6RPPDULR
,QWURGX]LRQH/RVSHWWURGLPDVVDGHOPHWDQROR BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB
&RQFHWWLIRQGDPHQWDOLGLVWUXPHQWD]LRQH BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB
Strumentazione di base _________________________________________________10
La sorgente ___________________________________________________________11
Interazione elettronica: EI (HOHFWURQLRQLVDWLRQLPSDFW) _____________________11
Ionizzazione chimica: CI (FKHPLFDOLRQLVDWLRQ)_____________________________13
Ionizzazione di campo: FI (ILHOGLRQLVDWLRQ) _______________________________17
Desassorbimento di campo: FD (ILHOGGHVRUSWLRQ) __________________________18
Ionizzazione chimica per desassorbimento: DCI (GHVRUSWLRQFKHPLFDOLRQLVDWLRQ) _19
Ionizzazione con atomi veloci: FAB (IDVWDWRPERPEDUGPHQW) ________________20
L’analizzatore _________________________________________________________23
Sistemi a deflessione magnetica_________________________________________23
Analizzatori a tempo di volo ___________________________________________27
Analizzatori quadrupolari _____________________________________________28
Trappola ionica______________________________________________________33
Rivelatori ____________________________________________________________34
Sistema di introduzione _________________________________________________37
Sistema da vuoto ______________________________________________________40
/
DFFRSSLDPHQWRFRQOHWHFQLFKHFURPDWRJUDILFKH BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB
I problemi tecnici che sorgono nell’accoppiare i due strumenti GC e MS: __________42
Le informazioni ottenibili da uno spettrometro di massa come rivelatore di un
gascromatografo possono essere distinte in due categorie: ______________________48
/DFRUUHQWHLRQLFDWRWDOH7,& WRWDOLRQFXUUHQW _________________________48
/DULYHOD]LRQHVHOHWWLYDGLLRQL6,0R6,'VHOHFWHGLRQPRQLWRULQJRGHWHFWLRQ __48
/
HVSORUD]LRQHULSHWXWDGLPDVVHVHOH]LRQDWH_______________________________51
,OFURPDWRJUDPPDULFRVWUXLWRGDOFDOFRODWRUHRFRUUHQWHLRQLFDULFRVWUXLWD ______52
,OFURPDWRJUDPPDGLPDVVD0& PDVVFKURPDWRJUDP ___________________53
&URPDWRJUDPPLULVROWLRULVROX]LRQHGHLSLFFKLJDVFURPDWRJUDILFLSHUIRUQLUHVSHWWUL
SXOLWL ___________________________________________________________54
VSHWWULGLPDVVDSXOLWL ____________________________________________54
SLFFKLJDVFURPDWRJUDILFLULVROWL ______________________________________55
Sviluppo di una analisi mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC/MS)
"gasmassa" ___________________________________________________________57
Linee essenziali della GC/MS qualitativa. ___________________________________58
Linee essenziali della GC/MS quantitativa __________________________________60
La scelta dello standard interno e tecnica di diluizione isotopica. _______________62
La scelta degli ioni da selezionare _______________________________________64
Processi di formazione del derivato ______________________________________65
Analisi quantitativa __________________________________________________66
1
/&06O
DEELQDPHQWRFURPDWRJUDILDOLTXLGDHVSHWWURPHWULDGLPDVVDBBBBBBBBBB
L’interfaccia __________________________________________________________69
Introduzione diretta di liquidi (DLI= direct liquid introduction) __________________69
Trasporto meccanico "nastro trasportatore" (MB=moving belt) __________________70
Formazione di aerosol (PB particle beam)___________________________________72
Flusso continuo in bombardamento con atomi veloci (CF-FAB o f-FAB continuous flow
fast atom bombardment) ________________________________________________72
Termonebulizzazione (TSP=thermospray) __________________________________74
Elettronebulizzazione (ES electrospray) ____________________________________76
Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)__________________________79
/
DFFRSSLDPHQWRHOHWWURIRUHVLFDSLOODUHVSHWWURPHWULDGLPDVVD&=(06 BBBBBBBB
2
Università degli Studi di Pavia
Corso di laurea in Chimica
Appunti del corso di Metodi fisici
in chimica organica.
Spettrometria di massa
Appunti e copie riservate alla circolazione interna per uso didattico
Giorgio Mellerio
Centro Grandi Strumenti
Laboratorio di Spettrometria di massa
3
Nunc age, quo motu genitalia materiai
corpora res varias gignant genitasque resolvant,
et qua vi facere id cogantur, quaeque sit ollis
reddita mobilitas magnum per inane meandi,
expediam: tu te dictis praebere memento.
Su pertanto! qual moto sospinga i vivaci primordi
della materia a tutte formare le cose,
e formate a dissolverle poi, da qual causa ciò faccian
costretti, qual vorticosa corsa li lanci pel vuoto
infinito, ti insegnerò: tu porgi attento al mio dire
l'orecchio.
T. Lucreti Cari de rerum natura II, 62 - 66
4
Introduzione. Lo spettro di massa del metanolo
E' comune uso trattare assieme le tecniche spettroscopiche, così assieme a
spettroscopia ultravioletta (UV), infrarossa (IR) e di risonanza magnetica nucleare
(NMR) viene illustrata la spettrometria di massa (MS); essa però è fondamentalmente
diversa dalle precedenti.
Queste infatti trattano della interazione della radiazione elettromagnetica con le
molecole, cioè sono misure "fisiche": le molecole dei composti investigati sono
eccitate dalla radiazione elettromagnetica, a seconda dei gruppi funzionali presenti
nelle molecole investigate sono assorbite soltanto radiazioni di energia ben definita;
la "misura" avviene su queste energie, dopo il composto può essere recuperato
immutato. In spettrometria di massa le molecole sono pure eccitate ma per mezzo di
elettroni. Se un elettrone "passa attraverso" una molecola, la sua energia viene
trasferita, la molecola viene ionizzata e spesso anche eccitata in modo tale da
rompersi in frammenti. Quindi il composto originale non può essere recuperato
intatto: la spettrometria di massa è tecnica affine all'analisi elementare, è una tecnica
distruttiva. E' una vera e propria reazione tra la molecola gassosa e gli elettroni per
dare dei prodotti (di decomposizione) che devono essere separati e rivelati. La logica
che ispira la spettrometria di massa nella determinazione della struttura di una
sostanza incognita è simile a quella usata un tempo in chimica organica: degradare
con reazioni note le molecole incognite fino ad arrivare a molecole sufficientemente
piccole da poter esser facilmente identificate anche per confronto con sostanze già
note.
Altra differenza rispetto alle altre "spettroscopie" è che la qualità ed addirittura il tipo
di informazioni ottenibili dipendono essenzialmente della strumentazione usata.
L'urto con gli elettroni ionizza la molecola, il movimento degli ioni così formati
(atomici e molecolari) attraverso campi magnetici e/o elettrici fa in modo che detti
ioni si separino in funzione del loro rapporto massa su carica (m/z).
Il dato che si ottiene è uno "spettro di massa" cioè un diagramma delle quantità
relative degli ioni (prodotti dalla sorgente e "contati" dal rivelatore) in funzione del
rapporto m/z (misurato dall’analizzatore).
La traccia ottenuta dal registratore è lo spettro di massa, un grafico delle particelle
rivelate in funzione del rapporto m/z.
Gli ioni oggetto della forma più comune di spettrometria di massa sono ioni positivi
ottenuti per rimozione di un elettrone. Lo ione ottenuto per semplice rimozione di un
elettrone dalla molecola è detto ione molecolare.
L'energia richiesta per rimuovere un elettrone da un atomo o da una molecola è il
suo potenziale di ionizzazione (P.I.). I composti organici hanno un potenziale di
-1
ionizzazione compreso fra gli 8 e i 15 eV (1eV equivale a 96,487 kJ mole che equivale
-1
a 23,06 kcal mole ). Però il raggio di elettroni non ha quella efficienza necessaria ad
ottenere spettri riproducibili fino a quando non raggiunge un potenziale tra 50 e 70
eV.
Questo raggio è così potente da rompere alcuni legami nella molecola producendo
così una serie di frammenti molecolari. Questi frammenti hanno una carica positiva
e vengono accelerati, separati, e registrati con valori corrispondenti alle loro
rispettive masse. Ioni frammento sono originati anche quando la molecola, perdendo
5
un elettrone, si trova in una situazione così instabile che si disintegra prima di essere
accelerata (tempo di vita minore di 10-6 sec.).
6
m/z
12
13
14
15
15,5
16
17
18
19
20
26
27
28
29
30
31
32
33
intensità relativa
1,11
2,6
5,6
26,47
0,2
0,96
2,35
2,61
0,26
0,01
0,02
0,21
10,6
78,93
10,45
100
79,49
1,76
31
100
D
Y
L
W
D
O
H
U
j
W
L
V
Q
H
W
Q
L
32
29
80
60
40
15
20
28
30
14
12
13
15,5
16
17
18
15,5
16
17
18
19
20
26
27
20
26
27
33
0
12
13
14
15
19
28
29
30
31
32
33
P]
Figura 1: spettro del metanolo
Lo ione formato nella camera di ionizzazione in maggiore abbondanza dà il picco più
elevato nello spettro di massa. Questo picco viene chiamato picco base. Le
abbondanze relative di tutti gli altri picchi nello spettro vengono riportate come
percentuali dell'abbondanza del picco base, lo spettro così ottenuto viene detto
normalizzato.
Lo spettro di massa mostra la massa della molecola e le masse dei pezzi della
molecola. E' importante ricordare che il valore di un qualsiasi ione accelerato nello
spettrometro di massa è la sua vera massa e non il suo peso molecolare ottenuto
usando i pesi atomici chimici. La scala chimica dei pesi atomici è basata sulla media
pesata dei pesi di tutti gli isotopi di un dato elemento. Naturalmente lo spettrometro
è in grado di distinguere tra le masse delle particelle. Di conseguenza le masse
osservate per lo ione molecolare sono le masse delle molecole in cui ciascun atomo è
presente con il suo isotopo più comune ed i segnali sono sempre accompagnati da
ioni isotopici.
Per lo meno nel suo asse delle x (scala m/z) lo spettro di massa è di facile
comprensione; prendiamo ad es. lo spettro del metanolo (Figura 1):
CH3OH+eCH3OH+.
CH2OH+
→CH3OH+. +2e→CH2OH+ +H.
→CH3+ +OH.
→CHO+ + H2
m/z
m/z
m/z
m/z
32
31
15
29
IONE MOLECOLARE
Lo ione m/z 31 è particolarmente stabile, la sua struttura può sopportare due cariche:
m 31
= 15,5 , è uno ione con doppia carica m++.
z 2
Si noti nei grafici la necessità di un esteso intervallo dinamico di registrazione.
Amplificando ulteriormente il segnale inoltre si potrebbe registrare su carta
fotosensibile un picco allargato, detto "metastabile", attorno ai valori di massa 26,8÷
27,3; l'origine di questo segnale è data dal processo seguente.
7
La rottura da m/z 31 a m/z 29 implica la perdita di una molecola di idrogeno, si
rompono due legami e se ne forma uno, un atomo di idrogeno migra per potersi
legare all'altro, è un processo di trasposizione. Questo processo è più "lento" della
rottura semplice e può avvenire non solo in sorgente ma anche durante il volo dalla
sorgente al rivelatore di uno spettrometro di massa basato su analizzatore a campo
29 2
magnetico. Quindi nel nostro caso m*=
= 27 ,129 . Il segnale che si origina dalla
31
rottura durante il volo è detto metastabile e la sua massa apparente è data dal valore
P2
P* = 2 per il processo P1+ → P2+ + neutro.
P1
Le reazioni di frammentazione in spettrometria di massa possono essere
razionalizzate con successo o persino predette partendo dall'assunzione che la
reazione è iniziata o dal sito radicalico (rottura α) o dal sito che porta la carica
(rottura i) (McLafferty 1966). Secondo questo concetto l'inizio della reazione al sito
radicalico scaturisce dalla forte tendenza all'appaiamento degli elettroni: l'elettrone
spaiato è donato per formare un nuovo legame verso un atomo adiacente ed il
processo è accompagnato dalla rottura del legame α
.+
H-CH2-OH
+
CH2=OH+H.
(m/z 31)
In alternativa l'inizio di una reazione di frammentazione da parte della carica implica
l'attrazione di un doppietto di elettroni e comporta la rottura del legame adiacente al
sito portante la carica (l'eteroatomo di solito) accompagnata dalla migrazione della
carica
+.
CH3-OH
+
.
CH3 +OH
(m/z 15)
L'inizio da parte del sito radicalico (rottura α) è il meccanismo più importante ed è
stato spesso riportato come "concetto della localizzazione della carica" (Budzikiewicz
1967). Per spiegare i processi di frammentazione preferiti adotteremo quindi il
formalismo illustrato precedentemente. Nello ione molecolare si assume che i siti di
localizzazione della carica e dell'elettrone spaiato si originino dalla perdita
dell'elettrone con la minor energia di ionizzazione, in analogia con le transizioni
elettroniche per gli spettri UV, la ionizzazione avverrà nell'ordine per gli elettroni n,
π, σ. La rottura di un solo legame in uno ione molecolare (ione ad elettroni dispari
ED=OE in inglese) produce una specie ad elettroni pari (EP =EE in inglese) ed un
radicale neutro. La rottura di due legami in uno ione molecolare (ED) produce uno
ione ad elettroni dispari (ED) tra i prodotti. Il processo di spostamento di un
elettrone, omolisi, verrà indicato con una freccia "ad amo", mentre frecce normali
indicheranno il processo di spostamento di una coppia di elettroni, eterolisi.
Riassumendo avremo ioni: molecolari, isotopici, frammento dovuti a rotture
semplici, frammento dovuti a trasposizioni, metastabili. Questi ioni ottenuti alle
normali pressioni di uno spettrometro (~ 10-6 mbar) sono formati in processi
monomolecolari; come conseguenza la loro abbondanza è direttamente
8
proporzionale alla pressione nella camera di ionizzazione. In sorgente può avvenire
però che uno ione (esempio molecolare) collida con una molecola neutra, cioè si
abbia una reazione ione-molecola, a seguito di questo fenomeno si formano specie a
massa più alta del peso molecolare con abbondanza relativa dipendente dal quadrato
della pressione. Ovviamente questo fenomeno è di solito sgradito e si opera in modo
da evitarlo, però la tecnica della ionizzazione chimica si basa appunto su questo
processo.
9
Concetti fondamentali di strumentazione
Strumentazione di base
Nella sua forma più semplice (Figura 2) lo spettrometro di massa attua tre funzioni
essenziali:
1.
le molecole sono soggette ad un bombardamento da parte di un flusso
di elettroni ad alta energia che converte alcune di esse in ioni,
"strappando" un elettrone; questi ioni sono accelerati in un campo
elettrico;
2.
gli ioni accelerati sono separati a seconda del loro rapporto massa su
carica in un campo magnetico o elettrico;
3.
gli ioni con un particolare rapporto massa su carica sono rivelati da un
sistema che è capace di contare il numero di ioni che lo colpiscono.
L'uscita del rivelatore è amplificata ed alimenta un registratore.
Figura 2: schema di uno spettrometro di massa (a settore magnetico)
10
La sorgente
La necessaria trasformazione del campione neutro in ioni avviene nella cosiddetta
sorgente ionica, essa è pregiudiziale per i risultati finali essendo ovvio che questi
ultimi dipendano da come il campione originale venga ionizzato. Se lo spettrometro
di massa può essere considerato un laboratorio analitico per particelle cariche, è
attraente per un chimico pensare alla sorgente ionica come a un reattore chimico,
perché in qualche modo un mutamento chimico avviene nel campione quando
diviene un gas ionizzato, prima di entrare nell'analizzatore. Ciascuna sorgente ionica
è una differente specie di recipiente per reazione chimica e deve essere scelta
appropriatamente rispetto al campione ed alle operazioni che vorremmo fare. Criteri
generali ispiratori potranno essere, con diverso peso a seconda dei casi: sensibilità,
riproducibilità, informazioni specifiche strutturali, soluzioni tecniche soddisfacenti.
Una classificazione "pratica" è tra metodi di ionizzazione comuni e metodi di
ionizzazione più sperimentali. La interazione elettronica è la tecnica più usata.
Interazione elettronica: EI (electron ionisation - impact)
Principi di funzionamento
Elettroni di appropriata energia possono dar origine, interagendo con una molecola
organica allo stato gassoso, a due processi: estrazione di uno o più elettroni (1 e 2) e
assunzione di un elettrone nella molecola (3: cattura di risonanza, 4: attacco
dissociativo, 5: produzione di coppie ioniche).
1.
2.
3.
4.
1.
potenziali esemplificativi in eV
10
AB + e- → AB.+ + 2eAB + e- → ABn+ + (n+1)eAB + e- → ABAB + e- → A. + BAB + e- → A+ + B- + e-
2
3
9
condotto dal sistema di introduzione
alloggiamento della sorgente
molecole del campione allo stato vapore
filamento
anodo - raccoglitore di elettroni
piastre di focalizazione
degli ioni
all’analizzatore di masse
raggio di elettroni
camera di
ionizzazione
piastra di accelerazione
al sistema
di pompaggio
Figura 3: schema di sorgente ad interazione elettronica
11
AB.+ sono ioni precursore, un tempo detti padre o genitore (indicati con M+.), ABn+
sono ioni a carica multipla e AB- e B- sono ioni negativi. In condizioni normali il
rapporto tra ioni positivi e negativi è 104 : 1 (dipende dalla energia degli elettroni).
Per comodità ignoreremo d'ora in poi gli ioni negativi.
Il processo 1. è causato dal passaggio di un elettrone entro circa 1/2 Å da uno degli
elettroni della molecola. Un elettrone ionizzante dotato di energia 50 eV si calcola
abbia una velocità di 4 . 108 cm/sec, il tempo impiegato da quell'elettrone per
"attraversare" una molecola di 10Å è circa 2.10-16 sec. Questo tempo è molto più
breve del periodo vibrazionale molecolare (1.10-14 sec) di conseguenza i nuclei
atomici potranno essere considerati "fermi" durante il processo di ionizzazione
(distanza nucleare invariata, principio di Frank e Condon) ed i successivi
riassestamenti elettronici in cui la carica positiva viene ripartita tra tutti i legami
saranno così rapidi che l'indebolimento dei legami è simultaneo. Questo avviene se
l'elettrone ionizzante porta energia appena superiore al potenziale di ionizzazione
della molecola.
Se invece l'elettrone ionizzate porta energia che eccede il P.I. lo ione molecolare
dovrà ridistribuire anche questo eccesso e lo farà tra i suoi vari modi vibrazionali
tramite una serie di transizioni "buie" tra i vari stati elettronici. Lo ione padre, con i
legami indeboliti e vibrazionalmente eccitati, si trova quindi in condizione di
frammentarsi non appena l'energia assimilata supera quella del legame più debole.
Un progressivo aumento dell'energia degli elettroni bombardanti provocherà un
corrispondente aumento dell'eccitazione vibrazionale di tutti i diversi legami che
potranno scindersi uno dopo l'altro via via che verrà raggiunta l'energia necessaria.
Si può quindi pensare allo ione padre come un sistema isolato con un grande ma
definito numero di gradi di libertà, ogni reazione di decomposizione avrà quindi una
propria costante di velocità.
1. Entrata del campione
2. Raggio di elettroni diretto
perpendicolarmente al piano
3. Elettrodi di accelerazione e
focalizzazione (ad es. ad un potenziale
di 2kV)
4. Elettrodo repulsore “repeller” (ad
esempio ad un potenziale +2V)
5. Raggio di ioni
6. Analizzatore
7. Sorgente ionica (il blocco ad es. è
posto a 0V)
Sistema da vuoto (conduttanza 30-100
l/s)
Figura 4: schema di sorgente “chiusa” (conduttanza 0,3-2 l/s) da McFadden, ridis.
12
Aumentando l’energia degli elettroni lo spettro si arricchirà di segnali di ioni dovuti
alle frammentazioni, con elettroni attorno al 70 eV vengono prodotti parecchi ioni in
quantità differenti, aumentando ulteriormente l'energia degli elettroni l'aspetto
qualitativo dello spettro rimane invariato e quello quantitativo cambia di pochissimo;
si comprende quindi l'uso standard di questo valore.
Campioni: qualsiasi campione volatile
Costruzione della sorgente
Gli elettroni sono prodotti per emissione termoionica di un filamento di W o Rh
riscaldato (∼2000 °C) elettricamente e sono accelerati per mezzo di una caduta di
potenziale (anodo) (ddp 70V ⇒ 70 eV di energia); inoltre sono presenti elettrodi per
accelerare gli ioni positivi, fenditure collimanti, altri elettrodi per la risoluzione
ottimale (vedi figure 3 e 4).
