Chimica analitica degli alimenti
Scopo dell’analisi sugli alimenti:
Aspetti legali
Controllo dei limiti di legge
Sostanze tossiche (es. aflatossine, mercurio)
Pratiche illecite (zucchero nel vino)
Aspetti nutrizionali
Resveratrolo nel vino
Vitamine, principi nutritivi
Qualità degli alimenti
Importanza dell’analisi degli alimenti
Dal punto di vista sanitario, l’l’analisi degli alimenti è l’unica garanzia per la nostra salute
relativamente a ciò che mangiamo (a meno che ci si possa fidare ciecamente del produttore).
Le frodi alimentari sono infatti alquanto diffuse e non sempre è possibile portarle alla luce. La
frode può intervenire su vari livelli:
Un alimento è prodotto e commercializzato con materie prime di scarsa qualità
qualità
Materie prime conservate non correttamente
Materie prime contaminate (es
(es.. Hg in pesce,
pesce, Mucca pazza)
Trattamenti che causano contaminazioni
Un alimento è commercializzato utilizzando un marchio o una denominazione non
corrispondente
Parmesan tedesco
Vino non corrispondente alla denominazione
Un alimento è commercializzato sostituendo completamente o parzialmente il prodotto
prodotto
autentico con un’
un’alternativa simile ma meno costosa
succo d’
d’arancio adulterato con succo di mela
olio d’
d’oliva miscelato con altri oli vegetali
Un alimento è prodotto con procedimenti non conformi
olio d’
d’oliva extravergine prodotto per estrazione con solventi
Un alimento è prodotto con pratiche non consentite
zucchero nel vino o nei succhi di frutta
Frodi antiche e moderne
La falsificazione degli alimenti e delle bevande non è un fenomeno nuovo
ma piuttosto una pratica molto antica della cui presenza nel passato
esistono importanti testimonianze.
Nell’antico Egitto si impiegavano speciali attrezzi per effettuare la
bollatura delle carni macellate ed impedire che con esse venissero
vendute parti di bestie morte per malattia.
Un reperto di epoca romana imperiale (I secolo d.C.) mostra un’anfora
gallica recante un sigillo con una falsa incisione del nome di un produttore
campano (tale M. C. Lassius) apposto da mercanti per far credere che
quella fosse la paternità del vino posto nei contenitori, mentre si trattava
di vino proveniente dalla Narbona da cui essi l’avevano acquistato
Ancora nel primo secolo d.C. Plinio il Vecchio descriveva
la falsificazione di prodotti di largo consumo, come il
pepe e la farina che, quando proveniva da cerali di
scarso pregio, grazie ad una serie di trattamenti,
poteva essere trasformata in un prodotto di prima
qualità, per la cui vendita si poteva esigere prezzi
superiori.
Va detto che in tempi antichi le adulterazioni erano
grossolane (es. annacquamento del latte) ma d’altra
parte non c’era alcuna nessuna protezione del
consumatore
In Francia, tra il 1200 ed il 1400, si moltiplicarono
editti ed ordinanze contro i malvagi frodatori che
smerciavano carni alterate, rovinate, gonfie, panetti di
burro rancido tinti con erbe e fiori gialli, birra
ottenuta con
misture di bacche selvatiche,
peperoncino, loglio o pece resina
In Germania, l’imperatore Federico III emise duri
provvedimenti per contrastare i falsificatori di vino, a
seguito di “casi di avvelenamento dovuti a certi
mercanti di Franconia, che avevano venduto come vino
puro una infusione in cui erano mescolate acqua di calce
e varie droghe nocive”
Anche Carlo V emanò rigide disposizioni contro le frodi
alimentari ma, pare, senza ottenere grandi risultati
Cronistoria delle frodi
Medio Evo: primi esempi di adulterazione riportati
Inizio del XVIII secolo: controllo su certi alimenti (birra, vino, alcolici,
tè) al solo scopo fiscale
1861: Uso del microscopio per certificare l'autenticità del caffè (a quel
tempo estremamente costoso
1875: Sale of Food and Drug Act (UK). Un alimento viene considerato
adulterato se:
Contiene ingredienti che lo rendono pericoloso per la salute del
consumatore
Contiene sostanze che ne aumentano il peso o il volume, a meno che
queste non siano necessarie alla preparazione e vengano dichiarate
al momento della vendita
Un costituente importante è stato rimosso in tutto o in parte
senza che questo venga dichiarato al momento della vendita
È una imitazione, o viene venduto sotto il nome, di un altro
alimento.
1931: Food and Drug Administration (FDA) (USA)
1962: Codex Alimentarius Commission (FAO) … Unione Europea
Aspetti positivi
Attualmente le condizioni sono diverse, non necessariamente
migliori. Gli aspetti positivi sono i seguenti:
l'industria produce alimenti confezionati secondo standard
definiti
i metodi di analisi sono sofisticati, quindi le frodi più grossolane
vengono facilmente smascherate. Frodi recenti come il vino al
metanolo non sono più possibili
i metodi vengono usati dalle industrie stesse per far fronte al
crescente grado di consapevolezza dei consumatori
il valore nutrizionale degli alimenti è generalmente garantito
c’è particolare attenzione alle qualità edonistiche in senso lato
(origine geografica, genuinità, assenza di contaminazioni)
generalmente le frodi non comportano più l'aggiunta di sostanze
nocive (con notevoli eccezioni...)
