IL SUPPORTO DEL LABORATORIO NELLA GESTIONE CLINICA DELLA LEISHMANIOSI:
APPROCCIO EFFICACE ALLA DIAGNOSI
Dott.ssa Elena Pistocchini, Dott.ssa Valeria Leto
La Leishmaniosi Canina è una malattia parassitaria causata da Leishmania infantum, un protozoo
trasmesso dalla femmina del flebotomo, l’insetto vettore che trasmette attivamente la malattia.
Nell’intestino del flebotomo il parassita si moltiplica per un periodo variabile da 4 a 25 giorni,
trasformandosi in una forma flagellata chiamata promastigote. Il promastigote viene iniettato nell’ospite
quando il flebotomo lo punge per il pasto di sangue. I promastigoti vengono fagocitati dai macrofagi
trasformandosi in amastigoti che, per mezzo dei macrofagi infette, raggiungono i vari tessuti (Fig1).
Il cane infetto da L. infantum costituisce l’unico serbatoio domestico della Leishmaniosi.
La Leishmaniosi Viscerale Zoonotica (LVZ), causata dallo stesso protozoo L. infantum (Fig.1), è una
grave patologia riemergente in tutta l’area mediterranea. In Italia i casi notificati di malattia nell’uomo
sono aumentati nel corso dell’ ultimo decennio e la maggior parte è a carico di individui
immunocompetenti, sia bambini sia adulti.
Figura 1:Ciclo vitale di Leishmania
L’elevata suscettibilità al parassita fa si che il cane costituisca un eccellente indicatore della diffusione
dell’ infezione nel territorio. Anche per la leishmaniosi canina si e assistito nell’ultimo decennio ad un
aumento di incidenza e diffusione geografica. Dalle aree tradizionalmente endemiche rappresentate dai
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versanti tirrenico, ionico, dell’adriatico centromeridionale e dalle isole, l’infezione si e diffusa sul
versante centro-settentrionale adriatico della penisola e in molte aree collinari prealpine e
preappenniniche delle regioni del nord Italia (Fig 2).
Figura 2 Principali distribuzione della leishmaniosi canina
L’infezion da Leishmania ha tre caratteristiche patogenetiche:
1- il bersaglio del parassita è rappresentato dai macrofagi, all’interno dei quali il parassita si può
replicare;
2- la comparsa e l’evoluzione della malattia dipendono dalla risposta immunitaria e infiammatoria
dell’ospite;
3- l’infezione persiste nei tessuti maggiormente ricchi di elementi del sistema monocito-macrofagico,
nei quali il parassita può essere rilevabile con metodi diretti già qualche settimana dopo l’infezione.
Una certa percentuale di soggetti infetti può negativizzarsi ad alcuni dei test diagnostici, dopo un
periodo generalmente breve dal primo riscontro positivo e senza aver ricevuto alcuna terapia.
L. infantum causa infezione, generalmente cronica, che a volte può essere asintomatica e a volte può
evolvere in malattia sintomatica evidente: la risposta immunitaria gioca un ruolo molto importante,
grazie ai linfociti T helper che possono indirizzare il sistema immunitario verso una risposta umorale
(Th2) o verso una risposta cellulo-mediata (Th1).
I cani infetti e clinicamente sani hanno una lieve o assente risposta Th2 e ed una risposta Th1 specifica
contro Leishmania. Al contrario, i cani infetti e gravemente malati presentano un’esagerata risposta Th2
e da una risposta Th1 assente o lieve.
La continua stimolazione antigenica e l’esagerata risposta anticorpale inducono ipergammaglobulinemia,
deposizione di immunocomplessi che possono provocare glomerulonefrite, vasculite, poliartrite, uveite
e meningite e produzione di autoanticorpi contro le piastrine e gli eritrociti.
Inoltre, i cani malati o asintomatici con una predominante risposta umorale si caratterizzano per una
disseminazione del parassita nell’organismo, causata dalla riduzione della conta dei linfociti per
l’immunosoppressione.