Limitazioni
- 70 eV sono un metodo estremamente drastico per creare ioni molecolari, come
risultato una notevole quantità di eccitazione (elettronica e vibrazionale) è
posseduta dallo ione molecolare; esso pertanto è in molti casi condannato alla
distruzione (cioè non si vede!).
- il processo richiede che il campione sia allo stato di vapore esiste quindi un
contributo di energia termica alla frammentazione.
Ionizzazione chimica: CI (chemical ionisation)
Principi di funzionamento
Un gas di reazione è introdotto nella sorgente a EI ad elevata pressione (60-199 Pa).
La ionizzazione primaria avviene nella maniera solita (EI), gli ioni formati reagiscono
con le molecole neutre del gas. Le risultanti reazioni ione-molecola producono ioni
secondari che sono specie chimiche caratterizzate da una propria reattività ed un
proprio comportamento come acidi o basi di Lewis. Questi prodotti sono i reagenti
che possono reagire con il campione, gassoso, introdotto come piccolissima
impurezza. Gli spettri dei campioni rappresentano i prodotti della reazione chimica
delle molecole neutre del campione con gli ioni provenienti dalle reazioni ionemolecola del gas. Il più comune tipo di reazione è il trasferimento di idrogeno
("reazione acido-base").
Per il metano da reazioni ione-molecola si hanno i seguenti prodotti:
CH5+(48%),
C2H5+(41%)
C3H5+(6%)
questo mazzo di ioni ("il plasma") reagisce con la molecola M da investigare:
M + CH5+ → MH+ + CH4
M+1
+
+
M + C2H5
→ [M + C2H5]
M + 29
+
+
M + C3H5
→ [M + C3H5]
M + 41
+
M + C2H5+ → [M - H] + C2H6 M - 1
(nel caso di idrocarburi)
13
Abbiamo cioè delle reazioni "acido-base", l'affinità protonica della base coniugata
sarà una misura della forza del gas reagente
hard
soft
CH4
H2O
CH3OH
isoC4H10
NH2
126
169
182
193
201
Kcal/mole
"
"
"
"
14
CH5+
H3O+
CH3OH2+
t-C4H9+
NH4+
Figura 5: spettri della terpina registrati in interazione elettronica (EI) e in
ionizzazione chimica (CI) con diversi gas reagenti
15
Dall’esame degli spettri registrati con diversi reagenti si arriva alla conclusione che,
oltre all’informazione sul peso molecolare, si possono anche ottenere informazioni
sulla frammentazione, mediante una oculata scelta del gas reagente (figura 5).
Campioni
Sono gli stessi esaminabili con la sorgente EI.
Costruzione della sorgente
La sorgente è la stessa dell'EI, un po' più chiusa per ottenere una maggior pressione,
richiede una maggiore potenza del sistema da vuoto nella zona circostante per
evitare aumenti di pressione nel resto del sistema (vedi figura 6).
Limiti
Le condizioni di elevata pressione possono portare a scariche; la natura dei gas
reagenti può far sorgere problemi tecnici (gli idrocarburi sporcano, NH3 dà reazione
con argento e rame, H2O è difficile da eliminare, etc.); il campione deve essere allo
stato gassoso.
Questa volta si hanno i pesi molecolari ma le informazioni sulla struttura, o meglio
gli ioni frammento, sono più difficili da interpretare.
Sonda per
Camera
l’introduzione diretta
di ionizzazione
Sistema
di focalizzazione
Entrata
del gas reagente
All’analizzatore
Al sistema di
Collegamento con il GC
pompaggio
(può essere rientrante)
in mancanza “tappo”
Figura 6: Schema di una sorgente CI; i valori tipici di una sorgente CI sono:
pressione in camera: 40-133 Pa
energia elettroni emessi: 150-200 eV
corrente: 250-350 µA
tempo di soggiorno degli ioni in sorgente: ∼10-100 µs (EI: 1µs)
libero cammino medio : 2x10-4 mm (EI: 200mm)
16
Ionizzazione di campo: FI (field ionisation)
Principi di funzionamento
La ionizzazione di campo avviene quando un atomo o molecola è sottoposto ad un
campo elettrico dell'ordine di 108 V/cm. La rimozione di un elettrone da una
molecola tramite un elevato campo elettrico è basata sull'effetto "tunnel" quanto
meccanico, (si può pensare ad una deformazione della curva di potenziale che
caratterizza lo stato) ne consegue uno ione positivo con piccolissima energia interna
nella forma di eccitazione elettronica o vibrazionale; esso viene di solito rivelato
come ione molecolare stabile.
Campioni
Sono eguali all'EI
Costruzione della sorgente
Fattore critico e differenziante questa sorgente dalla EI è il disegno ed il materiale
dell'elemento ionizzante. Questo consiste in una punta metallica aguzza o affilata
come anodo mentre catodo è la fenditura di uscita della camera di ionizzazione. Un
potenziale di 5-20 kV è applicato tra questi elementi molto ravvicinati (mm) (vedi
figura 7).
Limiti
Costruttivi: facilità di scariche, fragilità dell'elemento ionizzante; sensibilità di
almeno un ordine di grandezza inferiore all'EI e dipendente dal tipo di composto.
Anche in questa tecnica la sostanza deve essere allo stato gassoso.
Primo elettrodo (estrattore)
Condotto di introduzione
del campione
Elettrodo focalizzatore
Elettrodo accelerante
“Blocco”
(scatola della sorgente)
Fenditura di sorgente
Elettrodo repulsore
per il funzionamento in EI
Raggio ionico
all’analizzatore
di masse
Porta
elettrodo
emittente
Potenziale
di accelerazione
Posizione EI FI
Potenziale di focalizzazione (+)
Figura 7: schema di sorgente a ionizzazione di campo utilizzabile anche per
ionizzazione elettronica
17
Desassorbimento di campo: FD (field desorption)
Principi
Sono gli stessi della FI ma la ionizzazione avviene allo stato solido; il campione è
adsorbito su un filo di tungsteno emittente opportunamente attivato ed introdotto
per mezzo di una sonda portacampione nella sorgente ionica. Con questo metodo
possono essere registrati spettri di composti non volatili o molto polari (sali). Molto
spesso si trova l'attacco di un H+ (M+1) o di un catione alcalino (+23 per Na + 39 per
K)
Campioni
Indicata per solidi non volatili e/o polari.
Costruzione della sorgente
Come FI, la cura è posta nell'elettrodo emittente che deve essere opportunamente
attivato facendo "crescere" su di esso ciuffi di carbonio "arborescenti" (vedi figura 8).
E' un'operazione che richiede degli specialisti.
Limiti
Fluttuazione della corrente (per cui è utile solo in analisi qualitativa); fragilità
dell'emettitore.
3mm
5mm
Figura 8
Particolare di porta elettrodo emittente
per desassorbimento di campo (FD), la
freccia mostra il filo di tungsteno (10 µm)
con gli aghi carboniosi.
18
Ionizzazione chimica per desassorbimento: DCI (desorption chemical ionisation)
Principi
Tecnica di compromesso tra la CI e la FD, la DCI è una delle tecniche "in raggio"
introdotte per limitare al massimo i processi di trasformazione del campione prima
della ionizzazione. Il campione disciolto in soluzione viene depositato su di un
elettrodo emittente simile a quello usato per FD; dopo aver lasciato evaporare il
solvente, l'elettrodo, tramite una sonda, viene introdotto nel bel mezzo del plasma
formato allo stesso modo della CI. Riscaldando rapidamente l'elettrodo emittente si
ottengono spettri in alcuni aspetti paragonabili a quelli ottenuti con la tecnica del
desassorbimento di campo. Ciò perché il rapido riscaldamento permette alla
temperatura di raggiungere un valore dove la vaporizzazione è favorita rispetto alla
decomposizione della molecola. Si pensa che la DCI (detta anche direct chemical
ionisation) non sia in realtà una ionizzazione "diversa" ma soltanto un metodo rapido
di vaporizzazione (Figura 9). Un gas reagente "morbido" fornisce di solito migliori
risultati.
Campioni
Solidi non volatili e/o polari.
Costruzione della sorgente
Sorgente CI convenzionale; la sonda per introdurre i campioni deve essere
modificata rispetto a quella convenzionale (vedi figura 9).
Limiti
Le condizioni sperimentali hanno effetti pesantissimi (posizione della sonda, stato
della superficie emittente) e gli spettri sono fortemente dipendenti anche dal tempo.
VRQGDFRQYHQ]LRQDOH
³VROLGVSUREH´
e
VRQGD³HVWHVD´
³GLUHFWH[SRVXUHSUREH´
-
e
-
sorgente per EI o CI
molecole neutre
vaporizzate e
prodotti di decomposizione
molecole di campione
in fase solida
Figura 9: tipi di sonda, convenzionale ed “estesa” o “in raggio”
19
Ionizzazione con atomi veloci: FAB (fast atom bombardment)
La ionizzazione ha preso origine come tecnica dalla spettrometria di massa a ioni
secondari (SIMS secondary ion mass spectrometry) in cui le molecole di campione,
trattenute su una superficie, sono urtate da ioni con elevata energia traslazionale.
Nella tecnica FAB un raggio di particelle neutre con elevata energia è diretto in modo
da urtare una pellicola di campione stesa su un supporto metallico pulito. L'urto
produce un intenso e repentino aumento termico la cui energia viene dissipata
attraverso gli strati più esterni della superficie del campione. Originariamente
venivano usati atomi neutri di gas argon o xenon; in seguito l'impiego di un raggio
primario di ioni cesio (Cs+) ha aumentato la sensibilità.
L'analisi degli ioni secondari emessi quando una superficie viene bombardata con un
raggio ionico (primario) energetico è un metodo da tempo utilizzato nell'esame degli
strati superficiali di materiali inorganici come metalli, leghe, semiconduttori ... I
danni che possono essere provocati da un simile bombardamento su molecole
organiche costringono all'uso di raggi primari a bassissima intensità con conseguente
scarsa sensibilità della tecnica. E' il metodo che assicura il rinnovarsi della superficie
l'idea vincente del FAB, permettendo l'impiego di intensi raggi primari costituiti sia
da atomi neutri (FAB, fast atom bombardment) sia da ioni (FIB oppure LSIMS, liquid
SIMS). La matrice liquida usata, rinnova in continuo lo strato superficiale della
molecola in contatto diretto con il raggio bombardante, prolunga così il periodo della
produzione degli ioni, riduce il grado di distruzione del campione ed aiuta la
stabilizzazione dello ione. Come risultato finale si hanno raggi di ioni secondari con
intensità sufficiente per strumenti a scansione, come ad esempio a settore magnetico,
e una loro produzione prolungata anche per venti minuti. L'energia impartita agli
ioni molecolari, di solito protonati, deprotonati o in addotti con la matrice, è spesso
sufficiente per dare origine a rotture di legami e produrre così ioni frammento;
l'estensione del fenomeno però varia con il tipo di composti. La teoria che spiega la
produzione di ioni in FAB non è stata ancora ben chiarita; la prima idea che si
trattasse di desassorbimento di ioni pre-formati in soluzione (della matrice) è
chiaramente una semplificazione anche se gli ioni pre-formati sono desorbiti di
preferenza. I meccanismi di protonazione o di rimozione di un idrogeno possono
avvenire all'interno della matrice oppure in un denso strato gassoso immediatamente
sopra la superficie (selvedge) con reazioni ione-molecola come nella ionizzazione
chimica. La cascata di collisioni che ha origine dall'impatto dell'atomo veloce causa
abbondanti ionizzazioni nella matrice.
ioni primari
ioni secondari
raggio ionico “energetico”
ioni di superficie “divelti”
superficie del campione
trasferimento di energia
Figura 10: processi SIMS
20
raggio di atomi veloci
θ angolo di incidenza
soluzione dell’analita in glicerina
superficie della sonda
Figura 11: visione pittorica del bombardamento con atomi veloci sulla superficie
della soluzione (dispersione) di glicerina con produzione di ioni positivi e negativi
dell’analita come pure di specie neutre (N) e ioni di glicerina (G)
Figura 12: principi della sorgente con atomi veloci (FAB)
21
Campioni
I vantaggi sopra descritti, tra cui la produzione di abbondanti ioni molecolari, sono
sufficienti per fare della tecnica FAB un metodo standard per analisi di campioni
polari o labili, in particolare di quelli ad elevato peso molecolare, soprattutto perché
non esiste la necessità di vaporizzare il campione.
Costruzione della sorgente
Un gas nobile, Ar° oppure meglio Xe°, viene usato come sorgente di atomi
bombardanti. Un raggio di ioni Xe+, dotati di elevata energia traslazionale (2-10
keV), viene prodotto mediante collisione con elettroni in una sorgente a scarica o a
campo a sella, e poi neutralizzato in una densa nube di atomi dello stesso gas xenon
per scambio di carica, cattura di elettroni, in modo da produrre un raggio di atomi
veloci. Questo insieme viene detto cannone atomico (atom gun). Il raggio di atomi
veloci passa nella regione della sorgente ionica (la solita dello spettrometro) per
andare a colpire il campione disciolto in una matrice liquida su una piccola superficie
metallica "bersaglio" montata su una sonda estraibile che può essere quella
normalmente usata per i campioni solidi dopo opportune modifiche. L'angolo di
incidenza del raggio primario sulla superficie del campione e l'allineamento del
bersaglio rispetto alla fenditura di sorgente sono messe a punto necessarie per
rendere massima la sensibilità rispetto agli ioni secondari che devono raggiungere
l'analizzatore.
Limiti
Sebbene il particolare pregio del FAB/LSIMS sia la sua abilità di produrre ioni
molecolari (o "quasi") da molecole molto grandi, questa tecnica di ionizzazione non è
una tecnica morbida (soft) con il desassorbimento di campo (FD). La natura della
matrice è di fondamentale importanza per la ionizzazione FAB. Innanzitutto il
campione deve essere solubile nella matrice; di solito però glicerina e tioglicerina
sono adatte per la maggior parte dei casi, l'importanza della vischiosità e scarsa
volatilità della matrice può essere facilmente intuita; altri materiali o additivi
possono fornire dei vantaggi. Le migliori condizioni di analisi per un particolare
composto sono il frutto di prove sperimentali e non c'è un procedimento universale.
Altri svantaggi dati dalla matrice sono l'elevato livello di rumore di fondo "chimico"
che fornisce ioni ad ogni valore di massa ed inoltre la presenza di intensi ioni addotto
tra molecole di matrice e campione e tra molecole della matrice stessa. Ciò porta ad
una sensibilità molto più bassa rispetto alla ionizzazione per interazione elettronica o
alla ionizzazione chimica oltre a complicazioni nell'interpretazione dello spettro.
Campioni in miscela danno origine a spettri FAB mischiati; effetti di competizione
sulla superficie della matrice possono però portare a ionizzazioni preferenziali di un
singolo composto a prescindere dalla sua concentrazione in miscela.
22
L’analizzatore
Successivamente gli ioni prodotti devono essere messi in movimento o meglio
"lanciati" mediante piastre metalliche poste ad un potenziale negativo variabile (5008000V) detto potenziale di accelerazione ed introdotti in un analizzatore che ha il
compito di separarli. Si ricordi che il potenziale del campo elettrico di accelerazione,
il cosiddetto potenziale di accelerazione, ha una notevole importanza in quanto il suo
valore determina l’energia cinetica degli ioni: esso varia a seconda del tipo di
analizzatore usato, passando ad esempio da poche decine di Volt per un analizzatore
quadrupolare a diversi kV per un analizzatore magnetico. La zona di accelerazione fa
parte del blocco della sorgente.
Esistono vari tipi di analizzatore, possono essere suddivisi in due categorie
fondamentali:
1. analizzatori di quantità di moto, sistemi cioè in grado di separare ioni aventi
valori diversi del prodotto mv. Sono tutti gli strumenti a deflessione magnetica
"B" compresi quelli dotati di un settore elettrostatico "E" (storicamente
analizzatori "statici")
2. analizzatori dinamici, sistemi nei quali la separazione degli ioni è basata sulla
stretta dipendenza dal tempo di uno o più parametri del sistema analizzatore.
Sotto gruppi:
a. a tempo di volo (TOF = time of flight)
b. a stabilità di percorso (quadrupolari) "Q"
c. a bilanciamento di energia (ICR = ion cyclotron resonance)
Sistemi a deflessione magnetica
Esaminiamo i principi fisici, detti (Figura 13):
m la massa di uno ione
z la carica posseduta dallo ione
V il potenziale di accelerazione
v la velocità acquistata dallo ione dopo l'accelerazione
dovuta all'azione del potenziale V
B il valore del campo magnetico
r il raggio di curvatura della traiettoria dello ione, dovuto all'azione del campo
magnetico B
Possiamo scrivere l'equazione dovuta all'energia cinetica
1
2
(1)
zV = mv
2
ed al fatto che il campo magnetico costringe lo ione a muoversi in un cammino
circolare: la forza esercitata dal campo deve essere eguale alla forza centrifuga
zvB =
mv 2
r
(2)
combinando si ottiene
m B2r 2
=
z
2V
23
(3)
che rappresenta analiticamente la proprietà di uno spettrometro con analizzatore
magnetico di separare ioni di diverso rapporto m/z in funzione di B o di V.
Mantenendo costanti B e V, tutte le specie ioniche aventi lo stesso valore m/z
andranno ad impressionare lo stesso punto di una lastra fotografica situata sul piano
focale (vedi figura 13); lo spettro apparirà costituito da righe, immagini della
fenditura usata per definire il raggio (dato che ha una certa apertura a ventaglio).
Effettuando una modulazione da zero ad un valore prefissato di B o di V
("scansione") risulta quindi possibile focalizzare attraverso una fenditura "in uscita"
dal campo tutte le specie ioniche generate nella sorgente, separate ed ordinate in
funzione del loro rapporto m/z. Se ricaviamo dalla (2)
r=
mv
Bz
(2bis)
avremo una relazione che esprime analiticamente il fenomeno fisico per cui tutti gli
ioni entranti nel campo magnetico ed aventi la stessa carica e la stessa quantità di
moto seguono una traiettoria circolare con eguale raggio di curvatura r,
indipendentemente dalla loro massa, mentre ioni con differente quantità di moto
seguono traiettorie con differenti raggi di curvatura. Questo tipo di analizzatore, a
voler esser precisi, produce uno spettro delle mv degli ioni che si identifica con lo
spettro di massa m solo quando tutti gli ioni entrano in B con identica energia,
quando cioè ad ogni specie ionica è associata una ben definita velocità.
Il settore magnetico soddisfa quindi a due funzioni:
I. focalizza gli ioni aventi stessa massa, stessa velocità e piccole differenze di angolo
di incidenza
II. separa gli ioni costituenti il fascio secondo il rapporto m/z
Riguardo a tale separazione viene definito un parametro detto risoluzione: abilità
dello spettrometro di separare ioni di differenti valori di m/z. Detti ioni di massa
m1>m2 la risoluzione ℜ
ℜ=
m1
m
= 1
m 1 + m 2 ∆m
24
FDPSRPDJQHWLFR
SRWHQ]LDOHGL
DFFHOHUD]LRQH
IHQGLWXUDFROOHWWULFH
VRUJHQWH
IHQGLWXUD
GLVRUJHQWH
ULYHODWRUH
Figura 13: settore magnetico (B)
SLDVWUHGHOVHWWRUHHOHWWURVWDWLFR(6$
SRVL]LRQHGHOOD
IHQGLWXUDGL
GHILQL]LRQHGHOOHHQHUJLH
IHQGLWXUDGL
GHILQL]LRQHGHOUDJJLR
VRUJHQWH
VSHWWURGLHQHUJLH
Figura 14: settore elettrostatico (E)
SRVL]LRQHGHOOD
IHQGLWXUDGL
GHILQL]LRQHGHOOHHQHUJLH
VHWWRUHPDJQHWLFR
VHWWRUHHOHWWURVWDWLFR
(6$
SXQWRGLGRSSLD
IRFDOL]]D]LRQH
VRUJHQWH
Figura 15: strumento a doppio fuoco (EB)
25
La risoluzione in uno spettrometro è funzione di parecchi fattori, tra di essi la scarsa
monocromaticità del raggio, cioè il fatto che non tutti gli ioni di stesso m/z hanno
stessa energia cinetica.
Per ovviare a tale problema si pone un filtro energetico (Figura 14) costituito da un
campo elettrostatico E direzionato perpendicolarmente a B ; avremo dall'espressione
della forza centripeta, ove R = raggio di traiettoria
zE =
mv 2
R
(4)
questa combinata con la (1)
R=
2V
E
(5)
per E costante si avrà una focalizzazione di tutti gli ioni con eguale energia cinetica.
Gli strumenti ad analizzatore elettrostatico e magnetico combinati vengono detti a
doppio fuoco (Figura 15). Esistono diverse disposizioni e geometrie degli strumenti a
doppio fuoco.