Aspetti negativi
l’adulterazione è rivolta ad alimenti di alto valore
commerciale (olio d'oliva, vini, tartufi, ecc.) sui quali il
giro di affari è incredibilmente aumentato
la frode è molto più sofisticata: pensata per frodare
criteri quali l'origine controllata, la presenza di
additivi naturali o artificiali, fino alla presenza di
organismi geneticamente modificati
Legislazione vigente
Nazioni
Argentina
La legislazione vigente differisce a
paese a paese. Si considerino le
differenze relative ai limiti di metalli
tossici nel vino
Australia
Brasile
Canada
Germania
Italia
Malta
Nuova Zelanda
Russia
Sud Africa
Svizzera
USA
As Cd
Hg
0.01
Pb
0.20
0.1 0.05 0.030
0.20
0.1 0.50 0.100
0.1 0.01 0.010
0.20
0.50
0.20
0.25
0.30
0.2
0.20
0.2
0.20
0.2 0.03 0.005 0.30
0.2 0.01 0.050 0.20
0.2 0.01
0.10
0.30
FAO/WHO
0.20
EU
0.20
OIV
0.2 0.01 0.020 0.20
Parametri comuni
Tuttavia, in molti Paesi un alimento viene considerato adulterato se:
contiene materiale vegetale o animale sporco, putrefatto, decomposto o
malato
è infestato da insetti o inadatto al consumo umano
è confezionato o conservato in condizioni non igieniche
contiene ingredienti tossici
è stato sostituito con sostanze inferiori o meno costose
sono stati rimossi alcuni dei suoi costituenti
è imballato con materiali tossici o nocivi
contiene additivi proibiti, o additivi consentiti in quantità superiori ai
limiti prescritti
la sua qualità è inferiore allo standard prestabilito
è di natura o qualità diversi dal dichiarato, o utilizza descrizioni false o
fuorvianti
Aspetti nutrizionali
Dal punto di vista nutrizionale, l’analisi degli alimenti ci dà un’idea
(evidentemente non esaustiva) dei potenziali benefici apportati
dall’assunzione degli alimenti. Per questo motivo sull’etichetta di molti
prodotti sono riportate le determinazioni di parametri quali:
vitamine
sali minerali (sottolineando a volte
la carenza, a volte l’abbondanza)
macromolecole
(proteine, grassi,
carboidrati, ecc.)
principi
nutritivi
non
meglio
identificati (Omega 3, triplo acido
di frutti...)
Aspetti commerciali
Va considerato che, spesso, l’aspetto nutrizionale è sfruttato ad arte a scopi
commerciali, per evidenziare le caratteristiche di un prodotto in maniera non
troppo realistica. Questo perchè l’analisi degli
alimenti ha ormai assunto un’importanza notevole,
vista l’espansione del mercato alimentare,
soprattutto per quei settori dove la ricerca di
valore aggiunto a tutti i costi fa leva su
informazioni scientifiche o pseudo-scientifiche
Parametri analitici studiati
Il numero di sostanze di interesse nel campo agroalimentare è ovviamente
elevatissimo. Soltanto in relazione agli aspetti sanitari, possiamo stimare
in diverse decine di migliaia le specie chimiche classificate come
indesiderate, comprendenti le seguenti classi:
Metalli pesanti (As, Cd, Hg, Pb) e transizione (Cr, Co, Ni, Cu, Zn)
Specie metalliche
composti organometallici (metilmercurio, tetraetilpiombo, ecc.)
ioni metallici a diverso stato di ossidazione, es. Cr(III) e Cr(VI)
Composti inorganici
sali minerali (nitriti, nitrati, fosfati, ecc.)
Composti organici
derivanti da reazioni chimiche (PAH, PCB, BTEX, diossine)
derivanti da attività biologica (aflatossine)
residui di composti impiegati nella produzione (pesticidi, fungicidi)
Quali parametri analitici?
Proprio per l’elevata quantità di sostanze potenzialmente indesiderate,
risulta impossibile poter avere un quadro tossicologico completo di un
alimento. A seguito di ricerche mirate, nel corso degli anni sono stati
sviluppati test analitici che hanno come target un numero ristretto di
composti o elementi tossici, in stretta relazione ai processi produttivi
coinvolti nelle filiere alimentari o ai metodi di stoccaggio e conservazione
delle derrate. I punti critici da tenere sotto controllo possono essere:
La qualità delle materie prime (assenza di composti indesiderati)
I processi di trasformazione delle materie prime (conversione di
sostanze presenti nelle materie prime in composti indesiderati)
L’addizione al prodotto di sostanze aventi funzioni varie (apporto di
composti indesiderati)
I materiali di contenimento (cessione dalla superficie)
Le
condizioni di conservazione (effetto di temperatura, umidità,
esposizione alla luce)
Evoluzione delle conoscenze
Il quadro dei parametri analitici sugli alimenti è necessariamente in
evoluzione, sull’onda emotiva degli eventi (vedi caso Mucca pazza...) o in
risposta a studi tossicologici aggiornati
Se consideriamo i secoli passati, è evidente che la mancanza di nozioni
sufficienti rendevano desiderabile in campo agroalimentare l’impiego di
sostanze che al giorno d’oggi non ci sogneremo di utilizzare
Durante l'ultima metà del XIX secolo, i progressi in chimica organica
resero disponibili una quantità di sostanze sintetiche, la cui utilità venne
provata in vari campi, ad esempio la saccarina ed i coloranti azoici. Allo
stesso tempo, essendo stata accertata l’origine batterica di certe
malattie, furono introdotti vari agenti antimicrobici per la conservazione
delle derrate (ad es. il creosoto, l'acido borico, l'acido salicilico).
