraverso il sistema generatore di radicale idrossili generati dalla reazione di Fenton. (a) spettro EPR tipico del radicale OH•
intrappolato con DMPO dalla reazione di Fenton (controllo positivo), (b) mieli incubati con H2O2 + FeSO4 e DMPO, (c) spettri
EPR tipici ottenuti per il miele uniflorale 10% (w/v) senza H2O2 + FeSO4 e DMPO. EPR spettri (d-h) ottenuti per il miele
uniflorale 10% (w/v) incubato con H2O2 + FeSO4 e DMPO e registrato un minuto dopo l'aggiunta di FeSO4 alla miscela di
reazione: (d) Christmas vine, (e) Morning Glory, (f) Black mangrove, (g) Linen vine and (h) Singing bean, n = 3 analisi.
69
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
La formazione dell’ addotto DMPO-OH è più pronunciato nel controllo positivo (senza
miele) (grafico Xa), mentre la presenza del miele provoca una diminuzione dell’ intensità di
segnale dell’ addotto DMPO-OH. Ciò dimostra che i mieli, con le loro componenti antiossidanti,
sono in grado di intrappolare queste specie e competere con la trappola per lo spin OH. Inoltre,
è stato trovato un rapporto tra l'intensità del segnale (e quindi l`attività scavenger OH) e l'origine
floreale del miele. Come è mostrato nella Figura 20, è stata osservata una significativa riduzione
(p < 0.01) di ampiezza del segnale DMPO-OH nel miele di Singing bean e Linen vine, seguiti
dal miele di Black Mangrove e Christmas vine, mentre il miele di Morning glory e il miele
artificiale sono stati quelli con la minore capacità di scavenger i radicali idrossili (p ≤ 0.05).
DMPO-OH signal amplitude (a.u)
25000
20000
*
*
15000
10000
**
**
**
**
5000
0
DMPO
Singing
bean
Linen vine
Black
mangrove
Christmas
vine
Morning
glory
Miele
artificiale
Tipo di miele
Figure 20. Attività di scavengin del radicale OH• nei cinque tipi di miele studiati.
Controllo positivo (DMPO, H2O2 e FeSO4), l`ampiezza del segnale è stata confrontata con quelli dell’ addotto DMPO-OH
registrata in presenza di mieli. La diminuzione dell’ ampiezza del segnale nei campioni di prova è correlata con la loro attività
antiradicalica. n = 3 analisi. Le barre di errore fanno riferimento alla variabilità biologica rappresentata come SD. * p ≤ 0.05
significativamente diversa dal controllo e ** p < 0.01 altamente significativo rispetto al controllo.
Nell'ambito della protezione alla salute, la presenza nel miele di molecole antiossidanti che
mostrano la capacità di catturare radicali O2, OH, ABTS+, radicali liberi dell'ossigeno e
capacità di ferro riduzione è particolarmente utile. La capacità di cattura dei radicali O2 è
importante per diverse ragioni, una delle quali, come già detto, è legata alla formazione di altre
specie reattive, come il radicale OH e di anioni ONOO (Abuja & Albertini, 2001). Un altro
motivo è direttamente legato alla protezione contro il danno ossidativo a biomolecole, dal
momento che i radicali O2 possono ossidare direttamente le proteine che contengono complessi
4Fe-4S nei loro siti attivi (Halliwell et al., 1995; Gardner et al., 1997). Così, il sistema di difesa
70
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
cellulare contro il danno ossidativo mediato dal radicale O2, che dipende dell'attività della
enzima SOD (Tabella 1, Introduzione), potrebbe essere migliorato con il miele.
Tuttavia, a causa della reazione di scavenger del radicale O2, il miele può contribuire alla
formazione intracellulare di H2O2 (allo stesso modo del funzionamento del SOD) ed
extracelulare,
dovuto alla presenza dell’ enzima glucosio-ossidasi come uno dei suoi
componenti (Gardner et al., 1997). In questo caso, la presenza supplementare nel miele di
molecole antiossidanti con capacità di ferro riduzione e di cattura dei radicale OH poù suggerire
che questi siano in grado di proteggere contro la tossicità indotta da H2O2 in presenza di metalli
come Fe2+. I radicali OH sono molto reattivi e sono coinvolti in danni alle biomolecole, come i
lipidi; ciò si verifica soprattutto in situazioni di stress ossidativo nelle cellule (poner aqui si por
fin fibroblastos (Schulz et al., 2000). Alcune stime indicano che circa 50 radicali OH si formano
al secondo in ogni cellula del corpo, ma non ci sono meccanismi enzimatici antiossidanti che
agiscono direttamente su di essi (Simonian & Coyle, 1996). Pertanto, la cattura di questi radicali
è una funzione delle molecole non enzimatiche come quelle che possono essere presenti nel
miele; l'esistenza di molecole che agiscano come antiossidanti diretti e indiretti nel miele può
spiegare il loro effetto protettivo contro la perossidazione lipidica in omogenati di tessuto epatico
di ratto. Il coinvolgimento della perossidazione lipidica nella formazione del danno cellulare in
diverse malattie degenerative è stato ben supportato (Schulz et al., 2000; Behl & Moosmann,
2002; Gilgun-Sherki et al., 2002) e sottolinea quindi la rilevanza delle proprietà antiossidanti del
miele come prodotto in grado di ridurre i danni ai lipidi di membrana causati dallo stress
ossidativo.
III.2.3. Valutazione dell'attività inibitoria della perossidazione lipidica in omogenati di
tessuto epatico di ratto
Per approfondire la capacità antiossidante del miele è stata valutata la sua attività inhibitoria
nei confronti della formazione di TBARS prodotti durante la perossidazione lipidica spontanea
che si verifica a T = 37 ºC in omogentai di fegato di ratto.
Per questo studio sono stati selezionati due tipi di miele sulla base della loro capacità
antiossidante totale studiata in precedenza, quella con la maggiore (LEÑ) e quella con la minore
(CB) capacità antiossidante totale.
71
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
In queste condizioni sperimentali è
BA
Liven vine
Christmas vine
% inibizione della perossidazione
lipídica spontanea
stato evidenziato che il miele ed i
flavonoidi purificati sono efficaci nel
prevenire
la
perossidazione
lipidica
spontanea in omogentao di fegato di ratto
ed è stato evidenziato anche un rapporto
diretto tra la sua concentrazione e i valori
IC50 ottenuti.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
mg/ mL
mostrano che il miele Linen vine ha
presentato una maggiore capacità di
prevenire
la
perossidazione
lipidica
spontanea con un valore di IC50 di 1.39
mg/mL, mentre il miele di Christmas
vine ha una capacità inferiore nel
prevenire il fenomeno di ossidazione dei
lipidi nell’ omogenato di fegato e quindi
è
necessaria
una
B
Christmas vine
Linen vine
% inibizione della perossidazione
lipidica indotta
I risultati esposti nella Figura 21 A
120
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
mg/mL
8
10
12
concentrazione
maggiore rispetto al miele di Linen vine,
che è stata determinata per un valore di
IC50 di 3.10 mg/mL.
Figura 21. Curva di concentrazione-risposta per l'effetto del miele sulla formazione di TBARS
durante la perossidazione spontaneo (A) o indotta chimicamente (B) in omogenati di fegato di
ratto.
I valori per entrambe le curve rappresentano la media di due esperimenti  SD con cinque repliche (N = 10). Per emtrambi gli
esperimenti è stato usato il Trolox alla concentrazione 200 mol/l come controllo positivo, che ha prodotto una percentuale
d`inibizione della perossidazione lipidica di: 61 ± 5% in A e 65 ± 8% in B . I valori di IC50 sono stati determinati utilizzando il
programma statistico GraphPad Prism.
La Figura 21 B mostra i risultati del`effetto antiossidante prodotto dal miele quando la
perossidazione lipidica è stata indotta chimicamente con l'aggiunta di acido ascorbico e FeCl3 in
omogenati di tessuto di fegato di ratto incubati a T=25 °C. Simile ai risultati esposti in
precedenza, è stato evidenziato anche un rapporto diretto tra l'effetto inibitorio della
72
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
perossidazione lipidica e la concentrazione di miele aggiunta. Anche in queste caso (come
l’inibizione della perossidazione lipidica spontanea), è stato rilevato che il miele di Linen vine
presenta migliori effetti inibitori contro la perossidazione lipidica indotta chimicamente con un
valore de IC50 di 4.76 mg/mL, mentre il miele di Christmas vine presenta un effetto minore con
un valore di IC50 di 8.94 mg/mL.
Inoltre, i risultati dello studio dell’ effetto protettivo dei flavonoidi estratti dal miele contro la
perossidazione lipidica nell’ omogenato di fegato di ratto sono raffigurati nella Figura 22.
A
% PI Cv
% PI Christmas vine
B
% PI Lv
% PI Linen vine
% inibizione della
perossidazione
lipidica spontanea
100
80
60
% inibizione della perossidaziine
lipidica indotta
100
90
80
70
60
50
40
4030
20
40
20
10
10 0
0
0
20
40
60
80
100
0
µg/mL
20
0
40
60
80
100
µg/mL
0
0
120
Figura 22. Curva di concentrazione-risposta per l'effetto dei flavonoidi estratti dal miele di Liven
vine e Christmas vine sulla formazione di TBARS durante la perossidazione spontanea (A) o
indotta chimicamente (B) in omogenati di fegato di ratto.
I valori per entrambe le curve rappresentano la media di due esperimenti  SD con cinque repliche (N = 10). Per emtrambi gli
esperimenti è stato usato il Trolox alla concentrazione 200 mol/l come controllo positivo, che ha prodotto una percentuale
d`inibizione della perossidazione lipidica di: 61 ± 5% in A e 65 ± 8% in B . I valori di IC50 sono stati determinati utilizzando il
programma statistico GraphPad Prism.
La Figura 22 A mostra che i flavonoidi estratti dal miele presentano una importante capacità
di prevenire la perossidazione lipidica spontanea con un valore di IC50 di 53.13 µg/mL, mentre il
miele di Christmas vine ha mostrato un comportamento simile ai precedenti esperimenti con una
capacità inferiore nel prevenire il fenomeno di ossidazione dei lipidi nel tessuto; la sua CI50
infatti è di 59.17 µg/mL. Parallelamente a questo studio è stata anche esaminata la capacità dei
flavonoidi di inibire la perossidazione lipidica indotta chimicamente. La Figura 22 B mostra i
risultati dove ancora è evidenziato un rapporto diretto tra l'effetto inibitorio della perossidazione
lipidica e la concentrazione dei flavonoidi. Anche in questo caso, il miele di Linen vine presenta
migliori effetti inibitori contro la perossidazione lipidica indotta chimicamente con un valore de
73
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
IC50 di 66.74 µg/mL, mentre il miele di Christmas vine presenta un effetto minore con un valore
di IC50 de 82.61 µg/mL.
Questi esperimenti hanno dimostrato che tanto il miele come i suoi composti fenolici sono in
grado d`inibire, in modo concentrazione-dipendente, la perossidazione lipidica spontanea in
omogenati di fegato di ratto. Alla temperatura in cui viene eseguito lo studio (T = 37 °C), la
perossidazione lipidica spontanea è avviata in seguito alla separazione del contenuto degli
idroperossidi lipidici presenti nell’ omogenato, catalizzata dai metalli di transizione (Fe2+
fondamentalmente) liberati dalla perdita di integrità cellulare del tessuto. Come risultato, si
formano radicali lipidici (RO2, RO) altamente reattivi che iniziano il danno ad altre molecole
lipidiche e innescano la reazione perossidativa a catena (Arai et al., 1987; Fauré et al., 1990).
Come è stato suggerito da questi Autori, un effetto antiossidante ottenuto in queste condizioni
può essere correlato soprattutto alla capacità di catturare diversi tipi di radicali liberi formati
