Capitolo III
Attività enzimatiche dei batteri lattici isolati da impasti
acidi per la produzione del Cornetto di Matera
Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione
del Cornetto di Matera, sono testati sulla base di attività enzimatiche rilevanti
nella fermentazione. Le attività ureasica, peptidasica, fitasica, fosfatasica
e β-glucosidasica sono state determinate in substrati sintetici utilizzando
metodi spettrofotometrici. L’attività proteolitica è stata misurata in impasti
acidi modello, utilizzando impasti neutri e acidificati come controllo.
Tutti i ceppi hanno mostrato una bassa attività ureasica, glutamil
aminopeptidasica e iminopeptidasica, mentre significative differenze sono
state osservate all’interno delle specie per le altre attività enzimatiche. I ceppi
di Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus curvatus hanno dimostrato
un’elevata attività aminopeptidasica, X-prolil dipeptidil aminopeptidasica,
β-glucosidasica, fitasica, mentre le attività enzimatiche dei ceppi di Lb.
plantarum, Lb. pentosus e Weissella cibaria erano dipendenti dal ceppo. Al
fine di classificare i ceppi sulla base di un profilo enzimatico simile, è stata
condotta una cluster analysis gerarchica. Diversi ceppi di Lb. plantarum
e Lb. curvatus e tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides hanno mostrato un
interessante profilo di attività enzimatiche, suggerendo il loro impiego
come colture starter nel settore della panificazione.
3.1. Introduzione
I batteri lattici svolgono un ruolo importante nella produzione di diversi
alimenti fermentati. Grazie alla loro attività metabolica, in realtà, essi
sono responsabili dei cambiamenti chimici e sensoriali che si verificano
durante la fermentazione dei prodotti lattiero-caseari, carnei e vegetali.
L’adattamento a specifici ecosistemi alimentari, tuttavia, può influire sul
metabolismo microbico e spiegare la prevalenza e il contributo di alcune
specie durante i processi di fermentazione.
Gli impasti acidi sono complessi sistemi biologici in cui si svolgono diverse
attività microbiche. Il sistema proteolitico dei batteri lattici, caratterizzato
dalla presenza di proteinasi, peptidasi e sistemi di trasporto intracellulare, è
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in grado di idrolizzare le proteine in piccoli peptidi e aminoacidi, che sono
importanti per la crescita microbica e come precursori per lo sviluppo di
composti aromatici. Gli enzimi proteolitici dei batteri lattici degradano le
proteine del glutine influenzando la reologia degli impasto e, di conseguenza,
la tessitura del pane (Di Cagno et al., 2004). Inoltre, i peptidi rilasciati
dall’idrolisi delle prolammine che colpiscono la mucosa dell’intestino
umano nei soggetti affetti da morbo celiaco (Di Cagno et al., 2002) possono
essere degradati durante la proteolisi. L’attività delle X-prolil dipeptidil
aminopeptidasi, in particolare, sembrano avere un grande potenziale nella
riduzione del contenuto di peptidi di gliadina ricchi di prolina che causano
la risposta immunitaria nel morbo celiaco (Gallo et al., 2005).
Le proprietà sensoriali del pane possono essere migliorate attraverso l’idrolisi
dei polisaccaridi. Le β-glucosidasi sono uno dei principali gruppi di glicosil
idrolasi in grado di catalizzare l’idrolisi del legame β-1,4- presente in vari
disaccaridi, oligosaccaridi e derivati β-D-glucosidici (Yan et al., 1998 ).
L’idrolisi dei glucosidi ha un ruolo importante in diversi processi biologici
e applicazioni biotecnologiche. Le β-glucosidasi, infatti, sono responsabili
dell’idrolisi del cellobiosio nella fase terminale della degradazione della
cellulosa, un importante fonte di fibre nei prodotti alimentari a base di cereali
(Bhatia et al., 2002).
La fermentazione degli impasti acidi, inoltre, aumenta il valore nutrizionale
del pane. Nei cereali una gran parte del fosforo è presente come acido fitico
(mio-inositolo esafosfato, IP6), collocato negli strati esterni del chicco.