Tuttavia, le implicazioni tossicologiche collegate al loro uso emersero solo
gradualmente e con ritardo. Da questo riconoscimento sorsero le prime
regolamentazioni sull'uso degli tali additivi
Progressi delle scienze mediche
I progressi in microbiologia hanno reso possibile la connessione tra agenti
patogeni e malattie, così da evidenziare il rapporto causale tra certe
intossicazioni o malattie
vere e proprie e agenti
patogeni contenuti nei
generi alimentari (ad es.
Salmonella,
botulismo,
micotossine)
Tuttavia le intossicazioni
alimentari sono ancora
possibile a causa di
pratiche fraudolente
Gli scherzi della Natura
Spesso è accaduto che la Natura abbia fatto brutti scherzi, con
conseguenze sanitarie drammatiche. Il caso di Minamata è sintomatico,
dal punto di vista sia del rispetto ambientale, sia del progresso della
conoscenza scientifica
Negli anni ’50, scarichi industriali
nella baia di Minamata (Giappone)
provocarono un grave inquinamento
da mercurio, con circa 10.000
avvelenati per danni al sistema
nervoso centrale. L’avvelenamento fu
causato da composti di Hg presenti
nei pesci e nei molluschi che
costituivano la principale fonte di
proteine per la popolazione della baia
Minamata
Prima di questo incidente era noto soltanto il rischio occupazionale da
esposizione, ma in seguito a Minamata furono focalizzati due aspetti:
Alcuni organismi (tra cui pesci e molluschi) sono in grado di concentrare
specie metalliche nei loro organi, in particolare nei tessuti lipidici
Questi organismi sono in grado di attivare processi biochimici per
limitare la tossicità delle specie assorbite: uno dei meccanismi è la
biometilazione
Hg2+ + CH3· ⇒ CH3Hg+
Prima di Minamata nessuno si sarebbe sognato di cercare composti
organomercurici negli alimenti
Parametri qualitativi
Oltre ai parametri determinati di routine per motivi sanitari, sono poi in
aumento i test che rispondono alla necessità di autenticare gli alimenti o
di qualificarli dal punto di vista della qualità, soprattutto per i prodotti di
maggior pregio. Sempre più spesso i disciplinari di produzione o le
normative prevedono l’impiego di questi test per permettere lo
sfruttamento commerciale di determinate etichette (es. olio
extravergine)
Alcuni tra i parametri analitici determinati a scopo qualitativo sono:
Alcuni elementi (selenio, calcio, ferro, in dosi opportune)
Composti antiossidanti come i polifenoli o i tocoferoli
Vitamine
Molecole con funzionalità particolari (es. resveratrolo nel vino rosso)
Concentrazione ottimale
La semplice indicazione della presenza o assenza delle sostanze non è di
per sè informazioni sufficiente a valutare un alimento dal punto di vista
sanitario. Ad esempio, il comportamento fisiologico dei metalli si può
rappresentare con una curva gaussiana
difetto
ottimale
eccesso
A concentrazioni basse si ha carenza dell’elemento, a concentrazioni
troppo alte si ha eccesso. La concentrazione ottimale corrisponde al
massimo della curva
Concentrazione o speciazione?
Oltre al semplice dato di concentrazione, in certi casi sarebbe più
utile indicare la specie in cui un certo analita si trova, ovvero
effettuare la speciazione dell’analita. Come il citato caso di
Minamata dimostra, la tossicità di un analita, o comunque le sue
potenzialità di interazione con l’organismo, dipendono non solo
dalla sua concentrazione ma anche dalla forma chimica in cui esso
si trova. Nel caso del mercurio si ha una tossicità crescente nella
serie
sali inorganici, es. HgCl , Hg(NO )
2
3 2
composti di organomercurio, es. metilmercurio, dimetilmercurio
vapori di mercurio elementare
Questa esigenza è a volte soddisfatta nei casi semplici,
come nella coppia Cr(III)/Cr(VI) in cui i due stati di
ossidazione del cromo hanno tossicità notevolmente
diversa. Raramente, però, si va oltre. Ad esempio quasi
mai si prende in considerazione la cosiddetta frazione
disponibile di un analita, cioè quella più attiva dal punto
di vista fisiologico in quanto può essere liberata
facilmente da un campione solido ed entrare in
contatto con l’organismo
Ciò è dovuto principalmente al fatto che le analisi di
speciazione sono più complesse e quindi costose
Considerazioni sulle tecniche
La chimica analitica degli alimenti è una disciplina piuttosto complessa, in
quanto il numero di sostanze d’interesse (o analiti) è ovviamente elevato,
comprendendo sia le specie di interesse nutrizionale (vitamine, principi
attivi, carboidrati, micrelementi, ecc.) sia le sostanze indesiderate o
contaminanti (metalli pesanti, pesticidi, fitofarmaci, ammine biogene,
ecc.). Inoltre, le matrici considerate vanno dall’acqua potabile alle carni al
miele, imponendo metodi di trattamento molto diversi da una matrice
all’altra
Per questi motivi, è praticamente impossibile adottare procedure
analitiche comuni per la caratterizzazione di tutti i tipi di alimenti. Ogni
alimento e ogni classe di analiti richiedono una procedura specifica.
