DCM023i-0
Ed. 08/2012
Treponema pallidum IgG
per analisi di routine
Determinazione immunoenzimatica per la determinazione qualitativa e semiquantitativa degli anticorpi
umani di classe IgG contro il Treponema pallidum nel siero umano
LOT
IVD
Vedere etichetta esterna
DESTINAZIONE D’USO
Il kit Diametra Treponema pallidum IgG è un metodo
immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e
semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgG
diretti control il Treponema pallidum nel siero umano.
Il kit Treponema pallidum IgG è destinato al solo uso
di laboratorio.
1. SIGNIFICATO CLINICO
Le spirochete sono batteri mobili con un filamento
assiale periplasmatico. Tutte le specie patogene
appartengono alla famiglia Treponemataceae, che
comprende i tre generi: Treponema, Borrelia e
Leptospira. I Treponema sono batteri mobili, di 5-15
µm in lunghezza e 0.2 µm in larghezza, contenenti
circa 10 flagelli morbidi e ondulati a forma di spirale.
Il Treponema pallidum è l'agente eziologico della
Sifilide, e si trasmette per contatto diretto, di solito
attraverso il rapporto sessuale.
La Sifilide è una malattia infettiva acuta e cronica,
che,
insieme
a
Gonorrea,
Chancroide
e
Linfogranuloma venereo, è designata come malattia
venerea (VD). Dopo un periodo di incubazione di 1230 giorni, i primi sintomi a comparire sono ulcere, e
successivamente
ulcere
sifilitiche
che
poi
scompaiono spontaneamente in poche settimane.
Durante questa prima fase (Sifilide primaria) il
Treponema pallidum si propaga nei linfonodi e si
propaga in tutto il corpo. Le tre fasi successive della
malattia sono classificate come secondaria, terziaria
e quaternaria.
Il trattamento con antibiotici nella fase precoce della
malattia e le misure di profilassi riescono a prevenire
le epidemie. A questo scopo, lo screening prenatale e
da donatori di sangue sono obbligatori nella maggior
parte del mondo.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il kit Diametra Treponema pallidum IgG è un test
immunoenzimatico in fase solida (ELISA).
I pozzetti della micropiastra (fase solida) sono rivestiti
con antigeni di Treponema pallidum.
I campioni diluiti dei pazienti e i controlli pronti all'uso
vengono pipettati in questi pozzetti. Durante
l'incubazione gli anticorpi specifici per Treponema
pallidum dei campioni positivi e dei controlli si legano
agli antigeni immobilizzati.
Σ = 96 test
REF DKI023
Dopo una fase di lavaggio per rimuovere il campione
non legato, vengono dispensati nei pozzetti anticorpi
anti-IgG umane coniugati a perossidasi di rafano.
Durante una seconda incubazione questi anticorpi si
legano specificamente agli anticorpi IgG dando luogo
alla formazione di immunocomplessi enzimatici.
Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il materiale
non legato gli immunocomplessi formati (in caso di
risultati positivi) vengono individuati mediante
incubazione con il substrato TMB e lo sviluppo di un
colore blu. Il colore blu si trasforma in giallo quando la
reazione enzimatica è stoppata con acido solforico.
L'intensità di questo colore è direttamente
proporzionale alla quantità di anticorpi IgG contro
vengono dispensati nei pozzetti nel campione del
paziente. L’assorbanza a 450 nm viene letta con un
lettore di piastre ELISA.
3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE
3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit
1. Controls (3 flaconi, 2 mL ciascuno, pronti all'uso)
Negative Control
REF DCE045/02301i-0
Positive Control
REF DCE045/02302i-0
Cut-Off Control
REF DCE045/02303i-0
2. Conjugate (1 flacone, 20 mL)
Anticorpi anti IgG coniugati con perossidasi
REF DCE002/02302i-0
3. Coated Microplate
(1 micropiastra breakable coattata con antigeni di
Treponema pallidum)
REF DCE002/02303i-0
4. TMB Substrate (1 flacone, 14 mL)
H2O2-Tetrametilbenzidina (TMB) (evitare il contatto con la
pelle)
REF DCE004/02304i-0
5. Stop Solution (1 flacone, 14 mL)
Acido Solforico 0,2M (evitare il contatto con la pelle)
REF DCE005/02305i-0
6. 20X Conc Wash Solution (1 vial, 30 mL)
Contiene preservanti privi di mercurio
REF DCE007/02307i-0
7. Sample diluent (1 vial, 100 mL)
Soluzione tampone pH 7,2
REF DCE053/02353i-0
3.2. Reattivi necessari non forniti nel kit
Acqua distillata.