Ricordiamo le storiche geometrie di Mattauch – Herzog e di Nier – Johnson nelle due
forme diretta (elettrostatico – magnetico: EB) e inversa (magnetico – elettrostatico:
BE)
26
Analizzatori a tempo di volo
Se consideriamo l’eq. (1) ricaviamo
2zV
k
=
m
m
v=
(1bis)
che indica: la velocità acquistata da uno ione sottoposto ad un campo accelerante V è
inversamente proporzionale alla radice quadrata della massa m.
Considerando una distanza s=vt si ha
k
t
m
s=
t=
ovvero
s m
k
(6)
ioni di identica energia, ma con valori di massa differenti, richiedono differenti
intervalli di tempo per percorrere la stessa distanza (Figura 16).
regione di ionizzazione
ed accelerazione
griglie di accelerazione
sorgente di elettroni
ad alta energia
rivelatore ed oscilloscopio
sincronizzato
regione di “deriva”
(libera da campi)
Figura 16: schema di un analizzatore a tempo di volo (TOF)
27
Analizzatori quadrupolari
Gli analizzatori fin qui esaminati "classici", separano gli ioni disperdendoli o nello
spazio, come nel caso degli strumenti a settore magnetico, o nel tempo, come nel caso
degli strumenti a tempo di volo. La proprietà di separare le masse (gli ioni) degli
analizzatori a quadrupolo si basa sulla stabilità o instabilità intrinseca dello ione
all'interno dello strumento.
Contrariamente agli strumenti a settore magnetico o elettrico, i quadrupoli separano
gli ioni sulla base del loro rapporto massa su carica (m/z) piuttosto che sulla base del
momento o della energia cinetica. Di conseguenza lo strumento può conservare la
capacità di separare ioni con differenze di un'unità di massa anche quando esamina
popolazioni ioniche che hanno estese distribuzioni di velocità.
Si dice campo quadrupolare un campo (elettrico) la cui dipendenza lineare dalle
coordinate spaziali è
E=E0 (αx+βy+γz)
ove α, β, γ, = costanti ed E0 è un fattore indipendente dalla posizione ma che può
essere funzione del tempo.
Un campo di tal genere si instaura tra quattro elettrodi di sezione iperbolica (vedi
Figura 17) quando si applica un potenziale composto da una componente continua
(dc) U e una componente a radio frequenza Vcos(ωt) detta (ac-rf). Nella figura 18 è
schematizzato uno spettrometro a quadrupolo: l'analizzatore consiste in un insieme
di quattro elettrodi a barre, questi elettrodi sono collegati agli alimentatori in modo
tale che le coppie opposte di barre sono accoppiate assieme con potenziali a
radiofrequenza (rf) e a corrente continua (dc) applicati fra di esse.
9UI9GF
9U I9GF Figura 17: campo in un quadrupolo
raggio di elettroni
ioni
U+Vcos ωt
filamento
+Us
sorgente
sistema di barre analizzatore
Figura 18: analizzatore e quadrupolo
28
collettore
Quando gli ioni entrano in questo campo in modo perpendicolare (vz=costante)
oscillano nelle direzioni x e y, l’ampiezza di tali oscillazioni dipende dalla frequenza
ν del potenziale applicato e dalle masse degli ioni.
Se l’oscillazione di uno ione è stabile (=ampiezza costante) in entrambe le direzioni x
e y, lo ione passa il campo e giunge al rivelatore. Gli altri ioni, nelle condizioni di
transito di quello ione, vengono sottoposti ad oscillazioni instabili e vanno a
scaricarsi sugli elettrodi.
Solo una massa ben determinata può attraversare il campo per determinati valori di
U, V e ν ; modulando ν si può avere uno spettro di massa.
L'azione "filtrante" di un analizzatore di masse a quadrupolo viene ottenuta
applicando una combinazione di potenziali indipendenti dal tempo (dc) e dipendenti
dal tempo (ac). Per comprendere l'azione della struttura degli elettrodi e dei
potenziali sulla traiettoria di una particella carica esamineremo i piani X-Z e Y-Z
separatamente. Iniziamo dal piano X-Z (vedi figura 19) e consideriamo gli effetti che
ha un potenziale dipendente dal tempo (ac) sulle traiettorie degli ioni che viaggiano
in quel piano. In assenza di potenziale continuo (dc), durante un singolo periodo
della forma d'onda (ac) applicata, gli elettrodi che giacciono sull'asse delle X
passeranno metà ciclo a potenziale positivo rispetto al centro degli assi e l'altra metà
a potenziale negativo. Quando il potenziale è positivo rispetto al centro, il raggio di
ioni positivi sarà accelerato e focalizzato verso l'asse centrale degli elettrodi. Quando
il potenziale è negativo invece, il raggio di ioni positivi sarà accelerato verso gli
elettrodi (a potenziale negativo). La dinamica del fenomeno sarà governata da
diversi fattori tra cui la grandezza istantanea del potenziale negativo applicato agli
elettrodi, il periodo di tempo che gli elettrodi trascorrono a potenziale negativo (cioè
la frequenza della forma d'onda ac) come pure dalla posizione, velocità, rapporto
massa su carica della particella. Ora aggiungiamo al potenziale una componente
indipendente dal tempo (dc), ad esempio un potenziale positivo applicato agli
elettrodi che giacciono nel piano X-Z. Consideriamo, in senso qualitativo, l'effetto
dipendente dalla massa che i due potenziali (dc-ac) combinati hanno sulle traiettorie
dei diversi ioni. Se uno ione è molto pesante e/o la frequenza del potenziale è molto
rapida, lo ione tenderà a sentire soltanto l'effetto del potenziale medio applicato agli
elettrodi, ovvero ioni pesanti tenderanno ad essere influenzati soltanto dal potenziale
continuo positivo, ciò vuol dire che questi ioni saranno focalizzati verso il centro
degli assi. I piccoli periodi di tempo durante i quali gli elettrodi passano a potenziale
negativo avranno effetti trascurabili sulle traiettorie degli ioni pesanti. Al contrario,
se uno ione è molto leggero, il suo cammino potrà essere molto influenzato dal
potenziale (ac) che varia con rapidità; se infatti uno ione è sufficientemente leggero,
esso durante un passaggio a voltaggio negativo può subire un'accelerazione
abbastanza intensa da arrivare a collidere con un elettrodo, scaricarsi ed essere
pompato via come una particella neutra. Ovvero gli ioni verranno filtrati sulla base
del loro rapporto massa su carica. In particolare, ioni sotto un particolare valore
critico di m/z saranno filtrati via dal raggio, a causa della velocità con cui essi
possono rispondere all'azione defocalizzatrice causata dalla porzione negativa del
potenziale alternato; d'altro lato, quegli ioni con massa superiore al valore critico
saranno trasmessi attraverso il quadrupolo e raggiungeranno il rivelatore. La
struttura degli elettrodi e la natura del potenziale si combinano per formare un filtro
di massa passa alto che opera nel piano X-Z (Figura 20a). Consideriamo ora le
29
traiettorie degli ioni nel piano Y-Z. In ogni istante il potenziale applicato agli
elettrodi che giacciono lungo l'asse Y è eguale in grandezza ma opposto in segno al
potenziale applicato agli elettrodi che giacciono lungo l'asse X. Ciò significa che la
forma d'onda alternata (rf) applicata agli elettrodi X è 180° sfasata rispetto al
potenziale applicato agli elettrodi Y. Più importante però è il fatto che mentre il
potenziale continuo applicato agli elettrodi del piano X-Z è positivo, quello applicato
agli elettrodi del piano Y-Z è negativo. Nuovamente gli ioni pesanti tenderanno ad
essere influenzati soltanto dal valore medio del potenziale applicato ovvero dal
potenziale continuo. In questo caso però il potenziale continuo è negativo. Ciò
significa che gli ioni relativamente pesanti tenderanno ad essere eliminati dal raggio
a causa dell'effetto defocalizzante dato dal potenziale dc negativo. D'altronde, se lo
ione è sufficientemente leggero, esso potrà rispondere all'azione focalizzante che si
ottiene quando la porzione positiva del campo alternante diviene maggiore del
potenziale continuo negativo. Se la frequenza e la grandezza del campo ac sono
opportunamente scelte, è corretto pensare che l'azione del campo ac si esplichi nel
correggere le traiettorie degli ioni leggeri in modo da impedire il loro urto sugli
elettrodi lungo l'asse Y. Gli elettrodi ed i potenziali applicati si combinano per
formare un filtro di massa passa basso che opera nel piano Y-Z (Figura 20b).
Affinché uno ione voli dalla sorgente al rivelatore, deve chiaramente rimanere stabile
in entrambi i piani X-Z e Y-Z. Ciò vuol dire che dovrà essere sufficientemente leggero
da non essere eliminato dal filtro passa basso che opera nel piano Y-Z ma non dovrà
essere così leggero da essere eliminato dal filtro passa alto che opera nel piano X-Z.
Queste condizioni di stabilità reciproca descrivono una filtro passa banda (Figura
20c). L'ampiezza della regione passa banda, che è indicativa della risoluzione delle
masse, è governata dal rapporto dei potenziali ac-dc applicati agli elettrodi. Si può
dimostrare che la massa corrispondente al centro della regione di stabilità reciproca è
determinata dalla grandezza di entrambi i potenziali.
HQ
LRV
VL
VP
D
WU
D
PDVVD
HQ
LRV
LV
VP
UD
W
E
PDVVD
QHR
LV
VL
P
VD
WU
Figura 19
F
PDVVD
Figura 20: il quadrupolo come filtro passa banda
30
Le equazioni del moto
Una completa descrizione della traiettoria di un qualsiasi ione in funzione delle sue
condizioni iniziali viene data da un insieme di tre equazioni differenziali. La
soluzione di una delle tre è banale, indica che la posizione e la velocità di uno ione
lungo l'asse delle z non viene influenzata da qualsiasi potenziale applicato agli
elettrodi. L'uso di elettrodi di sezione iperbolica porta a equazioni del moto che non
contengono termini misti in coordinate. Cioè il moto delle particelle rimane
indipendente lungo ciascuno dei tre assi di coordinate. Tenendo presente che u
1
d2u
rappresenta sia x che y e che x= wt l'equazione è
+ a u − 2q u cos2 ξ u = 0
dξ 2
2
4zU
2zV
con a = 2 2
q= 2 2
ω r0 m
ω r0 m
ove x ed y sono le distanze lungo il dato asse delle coordinate, r0 è la distanza tra
asse centrale (asse z) e la superficie di ciascun elettrodo, ω è la frequenza angolare (2π
f) della forma d'onda della corrente alternata applicata (ac), V è la grandezza della
corrente alternata (ac o rf) ed U è la grandezza del potenziale continuo applicato.
Ovviamente m ed z sono la massa e la carica dello ione.
L'equazione è nella forma canonica dell'equazione differenziale di Mathieu
(matematico francese del XIX secolo); per nostra fortuna la comprensione del
funzionamento di un quadrupolo non richiede una approfondita conoscenza delle
soluzioni. La caratteristica essenziale dell'equazione è che la soluzione per u può
essere espressa come una serie coinvolgente termini della forma eµξ che possono
essere (a) oscillatori (quando µ è immaginario) con ampiezze finite in x ed y o (b)
esponenziali (quando µ è reale) con ampiezze che aumentano rapidamente con il
tempo. Dal momento che µ è una funzione di a e q, le condizioni per traiettorie stabili
possono essere identificate da un grafico-diagramma di Mathieu (figura 21) in cui si
possono distinguere regioni dello spazio a-q dove le soluzioni alle equazioni del
moto sono stabili o instabili.
Nei termini del nostro filtro quadrupolare nel caso di soluzioni stabili una particella
che entra nel filtro sarà trasmessa attraverso tutto il sistema ed infine registrata dal
rivelatore. Al contrario, una soluzione instabile corrisponde al caso in cui la
dislocazione radiale della particella aumenterà senza limite. Tali particelle saranno
filtrate via dal raggio degli ioni prima che possano raggiungere il rivelatore in quanto
collideranno sugli elettrodi. In linea di principio per una qualsiasi massa un
quadrupolo può funzionare in un qualsiasi punto dello spazio a-q interno al
diagramma. In pratica, i quadrupoli di solito operano in modo tale che i valori dei
parametri a e q siano sempre legati da un rapporto semplice. Di solito questa
condizione viene raggiunta facendo in modo che il potenziale continuo applicato sia
sempre una frazione del potenziale alternato; cioè il rapporto U/V viene mantenuto
costante, a prescindere dal valore dei due termini. In termini di diagramma a-q,
mantenere U/V costante equivale a restringere le operazioni del filtro di massa ad
una serie di punti operativi che giacciano su una retta con intercetta all'origine.
Questa linea è conosciuta come linea della scansione di massa o linea d'operazioni
(operating line). Dal momento che a e q contengono molti termini in comune
l'inclinazione della linea di scansione di massa (a/q) è data dal rapporto 2U/V.
31
I punti della regione di stabilità intersecati dalla linea di operazioni determinano la
banda passante dello spettrometro. Se, per un momento, si assume che i valori dei
parametri z, ω, U e V rimangono fissi, allora un'utile raffigurazione della linea
d'operazioni o di scansione di massa è quella di una scala graduata che contiene la
massa di tutte le particelle. Se l'inclinazione della retta viene variata (con opportune
variazioni del rapporto U/V) si può fare in modo che solo un ristretto intervallo di
masse cada nell'intervallo di stabilità del diagramma. La figura 21 illustra il caso in
cui solo lo ione di massa m2 passa attraverso il quadrupolo; lo stretto apice della
regione di stabilità può essere usato per avere un filtro passante molto selettivo. La
regione della banda passante definisce la risoluzione, se il rapporto U/V viene
abbassato la risoluzione verrà ridotta (Figura 21 caso R=1). Qualora venisse annullato
il potenziale continuo, rimane solo quello alternato ("rf-mode"), il parametro a si
annulla, la linea di operazioni nello spazio a-q ha inclinazione zero ed intercetta l'asse
a nel punto a=0, un elevato numero di valori di masse cadranno all'interno del
diagramma, il sistema è ritornato ad essere un filtro passa alto. (Ricordiamo che la
massa m è inversamente proporzionale ad a e q, quindi le masse più basse
appariranno a destra nei diagrammi e quelle più alte a sinistra).
Figura 21: zona espansa di un diagramma di stabilità. Le linee di scansione
corrispondono alla risoluzione R=100, 10, 1 • m1, m2, m3 rappresentano tre ioni di
massa crescente
32
Trappola ionica
I principi base delle operazioni della trappola ionica possono essere meglio compresi
in relazione a quelli di filtro quadrupolare.
Se immaginiamo un solido di rivoluzione generato ruotando la struttura delle barre
illustrata in figura 22a lungo il suo asse z, la coppia di elettrodi A formerà una
superficie simile un iperboloide continuo, mentre gli elettrodi B formeranno delle
superfici di due iperboloidi separati ("a tappo") come illustrato in figura 22b. La
trappola ionica è quindi un sistema a tre elettrodi e di solito viene configurata in
modo che i due elettrodi terminali "a tappo" sono collegati assieme e tenuti a terra
mentre i potenziali rf e dc (se presenti) sono applicati soltanto all'elettrodo toroidale.
Come per gli analizzatori quadrupolari, gli ioni all'interno del campo elettrico
possederanno traiettorie stabili e quindi rimarranno intrappolati, oppure saranno
instabili e di conseguenza verranno persi sugli elettrodi. Questo sistema fu per la
prima volta descritto da W. Paul nel 1956.
Nel 1984 fu introdotta la prima versione commerciale della trappola ionica
quadrupolare basata su un nuovo metodo di espulsione selettiva dalla trappola degli
ioni dotati di massa su carica (m/z) crescente; scopo di questa versione era di
costituire un rivelatore per gascromatografia di poco costo ma sensibile basato sulla
spettrometria di massa. Applicando all'elettrodo anulare (Figura 23) un voltaggio rf
di appropriata grandezza e frequenza sono intrappolati ioni che coprono un vasto
intervallo di massa. Quando si vuole registrare uno spettro di massa viene aumentata
l'ampiezza del voltaggio, si ha come conseguenza che gli ioni di m/z sempre più
elevato diventano instabili dal momento che il loro moto all'interno della camera
aumenta in ampiezza e può portarli al di là dei confini fisici del sistema. A questo
punto essi sono espulsi dal sistema in una sequenza di massa attraverso dei fori
praticati in un elettrodo terminale.
In pratica la trappola funziona allo stesso tempo come sorgente ionica e come
analizzatore di massa.
B
a
x
z
b
y
r0
x
y
z
A
B
A
B
A
B
Figura 22: a) quadrupolo; b) trappola ionica generata dalla rotazione di una sua
sezione
33
Figura 23: schema di trappola ionica
Rivelatori
Dopo essere stati separati gli ioni devono essere rivelati e la loro abbondanza relativa
deve essere misurata. Anche qui esistono diversi tipi di sistemi:
1. gabbia di Faraday (Figura 24)
2. moltiplicatore di elettroni (Figura 25a, b)
3. lastra fotografica
La differenza tra spettrometro e spettrografo (di massa) risiede proprio nel tipo di
rivelatore impiegato: Spettrometro: rivelatore di tipo elettrico (n. 1 e 2), Spettrografo:
rivelatore a lastra fotografica (n. 3)
Altra differenza fondamentale:
rivelatori elettrici: rivelano un singolo valore di m/z per volta (è quindi necessaria
una esplorazione del campo "scansione")
rivelatore a lastra: rivelazione e registrazione simultanea di tutti gli ioni emergenti
(dal campo magnetico)
Il problema della registrazione si pone solo per i segnali provenienti dal rivelatore
elettrico: un normale registratore potenziometrico basterebbe se non fosse per
l'inerzia del pennino che richiede tempi di registrazione piuttosto lunghi; si usava
normalmente un registratore oscillografico (Figura 26); ora tutto viene trasmesso,
tramite un'opportuna interfaccia, ad un calcolatore. Gli spettrografi di massa e le
lastre fotografiche appartengono oramai alla storia della scienza.
34
elettrodo soppressore
degli ioni
fenditura del rivelatore
gabbia di Faraday
analizzatore
elettrodo
collettore
raggio di ioni
all’applicatore
e registratore
potenziale
della camera
di ionizzazione
resistenza
di ingresso
di riferimento
Figura 24: schema di rivelatore a gabbia di Faraday
raggio di ioni
all’amplificatore
elettroni
a)
primo dinodo
superficie
conduttrice
resistiva
raggio di ioni
-2kV
cascata di elettroni
segnale
b)
Figura 25: a) schema di rivelatore a moltiplicatore di elettroni con dinodi discreti
(“SEM”); b) schema di rivelatore a moltiplicatore di elettroni con dinodo continuo
(“CDEM”), il gradiente di campo lungo la superficie interna della “cornucopia”
attrae gli elettroni verso il preamplificatore
35
Figura 26: schema del funzionamento di un registratore oscillografico
36
Sistema di introduzione
Poiché lo spettrometro di massa lavora sotto vuoto, è ovvio che la introduzione del
campione rappresenti quanto meno un problema di compatibilità con la pressione
atmosferica; il sistema di introduzione è quindi un'altra parte vitale dello
spettrometro. (In Figura 27 i vari accessi in sorgente)
Per i campioni gassosi non esistono problemi, bastano valvole di regolazione del
flusso lungo la linea di collegamento. Per campioni liquidi è necessario un serbatoio
riscaldato evacuabile, collegato alla sorgente tramite una valvola regolatrice. Il
liquido viene introdotto nel volume di espansione con una comune siringa
micrometrica passando attraverso un setto di gomma con una operazione identica
all'iniezione in un gascromatografo. Spesso il sistema di introduzione per liquidi è
tutto costruito in vetro (AGHIS=all glass heated inlet system) (Figura 28). Questo
sistema, una volta molto utilizzato, oggi ha perso notevolmente di importanza; in
forma più semplificata viene utilizzato per introdurre in sorgente sostanze
polifluorurate il cui spettro serve a calibrare la scala delle masse dello spettrometro. I
campioni solidi vengono fatti sublimare direttamente in sorgente dopo essere stati
depositati in una provettina (crogioletto) posta sulla testa di una sonda riscaldabile
(probe) (Figura 29). La sonda viene introdotta in sorgente dopo essere passata
attraverso un sistema di compensazione del vuoto (paratie stagne e precamera
collegata al sistema di pompaggio). L'operazione viene indicata come introduzione
diretta (DIS direct inlet system) e la sonda è spesso abbreviata in DIP (direct inlet
(introduction) probe). Il principale vantaggio del sistema di introduzione diretta è che
esso riduce il tragitto delle molecole in fase vapore verso la zona di ionizzazione
diminuendo così le possibilità di decomposizione. Un'importante caratteristica della
spettrometria di massa è la sua estrema sensibilità: con sostanze pure bastano
-9
quantità dell'ordine di pochi nanogrammi (10 g) per ottenere uno spettro completo
ed interpretabile.
apertura
per gli elettroni
eventuale entrata
del gas reagente
per CI
fenditura
filamento
3
1
2
collegamento
con il forno riscaldato
elettrodo
foro di collegamento
al GC (separatore)
sistema
riscaldante
foro di entrata
della sonda
Figura 27: vari accessi in sorgente
37
focalizzatore 3
estrattore
2
repulsore
1
volume di
espansione
forno
setto
alla sorgente ionica
foro regolatore
del flusso “molecolare”
al sistema
di pompaggio del vuoto
Figura 28: sistema di introduzione per liquidi
Particolare della testa di sonda
1.punta isolata (ceramica)
2.campione solido
3.capillare (crogioletto)
porta campione
4.camera di ionizzazione
Lo schema mostra la sonda completamente introdotta “in sorgente”
al sistema
di pompaggio del vuoto
sorgente
(camera di ionizzazione)
spirale
riscaldante
valvola a soffietto
di isolamento: assicura
la tenuta atmosfera/vuoto
Figura 29: sonda per introduzione di solidi
38
Figura 30: sezione di una pompa rotativa
Figura 31: sezione di una pompa diffusiva
39
Sistema da vuoto
Per assicurare agli ioni un "volo" senza intoppi è necessario sgombrare il loro
percorso, che è dell'ordine del metro. Ciò si ottiene con evacuazione spinta (10-6 – 10-7
mbar) attuata con sistemi di pompaggio adeguati e costruendo tutto lo spettrometro
con tecnologia da alto vuoto. In tali condizioni operative il libero cammino medio
delle molecole è largamente superiore alla distanza che gli ioni devono coprire; ciò
comporta, oltre ad un aumento generale in sensibilità e risoluzione, la conseguenza,
determinante per le teorie interpretative sugli spettri, che i processi in sorgente sono
praticamente unimolecolari. I motivi per un vuoto così spinto non si esauriscono al
libero cammino medio degli ioni: un'elevata pressione, dovuta a gas residui, dà
luogo ad uno spettro di massa (del rumore di fondo: background) che interferisce con
lo spettro del campione; con elevate pressioni in sorgente possono avvenire reazioni
ione-molecola che cambiano l'aspetto dello spettro (vedi ionizzazione chimica).
