DISS. ETH NO. 17305 DETERMINATION OF HYDRATION PROPERTIES OF INSOLUBLE PLANT MATERIAL WITH DIFFERENT METHODS UNDER PHYSIOLOGICAL CONDITIONS A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by ALESSANDRA FRAZZOLI Dottoressa in Chimica Industriale, Università degli studi di Bologna born April 13, 1976, citizen of Italy accepted on the recommendation of Prof. Dr. Renato Amadò, examiner Prof. Dr. Felix Escher, co-examiner 2007 Summary The beneficial health effects of dietary fibre in human nutrition are generally recognised. One key factor for the positive effects of fibre in the gastrointestinal tract are the hydration properties, important physical features, which should therefore be considered in studies concerning mechanical and physical properties of dietary fibre. Different methods analysing the hydration properties of insoluble samples are available. This study was firstly aimed to improve and apply a method determining only the macroscopic water uptake, i.e. only the water taken up by the swollen particles (dye exclusion method). Subsequently, the results obtained by this method were compared to those obtained by a method determining the swelling of the samples (swelling method), and by a method determining the kinetics of the water absorption. This comparison allowed to validate the results obtained by the improved dye exclusion method and to outline the most relevant applicative aspects of the different methods used. To improve the knowledge on the behaviour of the non-digestible carbohydrates during the passage through the gastrointestinal tract trials simulating the physiological conditions (37 °C, at pH values between ~1 and ~7 in physiological buffers, continuous mixing when possible) were carried out. For comparative purpose, the experiments were also performed at different experimental conditions (22°C, different hydration liquid, different material/liquid ratio or amount of material, presence or absence of continuous mixing). The influence of the particle size and of the in vitro digestion was also studied. The improved dye exclusion method turned out being not very robust and the accuracy of the results obtained was considered low for an analytical method. However, reproducible and reliable results could be obtained paying particular attention to the different steps of the procedure. A disadvantage of the dye exclusion method could be the possible interaction of the FITC-dextran with the samples at low pH which would limit the field of application of this technique with respect to the pH. A probable interaction of the FITC-dextran with the samples at low pH was noticed. This observation suggested prudence in the use of this technique at low pH. X Summary The swelling method was the simplest method from the experimental point of view and consequently the results were little influenced by procedural parameters. Nevertheless, the swelling as the kinetics of the water absorption method does not allow the direct determination of the water uptake as the dye exclusion method does. Water uptake values can be calculated, but the introduction of other experimental data (e.g. ρb) and approximations led to results affected by errors. The expected positive correlation between the particle size and the swelling values was observed, while an equalisation of the water uptake values was noted. Lower swelling values of the digestion residues were generally not observed for the digested samples as compared to the corresponding non-digested samples. On the contrary, the water uptake values confirmed the hypothesis that the digestion leads to materials which are more dense and, therefore, less susceptible to hydration than the non-digested ones. In general, the hydration properties were found scarcely influenced by the different pH observable during the passage of food through the gastrointestinal tract (pH ~1, ~5, ~7). Similarly, no influence of the temperature (22 °and 37 °C) and of the hydration liquid (physiological buffer, low concentrated buffer, nanopure water) was found. The physiological conditions considered in the present study were extremely simplified and the results obtained should be considered only as an approximate representation of the behaviour of dietary fibre along the gastrointestinal tract. The NMR relaxometry technique did not allow obtaining the desired information about the porosity of the material, the rigidity of polymer chains or the interaction between water and polymers. Nevertheless, for the simplest insoluble sample tested (cellulose), it was possible to specifically assign the peaks representing the water inside the solid particles. The CPMG experiments carried out in water gave similar results for different insoluble samples, whereas some deviations were observed for complex cell wall materials. Similarities were also noted in the graphs representing the distributions of T2 values obtained for different samples having similar particle size. Riassunto L’effetto benefico delle fibre