3.3. Materiale e strumentazione ausiliari
Dispensatori automatici.
Lettore per micropiastre (450 nm).
•
Note
Conservare tutti i reattivi a 2÷8°C, al riparo dalla
luce. Una volta aperto, il kit mantiene la sua
funzionalità per 2 mesi se conservato a 2-8°C.
Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate)
solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e
chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da
utilizzare.
•
•
•
4. AVVERTENZE
• Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da
parte di personale esperto. Non per uso interno o
esterno su esseri Umani o Animali.
• Usare i previsti dispositivi di protezione individuale
mentre si lavora con i reagenti forniti.
• Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP)
per la manipolazione di prodotti derivati da
sangue.
• Tutti i reattivi di origine umana usati nella
preparazione dei reagenti sono stati testati e sono
risultati negativi per la presenza di anticorpi antiHTLV, TPHA (Sifilide), HIV 1&2, HBV e HCV.
Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti
infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere
maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.
• Alcuni reagenti contengono piccole quantità di
R
Sodio Azide (NaN3) o di Proclin 300 come
conservante. Evitare il contatto con la pelle e le
mucose.
• La Sodio Azide può essere tossica se ingerita o
assorbita attraverso la cute o gli occhi; inoltre, può
reagire con le tubature di piombo o rame
formando
azidi
metalliche
potenzialmente
esplosive. Se si usa un lavandino per eliminare i
reagenti, lasciar scorrere grandi quantità di acqua
per prevenire la formazione di azidi.
• Il TMB Substrato contiene un irritante, che può
essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare
l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
• La Stop Solution è costituita da una soluzione di
acido solforico diluito. L’acido solforico è velenoso
e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per
prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il
contatto con la cute e con gli occhi.
• Evitare l’esposizione del reagente TMB/H2O2 a
luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non
congelare la soluzione.
5. PRECAUZIONI
• Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza
dei passaggi indicata in questo protocollo. I
risultati presentati qui sono stati ottenuti usando
specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per
l’Uso.
•
•
•
•
•
•
•
Tutti i reattivi devono essere conservati a
temperatura controllata di 2-8°C nei loro
contenitori originali. Eventuali eccezioni sono
chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino
alla data di scadenza se conservati e trattati
seguendo le istruzioni fornite.
Prima dell’uso lasciare tutti i componenti dei kit e i
campioni a temperatura ambiente (22-28°C) e
mescolare accuratamente.
Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi.
Devono essere osservate le date di scadenza
riportate sulle etichette della scatola e di tutte le
fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di
scadenza.
Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è
responsabilità dell’utilizzatore assicurarsi che il kit
sia stato opportunamente validato.
Un lavaggio incompleto o non accurato dei
pozzetti può causare una scarsa precisione e/o
un’elevato background.
Per la riproducibilità dei risultati, è importante che
il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso.
Per evitare il time shifting durante la
dispensazione degli reagenti, il tempo di
dispensazione dei pozzetti non dovrebbe
estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si
raccomanda di seguire lo stesso ordine di
dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si
raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in
ogni piastra.
L’addizione del TMB Substrato dà inizio ad una
reazione cinetica, la quale termina con l’addizione
della Stop Solution. L’addizione del TMB
Substrato e della Stop Solution deve avvenire
nella stessa sequenza per evitare tempi di
reazione differenti.
Osservare le linee guida per l’esecuzione del
controllo di qualità nei laboratori clinici testando
controlli e/o pool di sieri.
Osservare
la
massima
precisione
nella
ricostituzione e dispensazione dei reagenti.
Non
usare
campioni
microbiologicamente
contaminati, altamente lipemici o emolizzati.
I lettori di micropiastre leggono l’assorbanza
verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti.