durante l'evento perossidativo e quindi un ottimo effetto prottetivo contro i danni causati da
questo meccanismo.
Al fine di stabilire meglio l'importanza relativa di questa modalità di azione antiossidante del
miele e dei suoi composti fenolici, è stato condotto anche uno studio per verificare se erano
anche in grado d`inibire questo fenomeno su di un modello di perossidazione lipidica indotta
chimicamente dal FeCL3 e l'acido ascorbico.
In questo secondo studio l`inizio della perossidazione è avviata dall'attacco del radicale OH,
formato attraverso la reazione di Fenton, in presenza di Fe 2+ in eccesso e acido ascorbico (come
agente riducente) (Halliwell et al., 1995; Callaway et al., 1998). Una volta iniziata la sequenza di
reazioni che generano il danno lipidico, la propagazione avviene con l'eccessiva formazione di
nuovi radicali lipidici (RO2, RO), allo stesso modo del modello precedente. La temperatura alla
quale il test viene eseguito (T = 25 °C) riduce al minimo la perossidazione lipidica spontanea e
consente quindi la differenziazione dei meccanismi di inizio dei danni ai lipidi. Così, in questo
modello, l'attività antiossidante che è stata registrata può essere correllata preferenzialmente con
la capacità di chelare Fe2+ e, anche in misura minore, con la capacità di intrappolare i radicali
liberi coinvolti nella iniziazione e nella propagazione dei danni ai lipidi (Callaway et al., 1998).
I valori di IC50 determinati nel caso del miele intero nel primo test (Inibizione della
perossidazione lipidica spontanea, Figura 21 A) sono stati significativamente inferiori (p ≤
0.05), di circa tre volte nel miele di Liven vine e di circa due volte nel miele di Christmas vine, in
confronto a quelli del secondo test (Inibizione della perossidazione lipidica indotta
74
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
chimicamente, Figura 21B). Ciò indica che, sebbene il miele possa agire su entrambi i modi di
azione antiossidante (intrappolamento dei radicali liberi e la chelazione del Fe2+), esso ha
mostrato una maggiore efficienza per il primo di questi (intrappolamento), in funzione anche del
tipo di miele, rivelando ancora una volta l'importanza della composizione fitochimica nelle
proprietà biologiche e confermando quindi la loro relazione diretta.
Nel caso dello studio condotto con gli estratti fenolici, questa differenza non è stata cosí
marcata, anche se, come nel test fatto con il miele intero, nel caso della perossidazione lipidica
indotta chimicamente è stato necessario aumentare il range di concentrazioni per ottenere un
valore d`inibizione della perossidazione tra il 20 e il 80 %. Ciò puo essere dovuto al fatto che i
composti fenolici sono più concentrati, evidenziando il loro proprio effetto antiossidante, senza
l`interferenze di altri composti che possono anche agire come potenti antiossidanti e che sono
presenti nel miele in diverse concentrazione. Questo fatto potrebbe essere spiegato anche
tenendo conto che la composizione qualitativa dei fenoli nei due mieli non è molto differente:
infatti sono state riportate solo variazioni del tipo quantitativo, e quindi i meccanismi
antiossidanti (intrappolare radicali liberi e la chelare il Fe 2+) sono molto simili in entrambi i tipi
di estratti.
Con lo scopo di approfondire l’efficacia del miele e dei suoi flavonoidi contro il fenomeno
della perossidazione dei lipidi è stata determinata la concentrazione degli idroperossidi lipidici
generati in ciascuno degli esperimenti sopra descritti. Questo test permette di offrire un valore,
insieme agli altri già esposti, molto più indicativo di questa capacità biologica, visto che diversi
Autori hanno indicato che negli omogenati di tessuti esiste una vasta gamma di composti
(proteine, lipidi intracellulari, etc) che possono interferire con i risultati. La Figura 23 mostra i
risultati della concentrazione degli idroperossidi totali generati nei processi di massima
perossidazione lipidica (spontanea e indotta chimicamente) e l`effetto del miele e dei suoi
flavonoidi nell’ inibire tale processo di perossidazione.
75
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Perossidazione spontanea
Perossidazione indottta
Idroperossidi lipidici (µM)
70
60
#
#
*#
50
*#
#
#
*#
40
*#
30
20
10
0
Massima
perossidazione
lipidica
Miele
Linen
vine
Miele
Christmas
vine
Flavonoidi strati
Liven vine
Flavonoidi strati
Christmas
vine
Massima perossidazione nell’omogenato, tipi di mieli e estratti di
flavonoidi
Figura 23. Concentrazione degli idroperossidi totali generati nei processi di massima
perossidazione lipidica (spontanea e indotta chimicamente).
Il grafico mostra la massima produzione degli idroperossidi lipidici prodotti dalla perossidazione lipidica nell’ omogenato di
fegato di ratto e l`effetto protettivo del miele e dei suoi flavonoidi contro la produzione degli idroperossidi lipidici prodotti dalla
perossidazione lipidica spontanea e indotta chimicamente. Le barre di errore fanno riferimento alla variabilità biologica
rappresentata come SD. # p ≤ 0.05 significativamente inferiore dal controllo (Massima perossidazione lipidica) e * p ≤ 0.05
differenza significativa tra i due tipi di miele.
In tutti i casi il miele e i suoi composti fenolici sono stati in grado di diminuire, in modo
significativo (p ≤ 0.05) rispetto al controllo, la concentrazione degli idroperossidi prodotti dal
processo di perossidazione lipidica tanto spontanea come indotta chimicamente. Anche in questo
caso è stata trovata una differenza significativa (p ≤ 0.05) tra i due tipi di mieli e anche tra i
rispettivi estratti di flavonoidi. In entrambi i casi, il miele di Linen vine e dei suoi flavonoidi
hanno mostrato i migliori risultati con una diminuzione significativa rispetto al controllo e al
miele di Christmas vine e ai suoi flavonoidi; ciò conferma i dati precedentemente esposti. I
risultati presentati da noi sono simili a quelli riportati in letteratura, che, sebbene non abbondanti,
riportano che il miele è in grado di proteggere contro la perossidazione lipidica negli omogenati
di diversi organi (fegato, cerebello, rene) (Pérez et al., 2006). Tale capacità del miele e dei suoi
composti fenolici supportano la conclusione che questi sono in grado di prevenire i danni causati
dal fenomeno perossidativo dei lipidi de membrana e fornire così un importante effetto prottetivo
contro i danni prodotti da questo meccanismo ossidativo.
76
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
III.4- Studio del miele e dei suoi flavonoidi come agenti di protezione contro il danno
ossidativo nei globuli rossi umani
Dati riportati in precedenza hanno riferito le proprietà antiossidanti dei diversi flavonoidi nei
vari modelli di sistemi di membrana come LDL, liposomi e microsomi (Gordon et al., 1998; Van
Acker et al., 2000; Ozgova et al., 2006). Il modello biologico, utilizzato nel presente studio, per
valutare le eventuali variazioni nella risposta cellulare al danno ossidativo, è stato il globulo
rosso. La scelta è stata motivata da diverse osservazioni. In primo luogo, gli eritrociti sono le
cellule più abbondanti nel corpo umano e sono facilmente ottenibili attraverso un semplice
prelievo di sangue. In secondo luogo, a causa delle loro caratteristiche strutturali e funzionali
sono destinati ad essere sotto continuo stress ossidativo e in possesso di caratteristiche
fisiologiche che li rendono un modello cellulare ottimale per lo studio degli effetti e dell'entità
del danno ossidativo. Infatti, poiché l'apporto di ossigeno ai vari organi in tutto il corpo è
effettuato esclusivamente per mezzo degli eritrociti, queste cellule sono costantemente esposte ai
radicali liberi durante la circolazione nel sangue.
Inoltre, l’ alto contenuto di acidi grassi polinsaturi (PUFA) nelle loro membrane, l’ elevata
tensione di ossigeno e la forte concentrazione intracellulare di ferro, potente catalizzatore per le
reazioni dei radicali liberi, e di emoglobina (Hb), promotore potenzialmente potente di processi
ossidativi, rende agli eritrociti facilmente suscettibili ai ROS, sia extracellulari che intracellulari.
Il danno ossidativo a livello della membrana eritrocitaria è generalmente dovuto ad un aumento
del processo di perossidazione lipidica, che a sua volta può causare malfunzionamento delle
membrane. La perossidazione lipidica è stata proposta come un meccanismo generale coinvolto
nel danno cellulare e la morte, fenomeni entrambi precedenti alla emolisi degli eritrociti.
Per continuare lo studio delle propietà antiossidanti e protettive del miele e dei suoi flavonoidi è
stato condotta una ricerca su un modello in vitro di globuli rossi umani, per determinare se il
miele e i suoi flavonoidi erano in grado di proteggere gli eritrociti dall`emolisi indotta dall’
AAPH e anche dall’ ossidazione a livello dei lipidi della membrana. Per questo studio sono stati
selezionati i due tipi di miele precedentemente studiati nella sezione III.2.3, sulla base della loro
capacità antiossidante totale studiata in precedenza.
In entrambi gli studi, la capacità di risposta degli eritrociti incubati sia col miele che con i suoi
flavonoidi contro l`ossidazione prodotta dall’ AAPH è stata valutata in termini di resistenza alla
emolisi delle cellule. Inoltre, è stato determinato anche il grado d`induzione della perossidazione
lipidica prodotta dall’ AAPH nei ghost.
77
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
E’ stato evidenziato che il miele e i flavonidi sono efficaci nell’ inibire la percentuale d`emolisi
e la perossidazione lipidica ed è stato evidenziato anche un rapporto diretto tra la sua
concentrazione e il suo effetto protettivo.
Nella Figura 24 si presenta la percentuale d'emolisi degli eritrociti dopo 1, 3 e 5 ore di
incubazione in tampone PBS (% emolisi spontaneo, grafico 24 A) e in soluzione AAPH (%
emolisi indotta, grafico 24 B). I risultati mostrano che una soluzione di miele al 2 e al 5 % di
concentrazione è in grado di produrre una notevole protezione ai globuli rossi del sangue contro
l`emolisi spontanea. Dopo 5 ore di incubazione il miele è stato in grado di diminuire la
percentuale d`emolisi spontanea da un 7.87 % nel controllo positivo (RBCs + PBS) fino a 2.84 e
2.47 % nelle cellule incubate con il miele di Linen vine e fino a 3.89 e 2.98 % col miele di
Christmas vine a una concentrazione di 2 e 5 % rispettivamente. In questo caso, non sono state
trovate differenze significative tra i due tipi di miele, sebbene rispetto al controllo positivo
(7.87%) ed al miele artificiale (5.03%) è stata trovata una riduzione significamente statistica (p ≤
0.05).
Inoltre, la capacità del miele di proteggere le cellule rosse del sangue contro il danno indotto è
stata valutata ad una concentrazione finale dell’ ossidate AAPH di 50 mM, al fine di valutare se
il miele era in grado di favorire una difesa antiossidante agli eritrociti e alle membrane cellulare,
in particolare quando il danno viene provocato da forti condizioni ossidative. In linea con i
risultati precedenti, è stata trovata una notevole protezione contro il danno prodotto dall’ AAPH
(Figura 24 B). I risultati esposti mostrano che il miele è in grado di proteggere contro il danno
ossidativo indotto dall`AAPH.
Entrambi i mieli sono stati molto efficienti (alle concentrazione di 5%) nel proteggere i globuli
