“Tecniche laser per la diagnosi delle malattie genetiche”
ALESSANDRA ANDREONI
Universita’ degli Studi dell’Insubria
Dipartimento di Fisica e Matematica
Via Valleggio, 11 – 22100 Como (Italy)
[email protected]
Luca Nardo
Maria Bondani
PhD
C.N.R.
COMO
ROBERTO ACCOLLA
Giovanna Tosi R.U.
VARESE
Sequenziamento
Significato e funzioni
delle sequenze di basi
Trattare in modo più specifico patologie fino a oggi aggredite
sulla base di bersagli molecolari già noti ma non
sufficientemente selettivi
Affrontare patologie che attualmente hanno scarsi presidi
terapeutici
Diagnosticare
genetiche.
preventivamente
l’insorgenza
di
malattie
INTERAZIONE
FARMACI-DNA:
MECCANISMI DI
LEGAME
1991
1973
Como
Milan
MICRO-FLUOROMETRIA
SUB-CELLULARE
LOCALIZZAZIONE
INTRACELLULARE
DI FARMACI
FLUORESCENTI
Naples
ANTRACICLINE:
FOTO-ATTIVAZIONE E
SITI DI LEGAME
1987
FOTO-ATTIVAZIONE
DI FARMACI
ANTITUMORALI
MICRO-FLUOROMETRIA
SUB-CELLULARE
LOCALIZZAZIONE
INTRACELLULARE
DI FARMACI
FLUORESCENTI
FOCALIZZAZIONE
DELL’ECCITAZIONE
SCELTA lexc
IMPULSI ULTRA-BREVI
MICRO-IMMAGINI AD ALTISSIMA
RISOLUZIONE SPAZIALE
SELEZIONE DEL COLORANTE O FARMACO
DA ECCITARE NEL MICRO-SPOT
E’ DETERMINATO DALLA PROBABILITA’ DI DECADERE EMETTENDO UN
FOTONE DI FLUORESCENZA RISPETTO A QUELLA DI DECADERE
LIBERANDOSI DELL’ENERGIA DI ECCITAZIONE PER ALTRA VIA NONRADIATIVA
FOTONE
DI
FLUORESCENZA
ALTRA VIA
NON-RADIATIVA
QUANTO PIU’ NUMEROSE (ED EFFICIENTI) SONO LE ALTRE VIE DI
DECADIMENTO NON-RADIATIVE TANTO PIU’ BREVE E’ IL TEMPO DI
VITA IN STATO ECCITATO E QUANTO PIU’ CORTO E’ L’IMPULSO
FORMATO DAI FOTONI DI FLUORESCENZA
1

 K rad  K non rad
I DECADIMENTI NON-RADIATIVI
AVVENGONO PER INTERAZIONI DELLA
MOLECOLA DI COLORANTE/FARMACO
CON L’ENVIRONMENT
ECCITAZIONE CON
IMPULSI ULTRA-BREVI
MISURA RISOLTA IN TEMPO
DELL’IMPULSO FORMATO
DAI FOTONI DI
FLUORESCENZA
CARATTERIZZAZIONE DELLE INTERAZIONI
DEL COLORANTE/FARMACO CON
L’ENVIRONMENT
UN PARTICOLARE MECCANISMO DI DECADIMENTO NON-RADIATIVO IL
FLUOROFORO ECCITATO DAL LASER VIENE FATTO INTERAGIRE CON
UN’ALTRA MOLECOLA SPECIFICA
Fluoroforo (DONOR)
eccitato dal laser
Acceptor (A) del FRET
Struttura rigida tra D ed A
D
A
D
A
A DISECCITA NON-RADIATIVAMENTE
D
QUANTO PIU’ GLI E’ VICINO
DISTANZA D/A:
IMPULSO DI FLUORESCENZA:
Grande
Piccola
Lento
Veloce
INTERAZIONE FARMACI-DNA: MECCANISMI DI LEGAME
Minor groove binders
Intercalators
Entrambi impediscono la replica del tratto di DNA, ma gli intercalanti
provocano errori nella replica delle sequenze adiacenti (mutazioni).
↔
Minor groove binders
Intercalators
PORTANO IL DNA AD ASSUMERE DIVERSE CONFIGURAZIONI?
Frammenti di DNA a doppia elica:
singole eliche della sequenza desiderata
sonde di DNA con le sequenze complementari (A e T, C e G)
D ed A per FRET attaccati agli estremi della sonda
D
TAAAT AT AAT AT TT AT TAAAT AT AA
A
ATTTA T A T T A T A AA TAATT T AT AT T
D
GCGC C CCC C C CCC GC C CCC C C CCC G
A
C G C G G G GG G G G GG C G G G GG G G G GG C
DNA-ligand binding modes
TAMRA
R
BI
BHQ2
MGB
Si aggiunge un Intercalator od un
Minor groove binder
Si cerca un effetto sulla
distanza D-A studiando
l’andamento temporale
dell’impulso di fluorescenza
emesso da D (TAMRA).
