FORMATO EUROPEO
PER IL CURRICULUM
VITAE
INFORMAZIONI PERSONALI
Nome
Indirizzo
Telefono
Fax
E-mail
Nazionalità
Data di nascita
Nardo Luca
Via Cadore, 48 – 20900 Monza (MB) – Italia
Uff. 1: 02/64488243; Uff. 2: 031/2386254
Uff.: 0312386119
[email protected]
Italiana
21 Maggio 1978
1
ESPERIENZA LAVORATIVA
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
1 Ottobre 2012 – in corso
Università degli Studi di Milano Bicocca
Università
Ricercatore a tempo determinato tipo A
Attività didattica e di ricerca su tecniche biofisiche di manipolazione di singole
molecole di DNA
1 Luglio 2011 – 30 Settembre 2012
Università degli Studi dell’Insubria
Università
Titolare dell’assegno di ricerca biennale “Laser-FRET risolto in tempo per tipizzare
sequenze geniche con sensibilità a polimorfismi di singolo nucleotide (SNP).
Prospettive di screening di popolazione per l’individuazione di varianti alleliche
correlate all’insorgenza del diabete mellito insulino-dipendente (IDDM)”
Applicazione di tecniche di FRET risolto in tempo alla tipizzazione molecolare di
DNA genomico non amplificato e non purificato, ottenuto per lisato cellulare di
campioni ematici. Determinazione delle modalità di binding tra proteine e loro
substrato tramite misure di spettroscopia di fluttuazioni della fluorescenza,
caratterizzazione della fluorescenza di polimeri organici ed organometallici in stato
solido
1 Marzo 2010 – 30 Giugno 2010/ 1 settembre 2010 - 31 Dicembre 2010
Università degli Studi dell’Insubria
Università
Titolare della borsa di studio quadrimestrale (rinnovata per un ulteriore quadrimestre)
“Esperimenti di statistica della luce”
Studi di fattibilità in merito all’applicazione di tecniche di FRET risolto in tempo alla
tipizzazione molecolare di DNA genomico non amplificato, realizzazione di misure di
spettroscopia di fluttuazioni della fluorescenza con rivelatori sensibili al numero di
fotoni, caratterizzazione delle performance di photosensitizers tramite time-correlated
single-photon counting
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
1 Giugno 2009 – 31 Gennaio 2010
Centro Grandi attrezzature per lo Studio e la Cara
dell’Università degli Studi dell’Insubria
Università
Titolare di contratto di collaborazione coordinata e contin
Progettazione e realizzazione di un setup di microsco
dell’attività di ricerca correlata alla time-correlated single
Dipartimento di Fisica e Matematica
1 Aprile 2008 – 31 Marzo 2009
Università degli studi dell’Insubria
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
Università
Titolare dell’assegno di ricerca annuale “Applicazioni classiche e quantistiche
dell’ottica non lineare”
• Principali mansioni e responsabilità
Ricerche sull’aggregazione e la fototossicità di sistemi molecolari per la delivery di
farmaci e sviluppo di tecniche di tipizzazione molecolare innovative. Entrambe le linee
2
di ricerca si basano sull’impiego di tecniche di fluorescenza risolta in tempo
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
1 Febbraio 2007 – 31 Luglio 2007
Unione Europea – Regione Lombardia
Ricerca universitaria
Borsa di studio semestrale della Sovvenzione Globale Ingenio
Ricerche sulla fotofisica di derivati della curcumina nell’ambito del progetto
“Anticarie attivato da lampade fotopolimerizzanti”, tramite implementazione di
tecniche di fluorescenza e fosforescenza steady-state e time-resolved e quantificazione
della produzione fotosensibilizzata di 1O2 mediante misure di luminescenza.
1 Giugno 2004 – 30 Settembre 2004
Università degli Studi di Milano Bicocca
Università
Titolare della borsa di studio annuale dal titolo “Studio sperimentale dei meccanismi
di legame di molecole sonda con macromolecole di rilevanza biologica”
Implementazione di tecniche di spettroscopia di fluorescenza per la determinazione
delle modalità di legame della sonda fluorescente Pepep Dimetile a DNA in vitro ed
in vivo
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
Settembre 2005 – In corso
Ministero della Pubblica Istruzione
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
Marzo 2001 – Settembre 2004
Hobby & Work
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
Giugno 2000 – Ottobre 2001
Gruppo Informatico SiGes, Via Ferrari 10, Saronno
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
Ottobre 1999 – Marzo 2000
Istituto professionale E.N.A.I.P. di Como (gestito dalla Regione Lombardia)
Scuola secondaria di primo e secondo grado
Docente
Effettuazione di supplenze a tempo parziale
Editoria
Collaboratore editoriale
Composizione testi di carattere monografico, selezione di materiale fotografico e
supporti audiovisivi
Sistemi gestionali on demand
Promotore commerciale
Telemarketing e contatto con i clienti; consulenza nella produzione di materiale
promozionale; preparazione di preventivi ed offerte
Istruzione
Docente di cultura scientifica
Insegnamento
3
• Date (da – a)
• Nome e indirizzo del datore di
lavoro
• Tipo di azienda o settore
• Tipo di impiego
• Principali mansioni e responsabilità
Giugno 1998 – Novembre 1999
Ristorante McDonald’s Lariofood, Portici Plinio 10, Como
Ristorazione
Operatore
Attività di cassa, cucina, pulizia
ISTRUZIONE E FORMAZIONE
• Date (da – a)
• Nome e tipo di istituto di istruzione
o formazione
• Principali materie / abilità
professionali oggetto dello studio
• Qualifica conseguita
• Livello nella classificazione
nazionale (se pertinente)
• Date (da – a)
• Nome e tipo di istituto di istruzione
o formazione
• Principali materie / abilità
professionali oggetto dello studio
• Qualifica conseguita
• Livello nella classificazione
nazionale (se pertinente)
Ottobre 1997 – Marzo 2004
Università degli Studi dell’Insubria
Fisica, Matematica, Chimica, Biologia
Laurea Quadriennale in Fisica
110/110
Ottobre 2004 – Luglio 2008
Università degli Studi dell’Insubria
Fisica, Matematica, Chimica, Biologia
Dottorato di ricerca in Fisica
Cfr. giudizio della commissione giudicante della Tesi di Dottorato, titolo a) allegato
alla domanda di partecipazione
CAPACITÀ E COMPETENZE
PERSONALI
MADRELINGUA
ITALIANO
ALTRE LINGUE
• Capacità di lettura
• Capacità di scrittura
• Capacità di espressione orale
INGLESE
ECCELLENTE
ECCELLENTE
ECCELLENTE
• Capacità di lettura
• Capacità di scrittura
• Capacità di espressione orale
FRANCESE
BUONA
BUONA
BUONA
CAPACITÀ E COMPETENZE
RELAZIONALI
Vivere e lavorare con altre persone, in
ambiente multiculturale, occupando posti
in cui la comunicazione è importante e in
situazioni in cui è essenziale lavorare in
squadra (ad es. cultura e sport), ecc.
L’esperienza lavorativa sia nel campo dell’insegnamento, sia nel campo della
divulgazione editoriale, sia nel campo della comunicazione promozionale ha
permesso che il candidato sviluppasse ottime capacità di comunicazione orale e
scritta, corroborate dalle competenze nell’implementazione di supporti tecnici quali
presentazioni informatiche, utilizzo di materiali audiovisivi e fotografici, schemi
logici, ecc. Il candidato ha esperienza approfondita di comunicazione sia personale,
sia rivolta a gruppi. L’esperienza di lavoro in fast-food ha costituito per il candidato
una occasione di confronto con le dinamiche relazionali tipiche del lavoro d’equipe in
un contesto in cui le sinergie umane e professionali sono cruciali all’erogazione di un
servizio adeguato. Si consideri a proposito anche l’esperienza del candidato nel
4
CAPACITÀ E COMPETENZE
ORGANIZZATIVE
Ad es. coordinamento e amministrazione
di persone, progetti, bilanci; sul posto di
lavoro, in attività di volontariato (ad es.
cultura e sport), a casa, ecc.
