Corso di Applicazioni Biotecnologiche
per l’Ambiente
• Modulo di “Microbiologia applicata
all’ambiente”.
• Requisiti: buone conoscenze di microbiologia
e degli aspetti ambientali della microbiologia
(Corso di Biotecnologie Ambientali 3° anno LT)
Corso di Applicazioni Biotecnologiche
per l’Ambiente
• Struttura del corso:
- Breve ripasso/riesame delle tematiche principali
della microbiologia ambientale (2-3 lezioni)
- Studio delle tematiche di interesse nella ricerca in
microbiologia ambientale tramite lettura ed analisi di
lavori scientifici (reviews, articoli di ricerca) come
discussione interattiva in un Journal Club
Corso di Applicazioni Biotecnologiche
per l’Ambiente
• Prova d’esame:
• 12 punti: presentazione di una tematica a
partire da lavori di ricerca
• 5 punti: frequenza/partecipazione al corso
• 15 punti: prova finale
- Discussione “one-to-one” di una tematica
presentata negli articoli discussi durante il
corso.
Corso di Applicazioni Biotecnologiche
per l’Ambiente
• Argomenti principali che verranno toccati nel corso:
- Processi e microrganismi coinvolti nella
degradazione di sostanze inquinanti e tecniche di
biorisanamento
- Ecologia microbica: metodologie di monitoraggio
delle comunità microbiche e loro applicazioni.
- Metagenomica: identificazione di nuove specie non
coltivabili in laboratorio; applicazioni pratiche.
- Utilizzo di microrganismi biosensori.
Corso di Applicazioni Biotecnologiche
per l’Ambiente
• “Entry test”
(ovvero: cosa credete di sapere e cosa
realmente sapete.....)
Risultati entry test
6
4
3
2
1
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
numero domande corrette
5
numero domanda
Numero studenti
5
4
3
2
1
0
5
10
numero risposte esatte
15
I- Biosensori
Geni controllati da un
promotore di interesse
Situazione fisiologica;
ceppo wild type
Es. codificanti per geni
per la degradazione
Biosensore
Gene reporter: codifica una
proteina la cui attività può essere
facilmente saggiata;
La fusione promotore::gene
reporter (es. xylE::lacZ) può essere
costruita inattivando l’operone
originale o clonando il promotore
a monte di un gene reporter,
generalmente su un plasmide
Promotore di interesse clonato
a monte di un gene reporter
Rep. gene
Problematiche legate ai
microrganismi biosensori
• Sensibilità (deve rispondere a concentrazioni
nell’ordine dei ppm (= mg/ml)
• Specificità: rispondere esclusivamente al
prodotto di interesse (in alcuni casi) o al più
elevato numero di molecole correlate
possibile
• Stabilità genetica, riproducibilità, affidabilità.
Unità gene reporter (b-galattosidasi)
Limitare o aumentare lo spettro di
azione di un biosensore?
2-nitrotoluene
induttore
4-nitrotoluene
Miglioramento genetico di ceppi
biosensori
Ecologia microbica
• I microrganismi sono fondamentali nei cicli
geochimici degli elementi (C, N, S, etc.)
permettendo di mantenere in omeostasi
(equilibrio) le diverse forme chimiche di questi
elementi
• Lo squilibrio tra popolazioni microbiche
diverse porta ad una perturbazione all’interno
dei cicli degli elementi (e viceversa).
Ciclo dell’Azoto
La presenza di cicli geochimici in equilibrio
è una delle basi dell’ “ipotesi Gaia”
• La terra è un sistema autoregolante capace di
mantenere le sue caratteristiche chimicofisiche (temperatura media, percentuali dei
gas, acidità...), in condizioni idonee alla
presenza della vita grazie al comportamento
degli organismi viventi stessi.
(Lovelock and Margulis, 1974)
Ecologia microbica e metagenomica
• Problema principale:
Nella microbiologia “classica”, l’isolamento e la crescita come “coltura pura”
sono fondamentali per lo studio e la caratterizzazione di un
microrganismo.
Nelle comunità microbiche naturali, alcune reazioni metaboliche vengono
effettuate da più specie: la crescita in laboratorio porta alla perdita della
diversità genetica e, quindi, delle capacità metaboliche di una data
comunità.
Concetto di microrganismi VBNC: “Viable but not culturable”
Lo studio delle metagenomica consente l’identificazione (almeno parziale) di
nuove specie batteriche a partire dalle loro sequenze di DNA, SENZA la
necessità di isolare e crescere queste specie in laboratorio.
Il problema della coltivazione
Il problema della valutazione della
complessità delle comunità microbiche
• Il concetto tassonomico di “specie” è difficilmente applicabile
al mondo microbico
• La tassonomia molecolare si basa sulla similarità di sequenza
tra geni che costituiscono un riferimento significativo per
seguire l’evoluzione delle specie (“cronometri evolutivi” es.
16S rRNA, gene rpoB)
• La differenza tra OTU (Operational Taxonomic Units) è fissata
al 3% di diversità nel gene marker
• La conoscenza ed identificazione delle diverse specie è
importante per l’attribuzione di funzioni metaboliche e
biochimiche ad una comunità microbica
Ma la specie non è tutto....
