Studi di Tossicità
I test di tossicità non sono finalizzati a dimostrare che un dato
composto chimico (farmaco, cosmetico, additivo alimentare,
fitoterapico, fitofarmaco) è sicuro (cioè assolutamente senza
rischio):
• ogni sostanza può indurre effetti sfavorevoli (o nocivi o
tossici, in base alla dose);
• è quindi importante arrivare a determinare la stima del
rischio, associato all’uso della sostanza, sottoponendola
a test appropriati per far emergere il livello di pericolosità
del contatto.
Cosa si intende per sperimentazione clinica
“… ogni forma di esperimento pianificato su
pazienti, programmato per valutare il
trattamento più appropriato di futuri pazienti
con una determinata condizione patologica.”
Modelli animali in vivo e in vitro
“NESSUNA UMANA INVESTIGAZIONE SI
PUO' DOMANDARE VERA SCIENZA SE
condizioni normali
stati patologici
NON PASSA PER LE MATEMATICHE
effetti farmacologici
DIMOSTRAZIONI”
durata di azione
vie di somministrazione
Leonardo Da Vinci
effetti avversi
SPERIMENTAZIONE PRECLINICA
Durata media 2 anni
Consente di isolare dalle migliaia di
sostanze sottoposte al primo screening
di base farmacologico e biochimico 20 – 30 composti
si identificano le strutture chimiche correlate a una certa azione
farmacologica ed il numero di sostanze esaminate diminuisce
ulteriormente
Modelli animali utilizzati
Topo
Ratto
Coniglio
Cane
Primati
1
Sperimentazione in vivo
Vantaggi/
/Svantaggi
Uso degli animali da esperimento
Il modello animale (mammifero) rappresenta il sistema di massima
complessità biologica a rappresentazione dell’impatto clinico.
L’animale è insostituibile ad un certo livello della sperimentazione: nessun
protocollo di sperimentazione di una nuova molecola prevede, per ora,
solo test “In vitro”.
Esistono comunque norme etiche che devono guidare la sperimentazione:
rispetto della vita e moderazione della sofferenza degli animali durante
l’esperimento e al momento della soppressione (sacrificio). Locali di
stabulazione e personale addetto sono soggetti ad approvazione da parte
del Ministero della Sanità.
Legislazione: Gazzetta Ufficiale D.L. n. 116, suppl; 18.2.1992;
EEC Council Directive 86/609.
Protocolli sperimentali controllati: devono seguire le norme di legge vigente o
essere approvati in caso di deroghe; sono previste visite periodiche di un
veterinario responsabile, specialmente durante la sperimentazione a
lungo termina.
Valuta effetti sistemici;
Ha un costo elevato
Permette di monitorare più parametri
biologici contemporaneamente;
Presenta la necessità di strutture e
processi di stabulazione adeguati
Consente di studiare, anche in tempi
prolungati, processi biologici
complessi: cancerogenesi,
teratogenesi, comportamento
Prevede un’ampia variabilità biologica
delle rilevazioni sperimentali
Tiene conto dei meccanismi di
tossicocinetica
Esperimenti in vivo
Requisiti richiesti:
Piccola taglia, docilità, maneggevolezza, robustezza, prolificità,
facile stabulazione, facile alimentazione
Topo, ratto, cavia, coniglio, cane, scimmia
Caratteristiche omogenee negli animali:
Condizioni di stabulazione:
Dieta:
Patrimonio genetico (ceppo), età, peso, sesso, stato di salute
Non permette di ottenere alcuna
informazione sul fine meccanismo
d’azione a livello molecolare
Metodi alternativi all’animale
Simulazioni al computer (modelli matematici complessi
che non sono comunque in grado di considerare tutte le
variabili di una matrice biologica
Saggi biochimici (che rappresentano una semplificazione
di sistema
Colture cellulari:
Colture primarie (estemporanee da tessuto, differenziate ma labili)
Linee “immortalizzate” (in grado di proliferare all’infinito)