alimentari nella nutrizione umana è generalmente riconosciuto. Un fattore chiave per gli effetti positivi delle fibre nel tratto gastrointestinale sono le proprietà di idratazione, importanti proprietà fisiche che dovrebbero quindi essere considerate in studi riguardanti proprietà meccaniche e fisiche delle fibre. Diversi metodi per l’analisi delle proprietà di idratazione delle fibre alimentari sono disponibili. Lo scopo principale di questo studio è stato quello di migliorare e applicare un metodo per la misurazione dell’assorbimento macroscopico di acqua, cioè per la misurazione della sola acqua assorbita dalle particelle idratate del campione (metodo dell’esclusione del colorante). Successivamente, i risultati ottenuti con questo metodo, sono stati confrontati con quelli ottenuti usando un metodo che determina il rigonfiamento dei campioni (metodo del rigonfiamento) e un metodo che misura la cinetica dell’assorbimento dell’acqua. Questo confronto ha permesso di convalidare i risultati ottenuti con il metodo dell’esclusione del colorante e di delineare i più importanti aspetti applicativi dei diversi metodi usati. Gli esperimenti sono stati eseguiti in condizioni che simulano quelle fisiologiche (37 °C, valori di pH fra ~1 e ~7 in tamponi fisiologici, mescolamento continuo quando possibile) al fine di migliorare la conoscenza del comportamento di carboidrati non digeribili durante il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale. Gli esperimenti sono stati inoltre effettuati in condizioni sperimentali diverse (22 °C, diversi liquidi di idratazione, diversi rapporti solido/liquido o quantità di materiale, presenza o assenza di mescolamento continuo) a scopo comparativo. Anche l’influenza della dimensione delle particelle e della digestione in vitro è stata investigata. Il metodo dell’esclusione del colorante, applicato nella forma migliorata, è risultato essere poco robusto e la precisione dei risultati è stata considerata bassa per un metodo analitico. Valori riproducibili e attendibili sono stati comunque ottenuti prestando particolare attenzione nelle diverse fasi della procedura. E’ stata evidenziata una probabile l’interazione dell’FITC-dextran con i campioni a pH acido. Questa osservazione suggerisce cautela nell’uso di questa tecnica a bassi pH. XII Riassunto Il metodo del rigonfiamento è il più semplice dal punto di vista sperimentale e, di conseguenza, i risultati sono influenzati solo in minima parte da parametri di procedura. Nondimeno, il metodo del rigonfiamento e il metodo che misura la cinetica dell’assorbimento dell’acqua non permettono la misura diretta dell’acqua assorbita dalle particelle come accade per il metodo dell’esclusione del colorante. L’acqua assorbita solo dalle particelle può essere calcolata ma l’introduzione di altri dati sperimentali (per esempio ρb) e le approssimazioni introdotte hanno portato a risultati affetti da errori. E’ stata effettivamente osservata la correlazione positiva fra la dimensione delle particelle e i valori di rigonfiamento che ci si attendeva, mentre nei valori di acqua assorbita solo dalle particelle è stato notato un livellamento. In generale, non sono stati osservati valori di rigonfiamento più bassi per i campioni digeriti rispetto ai corrispondenti campioni non digeriti. Al contrario, analizzando solo i valori di acqua assorbita dalle particelle del campione si è potuto confermare l’ipotesi che la digestione produce materiale più denso e, di conseguenza, meno incline all’idratazione rispetto ai campioni non digeriti. Complessivamente, le proprietà di idratazione sono risultate poco influenzate dai diversi pH osservabili durante il passaggio del cibo attraverso il tratto gastrointestinale (pH ~1, ~5, ~7). In modo analogo, non è stata evidenziata nessuna particolare influenza né della temperatura (22 °C e 37 °C) né del liquido di idratazione (tamponi fisiologici, tamponi a bassa concentrazione, acqua deionizzata). Le condizioni fisiologiche considerate in questo studio sono molto semplificate e i risultati ottenuti possono rappresentare solo approssimativamente il comportamento delle fibre alimentari lungo il tratto gastrointestinale. La rilassometria NMR non ha permesso di ottenere le informazioni desiderate riguardo la porosità del materiale, la rigidità delle catene di polimero o l’interazione fra acqua e il polimero stesso. Nonostante ciò, per il più semplice materiale testato (cellulosa), è stato possibile dare specifiche assegnazioni ai picchi rappresentanti l’acqua presente all’interno delle particelle solide. I risultati degli esperimenti acquisiti con la sequenza CPMG in acqua sono apparsi simili per diversi campioni insolubili, mentre alcune deviazioni sono state osservate per i campioni più complessi quali quelli derivanti dalla parete cellulare delle piante. Sono state notate delle analogie nel profilo dei grafici che rappresentano la distribuzione dei valori di T2 ottenuti per diversi campioni con simile dimensione delle particelle.