REGIONE PIEMONTE
Torino, 16 Settembre 2011
Innovazioni metodologiche e tecnologiche
per accertare l’esposizione cronica e acuta
a farmaci, alcol e droghe
Marco Vincenti
Sostanze Stupefacenti
Abuso Alcolico
Codice della strada:
DL 285 del 30.04.92 Art. 187
DL 117 del 03.08.07 Art. 5 – 6
Codice della strada:
DL 285 del 30.04.92 Art. 186
L 125 del 30.03.2001 Art. 6
DL 117 del 03.08.07 Art. 5 – 6
Abuso e trattamento:
L 685 del 22.12.1975
L 162 del 26.06.1990
DPR 309 del 09.10.1990
Mondo del lavoro:
S/R Parere del 13.11.2003
S/R Provv. del 30.10.2007
S/R Provv. del 18.09.2008
DL 81 del 09.04.2008
Abuso e trattamento:
L 125 del 30.03.2001 Art. 6
Mondo del lavoro:
DPR 19.03.1956
L 125 del 30.03.2001 Art. 6
S/R Parere del 13.11.2003
S/R Provv. del 16.03.2006
DL 81 del 09.04.2008
1
Analisi chimica di campioni biologici
Identificazione - Accertamento di positività
Violazione di Legge
Sanzione
Accertamento Diagnostico vs. Test Tossicologico
Matrice
Finalità
Analisi Chimico-Cliniche
Test Tossicologico
La matrice più adatta
Urina - Sangue - Saliva - Capelli
Test diagnostici
Evidenza di prova
dell’analisi
Certificato/ Identificazione e quantificazione di
Rapporto
markers
di analisi
Profili multiparametrici di funzionalità
Casi
dubbi
Identificazione e quantificazione
di specifiche sostanze
Trattati come negativi fino a
Trattati come positivi - approfondimento riscontro contrario: analisi di
conferma?
2
Quali violazioni della libertà individuale ?
Principi inderogabili
Principi derogabili solo in circostanze eccezionali
(perquisizioni, intercettazioni, limitazioni)
Principi derogabili per giusta causa
(autisti, carrellisti: vantaggi superano svantaggi)
→ efficienza come “necessità”
→ limitazioni di libertà e privacy “accettabili”
Principi derogabili su base routinaria
(automobilisti: etilometro, campioni di saliva)
ACCERTAMENTI SU STRADA
Abuso alcolico: Etilometro
Eventuale conferma:
Alcolemia
con GC-FID o GC-MS
3
ETANOLEMIA PER GC-MS SPAZIO DI TESTA
Etanolo nel sangue
4
Che succede dopo? Le 3 “S”!
- Sanzioni pecuniarie
- Sequestro del veicolo
- Sospensione della patente
- Sospensione dalla mansione
Come si ritorna in possesso
della patente di guida o
si ritorna idonei alla mansione?