CAPACITÀ E COMPETENZE
TECNICHE
Con computer, attrezzature specifiche,
macchinari, ecc.
mondo della ricerca universitaria, nell’ambito della quale numerose sono state e sono
le collaborazioni con colleghi italiani e stranieri.
IL CANDIDATO È STATO COREDATTORE DEI SEGUENTI PROGETTI DI RICERCA AMMESSI A
FINANZIAMENTO:
- “Timing di singoli fotoni di fluorescenza con fotodiodi a valanga per il
riscontro sperimentale di dinamiche molecolari di interesse biomedico
previste su tempi di 10-100 ps” progetto biennale finanziato dal MIUR
nell'ambito del bando P.R.I.N. 2005
“Anticarie attivato con lampade foto polimerizzanti” finanziato da EU,
MIUR e Regione Lombardia nell’ambito delle attività a sostegno di giovani
ricercatori previste dal VII programma quadro nel contesto della
Sovvenzione Globale Ingenio. Il candidato risulta Capofila del presente
progetto
- “Lu.Na.: La natura della luce nella luce della natura” finanziato dalla
Fondazione Banco del Monte di Lombardia nell’ambito delle iniziative a
sostegno della formazione d’eccellenza intraprese dalla Fondazione nel
Piano Strategico 2009 (http://luna.dfm.uninsubria.it/)
Nell’ambito della didattica nella scuola, il candidato è stato responsabile delle attività
di laboratorio scientifico (sezione “Archimede”) del progetto “Agorà”, ammesso al
finanziamento MIUR nell’ambito del bando “Scuole Aperte 2009”.
Il candidato ha inoltre collaborato, e tuttora collabora, ad alcuni progetti didattici
finanziati dal MIUR nell’ambito del progetto lauree scientifiche, e ad altri patrocinati
dal Dipartimento di Fisica e Matematica dell’Università dell’Insubria. Tali attività
sono finalizzate all’orientamento degli studenti della scuola secondaria nella scelta del
percorso di studi universitari e si concretizzano nell’organizzazione di seminari,
lezioni, dimostrazioni e stage in laboratorio.
COMPETENZE INFORMATICHE:
Ambiente Windows:
- Office
- Origin
- Matlab
Derive
Mathematica
COMPETENZE LINGUISTICHE:
Attestati:
- “Cambridge First Certificate of English as a foreign language”
conseguito nel 1996
- Certificati di iscrizione e profitto relativi a quattro corsi intensivi di
lingua inglese frequentati in UK dal 1993 al 1997
COMPETENZE SCIENTIFICHE E TECNICHE:
a) preparazione di base in fisica, biologia molecolare e chimica generale, in virtù del
piano di studi effettuato
b) ampio background, teorico e sperimentale, in merito ai fenomeni di assorbimento
risonante (sia per quanto riguarda l'eccitazione dei livelli elettronici, sia per quanto
riguarda le transizioni rotovibrazionali) e di riemissione fluorescente di radiazione
elettromagnetica da parte di molecole in soluzione.
c) capacità di utilizzo delle più moderne tecniche di spettroscopia di fluorescenza
laser-indotta (Photon Counting Histogram, Fluorescence Correlation Spectroscopy,
Fluorescence Imaging, Fluorescence Lifetime Imaging, Photon Counting Histogram
Imaging), in vitro ed in vivo, sia in regime di eccitazione a singolo fotone sia in
regime di eccitazione a due fotoni
d) esperienza rilevante in merito a metodologie e apparecchiature per la misurazione
dei tempi di decadimento della fluorescenza di molecole in soluzione, sia nel dominio
dei tempi, sia nel dominio delle frequenze
e) esperienza rilevante nell'applicazione di tecniche di time-correlated single-photon
5
counting
f) conoscenze teoriche nel campo dell'ottica lineare e non lineare e della fisica dei
laser, capacità tecnico-sperimentali elevate maturate nei campi della realizzazione di
setup ottici complessi, della generazione fuori cavità di armoniche di una sorgente
laser a mezzo di cristalli non lineari, della manutenzione di sorgenti laser complesse
(relativa anche all'allineamento delle cavità risonanti)
g) conoscenze di base nel campo dell'elettonica dei fotorivelatori
h) conoscenze di base in merito all'aspetto medico di problematiche scientifiche di
particolare attualità quali la ricerca sul cancro, sull' A.I.D.S. e sulle patologie che
coinvolgono l'azione o il danneggiamento di strutture genomiche e proteiche
i) capacità di base in merito all'handling di strumentazione e sostanze tipiche di un
laboratorio di chimica
j) nozioni in merito al trattamento di biomolecole in soluzione
k) nozioni in merito al trattamento, alla incubazione ed alla marcatura fluorescente di
cellule per applicazioni in vivo
l) esperienza di tecniche olografiche
CAPACITÀ E COMPETENZE
ARTISTICHE
Musica, scrittura, disegno ecc.
PATENTE O PATENTI
Il candidato ha cantato dal 2005 al 2009 come tenore in un coro dilettantistico
specializzato nel repertorio sacro e profano di compositori italiani e mitteleuropei dei
sec. XV – XIX.
La sua attività editoriale comprende pubblicazioni nei settori della critica e della
storiografia musicale, attività di filologia letteraria e ricerche biografiche su figure di
rilievo del mondo dell’opera lirica
Patente automobilistica B
6
ULTERIORI INFORMAZIONI:
DETTAGLIO ESPERIENZE DI RICERCA:
Settembre 2002 – Marzo 2004
Presso il gruppo di Biofisica diretto dal Prof. G. Baldini al Dipartimento di
Fisica dell’Università degli Studi di Milano Bicocca per la realizzazione
della tesi di Laurea in Fisica, dal titolo “Pepep, una nuova sonda fluorescente
per il DNA con eccitazione a due fotoni” (cfr. riassunto allegato), effettua le
prime misure di time-resolved fluorescence, procedendo alla determinazione
del tempo di decadimento del fluoroforo Dimethyl-Pepep in solventi di
diversa polarità. Le misure sono effettuate sia nel dominio dei tempi (tramite
time-correlated single-photon counting) sia nel dominio delle frequenze
(tramite eccitazione dei campioni con sorgenti laser continuous-wave
modulate ad alte frequenze da modulatori acusto-ottici e misura della
demodulazione e dello sfasamento della fluorescenza rispetto alla radiazione
eccitante). Matura altresì rilevanti esperienze nell’handling di campioni
biologici (cellule e biomolecole) e nell’indagine spettroscopica di reazioni di
binding, con particolare riferimento all’interazione tra DNA e piccole
molecole.
1 Giugno 2004 – 31 Settembre2004
Presso il gruppo di Biofisica diretto dal Prof. G. Baldini al Dipartimento di
Fisica dell’Università degli Studi di Milano-Bicocca, quale vincitore di una
Borsa di Studio annuale a tema in Spettroscopia Molecolare applicata allo
studio di biosistemi dal titolo “Studio sperimentale dei meccanismi di
legame di molecole sonda con macromolecole di rilevanza biologica”,
prosegue le attività intraprese nel corso del lavoro di tesi.
1 Ottobre 2004 – 31 Gennaio 2007
Titolare di Borsa di Dottorato di Ricerca MIUR - Progetto Giovani 2004
(XX ciclo di Dottorato), riservata a ricercatori operanti nei settori
optoelettronica e laser, usufruita presso il Dipartimento di Fisica e
Matematica dell’Università degli Studi dell’Insubria a Como, svolge le
attività di ricerca basate sul timing di singoli fotoni e prende in carico la
gestione della facility di time-correlated single-photon counting diretta dalla
Prof. A. Andreoni, suo PhD tutor (cfr. lettera di referenze, titolo b) allegato
alla domanda di partecipazione), occupandosi, oltre che dell’attività
sperimentale come principal user, della manutenzione (estesa
all’allineamento intracavity) delle due sorgenti ad alta frequenza di
ripetizione ed impulsi ultrabrevi in dotazione presso la facility. È parte attiva
della collaborazione con il Dip. di Elettronica ed Informazione del
Politecnico di Milano nell’ambito del progetto MIUR - PRIN 2005 (cfr.