rossi dalla lisi indotta dai radicali perossilici. In questo esperimento sono state trovate differenze
significative nella diminuzione della percentuale di emolisi dopo 5 ore d`incubazione. Il miele di
Linen vine (5 % di concentrazione) ha presentato i migliori risultati protettivi contro l’ emolisi,
con una riduzione della percentuale d`emolisi di 71.91 % nel controllo positivo (RBCs + PBS+
AAPH) fino a 45.24 % in presenza di miele (RBCs + PBS+ AAPH + MIELE). E’ stata trovata
una riduzione significativa (p ≤ 0.05) anche nel miele di CB in confronto al controllo, dopo 5 ore
d`incubazione. Questi dati confermano quindi l'ipotesi del presunto effetto protettivo contro il
danno ossidativo da parte del miele.
78
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
A
8,00
7,00
6,00
1h
5,00
spontanea
% emolisi spontanea
9,00,0
3h
4,00
5h
3,00
2,00
1,00
0,00
Baselin
B
Liven vine 2% Liven vine 5% Christmas
vine 2%
Christmas
vine 5%
Miele
Artificiale 5%
70,00
60,00
50,00
1h
40,00
3h
5h
30,00
20,00
mM)
% emolisi indotta dall`AAPH (50 mM)
80,00
10,00
0,00
Baselin
Liven vine 2% Liven vine 5% Christmas
vine 2%
Christmas
vine 5%
Miele
Artificiale 5%
Figura 24. Cambiamenti nella percentuale d`emolisi spontanea (A) e indotta (B) (AAPH, 50
mM) in eritrociti umani prima e dopo l'incubazione col miele Liven vine e Christmas vine alle
concentrazioni del 2 e 5 %.
I risultati mostrano la percentuale d`emolisi valutata dopo 1, 3 e 5 ore di incubazione nel controllo (RBCs + PBS + miele) o con
AAPH (50 mM) (RBCs + PBS + miele) alle concentrazione di 2 e 5 %. I dati sono presentati come i cambiamenti medi rispetto
alla % basale (Baseline).
Inoltre, i risultati dello studio dell’ effetto protettivo dei flavonoidi del miele contro l`emolisi
indotta dall’ AAPH sono mostrati nella Figura 25. I risultati esposti mostrano che anche in
questo caso i flavonoidi sono in grado di diminuire la percentuale d`emolisi indotta dall’ AAPH.
Entrambi gli estratti di miele sono stati molto efficienti (a partire da 5 µg/mL e fino a 60 µg/mL)
nel proteggere le cellule dalla lisi indotta dai radicali perossilici. I risultati evidenziano, come già
in precedenza, un rapporto diretto tra l'effetto di protezione contro l`emolisi e la concentrazione
dei flavonoidi. In questo studio, il rapporto concentrazione–effetto tra i due estratti di miele non
79
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
ha evidenziato differenze significative tra di loro e questo fatto può essere giustificato come
precedentemente esposto nel caso dello studio negli omogenati di fegato di ratto.
% Inhib Christmas vine
% Inhib Liven vine
120
% Inibizione della emolisis
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Flavonoidi (µg/mL)
Figura 25. Effetto protettivo dei flavonoidi contenuti nel miele Liven vine e Christmas vine
contro l`emolisi indotta dall’ AAPH (50 mM concentrazione finale) in una sospensione di RBCs
(Ht 10%).
I valori e le concentrazione indicati sonostati ottenuti nel corso di una incubazine di 5 ore con AAPH (50 mM concentrazione
finale). La percentuale d`emolisi è riportata come media ± SD (n = 4).
III.5. Suscettibilità alla perossidazione dei Ghost degli eritrociti
Per valutare se la migliore resistenza degli eritrociti all`emolisi ossidativa osservata nel
precedente studio era legata ad una modificazione della funzionalità della membrana
eritrocitaria, sono stati purificati ghosts degli eritrociti sottoposti allo studio precedente in ogni
ora di incubazione; la formazione di idroperossidi è stata quantificata tramite il saggio FOX.
Nel caso dell’ esperimento sul modello in vitro di globuli rossi umani per determinare se il
miele era in grado di proteggere contro l`emolisi indotta dall’ AAPH, è stata trovata una
formazione più bassa dei lipidi idroperossidi nelle membrane degli eritrociti dopo l'incubazione
con miele, però senza alcuna variazione significativa tra i due tipi di miele ma verso il controllo
si (p ≤ 0.05).
80
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Tabella 9: Formazione degli idroperossidi lipidici nelle membrane degli eritrociti dopo
incubazione con miele e AAPH (50 mM).
µM
94.8 a
78.83 b
72.26 b
Controllo (baselin)
Liven vine
Christmas vine
Sono confrontati i valori ottenuti prima e dopo incubazione con miele e AAHP (50 mM). I dati sono presentati come media ± SD
.
Tra i valori medi all'interno di una colonna che condividono la stessa lettera non ci sono differenze statisticamente significative (p
≤ 0.05).
Inoltre, la Figura 26 mostra i risultati dello studio della suscettibilità dei lipidi di membrana
eritocitaria alla perossidazione e l’ effetto protettivo dei flavonoidi del miele. I risultati
evidenziano che i flavonoidi del miele presentano un’ importante capacità nel prevenire la
perossidazione lipidica indotta dall’ AAPH, con un valore di IC50 di 14.92 e 18.84 µg/mL (nel
miele di L e CB, rispettivamente). Ancora una volta i risultati indicano, come in precedenza, un
rapporto diretto tra concentrazione–effetto.
A causa della presenza di componenti funzionalmente rilevanti incorporati nel doppio strato
lipidico di membrana, come proteine, i ghost degli eritrociti possono offrire un sistema più
realistico per valutare l`azione di un farmaco o di un fitochimico nelle biomembrane, rispetto ai
modelli più semplici, come le membrane di liposomi.
% di inibizione della
perossidazione lipidica
% Inhib Christmas vine
% Inhib Liven vine
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Flavonoidi µg/mL
Figura 26. Effetto protettivo di varie concentrazioni (5-60 µg/mL) dei flavonoidi contenuti nel
miele Liven vine e Christmas vine sulla perossidazione lipidica nei ghost di membrane lipidiche
dei globuli rossi trattati con AAPH.
I valori e le concentrazione indicati sono presentati nel corso di una incubazine di 3 ore con AAPH (50 mM concentrazione
finale). La percentuale d`inibizione è riportata come media ± SD (n = 4).
81
_______________________________CAPITOLO III: RISULTATI E DISCUSSIONE
Recenti studi in vitro hanno dimostrato che il legame di composti flavonoidi del miele alle
membrane RBC ha inibito significativamente la perossidazione lipidica e allo stesso tempo
potenziato la propria integrità contro la lisi ipotonica.
È interessante notare che è stato
dimostrato che l`effetto antiossidante e la attività antiemolitica sono risultati strettamente
dipendenti dalla posizione dei flavonoidi nella membrana lipidica (Blasa et al., 2007). In questo
studio è stato dimostrato che i flavonoidi del miele sono in grado di proteggere i globuli rossi
contro il danno generato da diversi ossidanti (AAPH e H2O2) e i risultati da noi ottenuti sono in
accordo con quelli formulati da questi autori.
In breve, i risultati qui esposti indicano l’esistenza di un potenziale effetto dose-dipendente
protettivo dei fitochimici presenti nel miele nella struttura e nella funzionabilità della membrana
dei globuli rossi e quindi può essere anche considerato come la “causa” del benefico effetto del
miele e dei suoi fitochimici sulla salute umana.
82
_______________________________________________CAPITOLO IV: CONCLUSIONI
Il miele ha una composizione chimica che gli permette di avere non solo un alto valore
nutritivo, ma anche interessanti proprietà biologiche. Questo potrebbe spiegare l`effetto benefico
sulla salute umana osservata nei soggetti che consumano regolarmente il miele come parte
integrante della loro dieta, suggerendo quindi che questo contenga composti biologicamente
attivi in grado di modulare diverse funzioni fisiologiche del corpo.
Per quanto riguarda le indicazioni nutrizionali, i carboidrati, soprattutto fruttosio e glucosio,
risultano essere i componenti più rilevanti, che ne fanno una fonte energetica eccellente,
soprattutto per bambini e sportivi. Oltre a ciò, il miele contiene anche un gran numero di altri
costituenti in minori quantità, in grado di produrre molteplici effetti nutrizionali e biologici:
effetti antimicrobici, antiossidanti, antivirali, antiparassitari, antinfiammatori, antimutagenici,
antitumorali e attività immunosoppressiva.
Il primo obiettivo dello studio è stato valutare e confrontare la qualità nutrizionale di cinque
tipi di miele uniflorale cubano, mediante diversi tipi di tecniche, così come identificare e
quantificare gli acidi fenolici e flavonoidi, potenzialmente responsabili dell’effetto antiossidante
del miele . Inoltre sono state determinate in vitro l’attività antiossidante totale del miele e la sua
capacità di scavenging i radicali OH e il radicale O2 , al fine di approfondire il presente lavoro
per quanto riguarda i meccanismi molecolari.
Il miele uniflorale cubano contiene importanti concentrazioni di acidi fenolici, flavonoidi e
carotenoidi, mostrando una notevole capacità antiossidante, facendo si che possa essere utilizzato
come fonte naturale di composti con queste proprietà. I nostri dati sono di particolare interesse
nel correlare l'effetto dell’ origine botanica con l'attività biologica del miele e di confermare la
sua importanza per quanto riguarda la composizione di composti fitochimici. I risultati ottenuti
in questo studio hanno mostrato una differenziazione tra tutti i gruppi di miele, per quanto
concerne la loro concentrazione di acidi fenolici, flavonoidi, le concentrazioni di carotenoidi e i
valori di TAC.
Come secondo obiettivo è stato condotto un esperimento in modelli più complessi, per
determinare se il miele e i suoi flavonoidi siano in grado di proteggere contro lo stress ossidativo,
sia su omogenato di fegato di ratto che su globuli rossi umani.
A tal proposito, abbiamo rilevato che il miele presenta una importante capacità di catturare i
radicali dell'ossigeno, i radicali ABTS.+ e di ridurre gli ioni ferro, caratteristiche che possono
essere correlate direttamente alla protezione contro il danno ossidativo mediato dai radicali liberi
nei confronti delle biomolecole e delle strutture cellulari. Inoltre, il miele e i suoi flavonoidi
84
_______________________________________________CAPITOLO IV: CONCLUSIONI
purificati sembrano essere efficaci nel prevenire la perossidazione lipidica spontanea e indotta
chimicamente, sia in omogenati di fegato di ratto che nei globuli rossi umani; in questi ultimi,
infine, è stato evidenziato che il miele e i flavonidi sono efficaci nel diminuire la percentuale di
emolisi e la perossidazione lipidica, evidenziando anche un rapporto diretto tra la sua
concentrazione e l’ effetto protettivo.
In conclusione, questo studio riporta per la prima volta la composizione dei composti con
potenziali capacità antiossidanti presenti nei mieli uniflorali di Cuba, confermando che essi
contengono notevoli concentrazioni di acidi fenolici e flavonoidi. I risultati qui presentati
indicano quindi che la capacità antiossidante del miele è probabilmente il risultato dell'attività
combinata e delle interazioni di una vasta gamma di composti, tra cui composti fenolici, così
come eventualmente enzimi e altri componenti minori. Il miele, perciò, rappresenta uno dei
prodotti naturali che può essere preso in considerazione per mantenere un buono stato di salute e
per proteggere contro i danni causati dai radicali liberi.
85
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA

Abuja PM, Albertini R (2001). Methods
for monitoring oxidative stress, lipid
peroxidation and oxidation resistance of
lipoproteins. Clinica Chimica Acta. 117.

Aljadi AM, Kamaruddin MY (2004).
Evaluation of the phenolic contents and
antioxidant capacities of two Malaysian
floral honeys. Food Chem 85:513-518

Al-Khalifa AS & Al-Arify IA (1999).
Physicochemical characteristics and
pollen spectrum of some Saudi honeys.
Food Chem., 67, 21–25.

Al-Waili NS (2003) Effects of daily
consumption of honey solution on
hematological indices and blood levels
of minerals and enzymes in normal
individuals. J Med Food 6:135-140




Ames BN, Gold LS, Willett WC (1995)
The causes and prevention of cancer.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:52585265.
Andrade P, Ferreres F, Amaral MT
(1997). Analysis of honey phenolic acids
by HPLC, its application to honey
botanical characterization. J. Liq.
Chromatogr. Relat. Technol. 20, 22812288.
Arai H, Kogure K, Sigioka E, Nakauro
M (1987) Importance of two iron
reducing systems in lipid peroxidation of
brain: implications for oxygen toxicity in
the central nervous system. Biochem.
Int., 14: 741- 749.
Ardanaz N, Pagano PJ (2006). Hydrogen
peroxide as a paracrine vascular
mediator: regulation and signalling
leading to dysfunction. Exp Biol Med.,
231:237-251.

Aruoma OI (1996). Characterization of
drugs as antioxidant prophylactics. Free
Rad Biol Med. 20(5): 675-705.

Aruoma OI (1998). Free radicals,
oxidative stress, and antioxidants in
human health and disease. J. Am. Oil
Chem. Soc. 75: 671–683.

Aruoma OI (2003). Methodological
considerations
for
characterizing
potential antioxidant actions of bioactive
components in plant foods. Mutation
Research. 523-524: 9-20.

Azeredo LC, Azeredo MA, De Souza,
RM, Dutra VML (2003). Protein
contents and physicochemical properties
in honey samples of Apis mellifera of
different floral origins. Food Chem., 80,
249–254.

Azzi A, Davies KJA, Kelly F (2004)
Free radical biology- terminology and
critical thinking. FEBS Letters. 558:3-6.

Babior BM (1999). NADPH oxidase: an
update. Blood. 93:1464-1476.

Baltrušaité V, Rimantas P, Čeksterytė V
(2007). Radical scavenging activity of
different floral origin honey and
beebread phenolic extracts. Food Chem.,
101, 502-514.

Bang LM, Buntting C, Molan P (2003)
The effect of dilution on the rate of
hydrogen peroxide production in honey
and its implications for wound healing. J
Altern Compl med., 9: 267-273.

Bastianetto S, Quirion R (2002) Natural
extracts as possible protective agents of
86
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA
brain
aging.
23(5):891-897
Neurobiol
Aging.

Beal MF (2005). Less stress, longer life.
Nat Med., 11:598-599.

Beckman KB, Ames BN (1998). The
free radical theory of aging matures.
Physiol. Rev. 78: 548-581.

Behl C, Moosmann B (2002) Oxidative
nerve cell death in Alzheimer‟s disease
and
stroke:
antioxidants
as
neuroprotective
compounds.
Biol.
Chem. 383:521-536.

Ben-Porath I, Weinberg R (2005). The
signals and pathways activating cellular
senescence. Int J Biochem Cell Biol.,
37:961-976.

Benzie IF, Strain J (1996). The ferric
reducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of „„Antioxidant Power”: The
FRAP assay. Analytical Biochem, 239,
70–76.


Beretta G, Orioli M, Facino RM (2007).
Antioxidant and radical scavenging
activity of honey in endothelial cell
culture (EA.hy926). Planta Med.,
73:1182-1189.
Blasa M, Candiracci M, Accorsi A, Piera
M, Piatti E (2007). Honey flavonoids as
protection agents against oxidative
damage to human red blood cells. Food
Chem., 104, 1635–1640.

Bogdanov S, Jurendic T, Sieber R
(2008). Honey for nutrition and health: a
review. Am J Coll Nutr 27:677–689.

Bogdanov, S (1997) Nature and origin of
the antibacterial substances in honey.
Lebensmittel-Wissenschaft
Technolgie 30:748-753
und-

Bompadre S, Leone L, Politi A, Battino,
M (2004). Improved FIA-ABTS method
for antioxidant capacity determination in
different biological samples. Free
Radical Res., 38, 831–838.

Bradford, MM (1976). Rapid and
sensitive method for quantification of
microgram quanties of protein utilizing
the principle dye binding. Analytical
Biochem., 72, 248–254.

Bravo
L
(1998).
Polyphenols:
Chemistry, dietary sources, metabolism,
and nutritional significance. Nutrition
Rev. 56(11): 317-333.

Cadenas, E (1997). Basic mechanisms of
antioxidant activity. Biofactors, 6, 391–
397.

Callaway JK (2001). Investigation of
AM-36: a novel neuroprotective agent.
Clin Exp Pharm Physiol. 28: 913-918.

Calzada F, Meckes M & Cedillo-Rivera
R (1999). Antiamoebic and antigiardial
activity of plant flavonoids. Planta Med
65, 78– 80.

Campisi J (2005). Review, senescent
cells, tumor suppression, and organismal
aging: good citizens, bad neighbors.
Cell, 120:513-522.

Cao G, Sofic E, Prior RL (1996).
Antioxidant capacity of tea and common
vegetables. J. Agric. Food Chem. 44,
3426-3431.

Carr A, & Frei, B (1999). Does Vitamin
C act as a pro-oxidant under
87
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA
physiological conditions? FASEB J., 13,
1007–1024.