RISULTATI PER DOSI CRESCENTI DI:
DNA-Base Intercalator
3100
3050
3000
3100
3050
3000
b
TAMRA-(AT)-BHQ2
TAMRA-(AT)
2200
2300
1(ps)
1(ps)
Durata dell’impulsodi fluorescenza
Minor groove binder
2000
2250
2200
2150
1800
2100
0
1
2
3
4
5
HOEC-to-BP ratio
6
7
Quantita’ relativa di MGB (HOEC)
BHQ2
BI
MGB
0 10 20 30 40 50 200
QUIN-to-BP ratio
250
b
300
Quantita’ relativa di BI (QUIN)
RD  A
TAMRA
TAMRA-(AT)-BHQ2
TAMRA-(AT)
Minor groove binder avvicina A a D
DNA BENDING: la doppia elica si
piega
Intercalator allontana A da D
DNA STRETCHING: le doppie basi
si allontanano l’una dall’altra
La precisione della misura di  permette una
sensibilita' a variazioni della distanza D-A <5 Angstrom
ROBERTO ACCOLLA
Giovanna Tosi
VARESE
 Sequenziamento
►Significato e funzioni delle sequenze di basi
►Diagnosticare preventivamente l’insorgenza
di malattie genetiche.
Piccole differenze, da un individuo all’altro della
stessa specie, nella sequenza di basi del DNA
possono codificare per un carattere del fenotipo
(v. biodiversita’, gruppo sanguigno, ecc.), ma
anche essere associate allo sviluppo di malattie
attraverso un’interferenza con processi
biologici cellulari.
VARIANTE
ALLELICA 0)
Sequenza 0
D
TAAAT AT AAT AT TT AT TAAAT AT AA
→
ATTTA T A T T A T A AA TAATT T AT AT T
VARIANTE
ALLELICA 1)
Sequenza 1
A
AAAA T AT AA T A T T T AT T AAAT A T AA
→
T TTTA T A T T A T A AA TAATT T AT AT T
Etc.
Sonda della Sequenza 0
D
TAAAT AT AAT AT TT AT TAAAT AT AA
Sequenza 0
ATTTA T A T T A T A AA TAATT T AT AT T
Sequenza 1
T TTTA T A T T A T A AA TAATT T AT AT T
Sequenza 2
ATTTA T A T T A T A AA TAATT T AT T T T
Sequenza 3
ATTTA T A T T A T A TA TAATT T AT AT T
PUNTI DI MISMATCHING Sonda/Sequenze
1 prima base
2 terzultima base
3 base al centro
A
DISTANZE D-A?
DIVERSI
?
S0
A
D
D
A
2662±8 ps
R0
S1
D
D
A
A
2621±18 ps
S2
D
A
R1<R0
D
A
2765±3 ps
R2>R0
A
S3
A
D
D
2300±20 ps
R3<R0
Chromosome 6
Major histocompatibility complex (MHC)
locus di massima variabilita’ allelica:
class II Human Leukocyte Antigen
(HLA)
varianti alleliche responsabili per un
gran numero di patologie
Cromosoma 6
TAMRA
BHQ2
D
A
Sonda Specifica per la Sequenza 0201
D- C T G C T G G G G C T G C C T G CCG C C G A G T A C T - A
G A C G A C C C C G A C G G AC GGC G G C T C AT G A
Sequenza 0201
CONCLUSIONE
L’unica sequenza che produce perfetto matching con la sonda
per essa specifica tiene A all’estrema distanza da
WORK IN PROGRESS
D
.
La stessa sonda produce MASSIMO  aggiungendola al DNA
(tutto) semplicemente estratto dai globuli bianchi del
portatore di IDDM.
Bibliografia
A. Andreoni, M. Bondani, L. Nardo,
“Feasibility of single nucleotide polymorphism genotyping with a single-probe
by time-resolved Förster energy transfer”
Molecular and Cellular Probes 23 (2009) 119-121.
Available on line, doi:10.1016/j.mcp.2008.12.008
A. Andreoni, M. Bondani, L. Nardo,
“A time-resolved FRET method for typing polymorphic alleles of the human
leukocyte antigen system by using a single DNA probe”
Photochem. Photobiol. Sci., 8 (2009) 1202-1206.
Available on line, DOI:10.1039/ B906043J
Highlighted in the magazines Chemical Technology
(http://www.rsc.org/Publishing/ChemTech/index.asp) and Chemistry World
(www.rsc.org/ChemistryWorld).
L. Nardo, M. Bondani, G. Tosi, R. S. Accolla, A. Andreoni
“Molecular typing of single-nucleotide polymorphic genes by time-resolved
fluorescence resonance energy transfer”
in: Photobiology: Principles, Applications and Effects, ed. by Léon N.
Collignon and Claud B. Normand (Nova Science Publishers Inc., Hauppauge,
NY, 2010). In press. Invited chapter. ISBN: 978-1-61668-005-3
FLUORESCENCE DECAY of MOLECULES
Light collected at 90 deg
Nd:VAN, SH or TH
Ti:sapphire, SH
BS
L
SAMPLE
LASER PULSES
PIN
ND
ND
CUTOFF
ADJ. DIST.
CFD
FIBER
OBJ
TAC
SPAD
+
AQC
STOP
CHANNEL
Dt=1/(113 MHz)
or
Dt=1/(48 MHz)
START
MCA