Campo: “Competenze e Capacità Organizzative”). Le ricerche nell’ambito di
tale progetto si concentrano su: (i) elaborazione di tecniche innovative di
mappatura delle discontinuità all’interno di mezzi altamente diffondenti,
basate sulla discriminazione dei fotoni snake (solo debolmente diffusi)
perseguita tramite la combinazione di selezione del modo spaziale e misura
del tempo di volo dei singoli fotoni trasmessi, e valutazione dell’impatto
delle suddette tecniche in applicazioni di diagnostica medica; (ii)
determinazione di un protocollo di discriminazione delle modalità di legame
di piccole molecole al DNA basato su misure di time-resolved fluorescence
resonance energy transfer.
Nel corso del primo anno di Dottorato il candidato frequenta altresì il corso
di ottica non lineare ed il corso di spettroscopia molecolare.
7
1 Febbraio 2007 – 31 Luglio 2007
Vincitore di una Borsa di Studio semestrale corrisposta dalla regione
Lombardia e dalla Comunità Europea nel contesto della Sovvenzione
Globale Ingenio per la realizzazione del progetto “Anticarie attivabile con
lampade fotopolimerizzanti” (cfr. Campo: “Competenze e Capacità
Organizzative”), usufruita presso il medesimo Dipartimento di Fisica e
Matematica dell’Università degli Studi dell’Insubria a Como, prosegue nello
svolgimento delle attività di ricerca basate su misure di time-correlated
single-photon counting, con particolare riferimento alle ricerche sulle
curcumine, pigmenti naturali che manifestano attività antibatterica
fotoindotta (è stata accordata al candidato la sospensione momentanea
dell’erogazione della Borsa di Dottorato in quanto incompatibile con
l’erogazione della borsa Ingenio). Le ricerche in oggetto sono svolte in
collaborazione con la Prof. H. H. Tonnesen, dell’Università di Oslo (cfr.
lettera di referenze, titolo c) allegato alla domanda di partecipazione).
1 Agosto 2007 – 31 Marzo 2008
Riprende il Dottorato di Ricerca, dedicandosi all’ideazione di tecniche
innovative, basate sul fenomeno di fluorescence resonance energy transfer,
per la tipizzazione molecolare di varianti alleliche polimorfiche. Questa
attività è condotta in collaborazione con il gruppo del Prof. R. Accolla, del
dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche dell’Università dell’Insubria
(cfr. lettera di referenze, titolo d) allegato alla domanda di partecipazione).
1 Aprile 2008 – 31 Marzo 2009
Titolare dell’assegno di ricerca annuale dell’Università dell’Insubria
“Applicazioni classiche e quantistiche dell’ottica non lineare”, prosegue gli
studi in merito alla tipizzazione molecolare. Parallelamente, nell’ambito di
una collaborazione con la Prof. J. Roberts della Fordham University di New
York ottiene le prime misure dei decadimenti della fluorescenza di derivati
idrosolubili del Carbonio 60 utilizzati in farmacologia come molecular drug
delivery systems.
Il 28 Luglio 2008 consegue il titolo di Dottore di Ricerca in Fisica,
difendendo la Tesi “Light interactions in medicine: measurements of weak
and ultrashort signals”
1 Giugno 2009 – 31 Gennaio 2010
Titolare di contratto di Co.Co.Co. bandito dal Centro Grandi attrezzature per
lo Studio e la Caratterizzazione della Materia dell’Università degli studi
dell’Insubria, opera presso la picosecond laser facility del Dipartimento di
Fisica e Matematica, con il compito di progettare e realizzare un setup di
microscopia confocale per l’implementazione di tecniche di Fluorescence
Fluctuation Spectroscopy e Lifetime Imaging con rivelatori dotati di elevata
capacità di discriminazione del numero di fotoelettroni. Utilizza il suddetto
setup di microscopia confocale per eseguire misure di Photon Counting
Histogram su fluorofori in soluzione con i rivelatori di cui sopra. La presente
attività di ricerca è sviluppata in collaborazione con il gruppo diretto dal
Prof. M. Caccia, il quale cofinanzia il contratto del candidato.
1 Marzo 2010 – 31 Dicembre 2010
Titolare della borsa di studio “Esperimenti di statistica della luce”
dell’Università dell’Insubria, si dedica a porre in funzione ed ottimizzare una
variante del correlatore di Hanbury-Brown e Twiss basata su rivelatori
SPAD di singoli fotoni caratterizzati da timing accurato (risoluzione 30 ps),
8
basso rate di conteggi di buio (<30 Hz) ed elevata efficienza quantica di
rivelazione (60% per luce a 530 nm) e su schede di correlazione dotate di
rate di conversione (10 MHz) e risoluzione temporale (800 femtosecondi)
elevati. Tale sistema consente la correlazione di singoli fotoni con
risoluzione dell’ordine di decine di picosecondi e range dinamico da qualche
picosecondo a svariati minuti. Il sistema è stato utilizzato per misure di
spettroscopia di autocorrelazione della fluorescenza emessa da un singolo
fluoroforo, ed ha permesso la rivelazione del fenomeno quantistico
dell’antibunching. Contemporaneamente è coinvolto nella caratterizzazione
delle performances di photosensitizers ottimizzati per la terapia fotodinamica
di tumori di tessuti interni, e caratterizzati da eccitazione ed emissione a
lunghezze d’onda > 650 nm (facilmente trasmesse all’interno dei tessuti).
Prosegue inoltre la ricerca in merito ai curcuminoidi. Effettua studi e misure
preliminari volte all’identificazione di sonde oligonucleotidiche
fluorogeniche ottimizzate per il targeting specifico di regioni polimorfiche
del gene DQB1 all’interno di DNA genomico non amplificato, con
l’intenzione di elaborare protocolli di screening di popolazione per la
determinazione della suscettibilità al diabete mellito basati sull’applicazione
dei metodi di FRET risolto in tempo per la tipizzazione molecolare elaborati
in precedenza e testati in vitro su oligonucleotidi sintetici.
1 Luglio 2011- 30 Settembre 2012
Titolare dell’assegno di ricerca biennale “Laser-FRET risolto in tempo per
tipizzare sequenze geniche con sensibilità a polimorfismi di singolo
nucleotide (SNP). Prospettive di screening di popolazione per
l’individuazione di varianti alleliche correlate all’insorgenza del diabete
mellito insulino-dipendente (IDDM)” cofinanziato dalla Regione Lombardia
nell’ambito del Programma UNIRE, Progetto Dote Ricerca Applicata per lo
Sviluppo del Capitale Umano nel Sistema Universitario Lombardo, prosegue
gli studi sulla tipizzazione di DQB1, pervenendo alla tipizzazione di DNA
genomico non amplificato. Prosegue altresì l’attività nel campo delle
tecniche di spettroscopia delle fluttuazioni della fluorescenza, applicando
metodi di spettroscopia di cross-correlazione della fluorescenza allo studio
del legame tra biotina e streptavidina. Parallelamente si dedica alla
caratterizzazione in stato solido della fluorescenza steady-state e timeresolved di polimeri organici e metallo-organici.
Il 30 Settembre 2011 consegue l’abilitazione al ruolo di ricercatore di terzo
livello a tempo indeterminato nel concorso per titoli ed esami bandito dal
CNR-IFN (bando 364-92 del 2010, cfr. comunicazione ufficiale, titolo e)
allegato alla domanda di partecipazione).
1 Ottobre 2012 – In corso
Ricercatore a tempo determinato presso il Dipartimento di Scienze della Salute
dell’Università degli Studi di Milano Bicocca, collabora all’attività di ricerca del
gruppo coordinato dal Prof. F. Mantegazza, effettuando misure di fluorescenza
steady-state e time-resolved volte alla caratterizzazione dei primi stadi
dell’aggregazione della proteina Ab, agente patogenico del morbo di Alzheimer.
Contribuisce all’integrazione di sistemi di epifluorescenza su setup di
nanomanipolazione di biomolecole (pinzette magnetiche, microscopio a forza
atomica). Svolge ricerche sulle caratteristiche termodinamiche e nanomeccaniche di
DNA metilato e sulla topologia, morfologia e cinetica di evoluzione di bolle di
denaturazione spontanea o indotta da superavvolgimento su DNA genomico
eucariote.