6. PROCEDIMENTO
6.1. Preparazione della Wash Solution
Diluire 1:20 la soluzione di lavaggio concentrata 20X
con acqua distillata; ad esempio per preparare 600
mL di soluzione di lavaggio diluita aggiungere 30 mL
di soluzione di lavaggio 20X a 570 mL di acqua
distillata. Se la " 20X Wash Solution" presenta i
cristalli, scioglierli scaldando il flacone in acqua calda
a 37°C prima dell'uso.
La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 mese a
2-8°C.
6.2. Preparazione del Campione
Il kit ELISA Diametra Treponema pallidum IgG può
essere utilizzato con siero umano.
Tutti i campioni di siero devono essere pre-diluiti
con Sample Diluent 1:101; ad esempio 10 µL di
campione può essere diluito con 1000 µL di Sample
Diluent. Dopo la diluizione agitare bene.
I controlli sono pronti all'uso e non devono essere
diluiti!
Per ottenere il siero, raccogliere il sangue venoso, far
coagulare e separare il siero centrifugando a
temperatura ambiente. Non centrifugare prima che la
coagulazione sia completata. I pazienti trattati con
terapia anticoagulante possono richiedere un tempo
di coagulazione più lungo. Non usare campioni
emolitici, itterici o lipemici.
I campioni possono essere conservati a 2-8°C per 1
giorno. Per conservazioni più lunghe tenere i
campioni a -20°C, congelare 1 sola volta. I campioni
scongelati devono essere agitati bene prima dell'uso.
•
•
•
•
6.3. Procedura
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente
(22-28°C).
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere
rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate a
2-8°C.
Per evitare potenziali contaminazioni microbiche
e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei
flaconi originali.
Al fine di aumentare l’accuratezza dei risultati del
test è necessario operare in doppio, allestendo
due pozzetti per ogni Controllo, due per ogni
Campione ed uno per il Bianco.
Reagente
Controlli
Controlli
(Neg, Pos,
Cut-Off)
100 µL
Campione
diluito
Campione
Bianco
100 µL
Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare
per 1 ora a 37°C.
Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i
pozzetti 5 volte con 300 µL di soluzione di lavaggio
diluita.
Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo
delicatamente la piastra capovolta su carta
assorbente.
Nota importante: la sensibilità e la precisione di
questo kit sono fortemente influenzate dal corretto
svolgimento della procedura di lavaggio!
Conjugate
100 µL
100 µL
Incubare 30 minuti a temperatura ambiente (2228°C). Non esporre alla luce solare diretta.
Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i
pozzetti 5 volte con 300 µL di soluzione di lavaggio
diluita.
Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo
delicatamente la piastra capovolta su carta
assorbente.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Incubare 15 minuti al buio a temperature ambiente
(22-28°C).
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Agitare delicatamente la micropiastra. (Nota:
campioni altamente positivi possono causare
precipitati scuri del cromogeno!)
Leggere l'assorbanza (E) a 450 nm con una
lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm o contro il
Bianco entro 30 minuti dopo l'aggiunta della Stop
Solution.
Misurazione:
Settare il lettore di micropiastra ELISA a zero usando
il bianco.
Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può
essere regolato a zero usando il bianco, sottrarre il
valore di assorbanza del bianco a tutti i valori delle
altre assorbanze misurate in modo da ottenere
risultati attendibili!
Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e
registrare tutti i valori di assorbanza di ogni controllo
e campione.
Si raccomanda una lettura a doppia lunghezza d'onda
utilizzando 620 nm come lunghezza di riferimento.
Laddove applicabile calcolare la media delle
assorbanze di tutti i duplicati.
7. CONTROLLO QUALITA’
Si raccomanda di utilizzare i controlli secondo le
norme statali e federali. L'uso di controlli è consigliato
per assicurare la validità dei risultati durante i test.
Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico.
Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi per la
valutazione della qualità nazionali o internazionali, al
fine di assicurare l'accuratezza dei risultati.
Se i risultati del test non rientrano nei range di
accettazione dei controlli, i risultati devono essere
considerati non validi.
In questo caso, si prega di consultare i seguenti
parametri tecnici: pipettaggio e apparecchiature di
cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei
reagenti, metodi di conservazione e condizioni di
incubazione, aspirazione e lavaggio.
Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile
alcun errore, contattare il proprio distributore o
Diametra direttamente.