Cellule tumorali (linee cellulari da ceppi specifici)
Cellule staminali (totipotenti, capaci di dare origine a qualsiasi tipologia di
differenziazione)
Temperatura (22-24 °C) ventilazione, umidità, ritmo circadiano
Standard di facile conservazione (pellets), composizione costante
Esperimenti “in vitro”
Vantaggi
Svantaggi
Prove di tossicità precliniche
da 2 a 5 anni, 40 milioni di euro per farmaco
commercializzato
tossicità acuta
tossicità subacuta
tossicità cronica
tossicità riproduttiva
tossicità mutagena
Facilità di reperibilità dei dati,
minima variabilità biologica
Uniformità genetica (elevata
riproducibilità)
Possibilità di manipolazione
genetica
Predittività dei meccanismi
d’azione a livello molecolare
Possibilità di impiego di materiale
umano
Impossibilità di rappresentare
processi biologici complessi
(es. tossicocinetica)
Difficoltà ad estrapolare i risultati
“in vivo”
Non perfetta rappresentatività
delle cellule “immortali” (anche
umane) rispetto a quelle
differenziate
dose singola (LD50)
tre dosi
1-2 anni (durante la sperimentazione clinica)
fertilità, teratogenicità, lattazione
tumori, mutazioni batteriche
2
Test di Tossicità
Generica
Tossicità acuta
Tossicità sub-acuta
Tossicità sub-cronica
Tossicità cronica
Sperimentazione animale
Particolare
Mutagenesi
Cancerogenesi
Teratogenesi
Sensibilizzazione (effetti
allergogeni)
Animale = uomo
mg/m2
differenze di specie
stesse vie di esposizione
esami clinici, strumentali, autoptici
Maggiore esposizione = maggiore incidenza
alte dosi
ridotto numero di animali
Dose/superficie
Roditori: non sono in grado di vomitare, ciò viene sfruttato per certi
rodenticidi (ANTU alfa-naftiltiourea, scilla rossa) che irritanti, vengono
vomitati da cane e gatto (funzione protettiva)
CONIGLIO: minore sensibilità agli effetti tossici dell’atropina --> dotato
di un’esterasi epatica in grado di idrolizzarla rapidamente (idrolisi lenta
nelle altre specie)
species
weight
dosage
(mg/kg)
dose
(mg/
animal)
surface
area
(cm2)
dosage
(mg/cm2)
mouse
20
100
2
46
0.043
rat
200
100
20
325
0.061
dog
12000
100
1200
5770
0.207
man
70000
100
7000
18000
0.388
3
Tossicità acuta
Obiettivi
Identificazione degli organi bersaglio e di altre
manifestazioni cliniche a rapida insorgenza
Informazioni sul meccanismo d’azione tossica
Durata degli effetti
Reversibilità dell’effetto tossico
Valutazione della letalità (DL50)
Stima dei livelli di dose da utilizzare negli studi
successivamente
4
Studi di tossicità sull’animale
Acuta
Sistemica (almeno 2 vie)
• 2 o + specie, reversibilità, organi bersaglio
• osservazione per 14 giorni, esame autoptico
• DL50
Supertossici: < 5mg/kg
Non tossici: > 15 g/kg
Locale
• cutanea
• oculare
Fattori che possono far variare la DL50
Numero degli animali considerati
Specie (e in certi casi il ceppo, es. topi nude)
Sesso
Età
Peso
Dieta
Temperatura ambientale (e altre variabili dell’ecosistema)
Periodo stagionale (cronobiologia)
Sensibilizzazione allergica
somministrazione cutanea o intradermica
sostanze adiuvanti
Studi di tossicità sull’animale
Subacuta
3-4 somministrazioni
tre dosi
• tossica (letale ≅ 10%)
• non tossica
• intermedia
Obiettivi degli studi di tossicità sub-cronica
Definire:
la relazione tra intensità degli effetti e dose assunta
gli organi bersaglio degli effetti tossici
la reversibilità/irreversibilità degli effetti
Indicazioni (dosaggi) per gli studi a lungo termine
Subcronica
via di esposizione umana, 90 giorni
dosi come nella subacuta
individuazione di NOAEL e LOAEL
Osservazioni
Dopo la somministrazione vi è un periodo osservazionale di circa 14
giorni per i seguenti rilievi:
Comportamentali: aggressività, tremori, piloerezione, posizione della
coda, comportamento esplorativo, emissione suoni
Fisiologici: peso corporeo, consumo di cibo, temperatura corporea,
riflessi, frequenza e ritmo cardiaco
Al termine del test tutti gli animali sono sottoposti ad esame autoptico
effettuando esami macro e microsopici su tutti gli organi
Mutagenesi
Mutazioni geniche o puntiformi: alterazioni in una o poche coppie di basi
Mutazioni cromosomiche: alterazione della struttura dei cromosomi
(accorciamento, alterazione della forma…)
Mutazioni genomiche: alterazioni nel numero dei cromosomi
Le mutazioni possono:
insorgere in modo spontaneo – mutazioni spontanee;
Essere indotte da agenti chimici o fisici – mutazioni indotte
5
CANCEROGENO GENOTOSSICO
Attivazione di oncogèni
Inattivazione di geni oncosoppressori
Iniziazione
CANCEROGENO EPIGENETICO
inibizione apoptosi,
induzione da stress ossidativo,
espansione clonale,
azione sulla replicazione del DNA
Trasformazione
neoplastica
Progressione
Tumore
Mutazioni indotte
Le lesioni premutazionali sono dovute a
Reazioni di deaminazione ossidativa: da acido nitroso a nitrosamine
Formazione di epossidi/radicali liberi
Formazione di legami covalenti tra le basi: effetto dei raggi UV
Reazioni di alchilazione, con legame di gruppi chimici alle basi
azotate: effetto degli agenti alchilanti
Inserimento o delezione di basi: agenti intercalanti
Il Test di Ames
Screening per gli agenti chimici che si sospettano capaci di mutagenicità
e cancerogenicità utilizzando ceppi di Salmonella typhimurium
Si basa appunto sulla forte correlazione esistente tra mutagenicità e
cancerogenicità
Stabilisce la capacità della sostanza di indurre mutazioni in un ceppo di
salmonelle (in genere istidina +) in cui è compromessa la via biosintetica
dell’istidina per mutazione selettiva sul gene corrispondente ad un enzima
chiave della biosintesi (istidina -)
Il mutageno può determinare con alta probabilità una nuova mutazione
corrispondente nel gene compromesso (reversione), permettendo così al
batterio di risintetizzare l’aminoacido essenziale istidina
6
La cancerogenesi
E’ un processo più complesso di quello che deriva dalla semplice
mutazione genetica
E’ caratterizzata da due processi successivi:
Fase di iniziazione
Fase di promozione
Esempi di promotori chimici
Induttori enzimatici: pesticidi organoclorurati (DDT),
idrocarbuti aromatici policiclici
(PAI, es. benzopirene), barbiturici.
Agenti ormonali:
estrogeni (tumori ormonosensibili).
Immunosoppressori: ciclosporina A, azatioprina, diossina.
Solidi cancerogeni: asbesto (amianto), plastiche.
Gli idrocarburi policlicici sono sia iniziatori che promotori dei tumori e si
definiscono perciò cancerogeni completi.
Alimentazione e cancro: procancerogeni
Affumicati/grigliati (presenza di benzopireni): attenzione ai cibi affumicati e
cotti su griglia, brace, barbecue (zone carbonizzate)
Fritti : trasformazione di grassi animali e oli di semi a basso punto di
cracking (rapido inscurimento)
Bevande alcoliche : etanolo →acetaldeide
Nitrati-Nitriti/Nitrosamine : cibi proteici + nitroderivati usati come conservanti
dal 1990 è obbligatorio aggiungere Ac. Ascorbico agli insaccati contenenti
nitrati per impedire la trasformazione a nitriti e nitrosamine
Tabacco : alcaloidi (nicotina) →nitrosamine
catrami- PAI (benzopirene) →derivati epossidici
Teratogenesi
Si assiste allo sviluppo di malformazioni strutturali e/o comportamentali
irreversibili presenti alla nascita o rilevabili in periodo perinatale (ecografia
intrauterina o primi anni di vita)
Tossicità embriofetale
Si assiste a ritardo di sviluppo psicofisico senza evidenza di
malformazioni.