Effettua attività didattica per i Corsi di Laurea in Fisioterapia e CLOPD.
ULTERIORI ESPERIENZE DIDATTICHE ED ATTIVITÀ DI DIVULGAZIONE SCIENTIFICA:
1.
Tutoring di studenti universitari presso C.E.P.U. (2005-2006)
9
2.
Effettuazione di moduli di Olografia (2006) e Interazione radiazione materia
(2007) nel contesto dell’attività di orientamento “Moduli didattici per
l’orientamento” della Facoltà di Scienze dell’Università degli Studi
dell’Insubria.
3.
Effettuazione di moduli di Interazione radiazione materia (2009) nel contesto
del “Progetto Lauree Scientifiche” del MIUR.
4.
Lezioni seminariali di olografia, laser, ottica non-lineare e spettroscopia
molecolare nell’ambito del progetto “Learning Weak - Tutti intorno alla luce”
sovvenzionato dalla UE e da Regione Lombardia (2009).
5.
Interventi di didattica sperimentale on-demand in scuole di ogni ordine e grado
nel contesto del progetto “Lu.Na.: La natura della luce nella luce della natura”
(2010 – in corso, cfr. sito web del progetto: http://luna.dfm.uninsubria.it)
6.
Correlatore delle Tesi di Laurea Specialistica in Fisica:
-
“Dinamiche in stato eccitato di coloranti di interesse biomedico:
Curcumine” (2007)
- “Tipizzazione di polimorfismi con misure di time-correlated single-photon
counting su DNA non amplificato di portatori di malattie a suscettività
genetica. Applicazione all’IDDM (Insulin-dependent diabetes mellitus)”
(2011)
7.
Correlatore delle Tesi di Laurea Triennale in Fisica:
-
“Studio dei meccanismi di decadimento da S1 per l’ottimizzazione della
fotoattività
di
curcuminoidi:
acido
carbossilico
della
bisdeidrossicurcumina” (2011)
-
“Determinazione tramite tecniche di fluorescenza steady-state e timeresolved dei meccanismi di decadimento da S1 del curcuminoide
ciclovalone” (2011)
8.
Contributo alla progettazione e alla realizzazione dell’Area Newton (Olografia)
della Mostra “La fisica attorno a noi” (Como, 15/12/2005-15/1/2006) ed
attività di guida scientifica nel contesto di tale manifestazione.
9.
Contributo alla progettazione ed alla realizzazione dello stand della Facoltà di
Scienze dell’Università dell’Insubria alla Fiera YOUNG – Orienta il tuo futuro
(Erba, 17/11/2010-21/11/2010)
10.
Contributo alla progettazione ed alla realizzazione dello stand della Facoltà di
Scienze dell’Università dell’Insubria alla Fiera YOUNG – Orienta il tuo futuro
(Erba, 1/12/2011-4/12/2011)
PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE:
Pubblicazioni su riviste internazionali referate:
1.
2.
3.
4.
A. Abbotto, G. Baldini, L. Baverina, G. Chirico, M. Collini, L. D’Alfonso,
A. Diaspro, R. Magrassi, L. Nardo, G. A. Pagani “Dimethyl-pepep: a DNA
probe in two-photon excitation cellular imaging” Biophys. Chem. 114 (2005)
35-41
A. Andreoni, L. Nardo, A. Brega, M. Bondani “Optical profiles with 180 µm
resolution of objects hidden in scattering media” J. Appl. Phys. 101 (2007)
024921/1-8. L’Articolo è stato altresì selezionato per la ripubblicazione nel
numero di Febbraio 2007 della rivista on-line Virtual Journal of Ultrafast
Sciences
L. Nardo, M. Bondani, and A. Andreoni “DNA-ligand binding-mode
discrimination by characterizing fluorescence resonant energy transfer
through lifetime measurements with picosecond resolution” Photochem.
Photobiol. 84 (2008) 101-110
L. Nardo, R. Paderno, A. Andreoni, M. Masson, T Haukvik, and H. H.
Tonnesen “Role of H-bond formation in the photoreactivity of curcumin”
10
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Spectroscopy: Biomed. Appl. 22 (2008) 187-198
L. Nardo, A. Brega, M. Bondani, and A. Andreoni “Non-tissue-like
features in the time-of-flight distributions of plastic tissue phantoms” Appl.
Opt. 47 (2008) 2477-2486
A. Andreoni, L. Nardo, G. Zambra, and M. Bondani “Time-correlared
single-photon counting based method for submillimeter transillumination
imaging of objects embedded in tissue-phantoms” J. Mod. Opt. 56 (2009)
413-421
A. Andreoni, M. Bondani, and L. Nardo “Feasibility of single-probe SNP
genotyping by time-resolved FRET” Mol. Cell. Probes 23 (2009) 119-121
L. Nardo, M. Bondani, and A. Andreoni “Discrimination of the
binding-mode of DNA-ligands by single photon timing” Spectroscopy 23
(2009) 11-28
A. Andreoni, M. Bondani, and L. Nardo “A time-resolved FRET method for
HLA DQB1 allele molecular typing by a single oligonucleotide probe”
Photochem. Photobiol. Sci. 8 (2009) 1202-1206
L’articolo è stato altresì selezionato per una referenza
sull’edizione on-line della rivista Chemical
Technology
della
Royal
Chemical
Society
(http://www.rsc.org/Publishing/ChemTech/index.asp).
L’highlight è apparso anche sulla versione cartacea
della medesima rivista. L’articolo è stato inoltre
referenziato sul mensile di divulgazione scientifica
Chemistry World della Royal Chemical Society.
L. Nardo, A. Andreoni, M. Bondani, M. Masson, and H. H. Tonnesen
“Photophysical properties of a symmetrical, non-substituted curcumin
analogue” J. Photochem. Photobiol., B: Biol. 97 (2009) 77-86.
M. Lilletvedt, H. H. Tønnesen, A. Høgset, L. Nardo, and S. Kristensen
“Physicochemical characterization of the photosensitizers TPCS2a and
TPPS2a 1. Spectroscopic evaluation of drug-solvent interactions” Pharmazie
65 (2010) 588-595.
M. Lilletvedt, H. H. Tønnesen, A. Høgset, S. Kristensen, and L. Nardo
“Time-domain evaluation of drug-solvent interactions of the photosensitizers
TPCS2a and TPPS2a as part of physicochemical characterization” J.
Photochem. Photobiol., A: Chem. 214 (2010) 40-47.
L. Nardo, A. Andreoni, M. Masson, and H. H. Tonnesen “Photophysical
properties of bis-demethoxy-curcumin” J. Fluorescence. 21 (2011) 627-635.
J. Stromqvist, L. Nardo, O. Broekmans, J. Kohn, M. Lamperti, A. Santamato,
M. Shalaby, G. Sharma, P. Di Trapani, M. Bondani, and R. Rigler “Binding
of biotin to streptavidin: a combined fluorescence correlation spectroscopy
and time-resolved fluorescence study” Eur. Phys. J. Special Topics 199
(2011) 181-194.
L. Nardo, A. Andreoni, M. Bondani, M. Masson, T. Haukvik, and H. H.
Tonnesen “Photophysical properties of dimethoxycurcumin and bisdehydroxycurcumin” J. Fluorescence 22 (2012) 597-608.
L. Nardo, S. Kristensen, H. H. Tonnesen, A. Hogset, and M. Lilletvedt
“Solubilization of the photosensitizers TPCS2a and TPPS2a in aqueous media
evaluated by time-resolved fluorescence analysis” Die Pharmazie 67 (2012)
598-600.
L. Nardo, A. Maspero, M. Selva, M. Bondani, G. Palmisano, E. Ferrari, and
M. Saladini “Excited-state dynamics of bis-dehydroxycourcumin carboxylic
acid, a water-soluble derivative of the photosensitizer curcumin” J. Phys.
Chem. A 116 (2012) 9321-9330.
L. Nardo, G. Tosi, M. Bondani, R. Accolla, and A. Andreoni “Typing of a
polymorphic human gene conferring susceptibility to insulin-dependent
diabetes mellitus by picosecond-resolved FRET on non-amplified genomic
DNA” DNA research 19 (2012) 347-355.