Carter C, Shafir S, Yehonatan L, Palmer
RG, Thornburg R (2006). E novel role
for proline in plant floral nectars.
Naturwissenschaften, 93(2):72-9.
Catani MV, Rossi A, Costanzo A,
Sabatini S, Levrero M (2001). Induction
of gene expression via activator protein1 in the ascorbate protection against UVinduced damage. Biochem. J., 356, 77–
85.
Cesquini M, Torsoni MA, Stoppa GR,
Ogo SH (2003). t-BOOH-induced
oxidative damage in sickle red blood
cells and the role of flavonoids. Biomed.
Pharmacother., 57, 124-129.
Chaudière J, Ferrari-Iliou R (1999).
Intracellular antioxidants: from chemical
to biochemical mechanisms. Food Chem
Toxicol. 949-962.
Chen J, Jarvi M, Lo PC, Stefflova K,
Wilson BC, Zheng G (2007). Using the
singlet oxygen scavenging property of
carotenoid in photodynamic molecular
beacons to minimize photodamage to
non-targeted
cells.
Photochem.
Photobiol. Sci. 6, 1311–1317.
Chia-Chi C, Ming-Hua Y, Hwei-Mei W,
Jiing-Chuan C (2002). Estimation of
Total Flavonoid Content in Propolis by
Two
Complementary
Colorimetric
Methods. Journal of Food and Drug
Analysis, 10, 178-182.
Conti ME (2000). Lazio region (central
Italy) honeys: a survey of mineral
content and typical quality parameters.
Food Control 11:459-463

Cooper AJL, Kristal BS (1997)
Multiples roles of glutathione in the
Central Nervous System. Biol. Chem.
378:793-802.

Copper RA, Molan PC, Harding KG,
(2002). The sensitivity to honey of
Gram-positive
cocci
of
clinical
significance isolated from wounds.
Journal of Applied Microbiology,
93:857-863; 2002.

Cuyckens F, Claeys M (2004). Mass
spectrometry in the structural analysis of
flavonoids.
Journal
of
Mass
Spectometry, 39, 1-15.

Dalle-Donne I, Giustarini D, Colombo
R, Rossi R, Milzani A (2003). Protein
carbonylation in human diseases. Trends
Mol. Med., 9, 169–176.

Dalle-Donne I, Scaloni A, Giustarini D,
Cavarra E, Tell G, Lungarella G, (2005).
Proteins
as
biomarkers
of
oxidative/nitrosative stress in diseases:
The contribution of redox proteomics.
Mass Spectrom. Rev., 24, 55–99.

D'Arcy BR (2005). Antioxidants in
Australian floral honeys -Identification
of
health
enhancing
nutrient
components. RIRDC Publication No
05/040

Davies KJA, Ursini F (1995). The
oxygen paradox. CLEUP University
press, 88-7178-374-3, Padova, Italy.

Davies KJA (1995). Oxidative stress: the
paradox of aerobic life. Biochem Soc
Symp, 61:1-31.

De Ruvo C, Amodio R, Algeri S,
Martelli N, Intilangelo A, D‟Ancona
88
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA
GM, Esposito E (2000). Nutritional
antioxidants as antidegenerative agents.
Int. J. DeV. Neurosci., 18, 359–366.



De Vries JH, Hollman PC, Meyboom S,
Buysman MNCP, Zock PL, van
Staveren WA, Katan MB. (1998).
Plasma concentrations and urinary
excretion of the antioxidant flavonols
quercetin and kaempferol as biomarkers
for dietary intake. Am. J. Clin. Nutr., 68:
60-65.
Dimitrova B, Gevrenova R, Anklam E
(2007). Analysis of phenolic acids in
honeys of different floral origin by solidphase extraction and high-performance
liquid chromatography. Phytochem
Anal., 18(1), 24-32.
Doi E, Shibata D, Matoba T (1981).
Modified
colorimetric
ninhydrin
methods for
peptidase assay. Anal
Biochem, 118, 173- 184.

Dröge W (2002) Free radicals in the
physiological control of cell function.
Physiol Rev. 82: 47–95.

El-Agamey A, Lowe GM, McGarvey D
J, Mortensen A, Phillip DM y Truscott
TG (2004). Carotenoid radical chemistry
and antioxidant/pro-oxidant properties.
Arch. Biochem. Biophys., 430, 37–48.

Esposito E, Rotilio D, Di Matteo V, Di
Gulio C, Cacchio M, Algeri S (2002). A
review of specific dietary antioxidants
and the effect on biochemical
mechanisms
related
to
neurodegenerative diseases. Neurobiol
Aging. 719-735.

Estevinho L, Pereira AP, Moreira L
(2008). Antioxidant and antimicrobial
effects of phenolic compounds extracts
of Northeast Portugal honey. Food and
Chemical Toxicology 46:3774–3779.

Facino RM (2001). Honey in tumor
surgery. Arch Surg 136: 600

Fauré M, Lissi EA, Videla LA (1990).
Antioxidant capacity of allopurinol in
biological systems. Biochem. Int. 21:
357- 366.

Feher J (1985). Free radical reactions in
medicine. Berlin Springer Verlag.

Ferreira I, Edmur A, Barreira JCM,
Estevinho LM (2008). Antioxidant
activity of Portuguese honey samples:
Different contributions of the entire
honey and phenolic extract, Foof Chem.,
114(4): 1438-1443.

Ferreira I, Aires E, Barreira JCM,
Estevinho L (2009). Antioxidant activity
of Portuguese honey samples: Different
contributions of the entire honey and
phenolic extract. Food Chem., 114,
1438–1443.

Ferreres F, Andrade P, Gil MI, TomásBarberán FA (1996). Floral nectar
phenolics as biochemical markers for the
botanical origin of heather honey. Z.
Lebensm, Unters. Forsch, 202(1), 40–44.

Ferreres F, Garcia C, Tomas F, TomasBarberan FA (1993). Hesperetin: A
marker of the floral origin of citrus
honey. J. Sci Food Agric, 61,121–123.

Ferreres F, Giner JM, Tomás-Barberán
FA (1994). A comparative study of
hesperetin and methyl anthranilate as
markers of the floral origin of citrus
89
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA
honey. J. Sci. Food Agric., 65(3), 371–
372.

Ferreres F, Juan T, Perez C, Herrera A,
Garcia C, Tomás-Barberán FA (1998).
Evaluation of pollen as source of
kaempferol in rosemary honey. J. Sci.
Food Agric., 77(4), 506–510.

Ferreres F, Ortiz A, Silva C, Garcia C,
Tomás-Barberán FA (1992). Flavonoids
of “La Alcaria” honey – A study of their
botanical origin. Lebensm Z, Unters.
Forsch., 194,139–143.

Ferreres F, Tomas-Barberán FA, Gil MI,
Tomas-Lorente F (1991). An HPLC
technique for flavonoid analysis in
honey. J Sci Food Agric., 56, 49–56.


Fiorani M, Accorsi A, Blasa M,
Diamantini G,
Piatti E (2006).
Flavonoids from Italian Multifloral
Honeys Reduce the Extracellular
Ferricyanide in Human Red Blood Cells.
J. Agric. Food Chem., 54, 8328-8334.
Frankel S, Robinson GE, Berenbaum
MR (1998). Antioxidant capacity and
correlated characteristics of 14 unifloral
honeys. J Apic Res 37:27-31

Fridovich I (1986). Biological effects of
the superoxide radical. Arch Biochem
Biophys., 246:245-256.

Fridovich
I
(1989).
Superoxide
dismutases, an adaptation to a
paramagnetic gas. J Biol Chem.,
264:7761-7764.

Gardner AM, Xu FH, Fady C, Jacoby
FJ, Duffey DC, Tu Y, Lichtenstein A
(1997). Apoptotic vs nonapoptotic
cytotoxicity induced by hydrogen
peroxide. Free Radic. Biol. Med. 22: 7383

Gheldof N, Wang XH, Engeseth NJ
(2003). Buckwheat honey increases
serum antioxidant capacity in humans. J
Agric Food Chem 51:1500-1505

Gheldof N, Engeseth NJ (2002).
Antioxidant capacity of honeys from
various floral sources based on the
determination of oxygen radical
absorbance capacity and inhibition of in
vitro lipoprotein oxidation in human
serum samples. J. Agric. Food Chem.,
50, 3050-3055.

Gheldof N, Xiao-Hong W, Engeseth N
(2002). Identification and Quantification
of Antioxidant Components of Honeys
from Various Floral Sources. J. Agric.
Food Chem., 50, 5870-5877.

Gil MI, Ferreres F, Ortiz A, Subra E,
Tomas-Barberan FA (1995). Plant
phenolic metabolites and floral origin of
rosemary honey. J Agric Food Chem
43:2833–2838.

Gilgun-Sherki Y, Rosenbaum Z,
Melamed E, Offen D (2002).
Antioxidant therapy in acute central
nervous system injury: current state.
Pharmacol Rev. 54:271-284.

Gilgun-Sherki Y, Rosenbaum Z,
Melamed E, Offen D (2002).
Antioxidant therapy in acute central
nervous system injury: current state.
Pharmacol Rev. 54:271-284.

Gilgun-Sherki Y, Rosenbaum Z,
Melamed E, Offen D (2002).
Antioxidant therapy in acute central
90
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA
nervous system injury: current state.
Pharmacol Rev. 54:271-284.







Gillespie KM, Chae JM., Ainsworth EA
(2007). Rapid measurement of total
antioxidant capacity in plant. Nature
Protocols., 2, 867-870.
Glaser, John A, Denis L Foerst, Gerald
D McKee, Stephan A Quave, and
William L Budde (1981). “Trace
analyses
for
wastewaters”,
Environmental Science and Technology
15, 1426-1435.
González-Paramás AM, Alfonso Gómez
Bárez RJ, Garcia-Villanova T, RivasPalá T, Ardanuy-Albajar R, Sánchez J
(2000). Geographical discrimination of
honeys by using mineral composition
and
common
chemical
quality
parameters. J Sci Food Agric 80:157165.
González AM, Gómez JA, Cordón C,
García-Villanova RJ, Sánchez J (2006).
HPLC-fluorimetric method for analysis
of amino acids in products of the hive
(honey and bee pollen). Food Chem., 95,
148-156.
Gordon MH, Roedig-Penman A (1998).
Antioxidant activity of quercetin and
myricetin in liposomes. Chem. Phys.
Lipids., 97, 79-85.
Grace SC, Logan BA (2000). Enery
dissipation and radical scavenging by the
plant phenylpropanoid pathway. Phil.
Trans. R. Soc. London B. 355: 14991510.
Graf E (1992). Antioxidant potential of
ferulic acid. Free Rad Biol Med. 13:
435-448.