L’acido fitico è considerato un composto anti-nutrizionale poichè è un
agente chelante di proteine, aminoacidi e minerali bivalenti come Ca2+,
Fe2+, Mg2+ e Zn2+, che quindi non possono essere assorbiti dall’uomo (De
Angelis et al., 2003 ). Pertanto, la degradazione dell’acido fitico durante la
fermentazione degli impasti acidi è auspicabile. Gli enzimi che degradano
l’acido fitico durante la fermentazione provengono dai batteri lattici e dai
lieviti (Lopez et al., 2000; Reale et al ., 2004). I bassi valori di pH causati dalla
produzione di acido lattico durante la fermentazione, inoltre, promuovono
l’attivazione delle fitasi endogene della farina, che contribuiscono ad una
maggiore degradazione dell’acido fitico (Leenhardt et al., 2005; Lopez et
al., 2001).
Durante l’uso come colture starter, i batteri lattici sono sottoposti a
diversi stress che influenzano le loro attività metaboliche e ne riducono le
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prestazioni. In particolare, la produzione di acido lattico e acetico durante
la fermentazione promuove una forte diminuzione di pH che può incidere
sull’equilibrio microbico. La risposta dei batteri allo stress acido si verifica
in modo diverso. Tra i meccanismi di risposta, l’attività ureasica sembra
svolgere un ruolo importante nella protezione di alcuni microrganismi ai
bassi valori di pH attraverso la conversione di urea in ammoniaca e anidride
carbonica (van de Guchte et al., 2002).
Le attività proteolitica, peptidasica, β-glucosidasica, fitasica e ureasica
sono state valutate per la maggior parte dei gruppi di batteri, ma pochi
studi sulle attività enzimatiche dei batteri lattici isolati da impasti acidi
sono presenti in letteratura. Nel presente lavoro è stato investigato il profilo
enzimatico dei batteri lattici per comprendere il loro ruolo nel processo di
fermentazione, nonché per delineare proprietà rilevanti nella produzione di
pane.
3.2. Materiali e metodi
3.2.1. Ceppi e condizioni di coltura
I batteri lattici utilizzati in questo studio sono stati isolati da impasti acidi
utilizzati per produrre il pane Cornetto di Matera (Ricciardi et al., 2002).
I ceppi sono stati mantenuti come colture liofilizzate nella collezione dei
microrganismi del Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie AgroForestali, Università degli Studi della Basilicata, Potenza, Italia. Gli isolati
sono stati propagati in MRS liquido (Oxoid) per 16 ore a 30°C prima di
effettuare i vari saggi enzimatici.
3.2.2. Attività proteolitica
Le sospensioni cellulari standardizzate (DO650 = 2) e cresciute overnight
in MRS liquido, sono state utilizzate per inoculare (10% v/v) impasti acidi
modello preparati mescolando acqua e farina di grano tenero (tipo “00”,
Divella SpA, Bari, Italia) con una spatola sterile per 3 minuti al fine di ottenere
un impasto con rendimento (DY) pari a 400. Dopo 24 ore di incubazione a
30°C, i pre-impasti sono stati aggiunti (10% v/v) alla seconda serie impasti
acidi e incubati per 24 ore a 30°C. Due fermentazioni, ottenute mediante
l’aggiunta di antibiotici all’impasto, sono state effettuate asetticamente a
pH 6,0 e 3,5, rispettivamente. La concentrazione totale di aminoacidi liberi
negli estratti solubili in soluzione salina (solvente: 0,5 mol/L di NaCl e 150
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mmol/L di fosfato di sodio, pH 6,8) è stata determinata utilizzando il metodo
del TNBS (Adler-Nissen, 1979). Una curva di taratura è stata preparata
utilizzando la glicina (Gly, Sigma), come standard (range 0,0 - 0,5 mmol/L
di Gly) e risultati sono stati espressi come mg di Gly/kg di impasto.