Problemi tecnici legati all'alta pressione sono dati nel caso di vuoto scarso dal
verificarsi di scariche elettriche nella sorgente ove vi sono differenze di potenziale del
kV; elevata pressione ovvero aria in sorgente comporta significative quantità di
ossigeno che può bruciare il filamento emittente.
Il sistema di vuoto è costituito non solo dalle pompe necessarie per produrlo, ma
anche da un complesso sistema di misuratori, valvole di isolamento, sistemi di
protezione in caso di fermate improvvise.
Gli strumenti più semplici utilizzano solo una pompa da alto vuoto con la rispettiva
pompa rotativa (Figura 30); gli strumenti più complessi invece utilizzano il
cosiddetto sistema di pompaggio differenziale. Due gruppi di pompaggio, costituito
ognuno da una pompa a diffusione (o turbomolecolare) (Figura 31) e da una pompa
rotativa sono collegati rispettivamente alla sorgente ed all'analizzatore. Sorgente ed
analizzatore comunicano tra di loro attraverso una piccola apertura che permette
soltanto il passaggio degli ioni ed offre elevata resistenza al passaggio dei gas
residui. In questo modo eventuali peggioramenti del vuoto in sorgente non
influiscono sul vuoto dell'analizzatore. Sono necessarie anche altre pompe rotative
supplementari per far funzionare ad esempio il sistema di introduzione diretta o il
separatore molecolare per l'accoppiamento GC/MS.
40
L’accoppiamento con le tecniche cromatografiche
L’idea dell’accoppiamento tra un gascromatografo (GC) ed uno spettrometro di
massa (MS) nasce quasi subito, nel 1957 (Holmes e Morrell), pochi anni dopo
l'invenzione del gascromatografo (1951), perché entrambi gli strumenti analizzano i
campioni in fase gassosa, hanno livelli di sensibilità paragonabili, operano in
intervalli di temperature simili, non richiedono eccessive modifiche per essere
collegati. L'idea di GC/MS sorge soprattutto perché i singoli componenti svolgono
funzioni analitiche complementari: il gascromatografo separa le miscele ma ha
difficoltà nella caratterizzazione dei composti, lo spettrometro di massa non è in
grado di separare i componenti di una miscela ma fornisce informazioni utili per
caratterizzare un composto. L'accoppiamento tra un cromatografo liquido ad alte
prestazioni (HPLC) e uno spettrometro di massa è stato tentato già alla fine degli
anni sessanta ma bisogna attendere la seconda metà degli anni settanta per vedere
apparire qualche lavoro incoraggiante; tuttora non esiste un sistema di
accoppiamento unico ed universale tra i due strumenti. Le difficoltà
dell'accoppiamento LC/MS provengono dallo stato fisico diverso in cui le sostanze
vengono a trovarsi nei due apparecchi, dalle proprietà fisiche diverse per ciascuno
dei sistemi di solventi abitualmente usati in HPLC (queste proprietà impediscono
infatti di avere un solo tipo di separatore universale) ed inoltre dal fatto di applicare
il metodo soltanto a sostanze difficili, molto "fragili" o affatto volatili che non
possono essere analizzate "normalmente" per GC/MS. In questa ultima difficoltà
risiede anche l'importanza della LC/MS per la sua capacità di trattare composti
termicamente e chimicamente labili, oppure a bassa volatilità. Un altro vantaggio
della LC/MS è la facile preparazione del campione e di conseguenza una maggiore
velocità di analisi. Le difficoltà di accoppiamento tra un cromatografo a fluido
supercritico (SFC) ed uno spettrometro di massa (MS) pongono la SFC/MS tra la
GC/MS e la LC/MS in parallelo con le caratteristiche fisiche di questo fluido.
Esistono per altro sistemi di accoppiamento tra la cromatografia su strato sottile
(TLC) e lo spettrometro di massa: TLC/MS con interfacce meccaniche che utilizzano
tecniche di ionizzazione di superficie (SIMS, LSIMS-FAB).
Schema generale del comune utilizzo della MS a seconda delle sostanze
Caratteristiche delle
sostanze
volatili
poco polari
polari
molto polari
estremamente polari
Sistemi di ionizzazione
Accoppiamenti possibili
EI
EI
EI
GC/MS
GC/MS
GC/MS (derivati)
GC/MS derivati
CI
CI
DCI
DCI
APCI FI
(APCI)
(FD)
TSP
FD FAB
ESI
41
LC/MS
LC/MS
GC/MS: lo spettrometro di massa può essere visto come un rivelatore
gascromatografico dotato di alta specificità, sensibilità e versatilità.
I problemi tecnici che sorgono nell'accoppiare i due strumenti GC e MS:
1.
E’ necessaria una rapidità di esplorazione dell’intervallo di massa da parte
dell’MS (=scansione) per seguire i tempi del GC, specialmente se con colonne
capillari, onde evitare la distorsione dell’aspetto dello spettro di massa dovuta
alla variazione di concentrazione della sostanza in sorgente durante l’eluizione
del picco gascromatografico. Se gli spettri sono sottoposti a scansione molto
veloce, il mutare della concentrazione del campione durante la scansione sarà
insignificante (Figura 32).
Un tempo la richiesta di rapidità di scansione si scontrava con l'isteresi
magnetica degli analizzatori e con i problemi di frequenza di risposta dei
galvanometri, ora è necessaria soltanto un po' di cura nella velocità di
acquisizione del calcolatore.
Spettro registrato
“in salita”
“all’apice”
“in discesa”
6 periodi di scansione
(esplorazione dello spettrometro da massa bassa a massa alta)
Figura 32: distorsione dello spettro di massa a seconda del punto del picco
gascromatografico in cui viene effettuata la scansione
2.
I due strumenti operano a pressioni molto differenti, GC: atmosfera (o più) MS: vuoto (10-5 – 10-7 mbar), inoltre la pressione è data da moltissimo gas di
trasporto e pochissimo campione che interessa (Figura 33).
Per risolvere questo si utilizza un'interfaccia che idealmente dovrebbe lasciar
passare tutto il campione per tutto il tempo dell'analisi senza decomposizione
e senza ritardi nei tempi con conseguente peggioramento della risoluzione
gascromatografica. Nel caso di colonne capillari l'interfaccia può essere
42
omessa e, con bassi flussi di gas (0,5 - 1 ml/min), la colonna può terminare
direttamente nella sorgente dello spettrometro; molto spesso però anche con
le colonne capillari si usa un'interfaccia a partizione aperta ("open-split")
(Figura 34).
Nel caso di colonne impaccate l'interfaccia è costituita da un separatore
molecolare, un sistema progettato sulla dinamica dei flussi e/o sulla effusione
molecolare che rimuove gran parte del gas di trasporto e lascia passare più
campione possibile.
I separatori molecolari (Figura 35) si basano su:
effusione attraverso pori fini o sottile fessura (Watson & Biemann,
Brunée);
diffusione preferenziale attraverso membrana semi-impermeabile, da
parte del gas di trasporto oppure del campione (sostanza organica)
(Llewellyn - Littlejohn);
frazionamento del gas in un flusso a getto in espansione ("jet") (Ryhage Becker). Nella sua versione a singolo stadio è ancora attualmente usato nel
caso di necessità dell’uso di colonne impaccate (Figura 35).
Un'altra soluzione all'accoppiamento GC/MS consiste nell'uso di sorgenti
a pressione atmosferica (API: atmospheric pressure ionisation); progettata in
origine per l'accoppiamento GC/MS, la sorgente API ebbe scarsissime
applicazioni, mentre ora ha un grande ritorno nell'accoppiamento LC/MS.
MS
Sorgente
EI
Separatore
0,1-2
ml/min
GC
2
GC
Sistema
pompe
vuoto
flusso
0,1-2 ml/min
flusso
10-60 ml/min
Gas reagente
=
Gas trasporto
<20
ml/min
MS
Sorgente
EI
Separatore
Gas reagente = Gas trasporto
Figura 33: accoppiamento GC con MS
43
MS
GC
Capillare di restrizione
MS
GC
He
Interfaccia a pressione atmosferica
MS
GC
He
Interfaccia a partizione aperta He
(RSHQVSOLW)
Figura 34: collegamenti GC/MS per colonne capillari
schiumatore
ugello
molecole di campione
molecole delgas di trasporto
al vuoto
Figura 35: separatore Jet, singolo stadio
44
Accoppiamento
diretto
-3
10 torr
MS
760 torr
GC
Pompa della
sorgente
Separatore effusivo
(Watson-Biemann)
-3
760 torr
GC
10 torr
MS
Pompa
Separatore
a orifizio -jet
(Ryhage)
Pompa Pompa
Separatore
a membrana
permeabile
(Llewellyn)
-3
760 torr
GC
10 torr
MS
Figura 36: collegamenti GC/MS per colonne impaccate
3.
Registrazione della corrente ionica, cioè scelta del tempo di scansione; è un
problema "storico" risolto dall'avvento dei calcolatori; senza calcolatore veniva
risolto utilizzando un'energia di ionizzazione degli elettroni tale che
ionizzasse le sostanze organiche ma non l'elio usato come gas di trasporto
(cioè 20 eV). La corrente ionica veniva registrata utilizzando il rivelatore di
raggio posto tra la sorgente e l'analizzatore magnetico per facilitare le
operazioni di accensione e di focalizzazione. Il rivelatore (una griglia) può
essere posto in modo da intercettare parte del raggio totale (un tempo una
porzione variabile) ed il segnale che ne esce, opportunamente amplificato, può
alimentare un registratore potenziometrico che ne fornirà un tracciato in
funzione del tempo. L'apparizione di sostanze organiche in sorgente dà
origine ad un aumento del segnale del raggio ionico. A 70 eV, siccome la
quantità di elio che comunque entra in sorgente è elevata, la corrente dovuta
agli ioni del gas è eccessiva rispetto al segnale degli ioni organici, per cui la
sensibilità rispetto a queste sostanze è estremamente limitata. L'operatore non
è in grado di distinguere nella registrazione della corrente ionica totale,
costituita da tutti gli ioni non separati compresi quelli a m/z 4, il punto dove
effettuare (manualmente) la registrazione dello spettro, specialmente per
sostanze in piccole quantità. Operando sotto il potenziale di ionizzazione
45
dell'elio (24 eV) si riduce la sensibilità di un fattore 5-10 e si modifica l'aspetto
degli spettri di massa (minore frammentazione) ma si riesce ad avere un
tracciato gascromatografico simile a quello ottenuto con un rivelatore a
ionizzazione di fiamma e quindi si può distinguere nel tracciato il punto dove
effettuare la scansione (di solito l'apice del picco).
4.
Controllo della temperatura delle linee di trasferimento evitando punti
freddi e punti caldi, scelta della colonna cromatografica a basso spurgo di fase,
sono accorgimenti necessari che il progresso tecnologico di anno in anno rende
meno limitanti rispetto ai drammatici esordi in cui bastavano dieci gradi in più
o in meno per passare da un'analisi ad un fallimento. Capitoli interi nei testi
"pratici" degli anni settanta erano dedicati alla temperatura dell'interfaccia e
della linea di trasferimento lunga a volte anche un metro. Ora che la colonna
entra direttamente in sorgente tramite una linea sempre più corta, il problema
ha perso molta della sua drammaticità, non bisogna però dimenticare il
controllo della temperatura di questo punto.
46
GC
separatore
1 FFR
MS sorgente
rivelatore
(GC) a
FID
ionizzazione
di fiamma
analizzatore
(magnete)
Rivelatore
della corrente TIC
ionica totale
I
moltiplicatore
I
(GC)
TIC
RIC
ricostruito
dal calcolatore
t
%
RS
%
m/z
interfaccia
(A/D)
sistema
elaboratore
scan~t
MS
I
SIM
t
m/z
I
MC
scan~t
Figura 37: segnali da una GC/MS
(*) in questo caso il calcolatore è usato come un registratore
FID:
FFR:
TIC:
RIC:
RS:
MS:
SIM:
MID:
MC:
flame ionization detector
field-free region
total ion current
reconstructed ion current
repetitively scanned (data)
mass spectrum
selected (single) ion monitoring
multiple ion detection
mass chromatogram
47
I
MID
t
(*)
Le informazioni ottenibili da uno spettrometro di massa come rivelatore di un
gascromatografo possono essere distinte in due categorie:
(Figura 37)
1.
2.
quelle ottenibili per via puramente strumentale (cioè anche senza l'aiuto di un
calcolatore);
quelle ottenibili soltanto tramite la logica di un calcolatore.
Al giorno d'oggi questa divisione è puramente didattica in quanto praticamente
tutti gli spettrometri sono collegati con un elaboratore.
Alla prima categoria appartengono:
La corrente ionica totale (TIC = total ion current):
misura del numero totale di ioni formati dal materiale eluito dal
gascromatografo registrata come funzione temporale; il suo tracciato è
paragonabile a quello ottenuto da un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID
flame ionisation detector). Non c'è alcuna differenza nei tempi di ritenzione
(nessun tempo in ritardo) se il sistema GC/MS è costruito correttamente.
Esistono qua e là alcune differenze nelle risposte dei differenti composti.
Abbastanza spesso si nota che il rivelatore a ionizzazione di fiamma non
risponde con la stessa efficienza dello spettrometro di massa con composti dai
tempi di ritenzione molto lunghi.
In qualsiasi punto della corrente ionica totale si possono prendere gli spettri di
massa; un tempo il tracciato TIC serviva proprio per stabilire il momento
esatto in cui registrare lo spettro.
La rivelazione selettiva di ioni (SIM o SID selected ion monitoring o detection):
le intensità degli ioni preselezionati sono registrate come funzioni del tempo;
qualsiasi ione può essere utilizzato in tale sistema: molecolare, frammento,
metastabile, dovuto al gas reagente in ionizzazione chimica (Figura 38).
Sebbene diverse compagnie commerciali abbiano inventato diversi nomi
depositati per questa tecnica, il concetto è chiaramente definito. Supponiamo
di predisporre lo spettrometro di massa per registrare un solo ione alla massa
definita dal rapporto m/z. Iniettato il campione nel gascromatografo, i vari
componenti della miscela verranno separatamente eluiti dalla colonna
gascromatografica ed entreranno nella sorgente ionica dello spettrometro di
massa dove verranno ionizzati. Ma poiché lo spettrometro è stato predisposto
per registrare il solo ione con rapporto massa su carica pari al valore m/z
prescelto, non si registrerà alcun segnale finché non verrà eluita dalla colonna
gascromatografica una sostanza che dia origine ad uno ione con eguale
rapporto m/z.
La rivelazione selettiva di ioni può essere:
- a ione singolo: uno ione caratteristico di una classe o di un particolare
composto viene registrato per tutta la eluizione del GC; si può operare a bassa
risoluzione registrando la massa arrotondata all'intero, oppure ad alta
risoluzione con potere risolutivo circa 10.000, misurando la massa alla quarta
cifra decimale;
48
Figura 38: Registrazione secondo rivelazione selettiva di ioni preselezionati
“frammentografia di massa” di metaboliti della cloropromazina
-
a ioni multipli (2 - 4): le intensità di due o più ioni preselezionati sono
registrate come funzione temporale. Lo spettrometro ciclizza tra questi
ioni per cui la registrazione si può dire simultanea. Gli ioni possono
provenire da composti diversi (classica applicazione è la quantitativa con
standard interno marcato da isotopi stabili, di solito trideuterato) oppure
dallo stesso composto (in questo caso vi è un aumento di specificità). Di
particolare interesse con i composti deuterati è il fatto che, sebbene i due
componenti (deuterato e non) possano essere non completamente risolti
dal gascromatografo, i loro ioni vengono risolti dallo spettrometro di
massa.
L'identificazione di un composto avviene quando: (vedi Figura 39)
il tempo di ritenzione è lo stesso dello standard puro
si innalzano simultaneamente le tracce degli ioni caratteristici prescelti per la
registrazione
le aree (le altezze) dei segnali corrispondenti agli ioni caratteristici stanno tra di
loro in rapporti eguali, entro i termini delle deviazioni sperimentali, a quelli
delle abbondanze relative degli ioni dello spettro di massa standard.
ovviamente quando i picchi sono almeno tre volte più grandi del rumore di
fondo
49
Masse
Figura 39: Condizioni per l’identificazione di un composto tramite SIM
1. tempo di ritenzione giusto
errato
errato
giusto
2. masse
giuste
errate
giuste
giuste
3. intensità relative
giuste
errate
giuste
distorte
è presente il composto si
no
no
probabile
distorto
giuste
distorte
possibile
La rivelazione selettiva di più ioni viene anche chiamata MID (multiple ion
detection) o, con un termine non raccomandato dalla IUPAC, frammentografia
MF (mass fragmentography).
-12
La sensibilità giunge fino a 10 g (ed ancora meno) e spesso è limitata soltanto
da interferenze o adsorbimenti della colonna cromatografica. Operando in
rivelazione selettiva di ioni lo spettrometro è paragonabile ad un rivelatore a
cattura d'elettroni (ECD electron capture detector) come selettività e sensibilità,
ma è superiore ad esso per versatilità, cioè non è limitato ad alcune classi di
sostanze (es. alogenati). La selettività del metodo SIM è riflessa dal fatto che il
segnale è ottenuto registrando soltanto quegli ioni che sono caratteristici del
composto che interessa. Un'elevata sensibilità può essere raggiunta dallo
spettrometro se tutto il sistema di registrazione si dedica all'acquisizione della
corrente ionica di soltanto alcuni valori di m/z. Il massimo della sensibilità
può essere ottenuto con il controllo della corrente ionica di soltanto un singolo
valore m/z. In una scansione ripetuta l'insieme spettrometro - sistema di
acquisizione spende la gran parte del tempo di analisi campionando le regioni
"vuote" dello spettro di massa tra i massimi dei picchi dei singoli ioni. Per
questa ragione il sistema SIM in cui il rivelatore si dedica a misurare soltanto
pochissimi ioni è circa 1000 volte più sensibile rispetto al sistema di scansione
ripetuta. Per mezzo della rivelazione selettiva degli ioni è possibile mettere in
evidenza e separare componenti presenti in miscela in piccolissima quantità e
per i quali non avrebbe alcun senso la registrazione dello spettro di massa,
perché occultato dalla memoria dello spettrometro e dallo spurgo (bleeding)
della colonna gascromatografica. Per utilizzare la tecnica della rivelazione
selettiva di ioni è necessario conoscere completamente lo spettro (gli spettri) di
massa del composto (della classe) oggetto di ricerca. In un certo senso più ioni
di una data sostanza vengono registrati e maggiore è la sicurezza che
l'operatore ha sulla presenza della sostanza nel campione. D'altro canto
rivelando un elevato numero di ioni si ha una scarsa rappresentazione
statistica di ciascuno ione singolo; poiché la tecnica SIM viene impiegata in
quei casi dove è importante un'elevata sensibilità, vengono seguiti soltanto
due o tre ioni per ciascun composto. Si preferisce rivelare almeno due ioni per
50
ciascun composto cosicché possa essere eliminata una qualsiasi ambiguità su
un solo tracciato di corrente ionica tramite il confronto tra due tracciati che
devono indicare simultaneamente dei picchi ad un appropriato tempo di
ritenzione. Nella necessità di rivelare un solo ione la miglior scelta è data dalla
registrazione dello ione molecolare perché è improbabile che un altro
composto dia origine ad uno ione frammento con la stessa composizione
elementare; soltanto gli isomeri danno significativi problemi di interferenza ed
è importante quindi fare in modo che siano separati in gascromatografia.