8. RISULTATI
8.1. Validazione del dosaggio
Il dosaggio può essere considerato valido se sono
soddisfatti i seguenti criteri:
Assorbanza (OD)
minore di 0,100
Bianco
minore di 0,200
Controllo Negativo
compresa tra 0,350 - 0,850
Controllo Cut-off
compresa tra 0,650 - 3,000
Controllo Positivo
8.2. Calcolo dei risultati
Valore medio di assorbanza del Controllo Cut-off
(CO)
Calcolare il valore medio di assorbanza dei due valori
del controllo Cut-off ottenuti.
Esempio: (0,49 + 0,51): 2 = 0,50 = CO
8.3. Interpretazione dei risultati
POSITIVO
Assorbanza media del paziente oltre
il 10% al di sopra del CO
(Media OD paziente > 1.1 x CO)
ZONA INCERTA Assorbanza media del paziente
dal 10% sopra al 10% sotto il CO:
ripetere il test 2-4 settimane dopo
con un campione fresco del paziente
(0.9 x CO
≤ Media OD paziente
≤ 1.1 x CO)
Risultato nel second test ancora nella
zona incerta ⇒ NEGATIVO
NEGATIVO
Assorbanza media del paziente oltre
il 10% al di sotto del CO
(Media OD paziente < 0.9 x CO)
8.3.1. Risultati in unità arbitrarie
Assorbanza media del paziente x 10 = AU
CO
Esempio: 1.580 x 10
0.50
= 32 AU
Interpretazione dei risultati in AU
Valore di Cut-off
Zona Incerta
Negativo
Positivo
10 AU
9-11 AU
< 9 AU
> 11 AU
È importante tenere presente che la determinazione
di un range di valori attesi in un dato metodo per una
popolazione “normale” è dipendente da molteplici
fattori, quali la specificità e sensibilità del metodo in
uso, e la popolazione in esame. Perciò ogni
laboratorio dovrebbe considerare i range indicati dal
Fabbricante come un’indicazione generale e produrre
range di valori attesi propri basati sulla popolazione
indigena dove il laboratorio risiede.
9. PARAMETRI CARATTERISTICI
9.1. Specificità Diagnostica
La specificità diagnostica é definita come la
probabilità del test di fornire un risultato negativo in
assenza di anticorpi specifici. La specificità
diagnostica è 99,9%.
9.2. Sensibilità Diagnostica
La sensibilità diagnostica è definita come la
probabilità di fornire un risultato positivo in presenza
di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica è
99,9%.
10. LIMITAZIONI DEL SAGGIO
La contaminazione batterica o ripetuti cicli di
congelamento e scongelamento del campione
possono influenzare i valori di assorbanza.
Nei pazienti immunocompromessi e nei neonati i
valori sierologici hanno un valore limitato.
11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO
I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le
leggi locali.
BIBLIOGRAFIA
1. Luger, A., B.L. Schmidt, und F. Gschnait. 1983.
Neue Fortschritte der Syphilisserologie. Wr. Klein.
Wsch. 95: 440-443
2. Penn. C. W., M. J. Baily, and Cockayne. 1985.
The axial filament antigen of Treponema pallidum.
Immunology 54: 635-641
Ed. 08/2012
DCM023i-0
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 –
20090 SEGRATE (MI) Italy
Tel. +39-02-2139184 - 02-26921595
Fax +39-02-2133354.
Manufactory: Via Pozzuolo 14, 06038 SPELLO (PG)
Italy
Tel. +39-0742-24851
Fax +39-0742-316197
E-mail: [email protected]
DCM023i-0
Ed. 08/2012
Treponema pallidum IgG
for routine analysis
Enzyme immunoassay for the qualitative and semiquantitative determination of human IgG-class
antibodies to Treponema pallidum in human serum
IVD
LOT
See external label
INTENDED USE
Diametra Treponema pallidum IgG ELISA assay is an
immunoenzymatic method for the qualitative and
semiquantitative determination of human IgG-class
antibodies against Treponema pallidum in human
serum.
Treponema pallidum IgG kit is intended for laboratory
use only.