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LE INDAGINI DI LABORATORIO
I cani affetti da leishmaniosi possono avere sintomatologia clinica aspecifica o essere del tutto
asintomatici.
I sintomi classici comprendono dimagrimento, linfoadenomegalia, dermatopatie furfuracee, PU/PD,
comparsa di aree alopeciche soprattutto perioculari e delle estremità, e sintomi oculari come
congiuntivite ed uveite.
La diagnosi precoce è di fondamentale importanza per rallentare la riproduzione del protozoo e tenere
sotto controllo clinico la malattia.
E’ anche necessario eseguire esami di laboratorio(Tab.1), esame emocromocitometrico, biochimico
completo, protidogramma, esame delle urine con rapporto PU/CU (per quantificare l’eventuale perdita
di proteine con le urine).
In funzione delle eventuali alterazioni riscontrate si approfondisce l’iter diagnostico con ulteriori
indagini.
Tabella 1: Rilievi compatibili negli esami di laboratorio di base
ESAMI DI BASE
Emocromocitometrico
Esame Coagulativo
Profilo Biochimico
Elettroforesi
Analisi delle Urine
RISCONTRI COMPATIBILI CON LEISHMANIA
Anemia rigenerativa e non rigenerativa
Leucocitosi (Leucogramma da stress/infiammatorio)
Leucopenia
Trombocitopenia
Aumento del fibrinogeno, allungamento PT e aPTT
Iperproteinemia con alterato rapporto Albumine/Globuline
Aumento Azotemia e Creatinina
Aumento enzimi epatici
Ipoalbuminemia
Aumento α2 e γ globuline
Poco concentrate (PS<1030)
Proteinuria (determinare PU/CU)
Nelle zone endemiche tutti i cani dovrebbero essere sottoposti a controlli regolari (per lo meno
annuali), che siano affetti da sintomi clinici o no. In generale, nella diagnosi delle malattie infettive ci si
può avvalere della ricerca diretta dell’agente patogeno, (esame citopatologico o tramite PCR),oppure si
può effettuare una ricerca indiretta tramite evidenziazione degli anticorpi, che dimostrano l’avvenuto
contatto con l’agente infettivo.
Entrambi i metodi hanno vantaggi e svantaggi e possono risultare più o meno indicati, a seconda della
patogenesi, dello stato di malattia e della situazione del paziente.
ESAME CITOLOGICO
Ha lo scopo di evidenziare la presenza della forma amastigote del parassita all’interno dei macrofagi.
Gli organi e i tessuti d’elezione per l’esame citologico possono essere: lesioni cutanee nodulari e
ulcerative mediante agoinfissione, agoaspirazione e apposizione; linfonodi e midollo osseo in caso di
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linfoadenomegalia localizzata o generalizzata e anemia; liquido sinoviale in caso di artrite con
tumefazione articolare o il liquido cefalorachidiano in caso di sintomi neurologici.
PCR (Polymerase chain reaction)
Tale metodica di laboratorio consente di amplificare le sequenze specifiche del genoma di Leishmania; è
un esame altamente sensibile e in grado di identificare piccolissime quantità di DNA protozoario
contenuto nel materiale biologico esaminato.
Va però ricordato che, nei cani resistenti, l’inoculazione di Leishmania può non essere seguita da
disseminazione del parassita, quindi un’eventuale positività cutanea in assenza di lesioni cutanee in area
endemica non significa necessariamente che il cane sia infetto e sviluppi infezione e allo stesso modo,
eventuali positività midollari possono poi essere seguite da negativizzazione.
Nella leishmaniosi canina, una PCR per Leishmania spp. effettuata su sangue periferico, siero o plasma
può risultare negativa anche in un cane ammalato, perché non c’è parassitemia in corso.
Si è visto che il protozoo può essere rilevato molto precocemente a livello linfonodale.