Esistono al proposito metodi standardizzati, frutto di anni di ricerche
Tecniche analitiche utilizzate
Le tecniche che si usano correntemente per determinare gli analiti si
possono riassumere nell’elenco seguente:
Tecniche di spettroscopia atomica (GF-AAS, FAAS, ICP-AES, ICP-MS)
per la determinazione elementare
Tecniche
cromatografiche (HPLC, IC, GC) per la separazione e
determinazione di miscele di composti organici ed inorganici
Tecniche spettrofotometriche (UV-visibile, IR) per la determinazione
di parametri analitici o di specie che assorbono nell’intervallo UV-IR
Tecniche
volumetriche (titolazione acido-base, redox) per la
determinazione di parametri vari
Sono saltuariamente utilizzate anche tecniche elettrochimiche
(polarografia, potenziometria) e alcune tecniche di analisi su solido
(Raman, NIR)
Tecniche più sofisticate con la spettroscopia NMR o l’analisi degli isotopi
stabili con spettrometria di massa sono utilizzate per determinazioni di
autenticità
Le tecniche utilizzate saranno richiamate o introdotte volta per volta
Il pretrattamento
L’analisi degli alimenti richiede generalmente uno stadio preliminare che consiste
nel portare il campione (tecnicamente la matrice) nella forma più opportuna ai fini
della determinazione analitica. L’insieme delle procedure richieste per avere
l’analita o gli analiti di interesse in forma determinabile è definito pretrattamento.
Esso è un punto essenziale del metodo analitico, importante quanto la
determinazione quali-quantitativa
La stragrande maggioranza delle analisi in chimica agroalimentare si effettuano
per via umida. Ciò significa che il campione, se non è già liquido, va portato in
soluzione o quantomeno va solubilizzata la parte che contiene l’analita o gli analiti
di interesse. Generalmente, quindi, il pretrattamento coincide o termina con uno
stadio di solubilizzazione. In rari casi è possibile effettuare l’analisi sul campione
tal quale, utilizzando tecniche non distruttive come la spettrometria Raman o la
spettrometria NIR
La varietà delle matrici considerate in chimica agroalimentare fa sì che sia
difficile enunciare regole valide per ogni tipo di alimento. A seconda della natura
chimica dell’alimento (organica o inorganica; acida, basica o neutra; solubile in
solvente acquoso o in solventi organici) e della tecnica analitica utilizzata, sarà
selezionato il metodo di pretrattamento più opportuno
Tipi di pretrattamento
I metodi di pretrattamento più frequentemente utilizzati nell’analisi
agroalimentare sono i seguenti:
Incenerimento
Digestione umida con reattivi
di
solubilizzazione
e/o
ossidazione
In sistemi chiusi
Con microonde
Separazione con membrane
Filtri
Ultrafiltrazione
Dialisi
Estrazione
Con solvente
Con solvente accelerata
(ASE)
Con
un
fluido
supercritico (SFE)
Con fase solida (SPE)
Incenerimento
L’incenerimento (ashing in inglese) consiste nel trattare un campione
solido sottoponendolo a temperature elevate senza fiamma, in modo da
causare la parziale o totale decomposizione delle sostanze organiche
presenti e di parte di quelle inorganiche
Normalmente una temperatura compresa tra 450 e 600°C è sufficiente
per degradare la maggior parte delle molecole organiche a molecole più
semplici o semplicemente a vapore acqueo ed anidride carbonica:
∆
CmHnOn → H2O + CO2
Naturalmente nella scelta della temperatura va tenuto conto della
possibile perdita di analiti, soprattutto per quanto riguarda elementi
volatili come As, Cd, Hg, Pb, Sb, Sn e Zn, sia presenti come elementi puri,
sia come composti. L’applicabilità va quindi verificata analizzando
materiali certificati
L’incenerimento può essere effettuato nei seguenti
modi:
con riscaldamento semplice
con l’ausilio di microonde, se il campione contiene
acqua che può assorbire l’energia, coadiuvando così
l’effetto della temperatura e ottenendo tempi più
brevi di ashing
con l’ausilio di reagenti esterni, es. acido solforico o
perossido di idrogeno in questo caso si parla di wet
ashing
Residuo dell’incenerimento
Il residuo di questo trattamento termico può essere composto da
ossidi e da sali poco volatili (fosfati, cloruri, solfati, silicati di
metalli alcalini e alcalino-terrosi), di colore biancastro. Una
colorazione nera o bruna è indice di un incenerimento parziale, in
cui parte delle sostanze organiche sono rimaste incombuste
Da quanto detto si deduce che questo pretrattamento è adatto
principalmente alla determinazione di parametri inorganici, come il
contenuto di metalli, anioni o il residuo secco
Principio del metodo
Il procedimento consiste nel pesare una quantità nota di campione e porla in un
crogiolo o in un contenitore apposito (ovviamente termoresistente, es. vetro
Pyrex). Il contenitore è poi inserito all’interno di un forno o muffola che viene
sottoposto ad un ciclo di temperatura crescente, in cui la temperatura finale
dipende dagli analiti e deve quindi essere inferiore al punto di ebollizione degli
analiti stessi. Il trattamento in muffola può
essere preceduto da un breve trattamento di
essiccamento a 120-180°C per eliminare
l’acqua ed evitare così reazioni violente di
ebollizione a temperature più alte
Al termine dell’incenerimento si attende il
tempo necessario al raffreddamento e poi si
preleva il contenitore. Se si è interessati
soltanto al residuo secco è sufficiente pesare
il crogiolo prima e dopo l’incenerimento,
mentre se si è interessati a determinare
alcuni analiti è necessario portare in soluzione
il residuo che però solitamente è costituito
da sostanze facilmente solubilizzabili in acqua
o in acidi (nitrico, cloridrico)
Vantaggi e svantaggi
• VANTAGGI
• non richiede l’uso di reagenti
• molto economico
• scarso pericolo di contaminazione
• molto semplice da eseguire
• elevato numero di campioni trattabili simultaneamente (dipende dalle
dimensioni del forno)
• SVANTAGGI
• richiede muffola a temperatura controllata (costo iniziale)
• processo lungo (12-18 ore)
• richiede una certa attenzione per le reazioni che può provocare
• perdite di campione ⇒ perdita di analita
