Una molecola multiuso nell’evoluzione: l’acido sialico Mario Pezzella 11 C irca 70 anni fa dall’idrolisi delle mucine salivari e dai glicolipidi cerebrali venne ottenuto un acido, chiamato acido sialico, dal greco σιάλον (siálon, saliva). Già negli anni ’40 del XX secolo prima che venisse conosciuta la struttura, la chimica e la biosintesi, per opera dei due ricercatori George Hirst e Frank Macfarlane Burnet, è stato dimostrato che l’acido sialico era implicato nella diffusione del virus dell’influenza, in quanto componente del recettore cellulare per virus influenzali. Inoltre, nel 1957 Alfred Gottschalk ha suggerito il nome di neuraminidasi a una proteina che agiva come una sialidasi, rilasciando acidi sialici da macromolecole. Una simile attività è stata poi dimostrata anche nei batteri. In genere il legame di una particella virale ai recettori superficiali di una cellula ospite è mediato dalle proteine del virus che specificamente riconoscono i recettori. Questi possono essere peptidi, lipidi e carboidrati (1). Acido sialico e virus I virus dell’influenza A e B hanno glicoproteine sulla loro superficie che si legano ai recettori presenti sulla superficie degli eritrociti umani e sulle membrane cellulari delle vie respiratorie superiori. I recettori sono costituiti da glicoconiugati sialici superficiali emergenti dalla parete cellulare. Gli acidi sialici sono di solito in posizione terminale delle catene olisaccaridiche presenti sulla superficie cellulare. I virus dell’influenza A e B riconoscono specificamente l’acido acetil-neuramminico (Neu5Ac), il più comune acido sialico. Il primo evento dell’infezione dei virus dell’influenza, (sottotipi A e B), è mediato dalla principale glicoproteina superficiale virale, emoagglutinina (HA) che lega i residui terminali di acido sialico presenti sulla cellula bersaglio cui segue la fusione delle membrane cellulari e virali per endocitosi (2). L’altra proteina influenzale è la neuraminidasi (NA), una esoglicosidasi che ha la funzione di catalizzare l’idrolisi del legame glicosidico tra l’acido sialico terminale e il carboidrato adiacente di una varietà di glicoconiugati (1). L’attività della neuraminidasi è essenziale per la mobilità del virus facilitandone il rilascio dalla cellula ospite. L’inibizione dell’attività neuraminidasica risulta quindi letale per il virus che, penetrato nella cellula bersaglio e in essa replicato, non può essere rilasciato dalla membrana cellulare e continuare la progressione della infezione virale (3). Osservando più da vicino l’acido sialico (Neu) si rileva che esso è un monosaccaride con 9 atomi di carbonio e contenente 5 gruppi 12 A B idrossilici e uno carbossilico -COOH sul carbonio C1. Questo consente la formazione di sali essendo carico negativamente a pH fisiologico. I gruppi idrossilici dell’acido sialico sui carboni denominati C7 e C8 contribuiscono in maniera significativa all’affinità dell’acido sialico con emoagglutinina. Essi partecipano al legame funzionando sia come accettori sia come donatori di legami idrogeno con gli amminoacidi della proteina. Anche le forze di Van der Waals partecipano al legame coinvolgendo piccoli frammenti idrofobici sulla superficie degli zuccheri. L’insieme di queste forze di legame assicura l’affinità e specificità dell’emoagglutinina. Da queste acquisizioni ne deriva che l’affinità dei diversi ceppi virali dell’influenza può variare con i tipi di acido sialico (oltre 50 finora individuati), determinando quale specie animale può essere infettata. Esistono varietà di modificazioni naturali e l’acido N-acetil-neuramminico (Neu5A) è il più diffuso membro di una famiglia di molecole correlate che derivano dall’acido neuramminico (Neu) (fig. 1A e 1B). Il virus dell’influenza umana preferenzialmente lega l’acido sialico Neu5Ac nelle cellule epiteliali del tratto respiratorio superiore (trachea) (fig 2). Fig. 1A e 1B – Formula chimica dell’acido neuramminico (A) e dell’acido N-acetilneuramminico (Neu5Ac) (B) il più comune acido sialico. Sul carbonio C5 (b) è presente il gruppo N-acetile. Fig. 2 - I ceppi di virus influenzali umani sono all’apice di una struttura biantennaria legato con legame α (2,6) al galattosio, nell’anatra (in figura) con legame α (2,3). Inoltre sotto la struttura biantennaria è illustrata la struttura del glicano costituita da zuccheri. La freccia indica il legame tra galattosio e acido sialico che viene scisso ad opera dell’enzima neuraminidasi. (Virology blog about viruses and viral disease Influenza virus attachment to cells: role of different sialic acid. 5 may 2009) Quando l’acido sialico non occupa una posizione terminale nell’ambito di una catena oligosaccaridica (glicano) le posizioni di legame interessate sono i carboni C2 e C8, gli stessi implicati nella formazione dell’acido polisialico. Il gruppo sostituente, N-acetile, è critico per le interazioni con emoagglutinina. L’orientamento del gruppo carbossilico è essenziale per il legame dell’emoagglutinina dei virus influenzali. La combinazione di differenti legami glicosidici con la moltitudine di possibili naturali modificazioni genera centinaia di modi con i quali l’acido sialico può essere chimicamente presente e agire. La notevole diversità chimica contribuisce a una varietà di glicani sulla superficie cellulare. Acido sialico e anticorpi Le immunoglobuline sono costituite da 5 classi distinte, isotipi, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD che differiscono fra loro per dimensioni, carica elettrica, composizione amminoacidica e contenuto glucidico (dal greco γλυχύς, glucús, dolce). La loro struttura è costituita da 2 identiche catene pesanti e 2 identiche catene leggere tenute da ponti disolfuro e divise in regioni di omologa sequenza. Fig. 3 - Struttura IgG umana che dimostra le regioni funzionali costituite da catene leggere e pesanti e la posizione dei domini di Fc. Inoltre è indicata la posizione dell’asparagina (Asn posizine 297 del dominio CH2) che forma legami O-glicosidici e N- glicosidici con l’oligosaccaride che è integrato nella struttura proteica ed ha una precisa conformazione (Royston Jefferis: “Glycosylation of recombinant antibody therapeutics” Biotechnology Progress 2005; 21:11-16) Nella risposta immunitaria gli anticorpi legano e neutralizzano gli antigeni estranei con il frammento cosidetto Fab (Fragment binding antigen) formando immunocomplessi e attivano la citotossicità anticorpo dipendente, l’opsonizzazione di antigeni e l’iniziazione della fagocitosi. Il frammento cristallizzabile Fc, di ogni immunoglobulina è deputato alle funzioni effettrici, legandosi a specifici substrati cellulari. Le funzioni effettrici sono fortemente dipendenti dalla frazione glucidica presente nel dominio CH2 di Fc, localizzato immediatamente dopo la regione cerniera. Dal punto di vista chimico ciascuna IgG umana presenta due identici siti di N-glicosilazione nel dominio CH2 (asparagina 297) che conferiscono la capacità di formare legame covalente (O-glicoside ed N-glicoside) con il glicano (fig. 3). Il primo tipo di legame, riguardante l’Nacetil-galattosammina (GalNAc) è formato con lo zucchero in configurazione α nell’apparato di Golgi mentre il secondo tipo di legame N-acetilglucosammina (GlcNAc) presenta lo zucchero in configurazione β a livello del reticolo endoplasmatico. La parte glucidica delle immunoglobuline, presente in percentuale del 2-3%, può essere costituita da qualche decina di zuccheri (fino a Fab Fab Antigen binding hinge Asn 297 CH2 domain Fc Effector functions CH3 domain Fab: fragment antigen binding Hinge: regione cerniera Fc: funzioni effettrici 13 14 centinaia) grazie alle innumerevoli possibilità di legame che portano alla formazione di strutture glucidiche diverse. In particolare le IgG presentano almeno 30 differenti complessi olisaccaridici a struttura definita “diantennaria”. Le IgG quindi contengono glicani altamente eterogenei a causa della presenza di differenti possibili zuccheri intermedi e terminali (5) L’analisi cristallografica ai raggi X rivela che la struttura dell’oligosaccaride è ben definita e forma multiple interazioni non covalenti, forze di Van der Waals e legame idrogeno, con la superficie proteica del dominio CH2. Di conseguenza la conformazione di Fc risulta dalle reciproche interazioni tra la parte proteica e quella oligosaccaridica. Gli acidi sialici, presenti su alcune cellule della risposta immunitaria, giocano