3.2.3. Attività peptidasica
Le cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state raccolte
mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte con tampone
potassio fosfato sterile 50 mmol/L, pH 7, e ri-sospese nello stesso tampone
per ottenere una sospensione cellulare standardizzata (DO650 = 1) da
utilizzare per il dosaggio degli enzimi. Le attività delle aminopeptidasi
generali (PepNC), prolina iminopeptidasi (Pepi), glutamil aminopeptidasi
(Pepa) e X-prolil dipeptidil aminopeptidasi (PepX) sono state misurate,
in accordo con Macedo et al. (2000), utilizzando come substrati sintetici
Lys-p-nitroanilide (-p-NA), Pro-p-NA, Glu-p-NA e Gly-Pro-p-NA o ArgPro-p-NA, rispettivamente. Per il dosaggio sono stati mescolati 30 μL di
substrato ad una concentrazione finale di 20 mmol/L in metanolo, 195 μL
di tampone potassio fosfato (50 mmol/L, pH 7,0), 95 μL di sodio azide
0,05% (w/v) e 75 μL di sospensione cellulare. Dopo l’incubazione a 30°C
per 4 ore, la reazione è stata interrotta con 900 μL di acido acetico al 10%
(v/v); il rilascio di p-nitroanilina (p-NA) nei surnatanti (12000 x g, 5 min)
è stata misurata spettrofotometricamente a 410 nm. I dati ottenuti sono
stati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando soluzioni
di p-NA (range 0,1 - 20,0 mmol/L p-NA). Una unità di attività enzimatica
(μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare
1 μmol di p-NA per secondo.
3.2.4. Screening per l’attività ureasica
L’attività ureasica è stata determinata valutando qualitativamente il
rilascio di ammoniaca utilizzando un metodo basato sul viraggio del rosso
fenolo (Mora et al., 2004). I ceppi sono stati coltivati in MRS liquido
contenente 5 g/L di urea (concentrazione finale) e 0,05 g/L di nichel solfato
(concentrazione finale). Le cellule, raccolte mediante centrifugazione
(12000 x g, 5 min), sono state lavate due volte con una soluzione
salina sterile (0,85% w/v di NaCl) e ri-sospese in 100 μL di soluzione
fisiologica sterile. Per il dosaggio enzimatico sono stati mescolati 100
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μL di sospensione cellulare e 400 μL di una soluzione contenente 1
volume di reagente A (2 g di urea disciolta in 2 ml di etanolo e 4 mL di
acqua deionizzata sterile) e 19 volumi di reagente B (1 g/L di KH2PO4,
1 g/L di K2HPO4, 5 g/L di NaCl e 20 μg/ml di rosso fenolo). La miscela
di reazione è stata incubata a 37°C per 2 ore e lo sviluppo di un colore
rosso-violaceo indicava la presenza di attività ureasica.
3.2.5. Attività fitasica e fosfatasica
Le cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state
raccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte
con soluzione salina sterile e ri-sospese in acqua deionizzata sterile per
ottenere le sospensioni cellulari standardizzate (DO650 = 1) da utilizzare
per gli esperimenti. L’attività fitasica è stata misurata utilizzando fitato di
sodio (Sigma) come substrato. Il dosaggio è stato effettuato mescolando
600 μL di substrato (Na-fitato 3 mmol/L in Na-acetato 0,2 mol/L, pH
4,0) e 150 μL di sospensione cellulare. Dopo 2 ore di incubazione a
45°C, la reazione è stata stoppata con 750 μL di acido tricloroacetico
al 5% (w/v) (De Angelis et al., 2003). Il fosforo inorganico liberato è
stato determinato misurato l’assorbanza a 700 nm. Una unità di attività
fitasica (μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario
per liberare 1 μmol di fosforo inorganico al secondo.
L’attività della fosfatasi acida è stata determinata utilizzando il
p-nitrofenil fosfato (p-NPP) come substrato. La miscela di reazione
conteneva 200 μL 1,5 mmol/L p-NPP (concentrazione finale) in 0,2
mol/L di Na-acetato, pH 5,2, e 400 μL di sospensione cellulare. Dopo
2 ore di incubazione a 45°C, la reazione è stata stoppata con l’aggiunta
di 600 μL di NaOH 0,1 mol/L e il p-nitrofenolo (p-NP) rilasciato è stato
determinato misurando l’assorbanza a 405 nm sui campioni centrifugati
(12000 x g, 5 min). Una unità di attività della fosfatasi (μkatal) è stata
definita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 μmol di
p-NP al secondo.
3.2.6. Attività β-glucosidasica
Le cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido (1,5 mL) sono state
raccolte mediante centrifugazione (12000 xg, 5 min), lavate due volte in
Tris-HCl 50 mmol/L, pH 8, e ri-sospese in 150 μL dello stesso tampone
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contenente 2 mg di lisozima/ml (Sigma). Delle biglie di vetro (0,15 a 0,212
mm di diametro, Sigma) sono state aggiunte e le sospensioni cellulari, dopo
essere state agitate su vortex ad alta velocità per 3 min, sono state incubate
a 37°C per 1 ora e sottoposte da tre cicli di sonicazione (10 min per ogni
trattamento, potenza 10%; Sonorex Super 10P, Bandelin, Berlino). Dopo
l’incubazione, le biglie di vetro e i frammenti cellulari sono stati rimossi
mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min) e i surnatanti sono stati utilizzati
per il dosaggio dell’enzima. La concentrazione di proteine in lisati cellulari
è stato determinato utilizzando il metodo Bradford (Bradford, 1976).