• combustione ⇒ danno al forno
• emissione di vapori
• non adatto per determinazione di composti volatili (es. Cd, Cr, Cu, Fe, Hg,
Ni, P)
• non adatto per la maggior parte dei composti organici
• rischio potenziale di interazione tra i sali e il crogiolo
Digestione umida
Si tratta di una tecnica di pretrattamento molto utilizzata per la
determinazione di specie inorganiche (metalli, anioni), mentre non è
adatta per la determinazione di specie organiche che subiscono
degradazione termica. Il processo di digestione avviene all’interno di un
contenitore nel quale sono introdotti il campione finemente suddiviso e i
reattivi di solubilizzazione, eventualmente coadiuvati da reattivi di
ossidazione. Generalmente sono utilizzati acidi puri o in miscela:
Acido nitrico, esercita azione ossidante a caldo ed è in grado di
rompere i legami glicosidici
Acido solforico, esercita azione ossidante e disidratante
Acido perclorico, esercita azione ossidante
Acqua regia (acido nitrico + cloridrico 1:3), esercita azione ossidante
molto forte
Acqua ossigenata, esercita azione ossidante
Precauzioni nella digestione
Le quantità di reagenti e di campione introdotte devono essere
compatibili con il volume del sistema. Considerando che la maggior parte
delle matrici alimentari contiene sostanze organiche, va considerata la
liberazione di composti gassosi conseguenti alla digestione, che può
provocare sovrapressioni:
(C, H, O) + O2 (acido ossidante) ⇒ H2O + CO2
Il volume dei gas liberati è ovviamente molto maggiore rispetto alla
miscela campione-reagenti di partenza
Il contenuto di carbonio nei cibi è quindi un valore da tener presente nel
progettare un pretrattamento per digestione umida
Applicazioni della digestione
La reazione di digestione può avvenire a temperatura controllata.
Lavorando in sistema chiuso, è possibile raggiungere temperature
superiori a quelle di ebollizione degli acidi a temperatura ambiente, con
aumento delle proprietà solubilizzanti e ossidanti dei reagenti impiegati;
inoltre il sistema chiuso limita le perdite di campione per volatilizzazione
Nel dettaglio delle varie matrici, la digestione umida è particolarmente
efficace per il pretrattamento di alimenti a base di carboidrati (zuccheri,
amidi, cellulosa, ecc.) che sono facilmente mineralizzati con acido nitrico a
180°C; più complessa è la solubilizzazione di matrici contenenti grassi e
proteine, che può richiedere l’addizione di acido perclorico per avere una
dissoluzione completa. In questo caso il trattamento va effettuato con
cautela
Digestione umida con microonde
Una variante più efficace della semplice digestione umida
prevede l’utilizzo di microonde per il riscaldamento del sistema.
L’energia associata alle microonde (600-1500 W nelle
apparecchiature da laboratorio) non è in grado di rompere
direttamente i legami molecolari, ma può essere assorbita da
sostanze come l’acqua e gli acidi minerali, che in questo modo si
scaldano rapidamente e, in un sistema chiuso, sono in grado di
solubilizzare il campione in maniera più efficiente e in tempi
minori
La digestione avviene generalmente in contenitori di materiale
inerte e trasparente alle microonde come il Teflon® o
Politetrafluoroetilene (PTFE) e il Perfluoroalcossifluorocarbonio
(PFA). Il trattamento delle matrici organiche va effettuato con
grande attenzione, visto l’innalzamento rapido di temperatura e
pressione che si ha all’interno dei contenitori. Per evitare che si
inneschino
reazioni
incontrollabili
se
non
esplosive,
generalmente è possibile controllare con dei sensori
temperatura e pressione dei contenitori
Esempi di trattamento con microonde
La maggior parte delle matrici organiche può essere solubilizzata con
acido nitrico concentrato: 2 ml sono sufficienti per la digestione di 100200 mg di campione di tessuti animali come carne e pesce, frutta e
verdura, bevande con alto contenuto di sostanze organiche (the, vino,
birra), latte e derivati. Nei casi più difficoltosi è possibile addizionare
acqua ossigenata, acido perclorico o solforico, ma sono necessarie
particolari precauzioni per evitare reazioni esplosive
Ciò è necessario, ad esempio, per
la solubilizzazione di farine e
prodotti da forno e in generale
per alimenti con alto contenuto di
grassi e proteine
Spesso i sistemi di digestione con
microonde esistenti in commercio
prevedono
la
possibilità
di
trattare contemporaneamente più
campioni, ciascuno nel proprio
contenitore,
e
ciò
abbrevia
notevolmente i tempi di analisi
Estrazione con solvente
Si tratta di una tecnica di pretrattamento molto comune,
utilizzata in tutti i casi in cui non è necessaria o è anzi
controindicata la solubilizzazione totale del campione. Permette di
portare in soluzione selettivamente gli analiti di interesse,
lasciando la matrice quasi intatta. Si effettua in contenitore
chiuso ponendo il campione a contatto con un solvente con esso
immiscibile, nel quale siano però solubili gli analiti. Si può avere:
Estrazione liquido/liquido se sono liquidi sia il campione sia il
solvente estraente
Estrazione liquido/solido se si effettua con un solvente liquida
su un campione solido
Esecuzione dell’estrazione
L’estrazione si effettua ponendo in
agitazione il campione e il solvente in un
imbuto separatore per un tempo
determinato
(A),
attendendo
la
separazione di fase (B) e recuperando la
fase solvente che contiene gli analiti
estratti di interesse (C) secondo una
modalità che dipende dalla sua densità:
prelevandola dal basso se è la fase più
densa, scartando la fase inferiore e
prelevando il residuo se è invece la fase
meno densa
L’ampia gamma di solventi disponibili
permette di effettuare estrazioni molto
selettive. Nell’esecuzione, va considerato
il fatto che si utilizzano quasi sempre
solventi organici e quindi tossici
A
B
C
Estrazione con Soxhlet
Un strumento molto utilizzato nel pretrattamento di campioni agroalimentari
agroalimentari è l’estrattore
Soxhlet,
Soxhlet, che consente di effettuare lunghi cicli di estrazione in modalità
modalità semiautomatica con
buon recuperi.