1. CLINICAL SIGNIFICANCE
Spirochetes are motile bacteria with a periplasmatic
axial filament. All pathogenic species belong to the
family Treponemataceae, which includes the three
genera: Treponema, Borrelia, and Leptospira. The
Treponema are motile bacteria, 5-15µ in length and
0.2µ in width, containing about 10 flexible, undulating,
spiral shaped rods. Treponema pallidum, the
causative agent of Syphilis, is transmitted by direct
contact, usually through sexual intercourse. Syphilis
along
with
Gonorrhoea,
Chancroid
and
Lymphogranuloma venereum, designated as a
venereal disease, or VD, is an acute and chronic
infectious disease. After an incubation period of 1230 days, the first symptoms to appear are chancres,
soon followed by syphilitic ulcers which then
spontaneously disappear in a few weeks. During this
first stage (primary syphilis) the Treponema pallidum
propagates in related lymph nodes to be distributed to
the whole body stream. Three further stages of
disease follow which are classified as secondary,
tertiary, and quaternary syphilis.
Treatment with antibiotics at the earliest disease
stage and prophylactic measures are ways to prevent
epidemics. For this purpose, antenatal and donor
blood screenings are mandatory in most of countries
around the world.
2. PRINCIPLE OF THE METHOD
Diametra Treponema pallidum IgG ELISA kit is a
solid phase enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA)
Microtiter wells as a solid phase are coated with
Treponema pallidum antigen.
Σ = 96 tests
REF DKI023
Diluted patient specimens and ready-for-use controls
are pipetted into these wells. During incubation
Treponema pallidum-specific antibodies of positive
specimens and controls are bound to the immobilized
antigens.
After a washing step to remove unbound sample and
control material horseradish peroxidase conjugated
anti-human IgG antibodies are dispensed into the
wells. During a second incubation this anti-IgG
conjugate binds specifically to IgG antibodies
resulting in the formation of enzyme-linked immune
complexes.
After a second washing step to remove unbound
conjugate the immune complexes formed (in case of
positive results) are detected by incubation with TMB
substrate and development of a blue color. The blue
color turns into yellow by stopping the enzymatic
indicator reaction with sulfuric acid.
The intensity of this color is directly proportional to the
amount of Treponema pallidum-specific IgG antibody
in the patient specimen. Absorbance at 450 nm is
read using an ELISA microtiter plate reader.
3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION
3.1. Reagents and materials supplied in the kit
1. Controls (3 vials, 2 mL each, ready to use)
Negative Control
REF DCE045/02301i-0
Positive Control
REF DCE045/02302i-0
Cut-Off Control
REF DCE045/02303i-0
2. Conjugate (1 vial, 20 mL)
Anti human IgG antibodies conjugated with peroxidase
REF DCE002/02302i-0
3. Coated Microplate
(1 breakable microplate coated with inactivated
Treponema pallidum antigen) REF DCE002/02303i-0
4. TMB Substrate (1 vial, 14 mL)
H2O2-Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact)
REF DCE004/02304i-0
5. Stop Solution (1 vial, 14 mL)
Sulphuric acid 0.2M (avoid any skin contact)
REF DCE005/02305i-0
6. 20X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 mL)
Contain non-mercury preservative
REF DCE007/02307i-0
7. Sample Diluent (1 vial, 100 mL)
Buffered solution pH 7.2
REF DCE053/02353i-0
3.2. Reagents necessary not supplied
Distilled water.
3.3. Auxiliary materials and instrumentation
Automatic dispenser.
Microplates reader (450 nm)
Notes
Store all reagents at 2÷8°C in the dark. Opened
kits retain activity for two months if stored as
described above.
Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only
when it is at room temperature and close it
immediately after use.
4. WARNINGS
• This kit is intended for in vitro use by professional
persons only. Not for internal or external use in
Humans or Animals.
• Use appropriate personal protective equipment
while working with the reagents provided.
• Follow Good Laboratory Practice (GLP) for
handling blood products.
• All human source material used in the preparation
of the reagents has been tested and found
negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and
HCV. No test method however can offer complete
assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious
agents are absent. Therefore, the reagents should
be handled in the same manner as potentially
infectious material.
• Some reagents contain small amounts of Sodium
R
Azide or Proclin 300 as preservative. Avoid the
contact with skin or mucosa.
• Sodium Azide may be toxic if ingested or
absorbed through the skin or eyes; moreover it
may react with lead or copper plumbing to form
potentially explosive metal azides. If you use a
sink to remove the reagents, allow scroll through
large amounts of water to prevent azide build-up.
• The TMB Substrate contains an irritant, which may
be harmful if inhaled, ingested or absorbed
through the skin. To prevent injury, avoid
inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.