L’attività β-glucosidasica è stata misurata utilizzando il p-nitrofenil-β-Dglucopiranoside (p-NPG) come substrato, in accordo con Gallo (2004).
Nella miscela di reazione sono stati mescolati 900 μL di p-NPG 2,5 mmol/L
(concentrazione finale) in tampone potassio fosfato 0,5 mol/L pH 7,5 e 100
μL di estratto cellulare. Dopo 1 ora di incubazione a 40°C, la reazione è
stata bloccata riscaldando la miscela a 95°C per 5 min. L’assorbanza è stata
misurata a 410 nm. I dati ottenuti sono stati confrontati con una curva di
taratura costruita utilizzando p-NP. Una unità di attività β-glucosidasica
(μkatal) è stata definita come la quantità di enzimia necessario per liberare
1 μmol di p-NP al secondo sotto. L’attività β-glucosidasica specifica è stata
definita come unità enzimatica/mg di proteina.
3.2.7. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche e i grafici sono state effettuati utilizzando Systat
10.0 per Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).
3.3. Risultati e discussione
Quarantuno ceppi di batteri lattici isolati da impasti acidi per la produzione
del Cornetto di Matera, un pane tipico della Basilicata, sono stati analizzati
in questo studio. L’attività proteolitica in impasti acidi modello inoculati con
colture di batteri lattici è stata espressa come concentrazione di aminoacidi
liberi dopo 24 ore di incubazione. Due fermentazioni, ottenute aggiungendo
antibiotici all’impasto, sono state condotte a pH 6,0 e 3,5, rispettivamente,
per valutare la proteolisi in assenza di metabolismo microbico. In generale,
gli impasti acidi e l’impasto di controllo acidificato a pH 3,5 hanno mostrato
un aumento della concentrazione di aminoacidi liberi rispetto a quella
dell’impasto di controllo a pH neutro (Figura 1).
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Figura 1. Grafico della concentrazione di aminoacidi liberi (espressa come mg Gly/kg
di impasto) negli impasti acidi modello dopo 24 ore di fermentazione. Lb. curvatus ();
gruppo Lb. plantarum (), che comprende le specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb.
pentosus; Leuc. mesenteroides (); W. cibaria (); impasto di controllo acidificato ().
Il maggiore contenuto di aminoacidi liberi è stato misurato negli impasti
inoculati con alcuni ceppi di Lactobacillus curvatus o Lb. plantarum o
Leuconostoc mesenteroides, anche se le differenze all’interno della specie
suggeriscono che l’attività proteolitica è ceppo-specifica. I livelli di
aminoacidi negli impasti dipendono da vari fattori come il valore di pH,
il tempo di fermentazione, l’attività proteolitica della microflora e/o degli
enzimi della farina e dal consumo di aminoacidi da parte dei batteri lattici
e/o dei lieviti. Gli impasti inoculati con Lb. plantarum DBPZ1019, Leuc.
mesenteroides DBPZ1005, Lb. plantarum DBPZ1002 e Lb. plantarum
DBPZ1008 (Figura 1) avevano una concentrazione di amminoacidi liberi
61
superiore a quella dell’impasto di controllo acidificato (49,6 - 48,5 - 47,6 47,0 Gly mg/kg di impasto dopo 24 ore di fermentazione, rispettivamente),
anche se il pH finale era superiore (4,39 - 4,32 - 4,01 - 4,21, rispettivamente)
a quella del controllo acidificato. Le concentrazioni più basse di aminoacidi
sono state osservate negli gli impasti inoculati con diversi ceppi di Lb.
plantarum e uno con Lb. curvatus (parte inferiore del grafico).
Nessun ceppo ha mostrato attività ureasica. Lo sviluppo del colore rossoviolaceo è stato rilevato solo in due ceppi di Leuc. mesenteroides dopo
2 giorni di incubazione, dimostrando che l’attività enzimatica era molto
bassa nelle specie di batteri lattici testate.