L. Nardo, N. Camera, E. Totè, M. Bondani, R. S. Accolla, and G. Tosi
“Time-resolved Forster resonance energy transfer analysis of single
nucleotide polymorphisms: towards molecular typing of genes on nonpurified and non-PCR-amplified DNA” J. Mol. Bio. Res. 3 (2013). In press.
DOI: 10.5539/jmbr.v3n1p15.
11
Proceedings congressuali:
1. L. Nardo, M. Bondani, and A. Andreoni “Optical biopsy and tissue-phantom
selection: a novel approach combining single-photon timing and spatialmode selection” Proceedings of SPIE, 7320 (2009) 732009, “Advanced
Photon Counting Techniques III” (Mark A. Itzler, Joe C. Campbell, Eds.).
2. A. Andreoni, M. Bondani, and L. Nardo “Time-resolved FRET for singlenucleotide polymorphism genotyping” Proceedings of SPIE, 7320 (2009)
732014, “Advanced Photon Counting Techniques III” (Mark A. Itzler, Joe C.
Campbell, Eds.).
3. L. Nardo, G. Tosi, M. Bondani, R. Accolla, and A. Andreoni “Picosecondresolved FRET on non-amplified DNA for identifying individual genetically
susceptible to type-1 diabetes” Proceedings of SPIE 837512 (2012) 8375127, “Advanced Photon Counting Techniques VI” (Mark A. Itzler, Joe C.
Campbell, Eds.). Submitted.
4. M. Ramilli, A. Allevi, L. Nardo, M. Bondani, and M. Caccia “Photonnumber statistics and correlations with silicon photomultipliers” Proceedings
of SPIE 8375 (2012) 83750T, “Advanced Photon Counting Techniques VI”
(Mark A. Itzler, Joe C. Campbell, Eds.)..
Libri o capitoli di libri:
1.
2.
3.
4.
5.
L. Nardo and M. Bondani “Optical imaging of tissues” in “Research
Advances in Photochemistry and Photobiology, 1” R. M. Mohan, ed., Global
Research Network – Kerala, India (2009), pp. 29-38. Invited.
L. Nardo, A. Andreoni, and H. H. Tonnesen “Intramolecular H-bond
formation mediated de-excitation of curcuminoids: a time-resolved
fluorescence study” in “Hydrogen bonding in excited states” Ke-Li Han and
Guang-Jiu Zhao, eds., J. Wiley & sons, Inc. – Hoboken, NJ – US (2010), pp.
353-373. Invited.
L. Nardo, M. Bondani, G. Tosi, R. S. Accolla, and A. Andreoni “Molecular
typing of single-nucleotide polymorphic genes by time-resolved fluorescence
resonance energy transfer” in “Photobiology: Principles, Applications and
Effects”, Léon N. Collignon and Claud B. Normand, eds., Nova Science
Publishers Inc. – Hauppauge, NY – US (2010), pp. 69-90. Invited.
L. Nardo, M. Bondani, and H. H. Tonnesen “Elucidating the relationship
between curcuminoids phenolic substituents and their excited-state
dynamics” in “Curcumin: biosynthesis, medicinal uses and Health benefits”,
Nadya Gotsiridze-Columbus, ed., Nova Science Publishers Inc. –
Hauppauge, NY – US (2012), pp. 81-104. Invited.
M. Ramilli, A. Allevi, L. Nardo, M. Bondani, and M. Caccia “Silicon
photomultipliers: Characterization and applications” in “Photodetectors”,
Sanka Gateva, ed., InTech open-access publisher – Rijeka, Croatia (2012),
pp. 77-100. Invited.
Interventi a congressi internazionali:
1.
2.
3.
Parte dei risultati della tesi di laurea è stata oggetto di presentazioni
nell’ambito di congressi internazionali (Focus on Microscopy - Genova
2003; SPIE – Monaco 2003; Biophysical Society – Baltimora 2004), ed è
pubblicata sugli atti dei congressi SPIE 2003 e Medicon 2004 (Ischia). Al
congresso della Biophysical Society Baltimora 2004 è stato inoltre presentato
un poster dal titolo “Pepep: a new DNA stainer for two photon excitation
cellular imaging”, di cui il candidato compare come coautore
L. Nardo, M. Bondani, A. Andreoni “Single-Photon detection of ultrafast
fluorescence decays for direct measure of DNA-Ligand binding mode”
Presentazione orale nell’ambito del convegno annuale dell’MMD-meeting
2005 di Genova. L’abstract è pubblicato sugli atti del congresso
L. Nardo, M. Bondani, A. Andreoni “Assessing the binding mode of
ligands to DNA by time resolved fluorescence” Presentazione orale
nell’ambito della conferenza CLEO/Europe-IQEC 2007 di Monaco.
L’abstract è pubblicato sugli atti del congresso
12
4.
L. Nardo, M. Bondani, A. Andreoni “Assessing Ligand/DNA binding
mode by time-resolved fluorescence” Poster presentato al congresso ECSBM
2007 di Parigi. L’abstract è pubblicato sugli atti del congresso
5. L. Nardo, R. Paderno, A. Andreoni, T. Haukvik, M. Màsson, H. H.
Tonnesen “Elucidating the role of H-bond formation in the photoreactivity of
curcuminoids displaying therapeutic potential” Poster presentato nell’ambito
del congresso ECSBM 2007 di Parigi. L’abstract è pubblicato sugli atti del
congresso
6. L. Andreoni, L. Nardo, G. Zambra, M. Bondani “Time-resolved laser
investigations in bio-medicine exploiting features of TCSPC” Invited Talk
presentato nell’ambito della conferenza Single-Photon Workshop 2007 di
Torino. L’abstract è pubblicato sugli atti del congresso
7. A. Andreoni, M. Bondani, and L. Nardo “Time-resolved FRET for singlenucleotide polymorphism genotyping” Poster presentato nell’ambito del
congresso SPIE conference on Advanced Photon Counting Techniques III –
Symposium on defense security and sensing, Orlando, 13-17 Aprile 2009.
8. L. Nardo, M. Bondani, and A. Andreoni “Optical biopsy and tissue-phantom
selection: a novel approach combining single-photon timing and spatialmode selection” Presentazione orale nell’ambito del congresso SPIE
conference on Advanced Photon Counting Techniques III – Symposium on
defense security and sensing, Orlando, 13-17 Aprile 2009.
9. M. Lilletvedt, H. H. Tonnesen, L. Nardo, A. Hogset, and S. Kristensen
“Characterization of the spectroscopic properties of the photosensitizers
TPCS2a and TPPS2a as part of pharmaceutical preformulation” Poster
presentato nell’ambito del congresso Drug transport and delivery,
Gothenburg, 28-29 Giugno 2010
10. L. Nardo, G. Tosi, M. Bondani, R. Accolla, and A. Andreoni “Picosecondresolved FRET on non-amplified DNA for identifying individuals genetically
susceptible to type-1 diabetes” Poster accettato per la presentazione
nell’ambito del congresso SPIE conference on Advanced Photon Counting
Techniques VI – Symposium on defense security and sensing, Baltimora, 2526 Aprile 2012.
11. M. Ramilli, A. Allevi, L. Nardo, M. Bondani, and M. Caccia “Photonnumber statistics and correlations with silicon photomultipliers”
presentazione orale invitata presso il congresso SPIE conference on
Advanced Photon Counting Techniques VI - Symposium on defense security
and sensing, Baltimora, 25-26 Aprile 2012.
ATTIVITÀ DI PEER-REVIEW:
-
Reviewer per “Photochemistry and Photobiology” dal 2008
Reviewer per “Journal of Photochemistry and Photobiology A:
Chemistry” dal 2009
Reviewer per “Journal of Physical Chemistry B” dal 2010
Reviewer per “Journal of Fluorescence” dal 2010
Reviewer per “Spectrochimica Acta A” dal 2011
PARTECIPAZIONI A SIMPOSI E SCUOLE SCIENTIFICHE INTERNAZIONALI:
1.
2.
3.