• The Stop Solution consists of a diluted sulphuric
acid solution. Sulphuric acid is poisonous and
corrosive and can be toxic if ingested. To prevent
chemical burns, avoid contact with skin and eyes.
• Avoid the exposure of reagent TMB/H2O2 to
directed sunlight, metals or oxidants. Do not
freeze the solution.
5. PRECAUTIONS
• Please adhere strictly to the sequence of pipetting
steps provided in this protocol. The performance
data represented here were obtained using
specific reagents listed in this Instruction For Use.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
All reagents should be stored refrigerated at 2-8°C
in their original container. Any exceptions are
clearly indicated. The reagents are stable until the
expiry date when stored and handled as indicated.
Allow all kit components and specimens to reach
room temperature (22-28°C) and mix well prior to
use.
Do not interchange kit components from different
lots. The expiry date printed on box and vials
labels must be observed. Do not use any kit
component beyond their expiry date.
If you use automated equipment, the user has the
responsibility to make sure that the kit has been
appropriately tested.
The incomplete or inaccurate liquid removal from
the wells could influence the assay precision
and/or increase the background.
It is important that the time of reaction in each well
is held constant for reproducible results. Pipetting
of samples should not extend beyond ten minutes
to avoid assay drift. If more than 10 minutes are
needed, follow the same order of dispensation. If
more than one plate is used, it is recommended to
repeat the dose response curve in each plate
Addition of the TMB Substrate solution initiates a
kinetic reaction, which is terminated by the
addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB
Substrate and the Stop Solution should be added
in the same sequence to eliminate any time
deviation during the reaction.
Observe the guidelines for performing quality
control in medical laboratories by assaying
controls and/or pooled sera.
Maximum precision is required for reconstitution
and dispensation of the reagents.
Samples microbiologically contaminated, highly
lipemeic or haemolysed should not be used in the
assay.
Plate readers measure vertically. Do not touch the
bottom of the wells.
6. PROCEDURE
6.1. Preparation of the Wash Solution
Dilute the "20X Conc. Wash Solution" 1:20 with
distilled water; for example to prepare 600 mL of
diluted Wash Solution add 30 mL of "20X Wash
Solution" to 570 mL of distilled water. If the "20X
Wash Solution" presents crystals, dissolve them by
warming up at 37°C in a water bath before use.
The diluted Wash Solution is stable for 1 month at 28°C.
6.2. Preparation of the Sample
Diametra Treponema pallidum IgG ELISA can be
used with human serum.
All serum samples have to be pre-diluted with
Sample Diluent 1:101; for example 10 µL of sample
may be diluted with 1000 µL of sample diluent. After
dilution mix well and let stand for 15 minutes.
The Controls are ready to use and must not be
diluted!
To obtain the serum, collect blood by venipuncture,
allow to clot, and separate serum by centrifugation at
room temperature. Do not centrifuge before complete
clotting
has
occurred.
Patients
receiving
anticoagulant therapy may require increased clotting
time. The usual precautions for venipuncture should
be observed. Do not use hemolytic, icteric or lipemic
specimens. Specimens should be capped and may
be stored for up to 24 hours at 2-8°C prior to
assaying. Specimens held for a longer time should
be frozen only once at –20°C prior to assay. Thawed
samples should be inverted several times prior to
testing.
•
•
•
•
6.3. Procedure
Allow all reagents to reach room temperature
(22-28°C).
Unused coated microwell strips should be
released securely in the foil pouch containing
desiccant and stored at 2-8°C.
To avoid potential microbial and/or chemical
contamination, unused reagents should never be
transferred into the original vials.
As it is necessary to perform the determination in
duplicate in order to improve accuracy of the test
results, prepare two wells for each Control, two for
each sample, one for Blank.
Reagent
Controls
Controls
(Neg, Pos,
Cut-Off)
100 µL
Diluted
Sample
Sample
Blank
100 µL
Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1
hour at 37°C.
Remove the contents from each well. Wash the wells
5 times with 300 µL of diluted Wash Solution.
Remove excess solution by tapping the inverted plate
on a paper towel.
Important note: the sensitivity and precision of this
assay is markedly influenced by the correct
performance of the washing procedure!
Conjugate
100 µL
100 µL
Incubate 30 minutes at room temperature (22-28°C).