I risultati relativi alle altre attività enzimatiche sono mostrati in Figura
2. L’attività delle peptidasi sono state misurate sulle sospensioni cellulari
in quanto il processo di fermentazione per la produzione di pane italiano
si verifica in poche ore (5-10 ore) ed in questo periodo i ceppi sono attivi
sulle proteine del glutine senza lisi cellulare. In generale, le attività delle
glutamil aminopeptidasi (Pepa) e delle iminopeptidasi (Pepi) erano molto
basse o assenti in tutti i ceppi. Ad eccezione di W. cibaria, le specie non
presentano differenze significative rispetto all’attività delle aminopeptidasi
generali (PepNC). Il più alto livello di enzima PepNC è stato trovato nel
ceppo Lb. pentosus DBPZ0984 e in tutti i ceppi di Lb. curvatus. I ceppi di
Lb. plantarum e Lb. paraplantarum hanno mostrato un’attività di PepNC
inferiore a quella dei ceppi di Leuc. mesenteroides. Una notevole variabilità
intraspecifica nell’attività di PepX, su substrato Gly-Pro-p-NA (PepXgly),
è stata osservata tra i ceppi di Lb. curvatus, del gruppo Lb. plantarum,
mentre gli isolati di Leuc. mesenteroides e W. cibaria hanno mostrato
livelli di attività enzimatica simili. Il valore più elevato è stato misurato
per il ceppo Lb. pentosus DBPZ0984. L’attività di PepX, su substrato sul
Arg-Pro-p-NA (PepXarg), era inferiore a quella corrispondente di PepXgly
in tutte le specie, ad eccezione dei ceppi Lb. plantarum DBPZ1021, Lb.
paraplantarum DBPZ1027 e Lb. curvatus DBPZ1009 e DBPZ1020.
Le attività fitasica e fosfatasica sono state determinate sulle sospensioni
cellulari perché questi enzimi sono sia intracellulari che associati alla
parete cellulare. E’ stato dimostrato che la maggior parte dei ceppi era
in grado di degradare il fitato, anche se i livelli di attività enzimatica
erano ceppo-specifici. Sono state riscontrate differenze all’interno della
specie Lb. curvatus e del gruppo Lb. plantarum per quanto riguarda
62
Figura 2. Grafico della distribuzione delle attività enzimatiche (attività proteolitica,
glutamil aminopeptidasica, prolina iminopeptidasica, X-prolil dipeptidil aminopeptidasica
su Gly-pro-pNA e Arg-pro-pNA, β-glucosidasica, fitasica, fosfatasica) dei ceppi di batteri
lattici isolati dagli impasti acidi per la produzione del Cornetto di Matera. Lb. curvatus
(Lbcu); Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. plantarum (Lbplgroup); Leuc. mesenteroides
(Leme); W. cibaria (Wecb).
l’attività fitasica e all’interno della specie Leuc. mesenteroides e del
gruppo Lb. plantarum rispetto all’attività della fosfatasi. I livelli più
alti di degradazione del fitato (0,488 μkatal/ml) sono stati misurati nei
ceppi di Leuc. mesenteroides e in alcuni ceppi appartenenti al gruppo
Lb. plantarum. Gli isolati di Lb. curvatus e W. cibaria hanno mostrato
valori di attività enzimatica da 0,042 a 0,263 μkatal/ml, mentre un elevato
numero di Lb. plantarum presentavano bassi valori di attività fitasica. Le
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diverse specie, al contrario, hanno mostrato livelli di attività fosfatasica
simili. La massima produzione di enzima è stata misurata nei ceppi Lb.
plantarum DBPZ1019 e DBPZ1003, Lb. paraplantarum DBPZ1027 e nei
due ceppi di W. cibaria, mentre i più bassi valori di idrolisi di p-NPP sono
stati osservati per alcuni ceppi di Leuc. mesenteroides e per alcuni ceppi
di del gruppo Lb. plantarum. L’attività β-glucosidasica è stata misurata
sugli estratti cellulari dei batteri lattici. Le maggiori differenze nella
produzione di quest’enzima sono state trovate nei ceppi del gruppo Lb.
plantarum e della specie Leuc. mesenteroides. Gli isolati di Lb. curvatus
hanno mostrato una moderata produzione di β-glucosidasi, mentre quelli
di W. cibaria, insieme con alcuni ceppi di Lb. plantarum, avevano la più
bassa attività enzimatica.