Greer EL, Brunet A (2005). FOXO
transcription factors at the interface
between
nlongevity
and
tumor
suppression. Oncogene., 24:7410-7425.

Greten FR, Eckmann L, Greten TFl
(2004). IKKβ links inflammation and
tumorigenesis in mouse model of colitis
associated cancer. Cell 118: 285-296

Halliwell B (1991). Reactive oxygen
species in living systems: source,
biochemistry, and role in human disease.
Am. J. Med. 91:14-22

Halliwell B, Aeschbacht R, Loligert J,
Aruoma OI (1995). The Characterization
of Antioxidants. Food Chem. Toxic, 33
601-617.

Halliwell B, Gutteridge JM (1989). Free
radicals in Biology and Medicine.
Oxford, Oxford University Press, UK.

Hamzaoglu I, Saribeyoglu K, Durak H et
al (2000). Protective covering of surgical
wounds with honey impedes tumor
implantation. Arch Surg 135-142

Havsteen BH (2000). The biochemistry
and medical significance of the
flavonoids.
Pharmacology
&
Therapeutics, 96, 67– 202.

Heinonen IM, Meyer AS, Frankel EN
(1998). Antioxidant activity of berry
phenolics on human low-density
lipoprotein and liposome oxidation. J.
Agric. Food Chem., 46, 4107–4112.

Henriques A, Jacksin S, Coope R,
Burton N (2006). Free radical
production and quenching in honeys
with wound healing potential. Journal of
91
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA

Iwashina T (2000). The structure and
distribution of the flavonoids in plants. J.
Plant Res., 113, 287-299.

Jiang ZY, Hunt JV, Wolff SP (1992).
Ferrous ion oxidation in the presence of
xylenol orange for detection of lipid
hydroperoxide
in
low
density
lipoprotein. Anal. Biochem., 202(2),384389.

Hix LM, Lockwood SF, Bertram JS
(2004). Bioactive carotenoids: potent
antioxidants and regulators of gene
expression. Redox Rep. 9, 181–191.
Johnsen SP, Overvad K, Stripp C,
Tjonneland A, Husted SE, Sorensen HT
(2003). Intake of fruit and vegetables
and the risk of ischaemic stroke in a
cohort of Danish men and women. Am.
J. Clin. Nutr., 78, 57–64.

Huidobro JF, Sanchez MP, Muniategui
S, Sancho MT (2005). Precise method
the measurement of catalasa activity in
honey. J AOAC Int. 2005, MayJun;88(3):800-4.
Jones DP, Carlson JL, Mody VC, Cai
JY, Lynn MJ y Sternberg P (2000).
Redox state of glutathione in human
plasma. Free Radic. Biol. Med., 28,
625–635.

Iglesias MT, de Lorenzo C, Polo MC,
Martín-Alvarez PJ, Pueyo E (2004).
Usefulness of amino acids composition
to discriminate between honeydew and
foral honeys. Application to honeys
from a small geographic area. J. Agric.
Food Chem., 52, 84-89.
Kagan VE, Kisin ER, Kawai K,
Serinkan BF, Osipov AN, Serbinova
EA, Wolinsky I, Shvedova AA (2002).
Toward mechanism-based antioxidant
interventions: lessons from natural
antioxidants. Ann N Y Acad Sci.
959:188-198.

Kanski J, Aksenova M, Stoyanova A,
Butterfield AD (2002). Ferulic acid
antioxidant protection against hydroxyl
and peroxyl radical oxidation in
synaptosomal and neuronal cell culture
systems in vitro: structure-activity
studies. J Nutr Biochem. 13: 273-281.

Khan FR, Ul Abadin Z, Rauf N (2007).
Honey: nutritional and medicinal value.
Int J Clin Pract., 61(10):1705-7.
Antimicrobial Chemotherapy, 58, 773777.





Hermosín I, Chicón, RM, Cabezudo MD
(2003). Free amino acid composition
and botanical origin of honey. Food
Chem., 83: 263–268.
Hernandez OH, Fraga JMG, Jimenez
AI, Jimenez F, Arias JJ (2005).
Characterization of honey from the
Canary Islands: Determination of the
mineral content by atomic absorption
spectrometry. Food Chem., 93, 449–458.

Ignarro LJ (2000). Introduction and
overview. In Nitric Oxide in Biology
and Pathobiology, 3-19, Accademic
press, San Diego.

Ischiropoulos H, Gow A, Thom SR,
Kooy NW, Royall JA, Crow JP (1999).
Detection of reactive nitrogen species
using 2,7- dichlorodihydroflurescein and
dihydrorhodamine 123. Methods in
Enzymol. 301: 367-373.
92
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA


Khanna S (2000). Protection against
oxidative stress and redox regulation of
cellular responses. Tesis para optar por
el Título de Doctor en Ciencias
Naturales, Universidad de Kuopio,
Finlandia.
Kikuzaki H, Hisamoto M, Hirose H,
Akiyama K, Taniguchi H (2002).
Antioxidant properties of ferulic acid
and its related compounds. J. Agric.
Food Chem. 50: 2161-2168.

Kregel KC, Zhang HJ (2007). An
integrated view of oxidative stress in
aging: basic mechanisms, functional
effects, and pathological considerations.
Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol, 292:18-36.

Krinsky NI (1992). Mechanism of action
of biological antioxidants. Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 200: 248-254.




Krinsky NI (1993). Actions of
carotenoids in biological systems. Annu
Rev Nutr. 13: 561-587
Krtolica A, Parrinello S, Lockett S,
Desprez PY, Campisi J (2001).
Senescent fibroblasts promote epithelial
cell growth and tumorigenesis: a link
between cancer and aging. Proc Natl
Acad Sci USA., 98:12072-12077.
Landis GN, Tower J (2005). Superoxide
dismutase evolution and life span
regulation. Mech. Ageing Dev., 126,
365–379.
Laughton MJ, Halliwell B, Evans,PJ,
Hoult JR (1989). Antioxidant and prooxidant actions of the plant phenolics
quercetin, gossypol and myrecetin.
Effects on lipid peroxidation, hydroxyl
radical generation and bleomycindependent damage to DNA. Biochem
Pharmacol 38, 2859– 2865.

Li WG, Miller FJ, Zhang HJ, Spitz DR,
Oberley LW, Weintraub NL (2001).
H2O2- induced O2• production by a non
–phagocytic NAD(P)H oxidase causes
oxidant injury. J Biol Chem.,
276:29251-29256.

Lievre V, Becuwe P, Bianchi A,
Bossenmeyer-Pourie C, Koziel V,
Franck P, Nicolas MB, Dauca M, Vert P,
Daval JL (2001). Intracellular generation
of free radicals and modifications of
detoxifying enzymes in cultured neurons
from the developing rat forebrain in
response
to
transient
hypoxia.
Neuroscience. 105 (2): 287-297.

Liochev SI, Fridovich I (1994). The role
of O2•, in the production of •OH: in vitro
and in vivo. Free Radical Biology and
Medicine.,16:29-33.

Loikkanen JJ, Naarala J, Savolainen KM
(1998). Modification of glutamateinduced oxidative stress by lead: the role
of extracellular calcium. Free Radic.
Biol. Med., 24:377-384.

Louveaux J, Maurizio A, Vorwohl G
(1970). Methods of Melissopalynology.
Bee World, 51, 125-138.

Manresa A (2005). Clasificación de
mieles de abeja uniflorales mediante
propiedades
químicas,
físicas
y
sensoriales. PhD Thesis. Habana
University, Cuba.

Marnett LJ (2000). Oxyradicals and
DNA damage. Carcinogenesis, 21:361370.
93
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA







Martínez-Florez S, González-Gallego
JM, Culebras JM, Tuñón MJ (2002). Los
flavonoides: propiedades y acciones
antioxidant. Nutr. Hosp. XVII (6) 271278
Martos I, Cossentini M, Ferreres F,
Tomas-Barberan FA(1997). Flavonoid
composition of tunisian honeys and
propolis. J. Agric.Food Chem., 45, 28242829.
Martos I, Ferreres F, Yao L, D-Arcy B,
Caffin N, Tomas-Barberan FA (2000).
Flavonoids in monospecific Eucalyptus
honeys from Australia. Journal of
Agricultural and Food Chem., 48(10),
4744–4748.
Masella R, Di Benedetto R, Vari R,
Filesi C, Giovannini C (2005). Novel
mechanisms of natural antioxidant
compounds in biological systems:
Involvement
of
glutathione
and
glutathionerelated enzymes. J. Nutr.
Biochem., 16, 577–586.
McNulty H, Jacob RF, Mason RP
(2008). Biologic activity of carotenoids
related
to
distinct
membrane
physicochemical interactions. Am. J.
Cardiol. 101, 20–29.
Meda A, Euloge CL, Romito M, Millogo
J, Germane O (2005). Determination of
the total phenolic, flavonoid and proline
contents in Burkina Fasan honey, as well
as their radical scavenging activity.
Analytical, Nutritional and Clinical
Methods, Food Chem., 91: 571–577.
Michalkiewicz A, Biesaga M, Pyrzynska
K (2008). Solid-phase extraction
procedure for determination of phenolic
acids and some flavonols in honey. J
Chrom A 1187:18–24

Michaluart P, Masferrer JL, Carothers
AM (1999). Inhibitory effects of caffeic
acid phenethyl esther on the activity and
expression of cyclooxygenase-2 in
human oral epithelial cell and in rat
model of infmmation. Cancer Res 59:
2347-2352

Miller ER, Pastor-Barriuso R, Dalal D,
Riemersma RA, Appel,L Jy Guallar E
(2005). Meta-analysis: High-dosage
Vitamin E supplementation may
increase all-cause mortality. Ann. Intern.
Med., 142, 37–46.