PANNELLO
Generalmente
AST – GOT (aspartate
aminotransferase)
variano con
ALT – GPT (alanine transaminase)
l’abuso di alcol
γ – GT (γ-glutamyl transpeptidase)
MA
ALP (alkaline phosphatase)
MCV (mean red-cellsono
volume)
influenzati
da molti fattori
Trigliceridi
indipendenti dal
Colesterolo
consumo di alcol
CDT (carbohydrate deficient transferrin)
ETG (ethyl glucuronide in hair)
INADEGUATI RISPETTO A SENSIBILITÀ, SPECIFICITÀ,
ETGPREDITTIVO
(ethyl glucuronide in hair)
VALORE
5
I BIO-MARCATORI DI “NUOVA GENERAZIONE”
PRODOTTI DEL
Etil Glucuronato (ETG)
METABOLISMO
Etil Solfato (ETS)
NON OSSIDATIVO
DELL’ETANOLO
sono metaboliti diretti dell’alcol
elevata
SENSIBILITÀ
SPECIFICITÀ
CARATTERISTICHE
relativamente stabile
non volatile
ETG
OTTIME
QUALITÀ
DIAGNOSTICHE
FINESTRA DI RIVELABILITÀ
sangue : 10 – 20 ore
urina: fino ad 80 ore
capello: alcuni mesi
solubile in acqua
lunga emivita
VALORE
PREDITTIVO
sensibilità
presente in tutti i fluidi
e tessuti biologici
specificità
DETERMINAZIONE NELLE 3 MATRICI
SANGUE, URINA, CAPELLO:
valutazione della “storia” dell’esposizione all’etanolo
chiusura del “gap” tra marcatori a breve e a lungo termine
6
SVILUPPO DEL METODO HPLC – MS/MS (ETG ED ETS)
CAPELLO:
1°
decontaminazione
2°
estrazione
STANDARD INTERNO ETG-D5 500 ppb
3°
incubazione
4°
concentrazione
Triplo quadrupolo
SISTEMA HPLC – MS/MS
ESI
Colonna C18
ANALISI DEL CAPELLO
7
EtG nel capello
CAD + ASL TO4 +
ASL TO2
Studio sperimentale
su 175 soggetti
8
PCA
6 VARIABILI
175 PAZIENTI
La concentrazione dell’ETG nel capello può essere usata come
marcatore di conferma per stabilire l’assunzione cronica di alcol?
E la CDT?
9
PCA
5 VARIABILI
(Senza ETG)
Che si osserva ?
SOSTANZE STUPEFACENTI
sempre nuove sfide
Nuove sostanze
Molteplici analiti
Eliminazione metabolica
Contesti differenti
10
SOSTANZE STUPEFACENTI
sempre nuove sfide
Nuove sostanze
Molteplici analiti
Eliminazione metabolica
Contesti differenti
CANNABINOIDI SINTETICI
THC
JWH-018
JWH-122
O
N
CBD
JWH-073
CH 3
JWH-250
O
O
N
CH 3
CBN
CP 47,497
CP 47,497 C8
HU-210
Quale sarà la prossima generazione?
11
analytical chemistry
Quantitative Measurement of JWH-018 and JWH-073 Metabolites
Excreted in Human Urine
Cindy L. Moran,† Vi-Huyen Le,‡ Krishna C. Chimalakonda,§ Amy L. Smedley,† Felisia D. Lackey,†
Suzanne N. Owen,‡ Paul D. Kennedy,|| Gregory W. Endres,|| Fred L. Ciske,|| James B. Kramer,||
Andrei M. Kornilov,|| L. D. Bratton,|| Paul J. Dobrowolski,|| William D. Wessinger,§ W. E. Fantegrossi,§
Paul L. Prather,§ Laura P. James,§,^ Anna Radominska-Pandya,X and Jeffery H. Moran*,‡,§
PRIMA OSSERVAZIONE:
ALLE SFIDE
NON CI SI PUO’
PRESENTARE
DISARMATI
12
Le procedure di controllo
negli anni ’90 e 2000
Screening
Conferma
Metodi
Immunoenzimatici
Metodi cromatografici e
spettrometrici di massa
Un metodo per ogni
classe di sostanze
Identificazione e
quantificazione di una
specifica sostanza
all’interno della classe
VINCOLI
INFORMAZIONE APPROSSIMATIVA
APPROCCIO
TRADIZIONALE
(due fasi)
Screening
GC-MS
HPLC-MS/MS
(tradizionali)
Conferma
Nuovi Metodi
Multiresiduo
LC-MS/MS
13
LIMITI dei metodi multiresiduo con strumenti
non aggornati
Elettronica di controllo degli MS lenta
Tempi di analisi troppo lunghi
Sensibilità e/o risoluzione MS insufficienti
Separazione cromatografica inefficiente
UPLC
O
UHPLC
NUOVI TRIPLI QUADRUPOLI
O NUOVI SPETTROMETRI
PER ALTA RISOLUZIONE
Diminuzione del
diametro delle
particelle della fase
stazionaria HPLC
minore volume morto
maggiore attrito
Minore tempo di transito
Minore diffusione
Minore resistenza al
trasferimento di massa
⇐ perdita di carico ⇒
MAGGIORE RISOLUZIONE
MAGGIORE SENSIBILITA’
14
UPLC
o
UHPLC
15
BREVE TEMPO DI ANALISI - MAGGIORE SENSIBILITA’
AMPIEZZA DEI PICCHI: 3-5 SECONDI. PROBLEMI ?
SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA DI MISCELE COMPLESSE
UPLC: ora disponibile da
diversi produttori
MS: fast-SRM - strumenti
QqQ & TOF
CONSEGUENZE:
Screening Multi-Residuo &
Analisi di Conferma
Alta produttività analitica
Rapida validazione metodi
Aumentato n° di controlli
A confirmatory method for the simultaneous extraction,
separation, identification and quantification of Tetracycline,
Sulphonamide, Trimethoprim and Dapsone residues in
muscle by UPLC-MS/MS according to Commission Decision
2002/657/EC
M. McDonald, C. Mannion, P. Rafter
J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 8110-8116.
16
Full Scan MS in Comprehensive Qualitative and Quantitative Residue Analysis
in Food and Feed Matrices: How Much Resolving Power is Required?
M. Kellmann, H. Muenster, P. Zomer, H. Molb
J. Am. Soc. Mass Spectrom., 20 (2009) 1464
Next figure: Extracted ion chromatograms of 151 compounds in animal feed matrix
at a concentration of 50 ppb (resolving power: 100,000)
CANNABINOIDI SINTETICI
THC
JWH-018
JWH-122
O
N
CBD
JWH-073
CH 3
JWH-250
O
O
N
CH 3
CBN
CP 47,497
CP 47,497 C8
HU-210
LA NOSTRA PRIMA RISPOSTA
17
CANNABINOIDI SINTETICI
LA NOSTRA PRIMA RISPOSTA
La strategia: ANALISI MULTI-RESIDUALE
Lo strumento: UHPLC-MS/MS
La matrice: CAPELLO
La coorte: POSITIVI ALLA CANNABIS
L’approccio: VALIDAZIONE DEL METODO
RISULTATI: 15 POSITIVI SU 93
ACCERTAMENTI SU STRADA
Sostanze Stupefacenti: ???
Prelievo campioni biologici:
Urina: dove? dimostra?
Sangue: dove? consenso?
18
EFFICACIA: CONTROLLI PIU’ MIRATI
PER ALCOL E DROGHE D’ABUSO
- Per periodo di latenza e persistenza
dall’assunzione
minuti fino a poche ore
(sangue, saliva)
ore fino a pochi giorni (urina)
molti giorni - mesi (capelli e peli)
- Per luogo di campionamento
in struttura sanitaria (sangue, urina)
in strada (saliva, sudore)
Il fluido orale
L’acqua è il componente
principale
È un ultra-filtrato del
plasma
Le sostanze psicoattive
passano dal sangue alla
saliva per diffusione
passiva
La finestra temporale si
estende da pochi min a
24 ore dall’assunzione
19
Vantaggi
Svantaggi
La positività dimostra
un’assunzione recente di
sostanze psicoattive
Raccolta di piccoli volumi
di campione
Correlazione con concentrazioni
plasmatiche e con lo stato di
alterazione psico-fisico
Bassi valori di cut-off
Instabilità della matrice
Prelievo a “vista” non invasivo
Inaccuratezza nella
valutazione volumetrica
Prelievo effettuabile anche dagli
agenti di Polizia stradale
Contaminazione del cavo
orale (fumo passivo, ecc.)
Procedura sperimentale
Accertamento
sanitario
CAMPER (C.R.I.) anziché il
Pronto Soccorso di A.O.
20
I fase
effettuata dagli Agenti di Polizia
Identificazione personale e controllo dei documenti di guida
Effettuazione della prova con l’etilometro
Prelievo di fluido orale e analisi tossicologica di screening
con test on-site
In caso di positività…
il soggetto controllato si
trasferisce nel camper.