Al fine di classificare i ceppi sulla base di un profilo enzimatico simile è stata
condotta una cluster analysis gerarchica (UPGMA) sulle attività enzimatiche.
La classificazione ha generato sette gruppi principali a una distanza di 0,3
(Figura 3). Solo due ceppi (posizione 1 bis e 2 bis) non erano raggruppati in
nessun cluster, poiché avevano un profilo enzimatico diverso da quello degli
altri ceppi. Le repliche dello stesso ceppo (Lb. plantarum DBPZ1023) erano
raggruppate ad una distanza massima di 0,022, dimostrando che l’analisi era
ripetibile.
I più alti livelli di attività enzimatiche sono stati individuati tra i ceppi
appartenenti ai cluster C1 e C4. I tre ceppi di Lb. plantarum, raggruppati
nel cluster C1, erano caratterizzati da un elevato livello di PepA e PepI, ma
da bassi livelli di PepNC e PepXarg. Il cluster C2 raggruppava un ceppo
di Lb. plantarum e uno di Leuc. mesenteroides caratterizzati da una forte
attività proteolitica e da elevati livelli di PepI e fitasi. Il cluster maggiore C3
comprendeva la maggior parte degli isolati di Leuc. mesenteroides e diversi
ceppi di Lb. plantarum con un’elevata attività di PepI, β-glucosidasica e
fitasica. Il cluster C4 comprendeva quattro ceppi di Lb. curvatus con un profilo
simile a quello dei ceppi del cluster C3, ad eccezione della maggiore attività
di PepNC. I cluster C5, C6 e C7, nella parte inferiore del dendrogramma,
includevano i ceppi con le più basse attività enzimatiche. Il cluster C6
raggruppava tre ceppi di Lb. plantarum con un elevata attività proteolitica,
insieme ad una buona attività β-glucosidasica e fosfatasica. I cluster C5 e C7,
al contrario, includevano ceppi con una bassa attività proteolitica, ma elevati
valori di β-glucosidasi e fosfatasi, rispettivamente.
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Figura 3. Dendrogramma mostrante la classificazione dei ceppi di batteri lattici sulla base del
profilo enzimatico; le barre rappresentano la mediana delle attività all’interno del cluster. Attività
proteolitica a 24 ore espresso come mg Gly/kg di impasto (barra 1); glutamil aminopeptidasi
(barra 2); prolina iminopeptidasi (barra 3); aminopeptidasi generale (barra 4); X-prolil dipeptidil
aminopeptidasi su Gly-pro-pNA (barra 5); X-prolil dipeptidil aminopeptidasi su Arg-pro-pNA
(barra 6); β-glucosidasi (barra 7); fitasi (barra 8); fosfatasi (barra 9).
I batteri lattici, insieme ai lieviti, sono i microrganismi dominanti negli
impasti acidi (Gobbetti et al., 2005) e la reologia, il sapore e le proprietà
nutrizionali dei prodotti da forno sono strettamente legati alle attività di
questo gruppo di batteri. Tuttavia, l’esatto ruolo svolto dai batteri lattici
durante la fermentazione non è ancora pienamente compreso. Lo studio
delle attività enzimatiche, pertanto, potrebbe essere utile per la selezione
di ceppi da impiegare come starter nel settore della panificazione.
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Durante la fermentazione degli impasti acidi, gli eventi proteolitici
sono da attribuire all’attività dei batteri lattici e/o lieviti o a quella degli
enzimi indigeni della farina, e di conseguenza, diverse teorie sulle fonti
della proteolisi sono state proposte in letteratura. In questo studio, le
differenze tra il contenuto di aminoacidi nell’impasto di controllo a pH
neutro (Gly 20,6 mg/kg di impasto) e in quello a pH acidificato (Gly 45,7
mg/kg di impasto) suggeriscono che i principali effetti dell’idrolisi delle
proteine sono imputabili alle condizioni di pH e all’attività proteolitica
degli enzimi della farina. Tuttavia, i risultati hanno dimostrato che il
pH non è l’unico fattore che determina il livello di aminoacidi liberi.