Molan PC (2001). Potential of honey in
the treatment of wounds and burns. Am j
clin Dermatol 2:9-13

Molan PC, Betts JA (2004). Clinical
usage of honey as a wound dressing: an
update. Journal of Wound Care, 13,
353–6.

Murrel DF (1993). A radical proposal
for the pathogenesis of scleroderma. J
AM Acad Deratol., 28:78-85.

Nanda V, Sarkar BC, Sharma HK, Bawa
AS (2003). Physicochemical properties
and estimation of mineral content in
honey produced from different plants in
Northern India. J. Food Comp Anal., 16,
613–619.

Nanda V, Sarkar BC, Sharma HK,
Bawa AS (2003). Physicochemical
properties and estimation of mineral
content in honey produced from
different plants in Northern India. J.
Food Comp Anal., 16, 613–619.
94
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA








Nogueira CW, Zeni G, Rocha JBT
(2004).
Organoselenium
and
organotellurium compounds: Toxicology
and pharmacology. Chem. Rev., 104,
6255–6285.
Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K (1979).
Assay for lipid peroxide in animal tissue
by thiobarbituric acid reaction Anal
Biochem., 95:331-58.
Oyanagui Y (1989). Reevaluation of
assay methods and establishment of kit
for superoxide dismutase activity. Anal
Biochem., 142, 290-296.
Ozgova S, Hermanek J, Gut I (2006).
Different
antioxidant
effects
of
poloyphenols on lipid peroxidation and
hydroxyl radicals in the NADPH-, FeAscorbate- and Fe-microsomal systems.
Biochem. Pharmacol., 66, 1127-1137.
Pagano G (2002). Redox-modulated
xenobiotic action and ROS formation: a
mirror or a window? Hum Exp Toxicol.,
21:77-81.
Patzold R, Bruckner H (2006). Gas
chromatographic detection of D-amino
acids in natural and thermally treated
bee honeys and studies on the
mechanism of their formation as result
of the Maillard reaction. Eur. Food Res.
Technol, 223 (3), 347-354.
Pérez RA (2002). Analysis of volatiles
from Spanish honeys by solid-phase
microestraction
and
gas
chromatography-mass
spectrometry.
Journal
Agricultural
and
Food
Chemistry, 2002. 50(9):2633-2637.
Pérez E, Rodríguez-Malaver A, Vit P
(2006). Antioxidant Capacity of
Venezuelan Honey in Wistar Rat
Homogenates. J Med Food., 9 (4), 510–
516.

Pérez JC (2000). Evaluación y
distribución del potencial melífero.
Apiciencia, (1):11-19.

Pérez RA, Iglesias MT, Pueyo E,
González M, De Lorenzo C (2007).
Amino
Acid
Composition
and
Antioxidant Capacity of Spanish
Honeys. Journal of Agricultural and
Food Chem., 55, 360 -365.

Pryce RJ (1972). The occurrence of
lunularic and abscisic acids in plants.
Phytochemistry. 11: 1759-1761.

Pryor WA, Houk KH, Foote CS, Fukuto
JM, Iganrro LJ, Squadrito GL, Davies
KJA (2006). Free radical biology and
medicine: it‟s a gas man! Am J Physiol
Regul Integr Comp Physiol., 291, 491511.

Pryor WA (1986). Oxyradicals and
related species: their formation, lifetimes
and reactions. Annu Rev Physiol.,
48:657-667.

Raskin I, Ribnicky DM, Kormamytsky
S, Ilic N, Poulev A, Borisjuc N, Brinker
A, Moreno DA, Ripoll C, Yakoby N,
O‟Neal JM, Cornwell T, Pastor I,
Fridlender B (2002). Plants and human
health in the twenty-first century. Trends
in Biotechnology. 20(12):522- 531.

Rauha JP (2001). The search for
biological activity in Finnish plant
extracts containing phenolic compounds.
Tesis para optar por el Título de Doctor
en Ciencias Farmacéuticas, Universidad
de Helsinki, Finlandia.
95
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA

Rice ME (2000). Ascorbate regulation
and its neuroprotective role in the brain.
Trends Neurosci. 23: 209-216.

Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganda G
(1996). Structure-antioxidant activity
relationships
of
flavonoids
and
phenolic acids. Free Radic Biol Med,
20:933 - 56.

Rieger JM, Shah AR, Gidday JM (2002).
Ischemia-reperfusion injury of retinal
endothelium by ciclooxygenase- and
xanthine oxidase-derived superoxide.
Exp Eye Res., 74:493-501.



Ritcher C, Park JW, Ames BN (1988).
Normal
oxidative
damage
to
mitochondrial and nuclear DNA is
extensive. Proc Natl Acad Sci USA.,
85:6465-6467.
Royall JA, Ischiropoulos H (1993).
Evaluation of 2‟,7‟-dichlorofluorescin
and
dihydrorhodamine
123
as
fluorescent probes for intracellular
H2O2 in cultured endothelial cells.
Arch. Biochem. Biophys. 302(2): 348355.
Russell, KM, Molan PC, Wilkins AL,
Holland PT (1990). Identification of
some antibacterial constituents of New
Zealand manuka honey. J. Agric. Food
Chem 38:10-13

Sahnoun Z, Jamoussi K, Zeghal KM
(1997). Free radicals and antioxidants:
human physiology, pathology and
therapeutics aspects. Therapie; 52: 25170.

Sanz S, Pérez C, Herrera A, SanzMand
Juan T (1995). Application of a
statistical approach to the classi®cation
of honey by geographic origin. J Sci
Food Agric 69:135-140.

Sarafian TA, Vartavarian L, Kane DJ,
Bredesen DE, Verity MA (1994). Bcl-2
expresssion decreases methyl mercuryinduced free radical generation and cell
killing in a neural cell line. Toxicol.
Lett. 74:149-155.

Sauer H (2001). Reactive Oxygen
Species as intracellular messengers
during cell growth and differentiation.
Cell Physiol and Biochem., 11:173-186.

Schafer FQ y Buettner GR (2001).
Redox environment of the cell as viewed
through the redox state of the
glutathione disulfide/glutathione couple.
Free Radic. Biol. Med., 30, 1191–1212.

Schrauzer GN (2006). Interactive effects
of selenium and chromium on mammary
tumor development and growth in
MMTV-infected female mice and their
relevance to human cancer. Biol. Trace
Element Res., 109, 281–292.

Schulz JB, Lindenau J, Seyfried J,
Dichgans J (2000). Glutathione,
oxidative stress and neurodegeneration.
Eur J Biochem. 267: 4904-4911.

Sen CK, Sies H, Baeurle PA (2000) En:
Antioxidant and redox regulation of
genes. Academy Press, San Diego, USA.

Shoham S, Youdim MB (2000). Iron
involvement in neural damage and
microgliosis
in
models
of
neurodegenerative diseases. Cell Mol
Biol. 46(4): 743-760.

Sies H (1986). Biochemie des oxidativen
stress. Angew chem. 98: 1061-1075.
96
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA

Sies H (1985). Oxidative stress:
introductory remarks. In Oxidative
Stress. 1-8, Academic press, London.

Stuehr DJ (1999). Mammalian nitric
oxide synthases. Biochim biophysic
Acta., 1411:217-230.

Simonian NA, Coyle JT (1996).
Oxidative stress in neurodegenerative
diseases. Annu Rev. Pharmacol.
Toxicol. 36:83-106.

Sundaresan M (1996). Regulation of
reactive-oxygen-species generation in
fibroblasts by Rac1. Biochem J.,
318:379-382.

Simonian NA, Coyle JT (1996).
Oxidative stress in neurodegenerative
diseases. Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol., 36:83-116.


Singleton VL, Orthofer R, LamuelaRaventos RM (1999). Analysis of total
phenols and other oxidation substrates
and antioxidants by means of Folin–
Ciocalteu
reagent.
Methods
in
Enzymology, 299, 152–178.
Suwalsky M, Orellana P, Avello M,
Villena F (2007). Protective effects of
Ugni molinae Turcz against oxidative
damage of human erythrocytes. Food
Chem. Toxicol., 45, 130-135.

Taormina PJ, Niemira BA, Beuchat LR
(2001). Inhibitory activity of honey
against
foodborne
pathogens
as
influenced by the presence of hydrogen
peroxide and level of antioxidant power.
Int J Food Microbiology 69:217-225

Tapiero H, Tew KD, Nguyen Ba G,
Mathé G (2002). Polyphenols: do they
play a role in the prevention of human
pathologies?. Biomed Pharmacother.
56(4):200-207.

Terrab A, Gonzále MML, González AG,
Díez MF, Escudero ML, Heredia FJ
(2003). Characterisation of Moroccan
unifloral honeys using multivariate
analysis. Eur. Food Res. Technol.,
218(1):88-95.

Terrab A, Diez MJ, Heredia FJ (2002).
Characterization of Moroccan unifloral
honeys by their physicochemical
characteristics. Food Chem., 79, 373–
379.

Tomás-Barberán FA, Ferreres F, GarcíaViguera C, Tomás-Lorente F (1993).
Flavonoids in honey of different.

Smith-Warner SA, Spiegelman D, Yaun
SS, Albanes D, Beeson WL, van den
Brandt PA, Feskanich D, Folsom AR,
Fraser
GE,
Freudenheim
JL,
Giovannucci E, Goldbohm RA, Graham
S, Kushi LH, Miller AB, Pietinen P,
Rohan TE, Speizer FE, Willett WC,
Hunter DJ (2003). Fruits, vegetables and
lung cancer: a pooled analysis of cohort
studies. Int. J. Cancer, 107, 1001–1011.

Stadtman ER (1992). Protein oxidation
and aging. Science., 257:1220-1224.

Stadtman ER (2004). Role of oxidant
species in aging. Curr. Med.Chem., 11,
1105–1112.