Le alterazioni possono essere permanenti o reversibili (es. crisi di
astinenza per tossici o farmaci)
7
La Placenta
Agenti tossico-nocivi per lo sviluppo della specie
umana
La barriera placentare è meno selettiva della BEE
Può essere considerata un filtro “a setaccio” di maglia larga, che può quindi
essere attraversata anche da molecole idrofile con PM fino a 700 Dalton
Quasi tutti i farmaci (tranne le macromolecole idrofile) possono quindi
raggiungere il feto
L’apporto di sangue attraverso i vasi ombelicali è ampio ma il flusso è lento
→aumenta il tempo di scambio.
Infezioni
Virus della Rosolia
Cytomegalovirus
Herpes virus
Toxoplasma
Spirocheta (sifilide)
Agenti fisici: Radiazioni →
Squilibri metabolici
Alcolismo
Diabete
Carenza di folati
Malattie reumatiche
Fenilchetonuria
Diagnostica/terapia o
Incidenti/armamenti
Valutazione dei risultati
La mancata comparsa di eventi teratogeni strutturali o comportamentali al
termine dei test sull’animale non garantisce l’innocuità di una
sostanza per l’uomo!
Ciò perché:
La durata della gravidanza nei comuni animali da esperimento è molto diversa
(20 gg ratto, 30 gg coniglio, 60 gg cane, 270 gg specie umana)
La struttura della placenta nella specie umana è più semplice che in altri
mammiferi (barriera meno efficace)
La metabolizzazione delle sostanze assunte può essere differente
I primi 10 giorni di vita del ratto corrispondono al terzo trimestre di gravidanza
Fattori che influenzano la teratogenesi
Cause di teratogenesi
La teratogenesi può essere conseguenza di:
Mutazioni (geniche, cromosomiche o genomiche) indotte di solito nel
feto da agenti chimici o fisici.
Carenze di nutrienti precursori e substrati essenziali (per lo più
vitamine e minerali) prodotte di solito da diete ristrette o monotone,
come pure da difetti di trasporto attraverso la placenta.
Inibizione di attività enzimatiche (alterazioni metaboliche) per
patologie materne e/o interazioni con sostanze assunte dalla madre.
Deficit di ossigeno (ipossia) per patologie materne e/o sostanze
assunte dalla madre.
La sostanza (farmaco/tossico) in relazione a:
1.
Capacità di attraversare la barriera placentare e di penetrare nei
tessuti embrionali (sost. lipofile > idrofile);
Via di somministrazione/esposizione (via parenterale > orale >
topica
Durata del trattamento/esposizione (assunzione cronica >
occasionale.
2.
3.
4.
Emivita della sostanza (t1/2) e/o dei suoi metaboliti
8
Cause di teratogenesi
La teratogenesi può essere conseguenza di:
Modello di studio sperimentale
Studi in laboratorio / sperimentazione clinica
Clinical Trial o Esperimento Clinico Controllato
Esperimento condotto per misurare l’efficacia di un
trattamento terapeutico.