Summer School “Protein folding and drug design”, 4 - 14 Luglio 2006,
Scuola Internazionale di Fisica Enrico Fermi, Villa Monastero, Varenna
Summer School “The living cell from nano to micro, mind the gap”, 17 - 29
luglio 2006, Institut d'Etudes Scientifiques, Cargese
“Gene Signature Symposia 2005. Milan Symposium”, 13 Aprile 2005,
Università degli Studi di Milano
Rovellasca, lì 19 Marzo 2012
13
(Luca Nardo)
Ai sensi degli artt. 46 e 47 del D.P.R. 28/12/2000, n. 445, consapevole che le dichiarazioni mendaci sono punite ai sensi del
codice penale e delle leggi speciali in materia, secondo quanto previsto dall’art. 76 del D.P.R. 28/12/2000, n. 445, il
sottoscritto, avendo presentato domanda di ammissione alla procedura di valutazione comparativa per l’assegnazione di n.
1 posto di Assegnista di Ricerca presso l’Università degli Studi dell’Insubria, dichiara di essere in possesso dei titoli utili
alla suddetta valutazione menzionati nel presente Curriculum Vitae, nonché la veridicità di tutte le informazioni in esso
riportate.
Rovellasca, lì 19 Marzo 2012
Il dichiarante
(Luca Nardo)
Ai sensi del Decreto Lgs. n. 196 del 30/06/2003, il candidato esprime il proprio consenso affinché i dati personali forniti
possano essere trattati per gli adempimenti connessi alla procedura di valutazione comparativa.
Rovellasca, lì 19 Marzo 2012
Il dichiarante
(Luca Nardo)
Ai sensi dell’art. 38 del D.P.R. 28/12/2000, n. 445, le firme poste in calce al presente documento non necessitano di
autenticazione, in quanto il documento stesso è inviato unitamente a fotocopia non autenticata di un documento di identità
del dichiarante in corso di validità.
Rovellasca, lì 19 Marzo 2012
Il dichiarante
(Luca Nardo)
14
Appendice A – Riassunto della tesi di Laurea/Summary of the Master Degree Thesis
ORIGINAL TITLE: “PEPEP : UNA NUOVA SONDA FLUORESCENTE
PER IL DNA CON ECCITAZIONE A DUE FOTONI”
Translated title: “Pepep: a new fluorescent label for DNA inspection by means of two photon excitation”
Summary:
The spectroscopic characteristics of the new fluorophore Dimethyl-Pepep have been extensively
investigated using state of the art single and two photon excitation techniques such as Fluorescence
Correlation Spectroscopy, Fluorescence Lifetime measurements (both in the time and frequency domain),
Photon Counting Histogram. The dye has shown particularly high two-photon absorption cross section.
Spectrofluorimetric titrations have shown an high chemical affinity of Dimethyl-Pepep for DNA.
The chromophore thus reveals to be particularly efficient for the in vivo inspection of the dynamics of
biological processes such as cellular replication, or for the localization of nucleic acids rich organs at
the interior of the cell by means of Fluorescence Images acquisition.
Detailed contents:
A) Framework
Since long times, the spectroscopic analysis is applied extensively and successfully to the study of biological systems.
The study of fluorescence phenomena shows particularly versatile, as they are characterized by times of response which
are comparable with those typical of the conformational changes of biomolecules and of their interactions with one
another and with the substrate.
Modern techniques have recently been implemented, still base on fluorescence analysis, which allow to acquire digital
images and interesting parameters (such as the intrinsic brilliance, diffusion coefficients, lifetimes of the fluorescent
excited state of the fluorophore) on in vivo samples, by means of the application of excitation sources, such as the IR
ultra-short pulsed lasers for Two Photon Excitation (TPE), capable of minimizing the biological damage to living
matter, and pursuing in the same time a notable increase in sensibility.
Unfortunately, the majority of biological macromolecules displays fluorescence activity which is poor or at least unfit
for TPE. The individuation of fluorescent probes capable of supplying fluorescence signals adequate to the
implementation of the cited techniques and of binding to specific sites of the macromolecules without drastically
affecting their conformational stability and biological functionality is thus a particularly interesting topic at the interior
of molecular biophysics framework. The work of thesis proceeds towards this goal, which consists in the spectroscopic
characterization of Dimethyl-Pepep (in the following Pepep), a fluorescent probe of recent patent (2003-Prof. Pagani,
Dip. Scienze dei Materiali Università degli Studi di Milano Bicocca), and in the study of its interaction with proteins
and nucleic acids.
The chemical structure of Pepep has been designed as to make it be particularly fit for spectroscopic measurements with
TPE, by virtue of its high two photon absorption cross section (122 x 10-50 cm4/photon).
B) Spectroscopic characterization of Dimethyl-Pepep
The dye has been preliminarily characterized acquiring the absorption, excitation and emission spectra for One Photon
continuous wave Excitation (OPE) of the free dye dissolved in Dimethylsulfoxide (DMSO), in Ethanol (EtOH) and in a
polar solvent such as Phosphate Buffer Solution (PBS).
It is well known that biological molecules are sensitive to the acidity/alkalinity and to the salt concentration of the
aqueous solution in which the are dissolved. With the aim of using the fluorescence of Pepep as a probe for the
variations introduced by the molecules it labels as a follow of environmental changes, particular care has been used in
the characterization of the dependence of the dye fluorescence intensity from the pH and ionic strength of the buffer.
Pepep fluorescence shows substantial stability in a wide range of pH values, spanning from strong acid to strong alkali
environment, and is not significantly altered by changes in the concentration of small ions.
Molar extinction coefficients at the absorption peak and fluorescence decay times have been measured in DMSO, EtOH
and PBS. These last have been determined both with methods based on excitation modulated at high frequencies and
with time correlated single photon counting, finding results in good accord between the two cases.
Moreover, the TPE spectrum and the response of fluorescence intensity versus the two photon excitation source
intensity (which has an initially quadratic trend and tends to saturation at intensities higher than several mW) have been
acquired.
15
Implementing the “photon counting histogram” (PCH) technique also allowed us to measure the intrinsic brilliance of
Pepep, that is the number of photons emitted by a single molecule in unit time at a given exciting light intensity.
Spectroscopic data of Pepep have been then compared to those relative to some of the most common and efficient
commercial dyes, such as Fluoresceins and Rodamines.
With the aid of the pulsed laser it has further been possible to undertake some fluorescence correlation spectroscopy
experiments, measuring the diffusion coefficient of Pepep in PBS and in EtOH, and the characteristic times of
reversible transitions from the fluorescent singlet to the dark excited triplet state.
C) Chemical affinity of Dimethyl-Pepep for macromolecules
The chemical binding affinity of Pepep with respect to a sample protein, the Bovine Serum Albumine (BSA), and for
calf thymus DNA has then been studied, by means of standard titration procedures using a static spectrofluorometer.
For BSA the determined binding constant is very week ( of the order of 102-103 M-1), while for DNA it is comparable to
those measured for two of the most used DNA stains, 4,6-Diamidinophenylindole (DAPI) and Ethydium Bromide (~105
M-1 for ionic strength values of about 100 mM). A linear trend of the logarithm of the association constant versus the
logarithm of ionic strength has been measured, in accord with the Manning theory of ligand binding to polyelectrolytes.
Titrations of Pepep with synthetic homopolymers such as Poly d(A-T) and Poly d(G-C) have demonstrated that the
binding constant is more than thirty times higher in the first case. This result seams to exclude, as the primary binding
interactions, both aspecific electrostatic affinity and base intercalation, and suggests that Pepep has a binding specificity
for AT sequences, in the same way displayed by most of the minor groove binders.
D) Deviations from the independent sites model in the binding of Pepep to DNA
The experimental binding curves display deviations from the independent sites model which are repeatable, even if to a
first order negligible. As to obtain a deeper insight on binding dynamics the possible causes of deviation have been
considered by proceeding to numeric simulations which take into account (separately) the effects introduced on the
shape of the binding isotherm by non ideality of the solutions (chemical activity minor than actual concentration at high
DNA concentration), by cooperative or anti-cooperative binding, and by the simultaneous presence of two different
classes of binding sites.
This last hypothesis seams to be the most probable.