Prima di procedere con il prelievo del materiale per PCR, è necessario considerare dove l’agente
patogeno potrebbe effettivamente essere presente e perciò evidenziabile. Per aumentare la sensibilità
della ricerca diretta dell’agente patogeno si consiglia di effettuare l’esame su più di un substrato per
esempio sia midollo osseo e linfonodo.
Il vantaggio di tali metodiche è la loro elevata sensibilità oltre alla precocità nella diagnosi in quanto il
parassita è evidenziabile già qualche settimana dopo l’infezione.
SIEROLOGIA (Ricerca degli Anticorpi Specifici)
La ricerca degli anticorpi specifici rappresenta un passo fondamentale nella diagnosi di leishmaniosi. La
titolazione anticorpale è di semplice esecuzione nella pratica clinica; gli anticorpi vengono ricercati per
lo più nel siero o nel plasma.
La sieroconversione dovrebbe avvenire entro circa 3/5 mesi dall’infezione. Il valore diagnostico di un
titolo positivo varia in base alla zona di provenienza del paziente ed è maggiore nelle zone endemiche.
Nei cani con disseminazione del parassita i titoli anticorpali tendono a risultare elevati o in aumento. Le
tecniche maggiormente disponibili sono rappresentate dai test di immunomigrazione rapida, dalle
tecniche ELISA e dall’immunofluorescenza indiretta (IFAT).
L’immunomigrazione rapida è di facile esecuzione e si può eseguire anche in strutture ambulatoriali, ma
ha un’efficienza diagnostica inferiore rispetto alle tecniche ELISA e IFAT: la specificità è medio-alta ma
la sensibilità è bassa (30-70%) e può quindi fornire risultati falsi negativi. In questi casi, se permane un
forte sospetto diagnostico, l’indagine sierologica va approfondita con uno degli altri due test.
Il test ELISA è un test specifico e ha sensibilità medio-alta (70-100%), il siero in esame è posto in
micropiastre rivestite di antigeni di Leishmania.
Il metodo dell’immunofluorescenza o IFAT viene tuttora considerato il “gold standard” nella ricerca
degli anticorpi anti leishmania, in quanto dovrebbe trattarsi della metodica dotata di più elevata
sensibilità e specificità.
La sensibilità e specificità dell’I FAT sono prossime al 100% e per tale motivo il test viene considerato
dall’Organizzazione Internazionale delle Epizoozie (OIE) il metodo sierologico di riferimento.
La Regione Lazio ha approvato delle procedure sanitarie e delle misure da adottare nei casi sospetti e/o
confermati di Leishmaniosi canina nel proprio territorio utilizzando le linee guida allegate alla delibera
del 21 dicembre 2006, n. 920 con la Delibera della Giunta Regionale del 29 ottobre 2010, n. 473 visto il
Regolamento di Polizia Veterinaria DPR 8 febbraio 1954 n.320.
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In questo regolamento nell’Art.1 viene definito
-Esame sierologico: la ricerca di anticorpi specifici mediante test di immunofluorescenza indiretta.
-Caso sospetto: cane clinicamente sano con titolo IFI pari a 1/80 oppure cane negativo all’esame
sierologico con sintomi compatibili con la Leishmaniosi.
-Caso confermato cane con titolo ≥1/160, indipendentemente dalla presenza di sintomi.
Nell’Art.5 il Caso sospetto dovrà essere sottoposto a ripetizione dell’esame sierologico a distanza di sei
mesi dal precedente, al fine di escludere il sospetto o di accertare il caso come confermato.
Nel cane asintomatico permette di differenziare l’animale infetto da uno malato. In un cane che
presenta un titolo positivo ma molto basso occorre una attenta valutazione degli esami di base. Se gli
esami non presentano alterazioni evidenti occorre ripetere il titolo dopo 30 giorni. Nel cane
asintomatico con titolo molto basso l’esame delle urine e la valutazione PU/CU hanno valore
prognostico. Un cane malato presenta un titolo quattro volte superiore il limite massimo segnalato dal
laboratorio. Poiché i laboratori spesso utilizzano titoli-soglia diversi è importante fare riferimento
sempre allo stesso laboratorio.