recuperi. Il campione è posto all’
all’interno di un ditale poroso permeabile al solvente
estraente.
estraente. Attraverso un sistema ciclico di ebollizione,
ebollizione, condensazione e ricaduta,
ricaduta, il solvente è
in grado di agire sul campione più
più volte,
volte,
estraendo gli analiti con maggiore
efficienze rispetto all’
all’estrazione classica
in imbuto separatore
La procedura è automatizzabile in batteria
per poter agire su più
più campioni
contemporaneamente
Modalità di estrazione
Imbuto separatore:
pochi campioni
piccole quantità di campione
oppure…
elevate quantità di solvente
Estrattore di Soxhlet:
numerosi campioni
grosse quantità
batteria di estrattori (Soxhtec)
Estrazione accelerata (ASE)
L’estrazione con solvente tradizionale, pur garantendo ottime prestazioni, presenta
alcuni inconvenienti tra cui i tempi lunghi di trattamento, le elevate quantità di
solvente utilizzato e la scarsa adattabilità all’automazione. Per questo motivo, sono
state sviluppate alcune varianti. Nell’estrazione pressurizzata o accelerata con
solvente (PSE o ASE) si utilizza un solvente in condizioni sub-critiche, nelle quali
l’efficienza di estrazione è molto maggiore. Si lavora in recipiente chiuso,
pressurizzato e termostatato. Ciò consente di ridurre i tempi di estrazione e la
quantità di solvente necessaria; inoltre è
possibile automatizzare il processo
La tecnica ASE è ormai d’uso corrente per il
trattamento di campioni agroalimentari.
Esempi di applicazioni in cui la tecnica è
preliminare all’analisi cromatografica sono:
Estrazione di pesticidi fosforici da frutta
e verdura con acetato di etile
Estrazione di idrocarburi policiclici
aromatici (PAH) da cibi affumicati con
miscela diclorometano/acetonitrile
Estrazione di composti organico-arsenici
da pesce con miscela acqua/metanolo
Estrazione con fluidi supercritici
In questa variante dell’estrazione liquido/solido si utilizza, al posto del solvente, un
fluido supercritico, cioè una sostanza portata al di sopra della pressione e della
temperatura critiche, quindi con un comportamento intermedio tra gas e liquidi: la
diffusione nei solidi è paragonabile a quella dei gas, mentre la capacità di
solubilizzazione è quella dei liquidi; inoltre i fluidi supercritici possono solvatare
molecole grandi non volatili. Queste caratteristiche
rendono i fluidi supercritici estremamente
efficienti nel processo di estrazione, senza
presentare gli inconvenienti dei solventi liquidi dal
punto di vista di prezzo e pericolosità
Il fluido più utilizzato per l’estrazione è la CO2 che
ha caratteristiche di prezzo e inerzia chimica
ottime e valori critici molto bassi: a 40°C e 378
Atm il suo potere solvatante è paragonabile a quello
del benzene
La tecnica SFE è utilizzata già da tempo in campo
agroalimentare per l’estrazione della caffeina dai chicchi di caffè e degli olii
essenziali dai prodotti vegetali. Attualmente le applicazioni sono numerose: la
tecnica (preliminare all’analisi con cromatografia fluida supercritica, SFC) risulta
particolarmente efficiente nell’estrazione di grassi dagli alimenti, ma è impiegata
anche per pesticidi, glucosidi, vitamine, ecc.