E) Two-Photon excited fluorescence cellular imaging
The binding affinity of Pepep for DNA and the ease of TPE induction of fluorescence make it particularly versatile for
in vivo measurements of fluorescence imaging.
Several images have been acquired on Saccaromices Cerevisiae cells, taking a 3D scan of the samples by means of
piezoelectric transductors. The cellular compartments that are more evidenced by the presence of the dye are the
nucleus and some organs of the cytoplasm in which great quantities of nucleic acids physiologically tend to concentrate,
as one can expect from the high chemical affinity of Pepep for DNA.
In fact analogous images obtained using DAPI as the stain show the same dye concentration distribution obtained with
Pepep, while a dye with no specific interaction with nucleic acids such as Rhodamine 6G concentrates on the
membrane.
Lifetime imaging (FLIM) measurements have also been performed, by acquiring the fluorescence decay for 500 ms on
each pixel of the image. The lifetime distribution at the interior of the cell is significant, as detected lifetimes range
from 1.5 ns to 2.0 ns. In vitro measurements have shown that the fluorescence lifetime of Pepep bound to Calf Thymus
DNA is 1.85 ns, while for the dye bound to baker’s yeast RNA the lifetime is 1.47 ns. The decay time for the free
chromophore in PBS is 0.6 ns. So one can conclude that almost all the dye present in the cell is bound either to cellular
DNA or RNA.
Photon Counting Histogram Imaging (PCHI) measurements obtained by sampling each pixel for 10 s have allowed to
estimate the distribution of local concentrations and intrinsic brilliance of the dye molecules at the interior of the cell.
The dye tends to concentrate in the nucleus, but the maximum brilliance is detected for Pepep bound to the
mitochondrial DNA.
F) Conclusions
In conclusion, the new fluorophore Pepep shows an high chemical affinity for DNA and is fit for TPE. It thus reveals as
to be particularly efficient for the in vivo inspection of the dynamics of biological processes such as cellular replication,
or for the localization of nucleic acids rich organs at the interior of the cell.
16
Appendice B – Riassunto della tesi di Dottorato/Summary of the Ph.D Thesis
TITLE: “LIGHT INTERACTIONS IN MEDICINE:
MEASUREMENTS OF WEAK AND ULTRASHORT SIGNALS”
Summary:
The Thesis reports biomedical studies performed with a homemade time-correlated single-photon counting
(TCSPC) facility developed by our group, that combines high detection quantum efficiency, low dark count
rate and extreme temporal resolution. Thanks to these features the study of “pathological” systems whose
phenomenology could not be investigated with conventional timing instrumentation could be undertaken.
Chapters 1 and 2 are introductory. Several biomedical applications of single photon timing are described,
the main single photon timing techniques are overviewed and the advantages of TCSPC are outlined. Our
TCSPC apparatus is described and the instrumental temporal point-spread function is reported.
In Chapters 3-5 the experiments performed and the results achieved during the PhD are presented.
Diagnostic optical imaging offers outstanding advantages over methods based on irradiation of patients
with ionizing radiation: it allows better spatial resolution in the detection of tissue abnormalities and
non-invasive assessment of the composition of the imaged soft tissues. The main issue of optical imaging
resides in high scattering of light by tissues. In Chapter 3 photon time of flight measurements performed on
the light emerging from a highly scattering medium, mimicking the optical properties of biological tissues,
are presented. These measurements, combining the unique features of our TCSPC system with extreme
spatial-mode selection, allow detection of the very few early arriving, nearly undeflected photons, that bear
the most valuable information regarding discontinuities on the medium optical properties. This ability was
exploited to develop an original method to localize objects embedded in the medium and assess their optical
nature. The performances of such method are discussed, and a comparison with other optical imaging
techniques is undertaken: our method is endowed with superior spatial resolution (<0.2 mm) and
signal-to-noise ratio (20:1).
During the PhD, our group has participated to a project aimed to clarify the relation between the capability
of synthetic analogues of the natural photoactivated drug-substance curcumin to form H-bonds and their
photochemical behaviour. During the project, by measuring the absorption and fluorescence emission
spectrum, the fluorescence lifetime and the fluorescence quantum yield of natural curcumin and of five
suitably designed substituted compounds, both dissolved in solvents of different polarity and H-bonding
potential and incorporated into molecular drug delivery systems, we elucidated the decay mechanisms and
the role of H-bonds in the excited state photophysics of the compounds, and established the influence of the
molecular phenolic substituents on the relevant H-bonds formation affinity. These results are a relevant step
towards the rational design of curcumin-based drugs. In Chapter 4 the guidelines of the project are
described, and part of the results is reported and commented.
Being able to assess the binding mode of a ligand to DNA, typically base intercalation (BI) or minor groove
binding (MGB), is critical to determine the ligand therapeutic potential. Still, drug designers can only gain
such information by means of indirect, complicated and expensive methods. In Chapter 5 an innovative
protocol that allows cheap and straightforward discrimination between ligands binding to DNA by MGB
and by BI is described. The method is based on assessing the deformations experienced by double-stranded
DNA oligonucleotides labelled with a fluorophore (F) and a quencher (Q) at their opposite ends upon the
ligand binding. The lifetime of F is the shorter the nearer is F to Q. We find that MGB induces decrease of
the F lifetime (caused by DNA bending), while BI induces increase of the F lifetime (due to the helices
unwinding) and the appearance of a short-lived component in the decay, which indicates denaturation of the
DNA double-stranded structure.
Detailed contents:
Spectroscopic techniques are applied extensively to the study of biological, biochemical and pharmaceutical systems
since long times. Among the most versatile and sensitive techniques light scattering and fluorescence spectroscopy
certainly deserve an important place. Light scattering allows detailed studies on the size of particles in emulsions (e.g.
lipid micelles in water) or dispersions (e.g. cellular organs in the cytoplasm of living cells, cultures of micro-organisms
in their physiological medium, drugs in the topic state, blood samples, etc.), and on the viscosity of the
emulsion/dispersion medium. Traditionally, light scattering investigation is based on the measurement of the spatial
intensity distribution of light obtained by making a collimated light beam to impinge on the scattering medium and the
photons composing it to interact with the scattering centres (the bodies dispersed in the emulsion/dispersion to be
17
studied). Fluorescence spectroscopy is applied to molecules (fluorophores) that, upon excitation to their first singlet
excited (fluorescent) state, S1, by means of light exposure, are able to return to the ground state by emitting light at a
longer wavelength. Fluorescence spectroscopy investigations allow to study the fluorophores excited state photophysics
and their photochemical interactions. Moreover, chemical equilibriums between the fluorophores and other molecules
as well as conformational transitions of molecules labelled with suitable fluorophores can be elucidated. By means of
fluorescence spectroscopy techniques it is also possible to determine a great number of relevant physical properties of
the environment of a fluorophore (e.g temperature, viscosity, pH, polarity and ionic strength), and to gain valuable
information on its chemical composition (e.g. presence/concentration of iodide, bromide, potassium or sodium ions and
of molecular oxygen). The fluorescence spectroscopy investigation is traditionally based on the measurement of the
wavelength and intensity of the radiation emitted by fluorophores.
As stated above, both light scattering and fluorescence spectroscopy analysis are classically based on light intensity
measurements. However, in more recent times, techniques such as dynamic light scattering and time-resolved
fluorescence spectroscopy have been developed, based on the temporal analysis of the signal emerging from the
samples. These techniques allow to acquire time-resolved distributions which are independent from the intensity of the
light to be analyzed. Moreover, the time resolved distributions bear all the significant information obtainable by means
of intensity measurements, and frequently additional relevant information. Thus, dynamic light scattering and
time-resolved fluorescence spectroscopy show substantial advantages with respect to steady-state light scattering and
fluorescence spectroscopy, specially when very weak light intensities are to be analyzed. In details, dynamic light
scattering allows to measure the time of flight of each scattered photon, that is the time lag between its emission by the
excitation source and its detection. Obviously, the time of flight of a photon is proportional to the number of scattering
events experienced by such photon, to the mean free path inside the scattering medium and to its refractive index. In
case of time-resolved fluorescence spectroscopy, the most relevant parameter to be measured is the mean permanence
time of the valence electron of the fluorophore on S1 after photo-excitation of the fluorophore itself. This last is called
the lifetime of the fluorescent state, or simply the fluorescence lifetime, of the fluorophore. The fluorescence lifetime of
a fluorophore is determined by the shape of its S0 and S1 molecular orbitals (fixing the intrinsic radiative decay rate) and
by a series of non-radiative decay mechanisms whose rate is strongly environment-dependent. As the radiative decay
rate does not depend from the properties of the fluorophore environment, the fluorescence lifetime is the shorter the
more are the fluorophore interactions with its substrate (solvent and other solute species), giving birth to non-radiative
decay pathways, probable.