Comunque il potenziale massimo del SIM è realizzato soltanto se viene presa
ogni dovuta cura per evitare l'uso di ioni con valori di massa simili a quelli
degli interferenti o del rumore di fondo e se i derivati, formati per aumentare
la volatilità dei composti, sono scelti in modo da non essere soggetti a
degradazioni o adsorbimenti irreversibili sulla colonna cromatografica.
Deve essere ben chiaro che il sistema GC/MS in MID (o SIM) rivela soltanto
quello che si vuole cercare, non si possono ottenere altre informazioni al di
fuori dei tracciati di corrente degli ioni prefissati a meno di ripetere all'infinito
l'analisi.
Qualsiasi strumento GC/MS può essere modificato per la rivelazione multipla
degli ioni. Comunque, specialmente in origine, la maggior parte degli
strumenti magnetici è limitata nell'intervallo di masse e nel numero di ioni che
possono essere selezionati. Un intervallo del 20% del campo di masse e 2-4
ioni selezionati sono i tipici valori per un sistema magnetico. Qualsiasi
intervallo di massa ed un notevole numero di ioni possono essere invece
utilizzati per sistemi quadrupolari e a tempo di volo.
Le precedenti osservazioni sulla aumentata sensibilità della tecnica SIM
rispetto alla tecnica di scansione ripetuta sono valide per strumenti che
esplorano l'intervallo di masse in maniera sequenziale; diminuendo il tempo
di esplorazione del campo, a parità di altri fattori, si diminuisce la differenza
di sensibilità tra le due tecniche. Con gli attuali strumenti la differenza non è
sicuramente più di un fattore 1000 a vantaggio di una sempre più sensibile
scansione ripetuta. La rivelazione simultanea di tutti gli ioni prodotti in uno
spettrometro di massa annullerebbe la differenza. I processi di produzione e di
conseguente separazione di soltanto quegli ioni prodotti in un preciso piccolo
intervallo di tempo ripetuti in rapida sequenza (es. 3 cicli in un secondo) di
fatto riduce ad un fattore 3-5 l'incremento di sensibilità offerto dal sistema di
rivelazione multipla di ioni preselezionati rispetto al sistema di scansione
ripetuta; ciò è caratteristico dei rivelatori a trappola ionica (ITD).
L’esplorazione ripetuta di masse selezionate
veniva utilizzata su strumenti non in grado di effettuare SIM e consisteva in
piccole (5 - 10 daltons) esplorazioni dell'intervallo di masse ripetute in
continuazione; può avere ancora qualche utilità per campioni con Cl o Br.
Si ricordi che un qualsiasi tracciato ottenuto da una GC/MS cioè corrente ionica (TIC
o RIC, SIM, MID, MC) ha un'area proporzionale alla quantità di sostanza presente in
miscela e quindi con opportune curve di taratura si presta ad una analisi
quantitativa.
51
Prima di passare alla categoria dei dati ottenibili tramite calcolatore ricordiamo che
il calcolatore fornisce l’acquisizione automatica degli spettri, la loro normalizzazione,
la loro riproduzione anche in forma grafica, la loro ordinata conservazione in poco
spazio; pertanto
- non è necessario aspettare che il picco sia all'apice per prendere lo spettro, il
sistema registra spettri a ripetizione in pochissimi secondi;
- si può facilmente lavorare con svariate migliaia di spettri, come quelle
prodotte da miscele complesse: campioni biologici, ecologici...;
- con un po' di ingegnosità si possono avere medie di spettri, sottrazione di
spettri uno dall'altro, "pulizia" del rumore di fondo etc.;
- si possono elaborare i dati sia in tempo reale sia dopo molto tempo dalla
esecuzione dell'analisi perché il sistema ha immagazzinato le scansioni
precedentemente acquisite.
- si possono avere utili indicazioni sull'identità o quanto meno sulla natura della
sostanza perché il sistema elaboratore può inoltre eseguire programmi di
ricerca degli spettri incogniti in un archivio di spettri di riferimento ("ricerca in
biblioteca").
Attualmente tutte le GC/MS sono interfacciate ad un sistema dati, per cui la vecchia
abbreviazione per indicare una gasmassa più calcolatore GC/MS/DS è caduta in
disuso perché tutte sono dotate di calcolatore; sopravvivono (nelle università...)
sistemi a registrazione analogica per il SIM o MID.
Appartengono alla seconda categoria di segnali da GC/MS quelli ottenibili soltanto
tramite calcolatore (vedi Figura 37:
Il cromatogramma ricostruito dal calcolatore o corrente ionica ricostruita
(RGC = reconstructed gas chromatogram o RIC=reconstructed ion current); esso è
generato (durante l'analisi) sommando le intensità di tutti gli ioni in ciascuno
spettro di massa acquisito in scansione ripetuta e ponendo in grafico i valori
così ottenuti come funzione nel numero di spettro (=scansione); conoscendo la
durata della scansione, la scala data dal numero progressivo di spettro può
essere convertita direttamente in scala dei tempi (di ritenzione). Il suo tracciato
è analogo al TIC (anzi a volte è così indicato o anche come ioni totali TI=total
ions) ma mentre quest'ultimo è registrato prima di separare il fascio ionico, il
RIC è dato dalla somma (l'integrale) delle intensità degli ioni dopo la loro
separazione. Questo genere di cromatogramma assomiglia ad un
cromatogramma di corrente ionica totale (TIC) od a un cromatogramma di
rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID), sebbene l'aspetto dei picchi possa
risultare distorto se le scansioni non sono state acquisite abbastanza
frequentemente. Meno scansioni si registrano durante l'eluizione di un picco
GC, meno accurata sarà la sua riproduzione. E' implicito che si possa passare
in qualsiasi momento dalla corrente ionica totale (RIC, RGC, ...) allo spettro
desiderato, localizzandolo con cursore o con numerazione mostrata all'apice
del picco; il calcolatore fornirà lo spettro già normalizzato sia sotto forma
grafica (istogramma) sia, a richiesta, sotto forma numerica (tabella, matrice). Il
cromatogramma (RIC) serve come utile istogramma dei dati dal momento che
correla gli spettri registrati con i componenti del campione; inoltre, poiché
52
ciascun punto del grafico corrisponde ad uno spettro di massa memorizzato
dal calcolatore come valori di m/z e abbondanza relativa %, l'operatore può
usare il sistema per classificare diverse centinaia (migliaia) di spettri.
La GC/MS genera quindi segnali tridimensionali caratterizzati da m/z,
abbondanza % relativa , n° scansione cioè tempo di ritenzione
gascromatografico (Figura 40).
Grafico della corrente
ionica totale (ricostruita)
5,&7,&
Intensità
0&
Cromatogramma
di massa m/z 143
0&
m/z
Cromatogramma
di massa m/z 298
Scan # 275 Numero dello
spettro proporzionale
al tempo (di ritenzione)
Spettro di massa
acquisito al n°....
Figura 40: rappresentazione della natura tridimensionale della informazione
contenuta nei dati di una GC/MS
Il cromatogramma di massa (MC = mass chromatogram).
Con tutte le scansioni ripetute immagazzinate nel calcolatore, l'intensità di
qualsiasi ione può essere estratta da ciascuna scansione e posta in grafico in
funzione del tempo; questo grafico, detto appunto cromatogramma di massa o
profilo ionico (ion profile), può essere ottenuto anche in tempo reale e ricorda
quello della rivelazione selettiva degli ioni (SID) ma nei suoi confronti è meno
4
sensibile anche di un fattore 10 , a causa del tempo di campionamento molto
più breve usato nella scansione ripetuta. Il vantaggio di questo segnale è che,
tramite una oculata scelta del valore m/z posto in grafico, ottiene la selettività
dell'analisi per specifici composti (es. utilizzando lo ione molecolare) o per
particolari classi (es. utilizzando ioni chiave come m/z 91 per gli alchil
benzeni). I cromatogrammi di massa sono specialmente utili per un rapido
53
esame di complessi dati GC/MS onde determinare la presenza ed i tempi di
ritenzione di composti contenenti un determinato ione. Sebbene l’altezza del
picco gascromatografico diminuisca col porre in grafico soltanto uno ione,
anche il rumore di fondo verrà ridotto con conseguente "pulizia" dei tracciati.
Se sono conservati tutti gli spettri di massa registrati durante l'analisi, si può
generare un cromatogramma di massa per ciascun valore di m/z entro i limiti
di scansione dello spettrometro. Ovviamente si possono sommare le intensità
degli ioni per un (limitato) intervallo di masse come funzione del tempo;
questa variante ha dato prova di utilità specialmente nell'analisi di idrocarburi
policlorurati. Un composto come il mirex, che ha 12 clori, conterrà ioni
molecolari su valori di 13u. L'intero gruppo di picchi molecolari può essere
sommato per fornire una sensibilità aumentata con qualche sacrificio nella
specificità.
Cromatogrammi risolti o risoluzione dei picchi gascromatografici per fornire
spettri "puliti";
applicazione del cosiddetto algoritmo di Biller e Biemann (1974), ne esistono
però altri che attuano le stesse funzioni, ad es. quello Reimendal e Sjövall
(1973) o quello di Dromey et al. (1976).
In gascromatografia la risoluzione dei picchi è ottenibile per accentuazione
della forma e della pendenza dei picchi. Se si usa lo spettrometro di massa
come rivelatore gascromatografico si può usare come base per la risoluzione
dei picchi la registrazione della crescita e della caduta di intensità di svariati
ioni. Come è già stato accennato, i profili delle intensità di due ioni (molecolari
o non, basta che non siano comuni ai due composti) sono risolti persino se i
due composti non sono completamente separati dal gascromatografo. Sulla
base dei tracciati delle correnti dei singoli ioni, cioè sulla base dei
cromatogrammi di massa, si può determinare quali intensità ioniche siano rese
massime simultaneamente in ogni punto del gascromatogramma (tempo), cioè
in quale scansione. Il calcolatore può considerare questo insieme di ioni "in
fase " come spettro ed eliminare tutti quegli altri ioni le cui intensità non sono
massime nello stesso tempo. Tramite questa elaborazione del calcolatore si
possono ottenere automaticamente:
spettri di massa "puliti",
liberi da contributi del rumore di fondo (come lo spurgo della fase di
colonna) oppure di composti co-eluenti. Una buona sottrazione del
rumore di fondo o una risoluzione di uno spettro di miscela è di solito
un requisito precedente all'identificazione sia che questa venga eseguita
manualmente sia tramite tecniche informatiche. Sfortunatamente non è
così facile ottenere uno spettro libero da rumore di fondo con le
semplici tecniche di sottrazione spettro a spettro a causa delle
fluttuazioni delle intensità degli ioni del rumore di fondo e di
campione. Un metodo che può orientare la scelta su come operare la
sottrazione utilizza il cromatogramma di massa per localizzare i punti
di maggiore o minore concentrazione del composto in esame.
Naturalmente l'uso di questa tecnica richiede una certa preventiva
54
conoscenza del composto o del tipo di composti da esaminare. Biller e
Biemann hanno descritto un sistema di analisi dei dati dei
cromatogrammi di massa più automatico e più generale. In questo
metodo il sistema dati attua un'analisi del profilo del picco
(gascromatografico) sui cromatogrammi di massa di ciascuna massa
dell'intero intervallo esplorato. Alla fine di questo processo, la tabella
risultante contiene, per ciascun numero di scansione, soltanto quei
valori di m/z che divengono massimi in quella scansione, ed inoltre le
loro intensità assolute. Ciascuno di questi spettri viene indicato come
spettro di massa ricostruito. Sebbene alcuni dei picchi minori vadano
persi nell'operazione, le caratteristiche dell'aspetto generale dello
spettro sono mantenute e questi spettri "semplificati" possono essere
utilmente usati nella ricerca automatica in banca dati. Questo
procedimento non solo rimuove efficacemente il contributo degli ioni
del rumore di fondo (essi non divengono massimi, sono costanti ... più o
meno) ma anche elimina quegli ioni dovuti a sostanze con tempi di
eluizione molto ravvicinati e quindi causa di picchi gascromatografici
coeluenti. Lo spettro così prodotto viene detto "intensificato" (enhanced).
picchi gascromatografici risolti.
Il programma di Biller e Biemann identifica tutti i valori di m/z che
diventano massimi come abbondanza per ciascuna scansione e toglie
via da quella scansione tutti gli altri ioni. In pratica la concentrazione di
tutti gli ioni non diviene massima sempre nella stessa scansione a causa
delle concentrazioni variabili in sorgente ionica durante la eluizione
gascromatografia, quindi il programma considera (e mantiene) i valori
m/z qualche scansione avanti e indietro a quella in cui sono massimi.
L'uso di questo algoritmo costituisce anche un utile mezzo per
migliorare l'apparente risoluzione gascromatografica di una corrente
ionica totale. Le correnti degli ioni così estratti (e soltanto quelle)
vengono nuovamente sommate per ottenere una nuova corrente ionica
ricostruita in cui i componenti di un picco mal risolto
cromatograficamente di solito risultano risolti alla linea di base. Questa
nuova
corrente
ionica
ricostruita
può
essere
chiamata
gascromatogramma risolto tramite le masse (mass resolved
gaschromatogram) in quanto il programma che lo produce - detto di
Biller e Biemann dagli autori - utilizza i cromatogrammi di massa di
tutti i valori m/z nell'intervallo di massa esplorato dallo spettrometro.
Il processo può essere anche chiamato deconvoluzione dei picchi
(Figura 41).
55
Figura 41: Separazione delle singole correnti ioniche in una GC/MS, applicazione
dell’algoritmo di Biller e Biemann
56
Sviluppo di una analisi mediante gascromatografia spettrometria di massa
(GC/MS) "gasmassa"
Per ottenere prestazioni soddisfacenti di un sistema GC/MS le operazioni al GC ed al
MS devono essere portate ad una condizione o a un risultato che possano essere
considerati i migliori possibili. Un tempo in pratica si consideravano per prime le
esigenze dell’interfaccia poi quelle dello spettrometro indi quelle del
gascromatografo, se venivano prese in considerazione. Ancora oggi le esigenze del
GC vengono in secondo ordine. Questa leggerezza deve ovviamente nascere dalla
familiarità con questa apparecchiatura piuttosto che da indeterminazioni, pena il
fallimento della GC/MS. Cattivi risultati di GC/MS vengono imputati per buona
parte a cattive separazioni o condizioni gascromatografiche. Prima di eseguire
un'analisi per GC/MS deve essere perfezionata l'analisi per gascromatografia
normale; si sceglie la migliore colonna per il massimo di separazione e vengono
cercate le migliori condizioni di temperature e flussi.
Ora possono essere esaminati gli obiettivi del problema GC/MS:
a. quanto campione è disponibile?
b. quali picchi sono già stati identificati?
c. l'analisi di massa è richiesta per tutti i picchi?
d. quale percentuale del campione totale è costituita da solvente?
e. ci sono dei residui non volatili che riducono la quantità reale di sostanza volatile?
f. è stata effettuata una separazione precedente in classi chimiche? (la separazione
acidi/basi/neutri o per polarità può portare ad arricchimenti da 2 a 3 ordini di
grandezza ed è fortemente consigliata in miscele complesse)
Le risposte a queste domande sono né più né meno che la normale conoscenza del
campione e del problema di ricerca, ma fino a quando esse non saranno conosciute,
né l'analisi gascromatografica né tanto meno quella GC/MS potranno essere eseguite
al massimo delle loro capacità. Importante fattore nella determinazione dell'utilizzo
del campione in GC/MS è l'acutezza di un picco gascromatografico. Un picco
-8
componente di una miscela che è causato da 10 gin totale, nello spettrometro di
massa per una ampiezza a metà (altezza) del picco di 10 sec. darà un flusso di
10-9g/sec
in sorgente mentre il flusso sarà di 10-10g/sec per un picco di
corrispondente ampiezza di 100 sec. Con strumenti a scarsa sensibilità e con colonne
impaccate questo fattore era di notevole importanza, ora con le capillari la situazione
è nettamente migliorata, val la pena però di ricordare alcuni dei fattori che
influenzano l'aspetto netto di un picco:
1. la % di carico della fase stazionaria o spessore del film
2. la velocità di flusso del gas di trasporto
3. la temperatura
4. il tipo di colonna o il diametro della colonna.
57
Linee essenziali della GC/MS qualitativa.
Essenziali ad una analisi seria in GC/MS sono una buona pianificazione e
preparazione. Il procedimento illustrato nello schema I include lo scarto di quegli
artefatti che spesso costituiscono la peste degli esperimenti GC/MS. L’origine dei
contaminanti ed artefatti può essere la vetreria, i solventi, i reagenti, l'iniettore del
GC, la colonna GC o l'aria stessa del laboratorio. Quantità in tracce di sostanze
organiche provenienti da una di queste sorgenti possono assumere un grande
significato dopo l'operazione di concentrazione. Di conseguenza è molto importante
comprendere anche l'analisi di opportuni bianchi e di campioni di controllo persino
quando si sono prese tutte le precauzioni per evitare la contaminazione. Più
operazioni sono coinvolte prima della analisi GC/MS (cioè più il campione viene
"maneggiato") e più importante è il ruolo del bianco nello schema analitico. Prima di
un'analisi GC/MS è necessario un adeguato procedimento di controllo per assicurare
il corretto funzionamento dello strumento. Inoltre il campione dovrebbe essere stato
analizzato in precedenza in GC (FID) per stabilire l'opportuna concentrazione del
campione, il volume da iniettare e le condizioni analitiche. Dopo aver acquisito i dati
GC/MS ed aver raccolto un insieme di spettri sottratti dal rumore di fondo dei
componenti di interesse, il procedimento di identificazione può essere migliorato
rispetto alle risposte della ricerca automatica. Quando la ricerca in biblioteca sembra
aver avuto successo e ha fornito una o più risposte, l'operatore - analista deve
paragonare visivamente lo spettro di massa incognito con quelli proposti dalla
biblioteca e prendere la decisione finale. L'occhio umano è un ottimo sistema per il
riconoscimento e l'accoppiamento di forme. Un paragone tra spettri EI giudicato
corretto ed accettato deve essere seguito per completare l'identificazione da un
accettabile paragone tra (i tempi) gli indici di ritenzione sulla stessa colonna GC.
Gli indici di ritenzione (RI) possono essere determinati tramite iniezione
contemporanea di una miscela di n-alcani. Purtroppo questi indici di ritenzione non
sono aggiunti alle banche dati commerciali perché non c'è e non può esserci accordo
sull'insieme di condizioni o sulla colonna GC di riferimento. Di conseguenza molti
laboratori si costruiscono la propria banca dati di spettri e di tempi di ritenzione (o
indici).
Il punto debole di una analisi automatica GC/MS tramite calcolatore è il
procedimento di ricerca in banca dati "biblioteca" per l'identificazione dei
componenti; questo procedimento paragona un insieme complesso ma incompleto di
dati con un altro usando un algoritmo che si basa su approssimazioni e che utilizza
dati semplificati. Il risultato ha un elevato potenziale di errori; possono verificarsi
con frequenza imprevedibile "identificazioni" false positive (come pure false
negative). Nonostante tutti i suoi limiti, la ricerca in biblioteca è un utilissimo aiuto
all'interpretazione ma deve essere considerata soltanto un punto di un rigoroso
procedimento di identificazione.