Dove lo sperimentatore:
determina un’esposizione e ne studia gli effetti
assegna le ‘unità sperimentali’ ai diversi trattamenti
definisce modalità e durata dei trattamenti
definisce il numero di unità sperimentali per ciascun trattamento
Sinonimi:
– Randomized Clinical Trial
– Trial Clinico Randomizzato
IL PROTOCOLLO DI STUDIO
Un clinical
trial non è uno studio isolato ma si
inserisce in una sequenza di indagini per conoscere
e valutare le ‘prestazioni’ di un farmaco o di un
trattamento, in modo comparativo rispetto ad altri
farmaci o trattamenti
Il protocollo di studio è il documento formale in cui:
si descrivono rigorosamente il razionale della ricerca,
gli obiettivi specifici, il disegno dello studio e la
metodologia di esecuzione
si fissano le linee guida di comportamento alla luce
dei risvolti etici della sperimentazione
9
Obiettivo della ricerca
La definizione degli obiettivi della ricerca presuppone una
ipotesi di lavoro in cui siano contenuti:
La definizione del trattamento (posologia e tempi)
Confronto vs Placebo : misura il puro effetto farmacologico
Confronto vs trattamento standard : fornisce la stima quantitativa
e qualitativa dell’efficacia del farmaco e la sua reale importanza
terapeutica
La scelta degli End Points (misurazioni fatte per rispondere
ai quesiti della sperimentazione)
Il gruppo di controllo e relativo trattamento
La scelta dei pazienti (randomizzazione)
Obbiettivi sperimentazione
Sperimentazione clinica
durata 4-6 anni
variabilità del decorso clinico
concomitanza di altre malattie
fattori di rischio ambientali o comportamentali
interazioni con altri farmaci
aderenza alla terapia
pregiudizi di paziente e sperimentatore
Obbiettivo
Definizione della dose
Evidenza di successo terapeutico
Confronto con trattamento standard
Vigilanza sugli effetti indesiderati
Sperimentazione clinica: Fase 1
Consente di definire dose massima tollerata, forma galenica, tempi
di somministrazione in rapporto agli studi di farmacocinetica
Fase
I
II
III
IV
Sperimentazione clinica: Fase 2
Consente di definire dosaggio migliore
università
piccolo gruppo di pazienti malati (10-200)
centri clinici,
centri di ricerca, università
ristretto numero di volontari (<20 non randomizzati)
Sani
Malati
Senza gruppo di controllo
Non randomizzati
Singolo dosaggio
confronto con placebo e farmaco attivo già noto
studio “in aperto”
risposta al farmaco
farmacocinetica
limiti di sicurezza
singolo cieco
efficacia terapeutica
effetti tossici
10
Sperimentazione clinica: Fase 3
Durata Fase 3
Consente di definire l’efficacia del farmaco
A seconda della patologia e del trattamento di
confronto
molti pazienti (1.000)
protocollo sperimentale modificato rispetto a
fase 1 e 2
doppio cieco
cross-over
Farmaco Depressione: 4w – 6 mesi
Farmaco Ipertensione: 3 – 6 mesi
Farmaco Diabete: 6 mesi – 1 anni
efficacia
effetti tossici poco frequenti
Farmaco Osteoporosi: 4 – 5 anni
• farmacoidiosincrasia
• farmacoallergia
La storia del talidomide (N-ftalimido-glutaride)
Sperimentazione clinica: Fase 4
Prodotta da CHEMIE GRÜNENTHAL (Contergan)
Fase 3 favorevole
ministero sanità → commercializzazione.
in casi eccezionali, si può saltare la fase 3
Fase 4
controllo post-marketing
effetti tossici rari (1:10.000)
Metodi sperimentazione clinica
consenso informato
scelta casuale dei soggetti (randomizzazione)
confronto con placebo o con farmaci noti
alternanza di trattamenti (cross-over)
1950 nasce come sedativo ed ipnotico
Prescritto nel controllo della nausea in gravidanza negli aa 60
1961 prima segnalazione di allarme su Lancet, della nascita di
bambini focomelici (10.000)
Farmaco ritirato dal commercio nel 1962
1965 viene utilizzato per sedare di pazienti di lebbra, maschi. Il
quadro clinico regredisce dopo 4-48 ore
1989 viene sperimentata la potenzialità di immunosoppressore
nei trapianti
2000 inizia l’uso per HIV e cancro (per ora sperimentale)
Cross-over
Cross-over o disegno sperimentale incrociato,
consiste nell’alternare, in ciascun soggetto, periodi di
somministrazione del farmaco in studio con periodi di
somministrazione di placebo (controllo) o di farmaco
standard (controllo positivo).
Questo serve a diminuire gli errori introdotti dalle
fluttuazioni della gravità della malattia in esame
singolo cieco
doppio cieco
11