Do not expose to direct sunlight.
Remove the contents from each well. Wash the wells
5 times with 300 µL of diluted Wash Solution.
Remove excess solution by tapping the inverted plate
on a paper towel.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Incubate 15 minutes in the dark at room temperature
(22÷28°C).
Stop
100 µL
100 µL
100 µL
Solution
Shake the microplate gently. (Note: Highly positive
patient samples can cause dark precipitates of the
chromogen!)
Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference
wavwlenght of 620 nm or against Blank within 30
minutes after adding the Stop Solution.
Measurement:
Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to
zero using the substrate blank.
If - due to technical reasons - the ELISA reader
cannot be adjusted to zero using the substrate blank,
subtract the absorbance value of the blank from all
other absorbance values measured in order to obtain
reliable results!
Measure the absorbance of all wells at 450 nm and
record the absorbance values for each control and
patient sample.
Dual wavelength reading using 620 nm as reference
wavelength is recommended.
Where applicable calculate the mean absorbance
values of all duplicates.
7. QUALITY CONTROL
It is recommended to use control samples according
to state and federal regulations. The use of control
samples is advised to assure the day to day validity of
results. Use controls at both normal and pathological
levels.
It is also recommended to make use of national or
international Quality Assessment programs in order
to ensure the accuracy of the results.
If the results of the assay do not fit to the established
acceptable ranges of control materials patient results
should be considered invalid.
In this case, please check the following technical
areas: Pipetting and timing devices; photometer,
expiration dates of reagents, storage and incubation
conditions, aspiration and washing methods.
After checking the above mentioned items without
finding any error contact your distributor or Diametra
directly.
8. RESULTS
8.1. Validation of the Test Run
The test run may be considered valid provided the
following criteria are met:
Blank
Negative Control
Cut-Off Control
Positive Control
Absorbance value (OD)
lower than 0,100
lower than 0,200
between 0,350 - 0,850
between 0,650 - 3,000
8.2. Calculation of Results
Mean absorbance value of Cut-off Control (CO)
Calculate the mean absorbance value of the two Cutoff Control determinations .
Example: (0.49 + 0.51) : 2 = 0.50 = CO
8.3. Interpretation of Results
Patient (mean) absorbance values
more than 10% above CO
(Mean OD patient > 1.1 x CO)
POSITIVE
GREY ZONE
NEGATIVE
Patient (mean) absorbance values
from 10% above to 10% below CO:
repeat test 2-4 weeks later with new
patient samples
(0.9 x CO ≤ Mean OD patient ≤
1.1 x CO)
Results in the second test again in
the grey zone ⇒ NEGATIVE
Patient (mean) absorbance values
more than 10% below CO
(Mean OD patient < 0.9 x CO)
8.3.1. Results in Arbitrary Units (AU)
Patient (mean) absorbance value x 10 = AU
CO
Example:
1.580 x 10
0.50
= 32 AU
Interpretation of Results in AU:
Cut-off value
Grey zone
Negative
Positive
10 AU
9-11 AU
< 9 AU
> 11 AU
Please pay attention to the fact that the determination
of a range of expected values for a “normal”
population in a given method is dependent on many
factors, such as specificity and sensitivity of the
method used and type of population under
investigation. Therefore each laboratory should
consider the range given by the Manufacurer as a
general indication and produce their own range of
expected values based on the indigenous population
where the laboratory works.
9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS
9.1. Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity is defined as the probability
of the assay of scoring negative in the absence of the
specific analyte. It is 99.9%.
9.2. Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity is defined as the probability
of the assay of scoring positive in the presence of the
specific analyte. It is 99.9%.
10. LIMITATIONS OF USE
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw
cycles of the specimen may affect the absorbance
values.
In immunocompromised patients and newborns
serological data only have restricted value.
11. WASTE MANAGEMENT
Reagents must be disposed off in accordance with
local regulations.
BIBLIOGRAPHY
1. Luger, A., B.L. Schmidt, und F. Gschnait. 1983.
Neue Fortschritte der Syphilisserologie. Wr. Klein.
Wsch. 95: 440-443
2. Penn. C. W., M. J. Baily, and Cockayne. 1985.
The axial filament antigen of Treponema pallidum.
Immunology 54: 635-641
Ed. 08/2012
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