Consenso/rifiuto a procedere agli accertamenti
II fase
Valutazione anamnestico-clinica
Raccolta dei campioni biologici
da sottoporre alle analisi di
conferma
21
Sigillatura dei contenitori che raccolgono i fluidi biologici
I sigilli evidenziano qualunque tentativo di violazione
Compilazione della catena di custodia
22
III fase: Analisi di conferma
SALIVA_TMS_SIM
SALIVA_AMPS_SIM
Morfina
Codeina
Eroina
6-MAM
∆9-THC
Cocaina
Amfetamina
Metamfetamina
MDA
MDMA
MDEA
MBDB
Ketamina
Metadone
Cromatogramma
23
Come si ritorna in possesso
della patente di guida?
DETERMINAZIONE DI ABUSO CRONICO DI
SOSTANZE STUPEFACENTI
TUTTE LE SOSTANZE STUPEFACENTI
POSSONO ESSERE RICERCATE NEL
CAPELLO
ANALISI SEGMENTARIA
Sostanze ricercate comunemente nei capelli
PANNELLO BASE:
cannabinoidi, oppiacei, cocaina, metadone, amfetamine
NUOVE DETERMINAZIONI:
cannabinoidi sintetici
benzodiazepine, ketamina, buprenorfina, altri farmaci
24
Applicazioni più comuni
• Morti correlate all’uso dei farmaci e/o sostanze
d’abuso (overdose, concausa di decesso)
• Valutazione di inidoneità alla guida
• Affidamento, custodia minori
• Esposizione prenatale a farmaci e sostanze
d’abuso
CAMPIONE REALE
XIC of +MRM (46 pairs): 286.300/165.200 amu MORFINA from Sample 50
0.92
5355
4000
200
0.70
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
XIC of +MRM (46 pairs): 300.300/165.000 amu CODEINA from Sample 50
1.47
6671
5000
4.0
Time, min
4.5
4.0
Time, min
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Time, min
XIC of +MRM (46 pairs): 290.200/168.100 amu BENZOILECGONINA from Sample 50
2.06
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
XIC of +MRM (46 pairs): 328.300/165.200 amu 6-MAM from Sample 50
1.69
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
7.5
8.0
7.5
8.0
.
4.8e4
4.0e4
2.0e4
2.8e5
2.0e5
1.0e5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
.
4.0
Time, min
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
4.0
Time, min
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
4.0
Time, min
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
XIC of +MRM (46 pairs): 304.200/182.300 amu COCAINA from Sample 50
2.53
1.9e6
1.5e6
1.0e6
5.0e5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
XIC of +MRM (46 pairs): 310.300/265.300 amu METADONE from Sample 50
3.59
1.8e6
1.5e6
1.0e6
5.0e5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
.
25
Reati di violenza sessuale
Legislazione in Italia
L’articolo 609-bis punisce la violenza sessuale
con la reclusione da 5 a 10 anni.
Pene aggiuntive per:
L’utilizzo di armi , sostanze alcoliche,
narcotiche o stupefacenti
Violenza su persone con limitazione della libertà
personale
Da persona travisata o che simuli la qualità di pubblico
ufficiale o incaricato di pubblico servizio