Estrazione con fasi solide (SPE)
L’estrazione con fasi solide prevede l’utilizzo di una fase estraente,
appunto, solida, normalmente costituita da una colonnina impaccata con
materiale avente proprietà sorbenti. Si tratta di una tecnica molto
diffusa e utilizzata in tutti campi della chimica analitica, sia per estrarre
selettivamente gli analiti di interesse, sia per purificare i campioni che si
vogliono analizzare (es. precolonne per cromatografia)
La tecnica sfrutta quindi l’affinità di una fase sorbente per alcune
sostanze presenti nel campione, che possono essere sia gli analiti di
interesse sia sostanze interferenti che si desidera eliminare dal
campione. La scelta del materiale sorbente più opportuno rende possibile
modulare la procedura a seconda delle necessità
Passaggi nella SPE
Il procedimento consta delle seguenti fasi:
Attivazione del
materiale
sorbente
Passaggio del
campione sulla
colonnina con
trattenimento
selettivo degli analiti
Lavaggio per
eliminare
specie
indesiderate
Desorbimento
(eluizione)
eluizione) degli
analiti trattenuti con
un opportuno solvente
Se si desidera eliminare gli interferenti anzichè
anzichè trattenere gli analiti,
analiti, è sufficiente usare una
fase solida con affinità
affinità per i composti che si vuole eliminare dal campione
Fasi sorbenti
I meccanismi su cui si basa il trattenimento delle sostanze su fase solida sono tre:
Adsorbimento, dovuto a forze di Van der Waals, legami idrogeno, interazioni
dipolo-dipolo
Ripartizione di un soluto tra due fasi immiscibili
Interazione coulombiana tra cariche di segno opposto
Su questi principi funziona la maggior parte delle fasi solide utilizzate per la SPE,
che sono molto simili a quelle impiegate in cromatografia liquida. A seconda del tipo
di composto che si vuole trattenere (non polare, polare o ionico) si possono
scegliere le seguenti fasi:
Non polari
Polari
A scambio ionico
Silice-C18
Si-CN
SCX, a scambio cationico con gruppi SO3Silice-C8
Silice
a scambio cationico con gruppi chelanti
Silice -fenile Allumina SAX, a scambio anionico con gruppi ammonio
La fase non polare Si-C18 è una delle più utilizzate per l’analisi alimentare come
filtro per la rimozione di interferenti idrofobici, es. composti organici nel vino e
nel mosto
Le fasi a scambio ionico sono utilizzate per il trattenimento di analiti ionici o
ionizzabili come pesticidi, erbicidi, tossine, ecc.
Fasi eluenti
Il desorbimento degli analiti o eluizione è effettuato facendo passare
sulla colonnina un piccolo volume di solvente che recupera le sostanze
trattenute. Il volume dell’eluente può essere ridotto per incrementare la
sensibilità del metodo analitico
Per la scelta dell’eluente è necessario tenere conto del tipo di interazione
stabilito tra la fase solida sorbente e l’analita; l’eluente deve avere
un’interazione con l’analita maggiore di quella che quest’ultimo ha con la
fase sorbente
Eluenti tipici possono essere:
una soluzione acida (HNO , HCl) per eluire ioni metallici da una fase a
3
scambio ionico
un
solvente organico a polarità varia (metanolo, diclorometano,
acetonitrile) per eluire composti organici da una fase Si-C18
Compatibilità con la tecnica analitica
Un parametro importante per scegliere il sistema SPE e in particolare la
fase eluente consiste nella compatibilità con la tecnica analitica. In
particolare, se successivamente al pretrattamento si impiega una tecnica
cromatografica possono esserci dei vincoli:
tolleranza del sistema cromatografico a solventi organici
tolleranza a valori di pH estremi (eluente molto acido o molto basico)
tolleranza a contenuto salino elevato
Ad esempio, se dopo il trattamento SPE è prevista la separazione su una
colonna Si-C18, stabile fino a pH 7, non si potrà evidentemente utilizzare
un sistema SPE che preveda l’uso di un eluente basico
Applicazioni della SPE
Le applicazioni della tecnica SPE in campo agroalimentare sono
numerosissime. Naturalmente i campioni liquidi sono quelli più idonei al
trattamento con SPE preliminare all’analisi vera e propria; nell’analisi di
campioni solidi è necessario uno stadio di solubilizzazione o di estrazione
con solvente. Alcuni esempi di applicazioni sono i seguenti:
Estrazione di composti volatili, acidi grassi ed esteri dal vino: si ottiene
con una fase estraente a fase inversa del tipo Si-C18 o Si-C8
Estrazione di antocianine e polifenoli dal vino: si ottiene con una fase
estraente polimerica a base di polivinilpirrolidone (PVP)
Purificazione di un campione liquido da cloruri: si ottiene con una fase
estraente contenente ioni Ag+, con i quali lo ione Cl- forma AgCl
insolubile
Verifica delle condizioni
Per ottenere un trattenimento efficiente, è sempre opportuno verificare
il campo di applicazione della fase estraente. In particolare il pH del
campione può essere decisivo nel successo di una procedura SPE, in
quanto a seconda del pH molte sostanze possono avere un comportamento
ionico o non ionico, acido o basico, ecc.
Nel caso, ad esempio del trattenimento di acidi carbossilici su fase
inversa Si-C18, esso si può realizzare già a pH debolmente acido, al quale
gli acidi carbossilici sono protonati e quindi hanno un comportamento non
ionico; per valori di pH elevati nel campione, invece, gli acidi potrebbero
essere parzialmente deprotonati e quindi non essere trattenuti su una
fase estraente apolare
Preconcentrazione con SPE
Un impiego importante della SPE consiste nel preconcentrare gli analiti di
interesse preliminarmente all’analisi, cioè nell’incrementare la concentrazione degli
analiti nel campione se questa è troppo bassa per poter essere misurata con gli
strumenti a disposizione
La preconcentrazione si ottiene facendo fluire volumi elevati di campione sulle
colonnine; se l’analita o gli analiti sono completamente trattenuti dalla fase
estraente, è possibile ottenerne il rilascio utilizzando un piccolo volume di eluente.