Diversi ceppi di batteri lattici possono svolgere un ruolo importante nella
degradazione delle proteine della farina, in accordo con diversi autori (Di
Cagno et al., 2002; Wehrle et al., 1999). Al contrario, Thiele et al. (2002)
hanno dimostrato che il rilascio di aminoacidi negli impasti inoculati con
ceppi di Lb. pontis e Lb. sanfranciscensis era inferiore a quello misurato
nell’impasto di controllo acidificato, indicando che l’attività proteolitica
dei batteri lattici era trascurabile rispetto all’attività proteolitica degli
enzimi della farina. Inoltre, in un secondo lavoro, Thiele et al. (2004)
hanno confermato che la proteolisi e le conseguenze reologiche della
degradazione del glutine sono legate principalmente all’attivazione degli
enzimi della farina dovuta ai bassi valori di pH. Il sistema proteolitico
dei batteri lattici è stato descritto in dettaglio per diversi ceppi di origine
lattiero-casearia, ma in letteratura sono presenti pochi dati sul sistema
dei ceppi provenienti da impasti acidi. Gobbetti et al. (1996a) hanno
dimostrato che i lattobacilli hanno attività aminopeptidasica, prolina
iminopeptidasica, carbossipeptidasica, endopeptidasica, dipeptidasica e
tripeptidasica. In uno studio successivo, Gobbetti et al. (1996b) hanno
purificato e caratterizzato il sistema proteolitico di Lb. sanfranciscensis
CB1, dimostrando che consisteva principalmente in una serina proteasi,
una dipeptidasi e una aminopeptidasi generale. Il sistema proteolitico
di Lb. reuteri CRL 1098, invece, era costituito da una aminopeptidasi,
X-prolil dipeptidil aminopeptidasi, dipeptidasi e tripeptidasi (Rollán e
Font de Valdez, 2001). L’attività della prolina iminopeptidasi, trascurabile
nei ceppi di batteri lattici testati in questo studio, è auspicabile nella
fermentazione degli impasti. Questo enzima è stato purificato e
caratterizzato in molti ceppi di batteri lattici isolati da prodotti lattiero-
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caseari ed è importante per la crescita dei microrganismi e la maturazione
per i formaggi (Magboul and McSweeney, 2000; Tsakalidou et al.,
1998; Bockelmann et al., 1991). Gallo et al. (2005) hanno dimostrato
la presenza di PepX in dodici isolati di Lb. sanfranciscensis, giungendo
alla conclusione che questo enzima è ampiamente diffuso all’interno di
questa specie. Recenti studi (Di Cagno et al., 2004) hanno dimostrato che
la degradazione dei peptidi di gliadina ricchi di prolina può influenzare
la tolleranza dell’uomo alle proteine del glutine. Le proline, infatti,
impongono restrizioni sulla organizzazione strutturale delle proteine tali
da limitare l’idrolisi da parte degli enzimi digestivi (Gallo et al., 2005) e
questo suggerisce un potenziale uso dei batteri lattici per la degradazione
dei peptidi tossici che inducono la risposta immunitaria delle cellule T
intestinali nei pazienti affetti da morbo celiaco.
L’aggiunta di impasti acidi nella produzione di pane può influenzare la
salute umana in vari modi. Durante la fermentazione la degradazione
dell’acido fitico migliora la bio-disponibilità di minerali e può avere effetti
benefici sulla salute, come la riduzione del rischio di malattie cardiache,
renali e alcuni tipi di tumori (Konietzny, 2004 ). Le fitasi sono enzimi
distribuiti in vari batteri, ma che non sembrano essere comuni tra i batteri
lattici (Palacios et al., 2005; Konietzny, 2004). Tuttavia, poiché i batteri
lattici sono utilizzati negli alimenti fermentati anche di origine vegetale
essi potrebbero essere una fonte di fitasi. Infatti, le specie utilizzate
nella produzione prodotti lattiero-caseari, come Lb. acidophilus, Lb.
casei, Lb. delbrueckii, Lactococcus lactis e Streptococcus spp. sono
poveri produttore di fitasi, mentre i ceppi provenienti da alimenti di
origine vegetale sono ottimi produttori di questi enzimi (De Angelis
et al., 2003). Il nostro studio ha dimostrato che alcuni ceppi sono in
grado di degradare l’acido fitico, in particolare quelli appartenenti alle
specie Leuconostoc mesenteroides, Lb. plantarum e Lb. paraplantarum.