By determining time of flight and fluorescence lifetime values with high temporal resolution it is possible to extract
determinant information and to make crucial assessments in a surprisingly variegated and ample range of topics in
biological and medical sciences. This Thesis work is devoted to describe one of the most performing single photon
timing techniques, time-correlated single-photon counting, and to report on selected biophysical, biomedical and
pharmaceutical studies performed during the PhD course by taking advantage of the time-correlated single-photon
counting facility developed over years by the group headed by Prof. Alessandra Andreoni, in close collaboration with
scientists operating at Milan Polytechnic (Prof. Sergio Cova and collaborators). Such facility combines high single
photon detection quantum efficiency, low dark count rates and extreme temporal resolution. These features allowed our
group to handle with success the study of several “pathological” systems whose phenomenology could not be
investigated with conventional timing instrumentation. Thus, within the Thesis a number of totally independent and
apparently uncorrelated issues regarding heterogeneous fields of medical diagnostics, drug design, and biochemistry are
addressed, which nevertheless are intimately connected as an exhaustive solution to each of them requires the capability
of performing single photon timing measurements combining unusually high temporal resolution and detection quantum
efficiency.
In Chapter 1, three biomedical applications of single photon timing are described, namely: optical imaging of tissues for
diagnostic purposes by means of time of flight measurements, drug design and evaluation by means of fluorescence
lifetime measurements, and probing of the conformation of macromolecules by means of fluorescence lifetime
measurements (Section 1). The principal single photon timing techniques are also briefly overviewed (Section 2). Most
scientists agree that, among these techniques, the method of time-correlated single-photon counting is, by far, superior.
This technique is, as mentioned above, the one that was implemented to perform the studies presented in the Thesis.
Thus, it is described in greater details, and its main advantages over the other techniques are outlined. One of the
principal advantages offered by time-correlated single-photon counting is that this technique can be implemented by
using high detection quantum efficiency on/off detectors instead of proportional detectors, that yield light-intensity
proportional response but feature significantly lower quantum efficiencies. The final part of Chapter 1 is devoted to
describe the principal kinds of on/off detectors. In details, photomultiplier tubes, reach-through mode avalanche
photodiodes and single-photon avalanche diodes performances are compared.
In Chapter 2, Section 1, the major components in a time-correlated single-photon counting system, and their mutual
interactions, are outlined. The characteristics required to each of these components are also described and the typical
issues to be afforded in optimizing a time-correlated single-photon counting system are discussed. In Section 2 the
actual measuring apparatus that was used to perform the time-resolved scattering and fluorescence measurements
presented in this Thesis is described in details. The instrumental laser-pulse responses measured at the wavelengths
relevant to the experiments presented in the Thesis are reported. A system elaborated to provide an absolute time
reference, and to reveal the occurrence of electronic drifts potentially affecting the histogram shape during acquisition
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of photon time distributions, is described.
In Chapters 3-5 the experiments performed and the results achieved during the PhD course are reported.
In Chapter 3, Section 1, the state-of-art in transillumination optical imaging for diagnostic purposes is described in
details. First, the outstanding advantages of optical biopsy over methods based on irradiation of patients with ionizing
radiation (X-Ray radiography, nuclear magnetic resonance) are analyzed: in principle, optical biopsy allows better
spatial resolution in the detection of tissue inhomogeneity and non-invasive assessment of the composition of the
imaged soft tissues; moreover, it promises to be cost effective and suitable for wide range preventive screening. Second,
the main issue of optical imaging, high scattering of visible and near infrared light by tissues, is stated, and the typical
optical properties of tissues are sketched. Contextually, the repeatability problems encountered in performing research
experiments on real tissues are mentioned, and the utility of working with tissue phantoms is stressed. Finally, the
solutions proposed to afford the main issue on the way of implementing optical biopsy in clinical diagnostics, selection
of the very few nearly undeflected photons out of an overwhelming quantity of multiply scattered photons, are listed,
and the tissue-penetration limit of nearly undeflected photons is estimated. In the first part of Chapter 3, Section 2, the
weakly-scattered photon selection expedients devised in our laboratory is described. In order to achieve the desired
selectivity, time-gating was combined with space and mode selection techniques. The remainder of the Section is
devoted to motivate our choice of the most suitable tissue-phantom to be used in our transillumination imaging studies.
In Section 3 a method to reveal the presence of both opaque and translucent objects embedded in highly scattering
media, mimicking the optical properties of several centimeter thick layers of biological tissue is described, its
performances are discussed, and a detailed comparison with other optical imaging techniques is undertaken.
During the PhD period, our group has taken part to the “curcuminoid project”, an international collaboration aimed to
better understand the relation between the capability of synthetic analogues of the natural drug-substance curcumin to
form H-bonds and their photochemical behaviour. In Chapter 4, Section 1, the guidelines of the “curcuminoid project”
are described. During the project, high purity samples of natural curcumin and five suitably designed substituted
compounds have been synthesized (University of Iceland). The fluorescence lifetimes (University of Insubria) and
quantum yields (University of Oslo) have been measured for each compound, both dissolved in solvents of different
polarity and H-bonding potential and incorporated into molecular drug delivery systems. The data allowed elucidating
the decay mechanisms and the role of H-bonds in the excited state photophysics of the compounds. Moreover, the
influence of the molecular phenolic substituents on the relevant H-bonds formation affinity and strength has been
established. These results are a relevant step towards the rational design of curcumin-based drugs. In Chapter 4, Section
2, the fluorescence decay data and the steady-state absorption and fluorescence emission spectra of curcumin dissolved
in several solvents differing as to their polarity and H-bonding capability are presented, and the deactivation
mechanisms of its first excited singlet state are elucidated. The native compound curcumin carries phenolic hydroxyl
and methoxy groups that influence the molecular charge distribution, and hence the intra-molecular H-bond formation
and the excited-state intra-molecular proton transfer rate, in an unpredictable way. In Chapter 4, Section 3, we present
static and time-resolved spectroscopic properties of a non-substituted curcuminoid that lacks both the phenolic hydroxyl
and the phenolic methoxy groups. The decay mechanisms of this compound are elucidated and compared to those of
native curcumin, in order to provide a rationale to the design of curcuminoids with molecular structures optimized for a
photosensitizer.
Being able to determine the binding mode of a ligand to DNA, typically intercalation or minor groove binding, is
critical to determine the ligand therapeutic potential. Still, drug designers can only gain such an information by means
of indirect, complicated and very expensive methods. In Chapter 5 an innovative protocol, elaborated during the PhD
studies, that allows cheap and straightforward discrimination of DNA-ligands binding mode, is described. In Section 1
the main properties of intercalators and minor groove binders are surveyed. The now-in-use techniques allowing
discrimination of a ligand binding mode are contextually shortly reviewed and the rationale of our method, based on
time-resolved fluorescence resonance energy transfer efficiency measurements, is explained. In Section 2 a detailed
description of the chemicals and procedures used in our binding mode determination experiments are given. In Section
3 the steady-state spectrophotometric and spectrofluorimetric titration data acquired to assess the binding parameters of
three model DNA ligands are presented and the results of the decay time experiments performed to assess the effects of
the binding of the same ligands on the structure of dual labelled oligonucleotides are reported and commented. In the
last part of the Section, the changes in the decay distributions ingenerated by addition of each ligand are given an
interpretation in terms of double-helix deformations induced by the binding and the donor-acceptor distances
corresponding to each lifetime is calculated, in units of the Forster’s distance, taking advantage of the observation that
the ligands do not directly interfere with the donor fluorescence.
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