Se il volume di eluente è inferiore al volume di campione caricato e se il
trattenimento e il rilascio degli analiti sono quantitativi, si avrà un incremento della
concentrazione degli analiti che può essere quantificato in ragione del rapporto
Vc/Ve
con Vc = volume di campione caricato sulla fase estraente
Ve = volume di eluente
Naturalmente l’eluente dovrà essere scelto in modo che sia sufficientemente forte
da desorbire tutto l’analita trattenuto in un piccolo volume
Il sistema fase solida estraente/eluente può essere scelto in modo da ottenere
contemporaneamente la preconcentrazione degli analiti e la rimozione delle
sostanze interferenti
Microestrazione in fase solida
Nella microestrazione in fase solida (SPME) una fibra ricoperta di materiale
sorbente è immersa in un campione liquido, oppure in recipiente chiuso nello spazio
di testa di un campione liquido o solido (1); le sostanze che hanno affinità per la
fase sorbente vengono estratte (2) e possono essere rilasciate per riscaldamento
della fibra (3), cosa che può avvenire nell’iniettore di un gascromatografo (4). Il
carico di sostanze che entrano in colonna è alquanto limitato, in particolare nella
versione che agisce sullo spazio di testa
15.0e6
12.5e6
10.0e6
7500e3
5000e3
2500e3
5
1
2
3
10
15
20
25
30
35
4
40
45
50
55
60
65
In questa figura si vede meglio
l’assemblaggio della sonda SPME.
Il materiale attivo dal punto di
vista della sorzione è limitato
alla fibra interna, che viene
esposta soltanto al momento
opportuno, cioè a contatto con il
campione o con il suo spazio di
testa, per evitare assorbimento
di sostanze volatili dall’aria
Le fasi sorbenti disponibili sono
analoghe a quelle impiegate in
SPE ma principalmente utili per
la determinazione di sostanze
volatili o semivolatili a vario
grado di polarità
Esempio di analisi SPME/GC-MS
L’applicazione tipica del metodo SPME si ha nella caratterizzazione di composti
volatili in accoppiamento alla tecnica GC-MS. Ad esempio nell’analisi del vino esso
permette di determinare un numero elevato di sostanze volatili, importanti per
definirne il quadro aromatico. In un vino sono determinabili 50-100 sostanze aventi
caratteristiche di volatilità, in prevalenza alcoli, terpeni ed esteri (nella figura
estratto SPME da un Nebbiolo)
Separazione con membrane
Nelle determinazione di parametri inorganici nel latte (anioni, cationi)
mediante cromatografia, il campione non può essere iniettato
direttamente in colonna sia a causa del suo elevato contenuto salino, sia
soprattutto a causa dei colloidi dispersi presenti in grande quantità, che
intaserebbero la fase stazionaria. In casi come questo, in cui cioè il
campione non sia omogeneo, è spesso consigliabile o necessario procedere
alla separazione delle fasi che compongono il campione, in particolare
quelle non in soluzione che potrebbero creare problemi al sistema di
misura
La separazione può essere effettuata in diversi modi:
• precipitando le fasi interferenti e poi filtrando la soluzione restante
• utilizzando filtri in base al peso molecolare (ultrafiltrazione)
• sfruttando la dialisi
La dialisi
Il pretrattamento con dialisi sfrutta la migrazione di sostanze a basso peso
molecolare attraverso una membrana di materiale polimerico (es. acetato di
cellulosa), impermeabile al passaggio di particelle grandi (> 0.2 µm), fino a
raggiungere l’equilibrio tra il campione e una soluzione accettore
I pazienti che soffrono di insufficienza renale cronica utilizzano questo metodo. A
causa di questa disfunzione, nel loro sangue i composti ionici a basso peso
molecolare si accumulano a concentrazioni troppo elevate, alterando l’equilibrio
elettrolitico e le funzioni metaboliche collegate. La concentrazione di questi ioni va
quindi ridotta ad intervalli regolari attraverso la dialisi: una soluzione accettore a
bassissima forza ionica – usualmente acqua
ultrapura – è fatta scorrere lungo una
membana semipermeabile, mentre il sangue
del paziente scorre dall’altro lato della
membrana. Gli ioni diffondono dalla soluzione
a maggiore forza ionica, il sangue, alla
soluzione a minore forza ionica, la quale è
rinnovata in continuo per fare in modo che
l’equilibrio non sia mai raggiunto e la
migrazione dal sangue sia continua, fino ad
ottenerne la purificazione
Dialisi per il latte
Il pretrattamento di campioni di latte a scopo analitico ha l’obiettivo
opposto: la soluzione accettore è a contatto con la membrana in condizioni
statiche, in modo che si raggiunga l’equilibrio al quale gli ioni sono
totalmente migrati nella soluzione accettore, la quale può essere
utilizzata per la determinazione degli analiti ionici in quanto non contiene
le sostanze interferenti
Il metodo di dialisi può essere automatizzato all’interno di un
cromatografo ionico. Il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio di
dialisi è di circa 10 minuti, dopo il quale
il campione (cioè la soluzione accettore)
è iniettato in colonna; mentre l’eluizione
è in corso è possibile preparare un
nuovo campione con la dialisi
Sulla soluzione trattata con dialisi è
possibile determinare tutte le specie
ioniche a basso peso molecolare, come
anioni, cationi e oligosaccaridi