58
6FKHPD,'LDJUDPPDGLIOXVVRULDVVXQWLYRGHOSURFHVVRGLDQDOLVLTXDOLWDWLYDSHU*&06
matrice
campione
estratto
campione
GC-FID-...
estratto
campione
vagliato
HVWUD]LRQHFRQFHQWUD]LRQH
bianco
paragone
estratto
bianco
spettro di massa
EI di buona
qualità + tempo
di ritenzione
QRQ
paragone
visivo
degli spettri
ULVSRVWD
insieme (ridotto)
dei dati GC/MS
WURYDWR
ricerca in
biblioteca
WURYDWR
ULVSRVWDUHVSLQWDGDOO¶RSHUDWRUH
DFFHWWDWD
paragone con
un campione
autentico EI-MS, RI
QHVVXQDFRQIHUPD
LOFDPSLRQH
QRQqGLVSRQLELOH
sintesi del composto
richieste nuove
informazioni
− spettro CI: PM
− massa esatta
(composizione elementare)
− interpretazione ”manuale”
− ricerca bibliografica
− altri studi sul campione e
sua storia
− comportamento
gascromatografico
RWWHQXWR
QRQVRQR
SRVVLELOL
struttura ipotizzata
QHVVXQDDOWUD
TXHLPLQLPL
FULWHULGL
LQWHUSUHWD]LRQH
LQIRUPD]LRQH
composto identificato
in modo certo
composto ipotizzato
59
composto
non identificato
Linee essenziali della GC/MS quantitativa
L’utilizzo della gascromatografia spettrometria di massa (GC/MS) nell’analisi
quantitativa è collegato all'introduzione negli anni '60 della tecnica di rivelazione
selettiva di ioni "Selected Ion Monitoring" (SIM). Come si è già visto nelle pagine
precedenti questa tecnica consiste nel focalizzare lo spettrometro di massa su uno o
più ioni, l'applicazione analitica quantitativa comporta il confronto dell'intensità
della corrente ionica generata dagli ioni della sostanza in esame rispetto a quella
prodotta dagli ioni di una sostanza presa come standard di riferimento e aggiunta in
concentrazione nota al campione. Si ha quindi il controllo specifico di uno o più ioni
di massa m/z caratteristici delle sostanze in esame mentre molecole che non
producono ioni a questi valori non vengono rivelate (lo spettrometro in questo caso è
utilizzato come rivelatore selettivo del gascromatografo). Rispetto alle tradizionali
tecniche gascromatografiche la GC/MS-SIM costituisce un aumento di specificità (in
quanto il campione in esame viene identificato sia dal tempo di ritenzione gascromatografico che da uno o più ioni specifici selezionati) e di sensibilità (infatti è
possibile dosare quantità dell'ordine dei 10-9 – 10-14g).
Il seguente schema riassume il protocollo per l'applicazione della GC/MS come
tecnica di saggio analitico
campione
↓
É
formazione del derivato
Ë
←
aggiunta dello standard interno
omogeneizzazione, estrazione con solvente
estratto
↓
purificazione tramite HPLC, TLC, ...
estratto arricchito
nel componente
↓
GC/MS
rapporto del componente
rispetto allo standard interno
↓
paragone con la curva standard
concentrazione del
componente nel campione
Il procedimento appare concettualmente semplice, ma soltanto mediante un'accurata
attenzione ai dettagli ed una conoscenza dei principi coinvolti in ogni passaggio si
possono ottenere risultati accurati ed attendibili.
Punti fondamentali preliminari alla quantitativa:
1. analizzare il campione qualitativamente
2. preparare un elenco di composti da determinare quantitativamente (analiti)
3. selezionare un appropriato standard interno per ciascun analita
4. escogitare un'accettabile "matrice di controllo" per la calibrazione/convalida
Le procedure per l'analisi quantitativa devono tener conto degli effetti di matrice,
delle perdite di analita durante l'estrazione e la concentrazione, delle variazioni del
60
comportamento nell'iniettore e nella colonna GC. Il caso inoltre di analisi di più
componenti nella stessa matrice poi non è di facile esecuzione.
La risposta del rivelatore, di solito l'area del profilo della corrente di uno ione
caratteristico, è direttamente correlata alla quantità ma non è necessario e soprattutto
non è opportuno calibrare questa risposta mediante standardizzazione esterna. Di
conseguenza viene usato uno standard interno (SI) e viene determinato un rapporto
di risposte che ovviamente è correlato alla quantità di analita. Viene eseguita la
calibrazione del rapporto delle risposte analizzando soluzioni contenenti diverse
quantità note di analita insieme con una quantità costante di standard interno. Da
queste misure si ricava la "curva standard", un grafico dei rapporti delle risposte
rispetto alla quantità o concentrazione dell'analita. Lo scopo di questo procedimento
è di eliminare o rendere minimi gli errori associati alle variazioni nell'iniettore,
colonna, rivelatore. Se lo standard interno viene aggiunto all'estratto appena prima
della GC/MS, allora l'analisi quantitativa si riferisce soltanto all'estratto concentrato.
Se lo scopo è quantificare la sostanza nella nostra matrice originale sarà necessario
determinare il recupero dell'analita dalla matrice; questa operazione è tediosa,
difficile e non priva di errori; è meglio evitarla quando è possibile. La soluzione più
semplice al problema è di aggiungere (ed equilibrare) lo standard interno
direttamente al campione (matrice) originale; purtroppo questo non è sempre
possibile.
Lo schema II illustra un procedimento molto tollerante rispetto a inconsistenze di
recupero, perdite durante la concentrazione del campione e persino perdite dovute a
rovesciamenti accidentali. Affinché il procedimento rimanga valido è necessario
soltanto dimostrare che il rapporto analita/standard interno rimanga inalterato.
Poche strategie di analisi quantitativa sono superiori alla GC/MS con standard
interno, naturalmente la scelta dello standard interno è il fattore cruciale di questa
procedura. Per poter arrivare ad un dosaggio accurato e preciso di molecole presenti
in matrici complesse quali quelle biologiche come omogenati di tessuto, plasma od
urine è necessario effettuare adeguati processi di purificazione del campione prima
che questo possa essere iniettato nel sistema GC/MS. Una volta estratte e purificate
le sostanze da analizzare, queste generalmente devono essere convertite in molecole
meno polari e più volatili (e quindi più adatte all'analisi GC) tramite manipolazioni
chimiche cioè reazioni di formazione di derivati (es. eteri, esteri ecc.). L'analisi
quantitativa vera e propria inoltre dipende da un numero di variabili strumentali
difficili da mantenere costanti anche tra misure effettuate nella stessa giornata.
Quindi la strategia che viene seguita in GC/MS per superare sia il problema della
resa durante la purificazione e preparazione del campione, sia le variabili strumentali
è l'aggiunta al campione in esame di uno standard di riferimento (standard interno,
S.I.) in quantità nota prima di tutti i passaggi preparativi.
61
6FKHPD,,'LDJUDPPDGLIOXVVRULDVVXQWLYRGHOSURFHVVR
GLDQDOLVLTXDQWLWDWLYDSHU*&06
matrice HTXLOLEULR standard HTXLOLEULR matrici di
campione
interno (S.I.)
controllo “drogate”
HVWUD]LRQHFRQFHQWUD]LRQH
campione
estratto
estratti di
controllo
GHULYD]LRQH
DQDOLVL*&06
risposta
rapporto
analita: S.I.
curva
standard
risposte
con rapporti
calibrati
concentrazione dell’analita
nella matrice (campione)
La scelta dello standard interno e tecnica di diluizione isotopica.
Tenendo presente che lo scopo dello standard interno (SI) è di stabilire un rapporto
di concentrazioni con l'analita nella matrice campione che sia accuratamente riflesso
dal rapporto di risposta di ioni preselezionati misurati nel passaggio analitico della
GC/MS, i seguenti fattori sono determinati per le scelte.
1. Non deve essere un componente della matrice campione
2. Deve avere proprietà fisiche e chimiche molto simili a quelle dell'analita
3. L'indice (tempo) di ritenzione gascromatografico deve essere molto simile a
quello dell'analita
4. Lo ione caratteristico dovrebbe avere un valore di m/z simile a quello dell'analita.
Il primo punto si spiega da solo. Il secondo e il terzo sono di vitale importanza;
l'analita e il suo standard interno dovrebbero equilibrarsi in modo eguale tra i vari
siti leganti potenziali nella matrice campione. Tali siti possono includere sostanze
disciolte o sospese ma anche le pareti del contenitore del campione. Se si è nel caso di
una estrazione liquido - liquido, il coefficiente di ripartizione tra le fasi acquosa e
organica deve essere eguale o, se si è nel caso di adsorbimento su una fase solida, le
proprietà di adsorbimento e di recupero devono essere le stesse. Esistono in potenza
possibilità di errori grossolani se non vengono rispettate queste condizioni.
Egualmente importante, a livello critico per la GC/MS è che l'analita e lo standard
interno (SI) mostrino anche comportamenti molto simili all'iniezione e nella colonna
GC. I tipi di SI che soddisfano i criteri desiderati possono essere così riassunti:
1. un isomero di posizione molto simile; deve però essere separato dall'analita
sulla colonna GC dal momento che entrambi hanno lo stesso ione caratteristico.
2. un omologo o un analogo strettamente correlato; può avere indice di ritenzione
(RI) eguale o differente a quello dell'analita perché i due ioni da registrare sono
di solito diversi (ma preferenzialmente non differenti di più di 20 unità di
massa)
62
Il primo approccio è comune ad altre tecniche analitiche quali GC, HPLC, ma in
questo caso molto più selettivo in quanto l'accoppiamento GC/MS permette
l'identificazione non sono sulla base del tempo di ritenzione ma anche dello specifico
ione di massa m/z selezionato. Esistono documentate prove sperimentali che
mostrano come grandi errori possano risultare dall'uso di uno SI non strettamente
legato come struttura all'analita. Sebbene possano esistere numerose possibili scelte
per uno standard interno adatto ad un particolare analita, l'unico tipo che in effetti
garantisce a pieno di soddisfare tutte le condizioni richieste è l'analogo marcato con
isotopi stabili. Le alterazioni nella struttura chimica e di conseguenza nel
13
2
comportamento fisico e chimico causate dall'introduzione di pochi atomi di C o H
isotopicamente puro in una molecola sono così sottili che soltanto la spettrometria di
massa può rivelare questa differenza in modo certo ai livelli di sensibilità richiesti.
Analita e standard interno si comportano in modo identico in tutti i processi
necessari per purificazione e derivazione. La tecnica di aggiungere un analogo
marcato per misurare quantitativamente una sostanza è nota come diluizione
isotopica (GC/MS-ID). La diluizione isotopica ha il vantaggio che la calibrazione dei
rapporti di risposta è semplice, diretta e mostra una linearità oltre almeno due ordini
di grandezza nella concentrazione dell'analita quando le abbondanze degli ioni sono
corrette per una qualsiasi sovrapposizione. Inoltre la convalida è facilmente ottenuta
mediante la dimostrazione che né la matrice campione né il sistema GC esercita un
effetto selettivo sul recupero dell'analita e dello standard interno. Più importante
ancora, la precisione e l'accuratezza del metodo sono facilmente determinate e sono
di solito eccellenti. Questi sono criteri importanti per giudicare l'accettabilità di un
metodo, sulla base della stima dell'errore totale. Gli isotopi stabili che vengono
2
13
15
18
generalmente utilizzati per la marcatura sono H, C, N e O, tuttavia uno dei
migliori S.I. in termini di precisione, accuratezza, riproducibilità e basso costo è
l'analogo tri-deuterato dell'analita, marcato in posizioni stabili. Infatti i mono
deuterati non possono essere efficientemente usati a causa delle interferenze
2
13
derivanti dagli isotopi naturali di H e C. Nell'impiego dei di-deuterati bisogna
tener conto delle piccole interferenze dello ione m+2 dovuto all'abbondanza naturale
dell' 18O. D'altra parte, gli analoghi tetra-deuterati od oltre avrebbero un tempo di
ritenzione gascromatografico troppo diverso rispetto all'analita, causando una
diminuizione dell'accuratezza della rivelazione dello spettrometro di massa in
quanto l'analisi strumentale non avverrebbe simultaneamente sui due ioni. Nei trideuterati invece la differenza di tre unità di massa tra l'analita ed il suo standard
interno rende minime le interferenze delle abbondanze isotopiche naturali dovute al
13
C ed all' 18O e mantiene i tempi di ritenzione gascromatografici tra lo standard
interno e l'analita pressoché identici.
Si noti che un composto con 13C risulta marcato in modo molto stabile, ma con 2H e
18
O può potenzialmente scambiare con atomi di ossigeno o con protoni della matrice.
La stabilità chimica di uno standard interno così marcato deve essere controllata
prima dell'uso, sia nella matrice campione che nelle soluzioni standard conservate.
Un inconveniente nella scelta di composti tri-deuterati come standard interni è che
spesso questi non sono disponibili in commercio ed è quindi necessario sintetizzarli
nel proprio laboratorio. Per questo tipo di applicazione, la sintesi di marcati con
deuterio deve soddisfare i seguenti requisiti:
63
la marcatura isotopica deve avvenire in posizione ben controllata ed in modo da
assicurare la stabilità della deuterazione durante la conservazione e l'impego del
composto;
– tutte le sequenze sintetiche devono garantire l'integrità della struttura, in
particolare dei gruppi funzionali presenti, e non ne deve essere alterata la
stereochimica;
– tutte le rese dei singoli passaggi devono essere elevate;
– il precursore da cui si inizia la sequenza sintetica deve essere facilmente reperibile
in commercio.
In ogni caso, sia che lo S.I. venga acquistato, sia che venga sintetizzato, è necessario
determinarne la percentuale di deuterazione e la distribuzione isotopica del tri-, di-,
mono- e non-deuterato. Questo tipo di analisi è importante soprattutto per
determinare la percentuale di non-deuterato presente nello standard interno che va a
sommarsi al composto endogeno durante l'analisi (infatti questi due composti hanno
lo stesso peso molecolare). Per questo la percentuale di composto non-deuterato
presente nello S.I. deve essere la più piccola possibile. Infine non si devono mai
utilizzare quantità di S.I. molto più elevate rispetto alle quantità di analita da
determinare perché la percentuale di non deuterato viene ad influire in maniera
tanto maggiore quanto minore è la concentrazione dell'analita. Alcuni autori hanno
usato quantità relativamente elevate di standard interno allo scopo di sfruttare
l'effetto di trasporto (carrier) in modo da rendere minime le perdite di analita dovute
ad adsorbimento su siti attivi alla superficie dei recipienti di estrazione e della
colonna cromatografica. Questo effetto è significativo a concentrazioni di analita
molto basse. Altri autori però contestano le affermazioni sull'utilità dell'effetto. E'
incontestabile però il fatto che una delle comuni cause di scarsa sensibilità nelle
analisi GC/MS è la perdita per adsorbimento dell'analita in colonna. Spesso la
sensibilità aumenta dopo un numero di iniezioni di soluzione di analita. Comune
pratica gascromatografica è la "mestica" (priming) delle colonne. L'effetto di tale
operazione si fa sentire quando una colonna è stata prima usata per analisi di
composti chimicamente differenti. Soluzione ideale sarebbe che una colonna separata
venga usata per ciascuna delle analisi quantitative in corso. E' comunque
consigliabile non utilizzare per dosare composti acidi una colonna precedentemente
usata per composti basici. Un pericolo insito nel metodo "di mestica" è che un po' del
composto adsorbito possa essere lavato via durante le successive iniezioni dando
come risultato un valore erroneamente elevato per le concentrazioni. Questa
potenziale sorgente di errore è facilmente appurabile analizzando un campione
bianco (cioè un fluido corporeo contenente lo standard interno ma non l'analita)
prima di iniziare le analisi degli incogniti.
–
La scelta degli ioni da selezionare
La scelta degli ioni può influenzare sia la sensibilità che l'accuratezza del metodo.
Bisogna infatti scegliere uno ione che venga prodotto in quantità abbondante durante
il processo di ionizzazione e che sia specifico del composto in esame. Generalmente si
sceglie lo ione molecolare se abbastanza intenso oppure uno ione di frammentazione
con la massa più alta possibile: più alta è la massa, minore è la probabilità di trovare
un altro composto che produca esattamente lo stesso ione m/z. Il processo di
formazione dei derivati può essere sfruttato per aumentare il peso molecolare del
64
composto tramite la formazione di composti adatti (nelle acilazioni, ad esempio, si
potrà utilizzare l'anidride eptafluorobutirrica, che introduce 7 atomi di fluoro invece
della trifluoroacetica che ne introduce solo 3). Un'altra possibilità per aumentare la
specificità dell'analisi è quella di focalizzare lo strumento contemporaneamente su
due ioni della sostanza in esame e di controllare che il loro rapporto rimanga
costante ed uguale a quello di uno standard iniettato puro. Nel caso in cui questo
rapporto vari, si ha la certezza della presenza di un inquinante che va ad interferire
con l'analisi. Estendendo il ragionamento si potrebbe pensare di aumentare ancora il
numero di ioni da seguire per composto dosato. Il numero può essere valutato con
un esempio pubblicato da Sphon nel 1978 riguardante il dietilstilbestrolo (DES),
tramite ricerca mediante calcolatore su una base dati della consistenza di circa 30.000
spettri (MSSS). Una tale ricerca rivela che esistono 1144 composti nell'elenco che
potenzialmente potrebbero dare una falsa risposta positiva per il DES se si segue
soltanto lo ione molecolare 268 mediante SIM. Cinquantasette di questi composti
hanno lo ione m/z 268 come picco base. Se vengono usati quindi oltre alla massa
dello ione i dati di intensità relativa, 149 composti verranno trovati con un picco a
m/z 268 con intensità relativa tra il 40 ed il 100% del picco più intenso. Se si
comprende nella nostra rivelazione un secondo ione a massa m/z 239 con un
intervallo di intensità tra il 30 ed il 100%, il numero di possibili composti scende a 5.
Se esaminiamo la nostra banca di dati alla luce di 3 ioni, cioè m/z 268, 239 con gli
intervalli di intensità già citati e m/z 145 con un intervallo di intensità tra il 40 e
100% si trova un solo composto il DES. Da ciò si può comprendere come sia inutile
aumentare a dismisura il numero di ioni da controllare per composto, anche perché
si ritornerebbe verso i valori di sensibilità tipici di uno spettro completo. Questi
problemi possono venir superati lavorando in alta risoluzione, se cioè si ha la
possibilità strumentale di poter distinguere tra due ioni la cui massa differisce solo
sulla seconda o terza cifra decimale. D'altra parte non bisogna dimenticare che
l'aumento della risoluzione strumentale porta alla diminuzione della sensibilità, e
quindi se si sta lavorando con composti presenti in bassa concentrazione è necessario
lavorare in condizioni strumentali che permettano di ottenere il massimo sia in
termini di sensibilità che di specificità.
Naturalmente uno strumento che sia in grado di registrare tutti gli ioni
simultaneamente oppure di registrare in rapida sequenza ioni formati
simultaneamente ed intrappolati fino alla registrazione non soffre di limitazioni di
sensibilità nella registrazione dello spettro completo, il dosaggio può essere eseguito
anche mediante scansioni ripetute. Di conseguenza negli strumenti a trappola ionica
il guadagno di sensibilità che si ottiene con una registrazione di ioni preselezionati è
soltanto doppio rispetto a quella di uno spettro completo.
Processi di formazione del derivato
Per una corretta analisi gascromatografica di composti polari è necessaria la loro
trasformazione in composti meno polari e più volatili tramite reazioni di derivazione
soprattutto se si effettuano determinazioni di sostanze presenti in tracce di matrici
biologiche. Il processo di formazione del derivato deve rispondere ad alcuni requisiti
quali:
– la reazione deve essere quantitativa e non deve introdurre nel campione
interferenze dovute ai reagenti
65
–
–
–
i derivati devono essere stabili e non devono subire degradazione nel processo
GC/MS.
i derivati devono avere uno spettro di massa che fornisca una alta corrente ionica
per il valore m/z registrato
nel caso di determinazioni simultanee di più composti è necessario che la
reazione avvenga in modo quantitativo su tutti.
Analisi quantitativa
La determinazione quantitativa di un composto in un campione incognito viene
comunemente effettuata tramite il metodo della predizione inversa utilizzando
un'opportuna curva di calibrazione costruita aggiungendo quantità note e scalari del
composto in esame ed una quantità di S.I. a campioni bianchi. Un'identica quantità di
S.I. deve essere aggiunta ai campioni incogniti. I campioni della curva di calibrazione
devono passare attraverso tutto il metodo di estrazione, purificazione e derivazione
come i campioni incogniti. Dopo l'analisi viene costruita una curva di regressione
(lineare o non lineare) che mette in correlazione i rapporti delle intensità ioniche del
composto in esame rispetto allo S.I. con le concentrazioni degli standard di
calibrazione. Utilizzando questa curva è quindi possibile risalire alla concentrazione
di un campione incognito dal suo rapporto con lo S.I.