un ruolo chiave nelle funzioni effettrici delle IgG influenzando il legame delle IgG ai recettori Fc e C1q (6). La glicosilazione avviene per vari motivi. La parte glucidica provoca un ripiegamento corretto della molecola consentendo di esplicare la propria funzione e, nello stesso tempo, consentendo di proteggere la molecola proteica dall’attacco delle proteasi. La presenza o l’assenza dei glucidi non influenza la capacità del frammento Fab di legare specificamente l’antigene ma ha un particolare effetto sui meccanismi biologici che sono attivati dall’immunocomplesso formato tra l’antigene estraneo e i frammenti Fab. Studi strutturali indicano che la presenza o l’assenza di specifici glucidi terminali può influire sulle interazioni idrofiliche e idrofobiche tra zuccheri e amminoacidi del frammento Fc. In relazione alle funzioni biologiche gli acidi sialici, le glicoproteine e i glicoconiugati sono necessari per un appropriato sviluppo delle cellule dei mammiferi. Poiché gli acidi sialici, carichi negativamente a pH biologico, sono in genere localizzati al terminale delle strutture dei glicani, le glicoproteine sializzate possono inibire molte reazioni intermolecolari e intercellulari. Nell’uomo, in particolare, la più alta concentrazione di Neu5Ac è localizzata nel cervello dove è parte integrante della struttura dei gangliosidi nella sinaptogenesi e trasmissione neurale (7). Numerose malattie autoimmuni e infiammatorie umane vengono anche trattate con immunoglobuline IgG endovena contenenti una varietà di distinte specificità anticorpali in quanto ottenute da pool di centinaia di donatori. Osservazioni sperimentali rilevano inoltre che i glucosidi presenti nel dominio IgG-CH2 mantengono le due catene pesanti di Fc in una conformazione aperta necessaria per attivare il recettore FcγRs presente sul macrofago effettore e responsabile dell’effetto infiammatorio. I benefici di tale trattamento di IgG endovena, ottenibili solo ad alte dosi, suggeriscono che le preparazioni di IgG da donatori normali contengano una piccola frazione ad attività terapeutica costituita da specifici glucidi che hanno profonde implicazioni sulle funzioni effettrici di Fc. Le IgG-Fc sializzate sono responsabili dell’attività antinfiammatoria su uomini e modelli animali con diverse malattie quali purpura trombocitopenica, nefrite nefrotossica e artrite reumatoide (8). Il modello ipotizzato è che il frammento Fc-IgG sializzato, naturalmente presente in bassa percentuale nelle immunoglobuline endovena, si lega al recettore specifico dell’acido sialico SIGN-RI presente sui macrofagi provocando il rilascio di mediatori solubili che attivano i macrofagi effettori aumentando l’espressione dei recettori inibitori (8, 9). Altre osservazioni sembrano confermare che gli Fc-glicani influenzano il legame delle IgG ai recettori Fc e C1q e sono importanti per le funzioni effettrici delle IgG. Il risultato terapeutico finale si manifesta con una evidente azione anti-infiammatoria. Bibliografia 1)Varki A, Schauer R Sialic acids. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009. 2) Kelm S, Paulson JC, Rose U et al Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem 1992; 205: 147153. 3) Bianco A, Brufani M, Manna F et al. Synthesis of a carbocyclic sialic acid analogue for the inhibition of influenza virus neuraminidase. Carbohydrate Research 2001; 332: 23-31. 4) Beck A, Wagner-Rousset E, Bussat MC et al. Trends in glycosylation and glycoengineering of therapeutic antibodies and Fc-fusion proteins. Current Pharmaceutical Biotechnology 2008; 9: 482-501. 5.) Jefferis R Glycosylation of recombinant antibody therapeutics. Biotechnology Progress 2005; 21:11-16. 6) Dwek RA, Lellouch AC and Wormald MR Glycobiology: the function of sugar in the IgG molecule. J. Anat. 1995;187:279-292. 7) Wang B, Brand-Miller J The role and potential of sialic acid in human nutrition. Eur J Clin Nutr 2003;57(11): 1351-69. 8) Gelfand EW Intravenous immune globulin in autoimmune and infiammatory diseases. New England J Medicine 2012; 367:32015-25. 9) Antony RM, Ravetch JV A novel role for te IgG Fc glycan: the anti-infiammatory activity of sialylated IgG Fcs. J Clin Immunol 2010; suppl1: 9-14. 15