Il metodo IFI si basa sulla capacità di anticorpi antiimmunoglobuline coniugate ad una sostanza
fluorescente, di rivelare la presenza di anticorpi fissati ad antigeni specifici espressi in substrati diversi
costituiti da cellule fissate su vetrino (Fig.3)
La reazione viene effettuata su un apposito vetrino in cui è fissato l’antigene in esame, sul quale viene
deposto il siero in analisi. Dopo un periodo in incubazioni a temperatura costante e un accurato
lavaggio, gli anticorpi fissati su questo antigene verranno messi ad incubare con una globulina marcata
con la fluoresceina. La fluorescenza è un fenomeno che insorge quando una molecola assorbe luce, si
eccita e rilascia luce ad una lunghezza d’onda più lunga ma con frequenza più bassa.
Figura 3: Tecnica IFAT
Nella lettura dei vetrini gli aspetti da valutare sono rappresentati dal quadro fluoroscopio e dalla
titolazione.
Per una corretta interpretazione dei risultati è necessario che in ogni seduta analitica vengano inseriti un
controllo negativo ed uno positivo.
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Il controllo negativo è necessario per una valutazione del grado di fluorescenza del preparato e quindi
per l’assegnazione dei livelli di intensità dei campioni.
Il controllo positivo serve a confermare che le procedure di esecuzione del test sono state compiute
correttamente in tutti i vari passaggi.
Il controllo endpoint permette di discriminare il positivo dal negativo: è infatti il livello minimo di
intensità di fluorescenza necessario perché un campione sia considerato positivo.
L’intensità di fluorescenza osservata può essere espressa con una valutazione quantitativa discreta
ottenuta effettuando diluizioni seriate del siero fino a scomparsa della fluorescenza, adottando come
titolo l’ultima diluizione in cui si è osservata fluorescenza.
Non si possono testare sieri lipemici e sieri emolitici poiché possono causare autofluorescenza dei
preparati, quindi invalidare il risultato sulla sua attendibilità.
Il titolo anticorpale permette di differenziare i cani infetti ma non malati, che avranno tendenzialmente
un titolo basso, da quelli malati e con disseminazione del parassita, che avranno un titolo
tendenzialmente elevato. La definizione di titolo “basso” o “elevato” va sempre rapportata alle soglie di
positività riportate dal laboratorio di riferimento.
Per raggiungere la diagnosi di leishmaniosi, dunque, il segnalamento, i dati anamnestici, i segni clinici
eventualmente presenti ed i risultati delle prove di laboratorio vanno integrati tra loro. In linea di
massima, nei cani che presentano segni clinici ed alterazioni degli esami di laboratorio di base
fortemente compatibili con Leishmaniosi, la PCR e la sierologia e, solo in alcuni tessuti, la citologia,
hanno tutte un’elevata sensibilità.
Il soggetto va considerato sicuramente malato quando l’esame citologico eseguito su tessuti presentanti
lesioni compatibili risulta positivo, indipendentemente dal risultato della sierologia, che però in questi
casi dovrebbe risultare più probabilmente positiva (tranne nei rari casi di lesioni molto localizzate, o
nelle fasi molto iniziali dell’infezione).Se la citologia risulta negativa, invece, la sierologia diventa
fondamentale per considerare il soggetto malato o semplicemente “sospetto di malattia”.
I protocolli terapeutici sono oggetto di continui studi e verifiche di efficacia ed attualmente alcuni
soggetti possono guarire. Cani che reagiscono molto bene alla cura possono continuare a vivere anni
senza più manifestare i sintomi ed alcuni possono negativizzarsi sierologicamente. Tuttavia sono
possibili delle recidive e per questo motivo in genere si effettuano esami di laboratorio periodici.
Numerosi sono i casi di negativizzazione del parassita (leishmanie) con gli attuali protocolli di cura, ma
ciò non rende purtroppo l'animale esente da un eventuale ricontagio o reinfestazione.
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