Una corretta interpretazione delle curve di calibrazione è l'unico modo per ottenere
dei buoni risultati, ed in particolare l'uso accurato di esse richiede l'esatta conoscenza
della loro forma. Se non esistono interferenze reciproche tra l'analita e lo S.I., allora la
curva di calibrazione è una linea retta passante per l'origine e si può applicare il
metodo della regressione lineare. In tutti gli altri casi l'assunzione dell'esistenza di
una relazione lineare introduce errori sistematici nel calcolo delle concentrazioni, con
notevole diminuzione della accuratezza delle analisi. E' però quasi sempre possibile
approssimare la curva di calibrazione ad una retta, passante o meno dall'origine,
utilizzando un intervallo di concentrazioni sufficientemente ristretto ed una
opportuna quantità di S.I. (intermedia tra il punto più basso e quello più alto della
curva): in questo caso è ancora applicabile la regressione lineare. Un caso limite è
quello rappresentato dal metodo detto "bracketing" che rappresenta il metodo più
preciso per il calcolo di concentrazioni incognite e che è quello attualmente utilizzato
dai laboratori facenti parte del National Bureau of Standards (NBS) per la certificazione
di standard da utilizzare come riferimento in tutti i laboratori. Questo metodo
consiste nella misura di campioni incogniti tra due standard di riferimento la cui
concentrazione sia molto vicina a quella del campione incognito. Questo implica che
la concentrazione di quest'ultimo sia già stata approssimativamente determinata
tramite uno dei metodi meno accurati a disposizione (metodi immunoenzimatici,
radioimmunometrici, ecc.). I campioni e gli standard di riferimento sono preparati in
modo tale da avere rapporti con lo S.I. in un intervallo ristretto e molto vicino a 1 (si
cerca ad esempio di aggiungere al campione tanto S.I. da avere un rapporto di 1 e si
preparano standard di riferimento che abbiano rapporti di 0,75 e 1,25). Ogni
campione incognito deve essere determinato tra i due standard di riferimento più
vicini, che abbiano concentrazione appena inferiore e appena superiore a quella del
campione. Il metodo del "bracketing" è estremamente preciso ed accurato, tuttavia
non sempre può essere applicato nei laboratori essendo complicato, lungo e piuttosto
costoso. E' stato tuttavia proprio questo metodo quello prescelto dal Community
66
Bureau of Reference (BCR) nell’ambito del progetto messo a punto nel 1975 dal gruppo
di Clinica Chimica della Comunità Europea per la certificazione di alcuni steroidi in
plasma umano liofilizzato da poter utilizzare come standard di riferimento definitivi
nel campo della Clinica Chimica. Questo si è reso necessario per unificare gli
standard di riferimento da utilizzare nella Chimica Clinica in cui vengono utilizzati
necessariamente metodi più "routinari" ed economici e quindi probabilmente meno
accurati e precisi rispetto alla GC/MS-ID.
67
LC/MS: l’abbinamento cromatografia liquida e spettrometria di massa
La quantità di informazioni deducibili da una GC/MS dimostra l'utilità
dell'accoppiamento in linea di un metodo di separazione, come la cromatografia, con
un metodo di identificazione, come la spettrometria di massa. E' quindi naturale
l'interesse alla possibilità di accoppiare la cromatografia liquida ad elevate
prestazioni (HPLC) con la spettrometria di massa (MS). Lo spettrometro di massa in
un sistema integrato LC/MS può servire come rivelatore universale (o almeno come
rivelatore che risponde ad una estesa gamma di soluti) mancante alla HPLC e come
rivelatore sensibile (in quanto il suo limite inferiore di rivelabilità è abitualmente
attorno al picogrammo).
Il sistema elaboratore per l'acquisizione e il trattamento dei dati non richiede
particolari programmi perché tutti i metodi e gli algoritmi sviluppati ed utilizzati per
la GC/MS possono essere applicati senza modifiche alla LC/MS. L'elaboratore
accresce le prestazioni di questo metodo analitico nello stesso modo della GC/MS,
permettendo ad esempio di registrare uno spettro completo o una corrente di uno
ione scelto in precedenza, di utilizzare queste correnti per districare i segnali di
picchi cromatografici mal separati, o per effettuare dosaggi quantitativi con l'aiuto di
riferimenti interni.
L'accoppiamento LC/MS è stato tentato già molti anni fa (Ryhage 1964 con
interfaccia, Tal'Rose 1968 con accoppiamento diretto) ma soltanto dal 1973 appaiono
lavori prodotti da diversi laboratori. Non esiste tuttora una vera e propria soluzione
generale ai numerosi problemi di questo genere di accoppiamento mentre si hanno
numerose soluzioni tecniche che possono portare a successi per limitate categorie di
sostanze ma a dei fallimenti per altre. Però le sorgenti ESI e APCI (nelle loro
varianti) stanno attualmente coprendo quasi tutto il mercato delle LC/MS.
Le difficoltà di tutti i metodi LC/MS provengono da una parte dalle differenti
proprietà fisiche di ciascuno dei sistemi solventi abitualmente usati in HPLC (acqua,
solventi organici, tamponi, ...), proprietà che impediscono di considerare una
differenza importante rispetto all'eluito su cui concepire un separatore selettivo; a
queste proprietà si aggiungono elevati flussi che impongono interfacce con capacità
di arricchimento molto superiori a quelle per GC/MS. Bisogna anche considerare che
le caratteristiche dell'eluente in gascromatografia (azoto, elio, idrogeno, ...), per
dimensioni molecolari, inerzia chimica, proprietà fisiche ..., sono assai diverse da
quelle dell'eluito consentendone una facile separazione ed eliminazione. D'altra parte
le difficoltà provengono anche dall'intenzione di applicare questo metodo LC/MS a
quelle sostanze difficili, perché fragili o non volatili, che non possono essere
analizzate con la GC/MS. Si potrebbe per altro osservare che, se una sostanza non
determinabile per cromatografia in fase gassosa può esserlo per cromatografia in fase
liquida, non è affatto corretto generalizzare che tutte le sostanze non analizzabili in
GC/MS siano per forza analizzabili in LC/MS.
I benefici della LC/MS possono essere così riassunti:
–
per il "cromatografaro": un rivelatore universale che all’occasione diviene
specifico, capace di essere qualitativo e quantitativo, e che fornisce
l’identificazione dei composti;
–
per lo "spettrometrista": analisi di composti non separabili mediante
gascromatografia, separazione di isomeri, sistema di analisi per introduzione
diretta facilmente utilizzabile in modo automatico.
68
L’interfaccia
Considerando un approccio tra strumenti convenzionali, questo dispositivo dovrà
rispondere ai seguenti requisiti, comuni nei casi di GC e di LC tranne che nell'ultimo:
1. eliminare l'eccesso di eluenti, portando i flussi in entrata del MS ai valori
opportuni, sopportabili dai sistemi di pompaggio
2. provocare una caduta di pressione (da atmosfera a 10-4-10-5mbar)
3. essere sufficientemente inerte, per non provocare la decomposizione delle
sostanze che lo attraversano
4. avere volume morto minimo per non compromettere la risoluzione
cromatografica
5. disporre di buona resa e di elevata capacità di arricchimento per ottenere la
massima sensibilità in condizioni di vuoto soddisfacenti
6. determinare il passaggio allo stato di vapore delle soluzioni provenienti dalla LC.
Le sostanze in uscita dai gascromatografici infatti si trovano già allo stato di vapore e
l'interfaccia (se presente), opportunamente riscaldata, non dovrà che trasferirle in
sorgente, mentre nel caso dei cromatografi liquidi dovrà provvedere anche alla loro
vaporizzazione per riscaldamento. Se si considera che la LC trova applicazione nel
campo delle sostanze termolabili (lavora tra 25 e 50°C), appare subito quale difficoltà
esista nell'accoppiamento LC/MS; di solito si cerca di ovviare a tale contraddizzione
rendendo più breve possibile la fase di riscaldamento. Una considerazione che rivela
tutta la necessità di pompaggio in un sistema LC/MS scaturisce dal confronto dei
volumi di vapore sviluppati da alcuni solventi usati come fase mobile in HPLC con la
capacità di pompaggio di 10 ml/min delle comuni pompe a diffusione usate nello
spettrometro. Da 1 a 3 ml/min di liquido corrispondono, in condizioni standard, per
il n-esano 180-540 ml/min di vapore, per il metanolo 550-1650 e per l'acqua 1250-3750
ml/min.
Tipi di interfacce LC/MS
–
–
–
–
-
introduzione liquida diretta (DLI)
trasporto meccanico ("nastro trasportatore") (MB)
formazione di aerosol (PB)
flusso continuo in bombardamento con atomi veloci (CF-FAB)
termonebulizzazione (TSP)
elettronebulizzazione (ESI)
ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)
Introduzione diretta di liquidi (DLI= direct liquid introduction)
Consiste nell’introdurre una minima parte (circa 1%) dell’eluito proveniente dalla
colonna direttamente nello spettrometro di massa attraverso un forellino (5 µ)
(Figura 42). Nel vuoto della sorg ente sia il solvente che la sostanza vaporizzano
istantaneamente generando goccioline. Gran parte del solvente viene risucchiato e
condensato da una criopompa (o da un sistema freddo che circonda la sorgente);
poiché però i vapori del solvente sono di gran lunga più abbondanti della sostanza,
questa ultima viene ionizzata con un processo di ionizzazione chimica (CI) in cui i
69
vapori del solvente costituiscono il gas ionizzante. I principali vantaggi di questa
interfaccia sono costituiti dalla sua semplicità costruttiva (è niente altro che un
sistema di introduzione diretta) e dal fatto che si possono analizzare composti polari
e termolabili senza timore di decomposizione termica e di processi di
contaminazione. Gli svantaggi sono che opera soltanto in ionizzazione chimica (per
altro molto dipendente dalle condizioni sperimentali, è il solvente che costituisce il
reagente), che necessita di tamponi volatili (es. acetato di ammonio), che ha solo
moderata sensibilità (opera su una partizione del flusso), che il forellino può ostruirsi
facilmente. Inoltre questo sistema può essere utilizzato solo con strumenti
quadrupolari meno sensibili ai problemi di isolamento elettrico (un sistema
magnetico ha 3000V di potenziale di accelerazione in sorgente contro 10V di un
quadrupolo).
Sorgente ionica
(Regione di ionizzazione chimica)
Interfaccia
Partizione esterna
(External Split)
Da HPLC
10 µl/min
Diaframma di acciao
1 ml/min
(al rivelatore UV)
Figura 42: sistema per LC/MS: introduzione diretta di liquidi
Trasporto meccanico "nastro trasportatore" (MB=moving belt)
La soluzione proveniente dalla colonna HPLC viene depositata su un nastro di
materiale sintetico (Kapton) che si muove in continuo trascinato da una puleggia
(Figura 43). Il nastro porta la soluzione dapprima sotto un riscaldatore a raggi
infrarossi che vaporizza gran parte del solvente, in seguito in una camera collegata al
sistema di pompaggio in modo da permettere l'allontanamento delle ultime tracce di
composti volatili. Arriva quindi in sorgente dove un rapidissimo riscaldamento
vaporizza la sostanza. Quindi il nastro ritorna indietro passando attraverso una
camera riscaldata per eliminare i residui. La tecnica permette di separare il soluto
dalla fase mobile che viene fatta evaporare prima che il soluto raggiunga la sorgente
dello spettrometro di massa. Questo tipo di interfaccia è utilizzabile sia con strumenti
magnetici che con strumenti quadrupolari.
Poiché la quantità di solvente che arriva in sorgente è minima possono essere
ottenuti spettri con ionizzazione per interazione elettronica (EI) oppure con
ionizzazione chimica (CI) usando come agente ionizzante il gas più appropriato per il
70
composto in esame, senza particolari vincoli. Lo spettro non è influenzato dal
solvente. La tecnica favorisce i composti semi-volatili e mostra buona sensibilità con
colonne microbore.
Gli svantaggi risiedono nel fatto che vengono persi i composti molto volatili, i
composti sensibili al calore si decompongono, il nastro mostra effetti di memoria
(picchi fantasma), non sopporta elevate quantità di acqua (flusso non superiore a 0,3
ml/min), usa tamponi volatili a meno di cercare di "raspar via" gli inorganici dal
nastro. Un'altra limitazione alquanto fastidiosa è che, avendosi delle parti in
movimento ed un nastro che subisce notevoli sbalzi di temperatura, si verificano di
frequente inconvenienti meccanici (oltre ai problemi di contaminazione).
Malgrado ciò questo sistema è stato molto usato negli anni scorsi (anche perché non
erano ancora disponibili altri); oggi è in disuso.
eluato da colonna HPLC
(1)
Spettrometro di massa
(3)
Tenute
Nastro mobile
(4)
(6)
Sorgente
Isolatore
(7)
(5)
(2)
+
(8)
Ruote motrici
Pompa da vuoto Pompa da vuoto
1° stadio
2° stadio
Figura 43: Sistema per LC/MS a nastro trasportatore, “cinghia mobile” moving belt
(MB)
Accessori:
(1) linea di drenaggio, in modalità di partizione per la rimozione dell’eccesso di soluzione, oppure in
modalità di addizione post colonna di reagente (ad esempio matrice per FAB); (2) depositore per
semplice contatto, in ceramica sinterizzata, spruzzatore a getto (gas nebulizzato), inclinato ad angoli
diversi (45-90°); (3) pre riscaldatore della soluzione, ventilatore o riscaldatore ad infrarossi nelle prime
versioni; non necessario per micro HPLC o FAB; (4)riscaldatore del campione; (5) riscaldatore per
pulire, usato nella modalità EI e CI e non in FAB; (6) sorgente di ionizzazione (EI, CI, FAB); (7) sistema
pulente del nastro (strofinio meccanico, bagno di lavaggio); (8) meccanismo di allineamento della
sonda
71
Formazione di aerosol (PB particle beam)
Questa interfaccia prende origine dal sistema MAGIC (monodisperse aerosol generator
for interfacing chromatography) (Figura 44). L’eluito dal LC entra nell’interfaccia
assieme a un flusso di elio e forma così un aerosol di goccioline di solvente che si
muovono verso la camera di desolvatazione. La camera è tenuta a pressione e
temperatura ambiente, in essa si ha la vaporizzazione del solvente e la produzione di
una miscela composta da vapori, particelle di analita e elio. Questa miscela entra in
una regione a bassa pressione (ottenuta da una pompa rotativa) attraverso uno
stretto ugello, durante questo processo la miscela accelera e forma un getto
supersonico che contiene un raggio centrale di particelle orientato in linea retta. I
vapori di solvente e l'elio sono "schiumati via" e rimossi per pompaggio da una serie
di due ugelli e schiumatori, per cui entra in sorgente (soltanto) il raggio delle pesanti
particelle dell'analita. Queste ultime collidono su una parete riscaldata del corpo di
sorgente e sono ionizzate per impatto elettronico (EI) o per ionizzazione chimica (CI).
I principi di funzionamento di questa interfaccia ricordano da vicino quelli del
separatore a getto (jet) della GC/MS. I vantaggi di questa interfaccia sono:
registrazione di spettri "classici" per EI, e/o spettri CI con diversi gas reagenti, facilità
di operazioni, buona riproducibilità, possibilità di passare velocemente dalla LC/MS
alla GC/MS. Gli svantaggi risiedono nel fatto che è richiesta una certa volatilità del
campione, che alcune classi (es. zuccheri ...) non danno spettri EI adeguati, per cui è
inadeguata allo studio di sostanze con pesi molecolari elevati o termolabili e poco
volatili, che ha scarsa sensibilità per molecole idrosolubili e che richiede comunque
tamponi volatili. L'intefaccia PB ha praticamente sostituito il nastro mobile (MB)
come sistema scelto per composti con pesi molecolari medi, principalmente per i
vantaggi di semplicità meccanica e robustezza; il sistema progettato originariamente
per i quadrupoli è stato adattato anche a strumenti magnetici. Riceve ancora qualche
attenzione per applicazioni in campo ambientale, con sostanze spesso separabili
anche per GC/MS.
nebulizzatore
gas di dispersione
(elio)
separatore dell’aerosol
N1
S1 N2
S2
pompe da vuoto
eluato da LC
camera di desolvatazione
MS sorgente di
ionizzazione
Figura 44: sistema per LC/MS a “particle beam” PB
Flusso continuo in bombardamento con atomi veloci (CF-FAB o f-FAB continuous
flow fast atom bombardment)
La tecnica di ionizzazione mediante bombardamento con atomi veloci (FAB) è stata
adattata in modo da poter operare con una matrice fluente invece che statica
rendendola così applicabile come interfaccia LC/MS, ma è principalmente una
72
tecnica FAB in cui si ha all’interno della sorgente un flusso continuo di un campione
in soluzione in questo modo spesso si hanno segnali migliori rispetto al FAB
convenzionale. Questa tecnica viene anche chiamata FAB dinamico (dynamic FAB or
dynamic LSIMS) o frit FAB.
Di solito sono usati due tipi diversi di sonda: uno in cui la fase mobile viene fatta
passare in una maglia fitta di acciaio o in un setto di ceramica sinterizzata posto
all'estremità in sorgente e un secondo in cui il campione fluisce liberamente in quella
che non è altro che una sonda normale portacampione FAB con un foro passante
(Figura 45). Naturalmente il solvente deve contenere la solita matrice FAB (glicerina,
tioglicerolo ...), se proviene da HPLC la matrice è spesso aggiunta dopo la colonna.
La tecnica ha delle severe limitazioni sui flussi, accetta flussi 5-10 µl/min, cioè è utile
per colonne capillari ma necessita di partizione per le colonne normali. Un problema
poi è dato dalla soluzione che non viene vaporizzata e rimane in sorgente; le prime
sonde CF-FAB avevano montato un tampone di carta assorbente (le idee artigianali
hanno sempre avuto fortuna tra gli spettrometristi di massa). Gli spettri forniti sono
simili a quelli di un FAB convenzionale per cui il sistema è molto adatto per composti
molto polari ad alto peso molecolare ma fornisce scarsa informazione sulla
frammentazione. Il CF-FAB è un veloce ed utile sistema di introduzione per
campioni (puri) in soluzione perché evita la noia di inserzione e rimozione della
sonda durante l'esecuzione di analisi.
punta emisferica
della sonda
isolatore termico
(vespel)
capillare in
silice fusa
Ca 3~10µl/min
lenti
L1
L2
all’analizzatore
di massa
asta della sonda
blocco di rame
fascio FAB
riscaldato
Figura 45: Sistema per LC/MS in flusso continuo con bombardamento con atomi
veloci (CF-FAB)
73
Termonebulizzazione (TSP=thermospray)
Rispetto alle precedenti ha avuto maggior impiego grazie alla sua praticità e
versatilità.(schema generale Figura 46). Il flusso di liquido proveniente dalla colonna
cromatografica (1-2 ml/min) è sottoposto ad un rapidissimo riscaldamento in un
capillare in modo da formare un getto supersonico di vapore; sorprendentemente in
queste condizioni la decomposizione termica praticamente non si verifica. Il capillare
termina in sorgente con un orifizio di circa 0,1 mm; il getto attraversa tutta la
sorgente ed entra in una linea di potente pompaggio munita di una trappola fredda
che elimina l'eccesso di solvente. Durante il processo di nebulizzazione-evaporazione
nel capillare riscaldato avviene un po' di ionizzazione per la presenza di elettroliti
volatili nella fase mobile; soprattutto se nella fase mobile HPLC sono presenti in
modo significativo ioni come l'ammonio o l'acetato (si usa un tampone a base di
acetato ammonio 0,1M) allora alcune goccioline porteranno delle cariche quando
lasceranno l'ugello. Nel moto il solvente evaporerà rapidamente lasciando le
molecole dell'analita "nude" ed accompagnate da una carica.
Figura 46: sistema LC/MS basato su termonebulizzazione (TSP)
Come risultato insomma si avrà una molecola carica libera dalla fase mobile, ottenuta
tramite un processo che avviene in modo statistico e non per applicazione di un
campo elettrico esterno (Figura 47). La maggior parte della ionizzazione però avverrà
mediante un classico processo di ionizzazione chimica. (NH4+ + M → [M+H]+ + NH3).
Gli ioni presenti nel getto vengono deviati dal campo elettrico presente in sorgente,
entrano nel foro del cono di campionamento e passano nell'analizzatore dello
spettrometro di massa (comunemente quadrupolare), il processo è incoraggiato da
un elettrodo repulsore. E' chiaro che con questo sistema di ionizzazione il soluto
viene sufficientemente ionizzato se abbastanza polare. La tecnica (Errore. L’origine
riferimento non è stata trovata.) può essere utilizzata anche con sostanze apolari
utilizzando una post-ionizzazione tramite un filamento (filament-on-TSP) che emette
elettroni o tramite scarica elettrica a bagliore (glow discharge) nel vapore di solvente;
in questo ultimo caso la tecnica viene detta plasmaspray (PSP). Se è presente la scarica
a bagliore si assume come modello semplificato del processo di ionizzazione una fase
primaria di ionizzazione elettronica delle molecole del solvente nella regione
74
negativa della scarica seguita dalla ionizzazione delle molecole di analita tramite
reazioni
Calore
Liquido
- + +
- + -+ -
-
H2O
A
+
-
H2O
-
M
+
NH4+
H2O MH+
S
+
NH4
H2O
-
+
-
-.
-
A
-.