• All’interno di una medesima specie esiste una
enorme diversità genetica e metabolica, legata
a presenza di elementi di DNA mobile
(plasmidi, integroni, etc.) o a semplici
mutazioni puntiformi
Es: isolati di Escherichia coli in
grado di produrre particolari
strutture extracellulari
Le tecniche molecolari
ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA
COMUNITA’ MICROBICA
ESTRAZIONE DNA DAL
CAMPIONE AMBIENTALE
AMPLIFICAZIONE PER PCR DI
UN FRAMMENTO DEL GENE
16s rRNA
ANALISI DIRETTA DELLA
DIVERSITA’ DEL CAMPIONE (es.
DGGE, T-RFLP)
Identificazione molecolare dei componenti di
una comunità microbica
DNA ambientale o
da coltura
Primer usati per la PCR:
16S RNA (per Bacteria)
rRNAs (universale)
Per microrganismi eucarioti:
18S RNA
ITS (internal transcribed spacer)
Prodotti di PCR da analisi di
campioni ambientali analizzati su
gel d’agarosio non denaturante
Specifiche bande possono
essere estratte e sequenziate
I frammenti vengono separati in
condizioni denaturanti
(generalmente gradiente di urea)
La DGGE è un importante tool
sperimentale
Tempo (sett.):
Aggiunta benzoato
0
4
+
0
4
-
Monitoraggio di microrganismi in grado di degradare composti
aromatici in un modello sperimentale di crescita in suoli contaminati e
non.
Analisi T-RFLP (terminal restriction length polymorphism)
ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA
COMUNITA’ MICROBICA
Creazione di una libreria di frammenti del gene 16S rRNA
ESTRAZIONE DNA DAL
CAMPIONE AMBIENTALE
• lunghezza frammento
fino a 1500 pb
AMPLIFICAZIONE PER PCR
DI UN FRAMMENTO DEL
GENE 16s rRNA
ANALISI DIRETTA DELLA
DIVERSITA’ DEL CAMPIONE
(es. DGGE, T-RFLP)
• numero
di
cloni
ottenuti: intorno ai 300400
Tre problemi nella definizione dell’ecologia
microbica di un determinato (micro)ambiente
• Definizione di specie nell’ambito microbico (OTU)
• Capacità di “vedere” i microrganismi, ivi inclusi i
microrganismi VBNC
• Determinare da un punto di vista statistico il numero
di specie (OTUs) che ci permette una definizione
sufficientemente completa di un ambiente
(Schloss and Handelsmann, Ann. Rev. Micro. 2007)
Stima della biodiversità (curve di rarefazione)
Raccolta dati
STIMA BIODIVERSITA’
(screening dei cloni ottenuti)
Operational taxonomic units
5000
0
4000
0.01
3000
0.02
0.03
2000
0.04
0.05
1000
0
0
2000
4000
6000
8000
10000
Reads (numero di cloni nella library)
% di differenza
nella sequenza
del gene marker
(es. 16S RNA
Perché la definizione precisa della
biodiversità è così importante?
• Conoscenza “teoretica” delle specie microbiche
• Correlare presenza di specie ad attività biologica di interesse
(biorisanamento, produzione di molecole di interesse)
• Confrontare ambienti simili, ma di diversa provenienza, in
termini di composizione microbica, per prevederne le
caratteristiche
• Problema metodologico: significatività statistica del
campione in esame
Un problema simile: uso delle parole in libri di
un determinato autore (the book model)
On the
Origin of
Species
The
The
The Voyage Adventures
The Descent
Adventures The Portrait Goodnight
of the
of
of Man
of Tom
of a Lady
Moon
Beagle
Huckleberry
Sawyer
Finn
n1
The
(10,196)
The
(22,164)
n2
Of (7396)
Of (12,304) Of (9429)
n3
And (4387) In (7547)
n4
In (3920)
And (7342) A (5325)
n5
To (3567)
To (5743)
n6
A (2473)
A (4412)
n7
That (2059) That (3529) Is (2413)
Was (2063) Was (1166) Her (4480)
Moon (3)
n8
Have (1760) Is (3237)
It (1998)
He (1667)
It (1116)
I (4076)
20 words
used twice
n9
Be (1655)
As (3134)
That (1940) Of (1641)
In (937)
That (3735)
n10
As (1579)
Are (2522)
On (1868)
In (1428)
That (890)
You (3735)
ST
7426
14,557
12,726
7263
8111
12,427
55
NT
150,951
272,296
205,424
110,271
70,030
230,485
151
St: numero totale di singole parole utilizzate
Nt: numero totale di parole nel libro
The
(16,924)
And (6228) The (3681)
The (4771)
The (8449)
Goodnight
(20)
And (3000) To (7469)
And (17)
A (1795)
Of (6592)
A (10)
To (2914)
To (1705)
A (5485)
The (6)
In (4288)
A (2911)
Of (1446)
She (4772)
Little (4)
To (4091)
It (2279)
He (1181)
And (4504) Of (3)
And (5765) I (3210)
Annual Reviews
Confronto di comunità microbiche nei suoli
dell’Alaska (a-b) e del Minnesota (c-d)
Annual Reviews
Annual Reviews
FIG. 1. Phylogenetic tree of Bacteria showing established phyla (italicized Latin names)
and candidate phyla described previously (70, 74, 114) with the November 2003 ARB
database (http://arb-home.de) (90) with 16,964 sequences that are >1,000 bp
Nitrospira: nuovo genere di batteri
nitrificanti (ossidazione di nitrito a nitrato)
Handelsman, J.. 2004. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68(4):669-685