Violenza su minori di 14 anni
“RAPE DRUGS”
Effetti delle droghe da stupro:
Sonnolenza e diminuzione dell’attenzione
Sedazione
Sottomissione e annullamento della volontà
Amnesia anterograda
Altre caratteristiche:
Facilmente reperibili
Facilmente somministrabili
26
Assunzione singola
• “Droghe da stupro”:
benzodiazepine, ipnotici, sedativi,
ketamina e GHB
• L’importanza dell’analisi segmentale
Sono state prese in
esame 22 differenti
BENZODIAZEPINE
ZOLPIDEM
Struttura base delle benzodiazepine
27
Nitrazepam-D5
(STD interno)
Totale campioni analizzati
Positività
26
4
Clonazepam
(urina)
Bromazepam
(capelli)
Delorazepam
(capelli)
Bromazepam
(sangue)
28
Case report
Lunghezza: 16 cm
0-6 cm: 6 segmenti di 1 cm (A
F)
6-16 cm: 5 segmenti di 2 cm (G
M)
Lunghezza: 27 cm
0-10 cm: 1 segmento di 10 cm (A)
10-20 cm: 11 segmenti di 1 cm (B
M)
20-27 cm: 1 segmento di 7 cm (N)
Lunghezza: 18 cm
0-18 cm: 9 segmenti di 2 cm (A
I)
Lunghezza: 5 cm
0-5 cm: 2 segmenti di 2.5 cm (A
B)
Risultati
• Segmento
• Finestra diagnostica
• (Crescita stimata dei capelli:
1 cm/mese)
• Lunghezza
(cm)
• Risultato (pg/mg)
•A
•Ottobre 2009-Novembre 2009
1
∆9-THC (24)
•B
•Settembre 2009-Ottobre 2009
1
∆9-THC (24)
•C
•Agosto 2009-Setttembre 2009
1
•D
•Luglio 2009-Agosto 2009
1
∆9-THC (56)
•E
•Giugno 2009-Luglio 2009
1
∆9-THC (47)
F
•Maggio 2009-Giugno 2009
1
G
•Marzo 2009-Maggio 2009
H
•Gennaio 2009-Marzo 2009
2
2
2
I
•Novembre 2008-Gennaio 2009
L
•Seytembre 2008-Novembre 2008
2
M
•Luglio 2008-Settembre 2008
2
Zolpidem
(2.8 )
∆9-THC (50)
Zolpidem
(1.6)
Zolpidem
(0.9)
∆9-THC
(166)
29
Analisi segmentale
A
B
cm 1
Nov
2009
C
2
Oct
2009
E
4
F
5
G
6
ZOLPIDEM
2.8 pg/mg
1.6 pg/mg
0.9 pg/mg
Aug
2009
A
Jul
2009
B
Jun
2009
C
May
2009
D
E
H
I
8
ZOLPIDEM
Sep
2009
D
3
ZOLPIDEM
Mar
G
H
I
L
M
12
Jan
2009
THC
2009
24-166 pg/mg
F
L
10
M
14
Nov
2008
Sep
2008
N
cm 10
16
Jul
2008
O
20
Nov
2009
27
Aug
2007
Negative
A
B
cm 2
C
4
Nov
2009
D
6
E
8
F
10
H
I
14
16
ZOLPIDEM
ALPRAZOLAM
FLURAZEPAM
ZOLPIDEM
ALPRAZOLAM
ZOLPIDEM
250-511 pg/mg
G
12
1
8
May
2008
ZOLPIDEM
ALPRAZOLAM
FLURAZEPAM
BROMAZEPAM
pg/mg
Uso terapeutico
M
8
9
8
8
8
09
09
09
09
09
-0 ul-0 p-0 v-0 n-0
ar- ay- Jul- Sep- ovay
J
Ja
Se
M
N
No
M
*Extimated average hair growth: 1
cm/month
Nov
200
9
A
B
cm 2
C
4
ZOLPIDEM
250-511 pg/mg
D
6
E
8
F
10
ZOLPIDEM
ALPRAZOLA
M
G
12
ZOLPIDEM
ALPRAZOLA
M
FLURAZEPA
M
H
14
I
16
ZOLPIDEM
ALPRAZOLAM
FLURAZEPAM
BROMAZEPA
M
18
May
200
8
30
Uso occasionale
A
Nov
200
9
B
cm 1
C
2
D
3
E
4
ZOLPIDE
M
2.8 pg/mg
Oct
200
9
Sep
200
9
Aug
200
9
F
5
G
6
ZOLPIDE
M
1.6 pg/mg
Jul
200
9
Jun
200
9
May
200
9
H
8
I
10
L
12
M
14
16
ZOLPIDE
M
0.9 pg/mg
Mar
200
9
Jan
200
9
Nov
200
8
Sep
200
8
Jul
200
8
Singola esposizione a Zolpidem in
almeno due occasioni:
Mar-Giu 2009 e Ago-Set 2009