H2O
Calore
Vaporizzatore
Alla pompa
+
H2O
(Cono Campionatore)
Allo spettrometro
di massa
Figura 47: termonebulizzazione: meccanismi di ionizzazione
ione/molecola in fase gassosa tra gli ioni del solvente e le molecole del campione
secondo un processo simile alla ionizzazione chimica. La presenza di una postionizzazione può aiutare non solo aumentando la risposta rispetto ai composti non
polari ma anche aggiungendo della frammentazione in più. I dati però non sono di
facile interpretazione perché il processo di ionizzazione è assai complesso e non
permette di prevedere in anticipo il comportamento dei vari gruppi funzionali
presenti nella molecola. Punto critico della tecnica è la messa a punto di molti
parametri; piccoli cambiamenti possono causare grosse perdite di sensibilità;
fondamentale fattore è il controllo della temperatura del capillare di vaporizzazione
per assicurare sensibilità ottimale e riproducibilità; questa temperatura deve essere
regolata ad un valore tale da permettere la vaporizzazione di quasi tutto il solvente.
Purtroppo la sensibilità della tecnica tende ad essere dipendente dal tipo di
composto, dalla composizione del solvente ..., arrivando anche a richiedere 10µg per
ottenere uno spettro invece del solito nanogrammo.
I vantaggi possono essere così riassunti: va bene per composti non volatili; si usano
solventi acquosi senza problemi, ma sempre con tamponi volatili; il capillare si
occlude meno facilmente che nella DLI, è più largo: non ci sono parti in movimento;
accetta i normali flussi HPLC (fino a 2,5 ml/min). Un vantaggio di questa tecnica TSP
è la possibilità di indurre la frammentazione in ioni altrimenti stabili applicando un
potenziale più elevato del normale (100-200V) all'elettrodo repulsore opposto al cono
(o altro apposito elettrodo). Si pensa che la frammentazione avvenga attraverso
l'accelerazione degli ioni nella regione ad alta pressione della sorgente e, tramite
collisioni, al trasferimento di energia interna alle molecole di analita. La discussione
sulla opportunità di questo elettrodo per frammentazione è tuttora aperta; di fatto è
stata superata dalla introduzione di analizzatori con possibilità MS/MS
75
Lenti
1
2
Cono
Campionatore
Uscita
ioni
Sonda
4
Linea
del
vapore
3
Da LC
Blocco
riscaldante
T2
T3
T1
T4
Alla pompa rotativa
(trappola criogenica)
Figura 48: esempio di interfaccia a termonebulizzazione (TSP) con le
opzioni: 1) filamento oppure 2) elettrodo per scarica a bagliore inserito in modo che
si protenda all’interno della zona dello spruzzo e contemporanea presenza di
3) elettrodo accelerante e 4) elettrodo repulsore.
Punti importanti per il controllo della temperatura
T1: vaporizzatore, T2 punta del nebulizzatore, T3 getto, T4 blocco di sorgente
Elettronebulizzazione (ES electrospray)
L'interfaccia a elettronebulizzazione si basa sulla ionizzazione a elettronebulizzazione (ESI electrospray ionisation abbreviata anche in ESP). Essa appartiene
alla famiglia delle interfacce di ionizzazione a pressione atmosferica (API Atmospheric
Pressure Ionization) così dette perché la vera e propria formazione di ioni si verifica al
di fuori del sistema di vuoto dello spettrometro. Il primo lavoro che descrive una
LC/MS con sorgente a pressione atmosferica (API) (Horning e collaboratori, 1973)
usava una sorgente di nichelio - 63 e la ionizzazione veniva ottenuta tramite gli
elettroni ad elevata energia emessi dall'elemento radioattivo.
Solo nel 1985 però le potenzialità di questo metodo sono state riconosciute nel campo
delle "grandi molecole" (polimeri e piccole proteine). Un flusso di liquido (1-40 µ
l/min) entra in un ago ipodermico (0,1 mm diametro interno) che è tenuto ad elevato
potenziale (valore tipico 6 kV). Il liquido è espulso dalla punta dell'ago dove la
repulsione coulombiana provoca una sua dispersione come un pennacchio di
goccioline cariche. Questa prima parte del processo avviene a pressione atmosferica.
Il nebulizzato è diretto verso le lenti/contro elettrodo poste all’ingresso di uno
analizzatore di massa, di solito quadrupolare. Tutta questa zona quindi costituisce
una sorgente a pressione atmosferica (API=atmospheric pressure ionisation source).
A seconda dei vari modelli di sorgente un capillare d’acciaio riscaldato (Fenn-Whitehouse, 1985) posto prima delle lenti come “elettrodo guaina” (sheath) oppure un
orifizio campionatore posto tra le lenti stesse (Bruins, 1988) agiscono da camera di
desolvatazione e evitano l’entrata di vapori neutri del solvente nella zona
analizzatore. In un efficace sistema brevettato anche una cortina di azoto anidro
fluisce dietro ed attraverso l'orifizio campionatore di queste lenti evita l'entrata di
vapori (neutri) di solvente (Figura 49).
Il solvente evapora rapidamente dalle goccioline che tendono ad "esplodere" in
goccioline ancora più piccole; questa diminuzione nella dimensione delle gocce
76
continua fino a quando il campo elettrico alla superficie raggiunge un valore
sufficiente per desorbire ioni direttamente nel gas circostante (Figura 50). Gli ioni
sono tratti attraverso le lenti in direzione dei coni campionatori (ugello e
schiumatore), dove si ha una sufficiente caduta di pressione che permette agli ioni
liberi di entrare nell’analizzatore di massa. La eventuale barriera di azoto attua un
secondo compito, quello di rompere i legami idrogeno dei gruppi ioni/solvente che
creerebbero confusione nello spettro di massa.
orifizio campionatore
contro elettrodo
cono schiumatore (skimmer)
analizzatore
quadrupolare
campione in
soluzione
capillare posto
ad elevato potenziale
pressione atmosferica
1 mbar
-4
-5
10 - 10 mbar
Figura 49: schema di sorgente ESI
gocciolina iniziale carica
dopo l’evaporazione del solvente
aumenta il campo elettrico
rottura della gocciolina raggiunto
un certo valore (limite di Rayleigh)
di campo
formazione di ioni desolvatati per
ulteriore rottura della gocciolina
e/o evaporazione degli ioni
[M+nH]n+
Figura 50: processo in ESI. Secondo quanto illustrato da S.I. Gaskell, J. Mass
Spectrom., 32 (7), 677 (1997)
77
Una tecnica correlata alla ES in cui la elettronebulizzazione è aiutata
pneumaticamente (ISP ion spray) (1986) può accettare flussi di liquido più elevati
(fino a 200 µl/min); di fatto quasi tutte le attuali sorgenti ESI hanno il capillare in un
nebulizzatore, con aggiunta di un flusso anulare di gas che assiste l’evaporazione del
solvente. Quindi le sorgenti electrospray sono tutte un po’ ionspray, anche se i nomi
rimangono legati a tipi commerciali di modelli.
Caratteristica del fenomeno della elettronebulizzazione è la capacità di attaccare
molte cariche alle grosse molecole generando una serie di ioni multicaricati; di
conseguenza un polipeptide di massa molecolare 60.000 con 30-60 cariche positive
attaccate, ha rapporti di massa su carica tra 1000 e 2000, ben compresi nell'intervallo
misurabile da quasi tutti gli spettrometri di massa moderni. L'ESI può essere molto
sensibile, può essere usata sia con ioni positivi che con ioni negativi, ed è stata
applicata su molecole da meno di 500 dalton fino a oltre 100.000 dalton, può quindi
essere applicata a piccole proteine. La maggior limitazione all'interfaccia ES della
LC/MS è data dai bassi flussi (100µl/min) e dalla apparente variazione nell'efficienza
di ionizzazione con la composizione del solvente ed il tipo di analita. Sotto molti
aspetti le considerazioni sulle condizioni sperimentali per ESP sono simili a quelle
per TSP perché sono simili i meccanismi di ionizzazione. ESP è usata con HPLC in
fase inversa e sembra che la sensibilità sia migliore quando è presente una quantità
significativa di acqua nella fase mobile. Invece di aggiungere acetato di ammonio alla
fase mobile, viene usato un acido volatile per favorire la ionizzazione (acido acetico o
trifluoroacetico nel caso di ioni positivi). Rispetto alla seguente tecnica APCI
l'elettronebulizzazione (ESI) è in genere più applicabile ad analisi di grosse molecole
(<200.000) a bassi flussi (<200 µl/min), ciò la rende importante per l'accoppiamento
con l'elettroforesi capillare (CE o CZE capillary (zone) electrophoresis) (1987).
La spettrometria di massa in elettronebulizzazione può essere utilizzata per la misura
della massa molecolare relativa (peso molecolare medio) di grandi molecole a causa
della tendenza alla formazione di ioni con (molte) più cariche. Per esempio una
molecola di massa relativa M=30.000 darà uno ione con 20 cariche positive che avrà
20+
e quindi il picco corrispondente apparirà a
la composizione (M+20H)
m/z=(M+20)/20=1501. Uno spettro tipico ESP (Figura 51) di ioni positivi della
mioglobina (peso molecolare medio 16951,5) mostra un insieme di picchi
corrispondenti alla molecola intatta con diverse cariche a partire da 23 con m/z 738
fino a 12 con m/z 1413. Quando la massa molecolare relativa (RMM) è incognita si
può calcolare da due semplici formule (o meglio il calcolatore la deduce da semplici
formule) date da
m1 − H
n2 =
M = n 2 ( m 2 - H)
m 2 − m1
per due picchi adiacenti di m/z m1 e m/z m2 dove m1<m2 e n2= numero delle cariche
dello ione a m/z m2, H= la massa di un protone e M= la massa molecolare relativa
RMM dell'incognito. Dal momento che i picchi dell'insieme sperimentale formano
una serie in cui ciascun termine differisce dal vicino per una carica, risulta facile per il
sistema di elaborazione dati identificare la carica associata a ciascun picco, calcolare
la massa molecolare da ciascun picco usando M=n(m-H) e mediare i valori di massa
molecolare. Un opportuno programma di trasformazione presenta poi i dati in uno
spettro di massa ricostruito come se il campione avesse uno ione molecolare a carica
78
singola. La calibrazione del sistema può essere ottenuta con soluzioni di
polietilenglicole o con soluzioni di mioglobina (10-20 pmol/µl).
S#: 1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 1.54E7
T: + p Full ms
Z=15
95
998.2
1131.1 1211.9
Z=13
90
Z=14
1060.5
100
85
942.9
80
1305.0
Z=12
75
70
893.3
60
1413.5
848.6
55
50
45
Z=11
40
808.2
35
1541.9
25
771.5
10
5
1696.0
Z=24
20
15
Z=10
30
616.2
Z=9
Relative Abundance
65
1884.2
707.3
1225.4
679.1
1420.7
1315.8
1551.7
1706.1 1820.8
1888.9
1938.7
0
700
800
900
1000
1100
1200
1300
m/z
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
S#: 1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 1.23E8
T: + p Full ms
16951.0
100
95
90
85
80
75
70
Relative Abundance
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
16995.0
15
16933.0
10
5
16784.0
16802.0
16851.0
17011.0
17031.0
17090.0 17114.0
17142.0
16894.0
0
16800
16850
16900
16950
mass
17000
17050
17100
17150
Figura 51: un tipico spettro ESI di una singola proteina, mioglobina equina, come
viene registrato dallo spettrometro (a) e come risulta dalla trasformazione dei dati in
un segnale risultante pari a quello ottenibile da uno ione a singola carica (b)
Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)
Un ulteriore sviluppo delle tecniche LC/MS è costituito dalla ionizzazione del
campione nebulizzato (da nebulizzatore pneumatico riscaldato) attraverso una
scarica per effetto corona nella regione delle goccioline dello spruzzo. I campioni
divengono carichi tramite ionizzazione chimica cosicché il metodo viene chiamato
79
APCI (atmospheric pressure chemical ionisation). Si ottengono spettri senza
frammentazione di tipo per ionizzazione chimica, da cui possono essere dedotte
informazioni sul peso molecolare. La presenza di “frammenti” può derivare da una
certa degradazione termica. E' un metodo di ionizzazione blando ed è
particolarmente adatto all'analisi di composti non volatili di peso molecolare medio
(<1500 Dalton) offre il vantaggio di essere anche compatibile con flussi LC fino a 2
ml/min (Figura 52).
gas cortina
Blocco riscaldante
N2
760 Torr
Calore
H2O
150° C
H3O
H2O
M
da LC - Liquido
Gas nebulizzatore
Gas ausiliario
(make up)
H2O
Gas
+
Vapore
MH
MH
H2O
H2O
Ago della
scarica
pressione atmosferica
N2
+600 V
0V
-4
10 mbar
Figura 52: schema di interfaccia/sorgente APCI
A seconda delle preferenze nella sorgente APCI con effetto corona possono essere
formati ioni reagenti sia positivi che negativi; è la polarizzazione del campo tra punta
e piano (del controelettrodo) che determina la polarità degli ioni analizzati. Nell'aria
ambiente una complessa sequenza di reazioni origina i protoni idrati H3O+ [H2O]n che
costituiscono gli ioni positivi reagenti. Gli elettroni originati per effetto corona danno
luogo agli ioni primari (N2+, O2+, H2O+ e NO+) per impatto elettronico sui componenti
dell'aria. (Sebbene NO non sia un componente principale dell'aria pulita, la
concentrazione di questa specie viene aumentata da reazioni neutre iniziate dalla
scarica). Questi ioni primari reagiscono molto rapidamente (entro 10-6 sec) formando
all'equilibrio un insieme di protoni idrati. Questi ultimi dominano l'insieme di tutti
gli ioni formati e reagiscono con i composti in tracce.
Nel modo "ioni negativi" gli elettroni generati dalla scarica a corona sono resi
rapidamente "termici" (cioè perdono il loro eccesso di energia) attraverso collisioni
con le specie neutre e sono prontamente catturati da specie elettro-negative come O2
per formare O2- e O-. Lo anione superossido (O2-), i suoi idrati (O2-[H2O]n) e adotti
(O2-[O2]n) costituiscono i maggiori ioni negativi reagenti presenti nella sorgente APCI
aperta all'aria ambiente. Le specie neutre formate nella corona (NO, NO2, O3, CO....)
hanno anch'essi una certa elettronegatività e possono reagire con O2 o O- per formare
una serie di ioni reagenti minori NO2-, NO3-, O3-, CO3-. Per semplificare le reazioni si
tende ad impedire la formazione di queste specie neutre.
Gli ioni reagenti (positivi o negativi) (R) possono reagire con i componenti in tracce
(T) nell'aria ambiente tramite trasferimento di carica (1,2) o trasferimento di protone
(3,4).
R+ + T → T+ + R
1
R +T→T +R
2
+
+
RH + T →TH + R
3
R + TH →T + RH
4
80
Le reazioni di trasferimento di un protone per dare origine a ioni positivi utilizzano
protoni idrati come ioni reagenti.
H 3 O + (H 2 O)n + T → TH + (H 2 O)m + (n − m + 1)H 2 O
5
Le molecole d’acqua addotte alla molecola di sostanza in tracce sono strappate via
dalla cortina di gas e nella regione delle lenti prima dell’analizzatore di masse; di
conseguenza soltanto specie TH+ viene rivelata anche se si formano in sorgente i suoi
idrati. La reazione 5 avverrà soltanto se l'acidità in fase gassosa di H3O+ aq è maggiore
di TH+ aq. Ciò è in generale vero se la basicità in fase gassosa (affinità protonica) di T
è maggiore di quella dell'acqua, il che di solito succede per la maggior parte dei
composti organici contenenti ossigeno ed azoto.
Nel caso di impossibilità di trasferimento di protoni è necessario lo scambio di carica.
I protoni idrati hanno energie di ricombinazione più basse di gran parte delle
sostanze organiche e di conseguenza non trasferiscono la carica a queste. Partendo
dall'aria ambiente la specie ionica che può trasferire la carica è principalmente O2+ (e
suoi idrati), purtroppo questi reagiscono rapidamente con il vapor d'acqua per
formare protoni idrati per cui si hanno sensibilità minori rispetto al trasferimento di
protone. Per compensare ciò viene aggiunto un opportuno reagente di ionizzazione
chimica al flusso di aria ambiente che entra in sorgente.
81
L’accoppiamento elettroforesi capillare/spettrometria di massa
CZE/MS
Il fondamento dell'elettroforesi consiste nella differente velocità di migrazione di
molecole ioniche in una soluzione di elettrolita quando queste si trovano sotto
l'influsso di un campo elettrico applicato. Dal punto di vista del principio quindi non
si tratta di una tecnica cromatografica, però in combinazione con la cromatografia su
carta ha dato prova di grande utilità per la separazione di sostanze con cariche, a
partire dai piccoli ioni per arrivare alle grandi macromolecole cariche che hanno
interesse biologico e biochimico. Moltissimi di questi composti contengono gruppi
acidi e basici che sono facilmente ionizzabili; l'aumentare della ionizzazione dipende
dalla composizione o dal pH della matrice.
La elettroforesi a zona capillare (Capillary Zone Electrophoresis CZE) è una tecnica per
separare composti ionici in un tubo aperto per mezzo di applicazione di un gradiente
di potenziale. I composti migrano in modo diverso attraverso il tubo a seconda della
loro mobilità elettroforetica. Usando la CZE si sono raggiunte efficienze di
separazione pari a 106 piatti teorici su molecole biologiche come peptidi, proteine e
nucleotidi. Questo fenomeno di elettroosmosi produce flussi di liquidi inferiori a µ
l/min nella direzione stabilita dalla polarità del potenziale e dalla chimica di
superficie del capillare di separazione. Per collegare con successo la CZE con la MS è
opportuno evitare la perturbazione di questo flusso onde evitare lo scompiglio del
processo di separazione. Oltre al sistema attraverso una sonda diretta, l'interfaccia
CZE/MS accoppia la colonna di separazione con una sorgente ad
elettronebulizzazione aiutata pneumaticamente (ion spray) attraverso un
"collegamento liquido". Questo collegamento liquido aggiunge tanto flusso di gas di
compensazione (make-up gas) quanto viene richiesto dalle condizioni ottimali della
sorgente (da 5 a 15 µl/min). Di conseguenza la giunzione liquida evita l'applicazione
del vuoto alla colonna CZE mantenendo il massimo dell'efficienza di separazione
(Figura 53).
82
Giunzione
liquida
Fine della colonna
elettroforetica
Uscita alla sorgente
ESI (ISP)
nebulizzatore aiutato
pneumaticamente
Colonna
elettroforetica
Alto
voltaggio
Ioni
Allo spettrometro
Serbatoio
del tampone
Cono campionatore
Gas di cortina
Elettrodo
Alimentatori
Figura 53: schema di un accoppiamento CZE/MS con sorgente ISP (ESI) attraverso
un “collegamento liquido”
83
Caratteristiche delle tecniche a termonebulizzazione e elettronebulizzazione
thermospray
calore
causa che produce lo
spruzzo di particelle cariche
di entrambe le polarità
cariche sulle goccioline
elevata
temperatura
i composti termicamente labili
decomposizione termica
sono suscettibili di
decomposizione
di solito in vuoto
pressione
meccanismo di ionizzazione ionizzazione chimica e
evaporazione ionica
numero di ioni multicarica pochi
frammentazione
un po’
tipo di soluzioni HPLC
etanoato di ammonio acquoso e
simili
gli elettroni emessi da un
filamento o da una scarica a
bagliore (=plasmaspray) per
aiutare la ionizzazione
varianti
la termonebulizzazione a
pressione atmosferica e la
termonebulizzazione
elettricamente assistita
aumentano la resa in multicarica
84
electrospray
campo elettrico
una sola polarità netta
ambiente
nessuna
atmosferica
evaporazione ionica
molti (se le molecole hanno
diversi siti capaci di portare
la carica)
nessuna (anche se si può
iniziare modificando i
parametri di sorgente)
acqua/solvente organico
polare/regolatore di pH
un gas di nebulizzazione
caldo allo scopo di favorire
l’evaporazione del solvente
permette flussi di liquido più
elevati (=ionspray)
un aiuto sia pneumatico sia
termico favorisce
l’evaporazione ma
diminuisce le cariche
TABELLE RIASSUNTIVE LC/MS
peso molecolare
Tabella indicativa delle caratteristiche dei sistemi LC/MS attuali, il numero di
stelle aumenta con le prestazioni
tipo di
limite di
flusso di
tipi di
campioni
campioni
intervallo
LC/MS rivelabilità
LC
solventi
seminon volatili
di massa
volatili
termolabili
››
›
›››
››››
››
››
DLI
››
›››››
›››››
›››››
›
›(›)
MB
›››››
››››
›››››
››(››)
›››(›)
›››(›)
TSP
››
››››
›››››
›››(›)
›(›)
›(›)
PB
›
›››
››››
›››››
››››
CF-FAB ››(›)
›
››››
›››››
›››››
››››(›)
››(›)
ESI
››››
››››
››
›››››
››››
›››(›)
APCI
PB
DLI
TSP
ESI
GC/MS
MB
f.FAB
85
polarità
APCI