Palacios et al. (2005) hanno studiato l’attività fitasica e fosfatasica in
alcuni lattobacilli isolati da impasti acidi dimostrando la presenza
degli enzimi in questi ceppi. Leenhardt et al. (2005) hanno dimostrato
che la fermentazione effettuata con ceppi di Lb. brevis è più efficiente
rispetto a quella effettuata con lievito nella riduzione dell’acido fitico. In
aggiunta, uno studio di Reale et al. (2004) ha evidenziato che durante la
fermentazione di impasti inoculati con ceppi di Lb. plantarum, Lb. brevis
67
e Lb. curvatus l’acido fitico era degradato in misura maggiore rispetto
alla fermentazione di impasti inoculati con Saccharomyces cerevisiae.
Una maggiore concentrazione di magnesio solubile in impasti inoculati
con ceppi di Lb. plantrum o Leuc. mesenteroides subsp. mesenteroides e
stato osservato da Lopez et al. (2001). La capacità di idrolizzare il fitato è
stato oggetto di indagine anche in uno studio di De Angelis et al. (2003);
Lb. sanfranciscensis CB1, in particolare, ha mostrato il più alto livello di
attività enzimatica, ma una buona degradazione dell’acido fitico è stata
osservata anche per i ceppi Lb. fructivorans DA106, W. confusa 14A, Lc.
lactis subsp. lactis 11M e Lb. alimentarius 5D.
I nostri risultati hanno dimostrato che i più alti livelli di attività
β-glucosidasica sono stati osservati nel ceppo di Lb. pentosus e in alcuni
ceppi di Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Leuc. mesenteroides.
Le β-glucosidasi sono state studiate in diversi gruppi di batteri,
compresi i batteri lattici. La presenza di glicosidasi è stata osservata in
Carnobacterium piscicola, una specie generalmente isolata da carne o
pesce (Coombs e Branchley, 2001). Inoltre, Spano et al. (2005) hanno
caratterizzato un gene che codifica per una β-glucosidasi da un ceppo
commerciale di Lb. plantarum e da un ceppo di Oenococcus oeni, per
dimostrare la capacità dei batteri lattici isolati dal vino a idrolizzare
glicoconiugati durante la fermentazione malolattica. Diversi autori hanno
scoperto che alcuni ceppi di Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. salivarius,
Lb. fermentum e Leuc. mesenteroides sono stati in grado di idrolizzare
β-glucosidi, come amigdalina e linamarina, durante la fermentazione di
manioca (Obilie et al., 2004; Lei et al., 1999). L’idrolisi di isoflavoni da
parte di alcuni batteri lattici durante la fermentazione del latte di soia
è stata anche riportata in letteratura (Choi et al., 2002). Tuttavia, sono
rari gli studi sulla attività enzimatica dei batteri lattici isolati da impasti.
Solo Gallo (2004) ha purificato e caratterizzato uno β-glucosidasi
intracellulare da Lb. sanfranciscensis CB1.
L’attività ureasica è stata ampiamente studiata in batteri lattici isolati da
bevande fermentate, vino, prodotti lattiero-caseari (Mora et al., 2004;
Pernoud et al., 2004; Kodama e Yotsuzuka, 1996), tratto gastrointestinale
(Sebbane et al., 2002, Toledo et al. , 2002) e cavità orale (Sisson et
al., 1999; Clancy e Burne, 1997), ma nessuno lavoro sulla presenza
dell’enzima nei batteri lattici isolati da impasti LAB è stato riportato
68
in letteratura. In questo lavoro, nessuno dei ceppi ha mostrato attività
ureasica. Tuttavia, è stato utilizzato un metodo rapido qualitativo e
l’implicazione dell’enzima nella resistenza allo stress acido deve essere
confermata.
In questo lavoro sono state esaminate alcune proprietà enzimatiche dei
batteri lattici per selezionare ceppi da utilizzare come colture starter nella
produzione di pane. In generale, i ceppi di Lb. plantarum, Lb. curvatus e
Leuc. mesenteroides hanno mostrato una interessante profilo enzimatico,
che potrebbe rappresentare un criterio importante per la preparazione di
una coltura starter mista. Alcuni ceppi di Lb. plantarum e Lb. curvatus
potrebbero essere selezionati per la loro attività proteolitica e peptidasica,
al fine di ottimizzare il sapore e la consistenza del pane; gli elevati
livelli di attività β-glucosidasica e fitasica riscontrati in ceppi di Leuc.
mesenteroides, invece, potrebbero costituire un utile caratteristica per
migliorare il valore nutrizionale del prodotto.
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