Questioni interpretative
• Concentrazioni delle sostanze trovate
• Ricerca di metaboliti per escludere
interferenti o contaminazioni esterne
• Contaminazioni “interne”
31
Deterioramento del capello
Deterioramento del capello
32
ANALISI TOSSICOLOGICHE POST-MORTEM
Aloperidolo
Amitriptilina
Citalopram
Clomipramina
Clorpromazina
Clotiapina
Clozapina
Flufenazina
Fluoxetina
Fluvoxamina
Levomepromazina
Mirtazapina
Olanzapina
Paroxetina
Perfenazina
Periciazina
Pipamperone
Promazina
Prometazina
Quetiapina
Reboxetina
Risperidone
Sertralina
Tiapride
Tioridazina
Tramadolo
Trazodone
Venlafaxina
Antidepressivo
Antidepressivo
Neurolettico
Neurolettico
Antidepressivo
Antidepressivo
Neurolettico
Range plasmatici terapeutici (ng/ml)
Aloperidolo Clomipramina
1 - 33
175 - 400
Flufenazina Mirtazapina
0,5 - 2
20 - 200
Perfenazina Trazodone
0,6 - 25
650 - 1500
Approccio generico applicato a sangue cadaverico
HPLC-MS/MS
GC-MS
{
{
Aloperidolo,
Aloperidolo, Flufenazina,
Flufenazina, Fluoxetina,
Fluoxetina,
Fluvoxamina,
Fluvoxamina, Paroxetina,
Paroxetina, Perfenazina,
Perfenazina,
Periciazina,
Periciazina, Pipamperone,
Pipamperone, Quetiapina,
Quetiapina,
Risperidone,
Risperidone, Trazodone
Amitriptilina,
Amitriptilina, Citalopram,
Citalopram, Clomipramina,
Clomipramina,
Clorpromazina,
Clorpromazina, Clotiapina,
Clotiapina, Clozapina,
Clozapina,
Levomepromazina,
Levomepromazina, Mirtazapina,
Mirtazapina, Olanzapina,
Olanzapina,
Promazina,
Promazina, Prometazina,
Prometazina, Reboxetina,
Reboxetina,
Sertralina,
Sertralina, Tiapride,
Tiapride, Tioridazina,
Tioridazina, Tramadolo,
Tramadolo,
Venlafaxina
33
Metodo HPLC-MS/MS
•
ANALISI IN MODALITÀ “SRM”
FLUVOXAMINA
Tempo di
ritenzione
12,82
min.
Ione
precursore
m/z 319,2
Ioni
prodotto
m/z
m/z 319,2 → 71,1
m/z 319,2 → 87,0
71,1
87,0
200,2
m/z 319,2 → 200,2
Metodo HPLC-MS/MS
•
Linearità risposta strumentale (1-100 ng/ml)
•
Linearità matrice ematica (1-100 ng/ml)
(no quetiapina e trazodone)
R2 > 0,98
- Deviazione standard e CV %
- Accuratezza
- LOD
=
1 ng/ml
- LOQ
=
5 ng/ml
}
Rilevabilità a
concentrazioni
terapeutiche
34
CASO REALE
•
Sesso femminile, situazione sociale disagiata
•
Problemi psichiatrici
•
Terapia con olanzapina (neurolettico), paroxetina
(antidepressivo), alprazolam (benzodiazepina) e ramipril
(antipertensivo)
•
Rinvenuta cadavere nel bagno di casa
•
Stato cadavere: avanzata putrefazione
•
Esame autoptico: morte traumatica
M-L: escludibili concausalità?
Indagini generiche protocollari ematiche
Olanzapina e metaboliti
Paroxetina
(metodo GC-MS)
(metodo HPLC-MS/MS)
m/z 242,4
m/z 331,2 → 193,3
m/z 331,2 → 70,0
Conferma:
Olanzapina sangue: 96 ng/mL
Metaboliti di olanzapina sangue: positivo
Paroxetina sangue: 53 ng/mL
VALORI EMATICI NELL’INTERVALLO TERAPEUTICO
35
GRAZIE !
36