Stocker A, Schramel P, Kettrup A,
Bengsch E (2005). Trace and mineral
elements in royal jelly and homeostatic
effects. Journal of Trace Elements in
Medicine and Biology 19:183–189
97
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA

Tomas-Barberán FA, Martos I, Ferreres
F, Radovic BS, Anklam E (2001). HPLC
flavonoid profiles as markers for the
botanical origin of European unifloral
honeys. J. Sci. Food Agric., 81(5), 485496.
Valko M, Leibfritz D, Moncola, J, Mark,
TD, Cronin, MM, Telser, J (2007). Free
radicals and antioxidants in normal
physiological functions and human
disease. The International Journal of
Biochemistry & Cell Biology, 39: 44–
84.

Truchado P, Ferreres F, Bortolotti L,
Sabatini AG, Tomás-Barberán FA
(2008). Nectar flavonol Rhamnosides
Are Markers of Acacia (Robinia
pseudacacia) Honey. J Food Agric
Chem., 56, 8815-8824.
Valko M, Rhodes CJ, Moncola J,
Izakovic M, Mazura M (2006). Free
radicals, metals and antioxidants in
oxidative
stress-induced
cancer.
Chemico-Biological Interactions, 160,
1–40.

Van Acker FAA, Schouten O, Haenen
GRMM, van der Vijgh WJF, Bast A
(2000). Flavonoids can replace αtyocopherol as an antioxidant FEBS
Lett., 473, 145-148.

Vela L, Lorenzo C, Pérez AR (2007).
Antioxidant capacity of Spanish honeys
and its correlation with polyphenol
content and other physicochemical
properties. J of the Science of Food and
Agriculture, 87, 1069–1075.

Verhagen H, Aruoma OI, van Delft
JHM, Dragsted LO, Ferguson LR,
Knasmüller S, Pool-Zobel BL, Poulsen
HE, Williamson G, Yannai S (2003).
The 10 basic requirements for a
scientific paper reporting antioxidant,
antimutagenic
or
anticarcinogenic
potential of test substances in in vitro
experiments and animals studies in vivo.
Food Chem Toxicol. 41: 603-610.

Vieira O, Escargueil-Blanc I, Meilhac O,
Basile J-P, Laranjinha J, Almeida L,
Salvayre R, Nègre-Salvayre A (1998).
Effect of dietary phenolic compounds on
apoptosis of human cultured endothelial
geographical origin. Z. Lebensm,
Unters. Forsch., 196(1), 38–44.




Truchado P, Martos I, Bortolotti L,
Sabatini AG, Ferreres F, TomasBarberan FA (2009). Use of quinoline
alkaloids as markers of the floral origin
of chestnut honey. J. Agric. Food Chem,
57, 5680–5686
Tulipani S, Mezzetti B, Capocasa F,
Bompadre S, Beekwilder J, de Vos CH
R, Capanoglu E, Bovy A, Battino M
(2008).
Antioxidants,
phenolic
compounds and nutritional quality in
different strawberry genotypes. J. Agric
Food Chem., 56, 696–704.

Tuzen M, Silic S, Mendil D, Soylak M
(2007). Trace element levels in honeys
from different regions of Turkey. Food
Chem., 103: 325–330.

Ursini F, Maiorino M, Morazzoni P,
Roveri A, Pifferi G (1994). A novel
antioxidant flavonoid (IdB 1031)
affecting molecular mechanisms of
cellular activation. Free Radic Biol Med
16, 547– 553.
98
___________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA
cells induced by oxidized LDL British
Journal of Pharmacology.123: 565-573.

Wagner JR, Hu CC, Ames BN (1992).
Endogenous oxidative damage of
deoxycytidine in DNA. Proc Natl Acad
Sci USA.,89:3380-3384.

Yao L, Jiang Y, Singanusong R, D‟Arcy
B, Datta N, Caffin N (2004). Flavonoid
in Australian Malaleuca, Guioa,
Lophostemon, Banksia and Helianthus
honeys and their potential for floral
authentication. Food Res Int., 37(2),
166–174.

Yi-Fang C, Jie S, Xianzhong W, Rui HL
(2002). Antioxidant and antiproliferative
activities of common vegetables. J.
Agric. Food Chem., 50, 6910–6916.

Weston RJ, Brocklebank LK, Lu Y
(2000). Identification and quantitative
levels of antibacterial components of
some New Zealand honeys. Food Chem
70:427-435
Youdim KA, Spencer JPE, Schroeter H,
Rice-Evans C (2002). Dietary flavonoids
as potential neuroprotectants. Biol
Chem., 383:503-519.

Weston RJ, Mitchell KR, Allen KL
(1999).
Antibacterial
phenolic
components of New Zealand manuka
honey. Food Chem., 64:295-301
Youdim KA, Spencer JPE, Schroeter H,
Rice-Evans C (2002). Dietary flavonoids
as potential neuroprotectants. Biol
Chem. 383:503-519.

Zalibera M, Straško A, Šlebodovà A,
Jančovičovà V, Čermàkovà T, Brezovà
V (2008). Antioxidant and radicalscavenging activities of Slovak honeysAn electron paramagnetic resosance
study. Food Chem., 110, 512-521.

Zangar RC, Davydox DR, Verma S
(2004). Mechanisms that regulate
production of reactive oxygen species by
cytochrome P450. Toxicol Appl
Pharmacol., 199:316-331.

Wahdan HAL (1998). Causes of the
antimicrobial activity of honey. Infection
26:26-31

Wang H, Cao G, Prior RL (1996). Total
antioxidant capacity of fruits. J Agric
Food Chem., 44:701-705.




(2003). Flavonoids, phenolic acids and
abscissic acid in Australian and New
Zealand Leptospermum honeys. Food
Chem., 81(2), 159–168.
Wang XH, Gheldof N, Engeseth NJ
(2006). Effect of processing and storage
on antioxidant capacity of honey. J Food
Sci 66, 96–101.
Wink DA, Hanbauer I, Krishna MC,
DeGraff W, Gamson J, Mitchell JB
(1993). Nitric oxide protects against
cellular damage and cytotoxicity from
reactive oxygen species. Proc Natl Acad
Sci USA., 90:9813-9817.

Yan X, Nagata T, Fan X (1998).
Antioxidative activities in
some
common seaweeds. Plant Foods Hum
Nutr., 52: 253-262.

Yao L, Datta N, Tomas-Barberan FA,
Ferreres F, Martos I, Singanusong R
99
___________________________________________________________RINGRAZIAMENTI
Muchísimo más brevemente de lo que quisiera y finalmente en español, expreso mis
agradecimientos a todos los que contribuyeron a la realización de uno de mis sueños y por ende
de esta tesis. Algunos deben ser necesariamente mencionados, como:
mi tutor (con signos de exclamación): el profe Maurizio Battino: profe: Ud sabe que sin
usted no hubiese nunca podido lograr el llegar a donde estoy ahora, mi agradecimiento no tendrá
fin.
mis compañeros de grupo: Sarita (ilustre PhD) quien me guio en mis primeros pasos por
estos laboratorios y quien contribuyó decisivamente y en grado sumo (durante y después de la
investigación) al perfeccionamiento de mi ser como investigador… (Te admiro y te quiero TIA y
lo sabes bien)……
a mi compañera de batalla Stefna, con quien he batallado durante estos largos tres años
luchado contra voluntarios y nuestros queridos y apreciados equipos (HPLC, FIA-ABTS, etc
…….) . Stefy hurra LO LOGRAMOS ¡!!!!!!!!!!!!!.
a los queridos profes y personas cercanas al trabajo en este período: Luca, Francesca, Liz,
Beta, la querida Mónica……...
qué decir del equipo del Master On line, Luisa y su esposo Luca (mis padrinos), saben
que sin su ayuda no hubiese podido lograr nada, los agradecimientos y mi cariño hacia ustedes
van más allá de lo que pueda expresar ahora mismo. Mattia, el gran Mattia, otro del grupo loco
del master quien ha sido un excelente amigo y compañero y quien me ha sacado de buenos
apuros con sus excelentes correcciones del inglés, GRACIAS AMIGO……!!!!!!
a Francesca Giampieri, quien desde que se incorporó a nuestro grupo, ha sido una
excelente colega y apoyo para toda esta locura de la cual nos nutrimos diariamente y quien me
tendrá que soportar aun por un tiempecito más………
Stefano, aunque siempre estoy peleando contigo por que el electroquímico no funciona,
sabes que eres indispensable para mí y nuestro trabajo, así que gracias por estar ahí siempre
cuando te he necesitado y por brindarme tu ayuda, tu simpatía y tus conocimientos …..
mis amigos insustituibles de todos lados que aunque lejos estén (CUBA) siempre los
recuerdo a ellos también dedico este trabajo
a mis PADRES, que decir de ellos ¡!!!!!, que mejor puedo hacer que regalarles este bulto
de palabras y extraños gráficos, pero que en sí encierra un gran significado y que con ello
pueden ver que su esfuerzo no ha sido en vano, que sus sacrificios, sus horas de desvelo y su
cansancio y preocupación para que siempre pudiera dedicarme a mis estudios…. Gracias papi,
gracias mami ¡!!!!!.
___________________________________________________________RINGRAZIAMENTI
a otro pedacito de mi ser que extraño a cada momento y que es mi hermano, Jorgi,
gracias por estar ahí siempre que te he necesitado, no digo más ……………!!!!!!!!.
a mi tío Carlos, mi tía Ana y mi primo José Antonio quienes han demostrado que nuestra
familia es única y eso me consta……., Gracias a ustedes también
a mis abuelos, donde quiera que estén y que sé que me miran todo el tiempo, muchas
gracias mis viejitos y ya descansen que hicieron MAS de lo que estaba en sus manos por los
caprichos de este nieto un poco caprichoso
por último (y no por ser menos importante ¡!!!!!) a mi linda, querida y siempre adorada
señora del amor, la dulzura, OSHUN, la linda Yalorde, GRACIAS POR PONER TU MIRADA Y TU SANTA
MANO SOBRE MI Y CONCEDERME ESTOS CAPRICHOS DE LOCO.
Mis agradecimientos al Dr Alfredo Dominguez, quien me hizo comprender, antes que el resto de
las personas, que la tesis de Doctorado per se es mucho menos importante que el trabajo y la
consagración que se necesitan para lograrla.
GRACIAS A TODOS…….!!!!!!!!!!!