Identificazione di geni nei mammiferi
by N.A.
Studiare un genoma
Studiare un genoma significa :
 clonare le sue sequenze,
 ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione
spaziale delle sequenze
 comprendere l’architettura del genoma identificand
i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione
 identificare i geni e la loro funzione
 studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con
altri genomi
by N.A.
Dalla genetica alla genomica: timeline di una
“evoluzione concettuale”
by N.A.
1865 - 1944
Da Mendel al DNA
by N.A.
1866: le leggi di Mendel
Per la prima volta è indagato
scientificamente il problema della
trasmissione dei caratteri:
Mendel scopre le leggi dell’ereditarietà.
Mendel, G. “Versuche über Pflanzen-Hybriden” in “Verhandlungen des
naturforschenden Vereines, Abhandlungen Brünn “, 4, 3-47, (1866).
Gli individui possono essere selezionati
e incrociati scientificamente,
ma non c’è ancora una spiegazione molecolare del fenomeno...
by N.A.
La biochimica
1869: Miescher per la prima volta isola una sostanza che chiama nucleina
perchè abbondante nel nucleo cellulare e scrive l’articolo “La composizione
chimica delle cellule del pus”. Più tardi la nucleina, caratterizzata
chimicamente, si dimostrerà un acido, le cui componenti sono desossiribosio,
fosfati e basi azotate. La sostanza è ribattezzata DNA.
Miescher, F. "Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen”, HoppeSeyler's medicinisch-chemische Untersuchungen, 4, 441-460, (1871).
by N.A.
La citologia
1903: Sutton propone la teoria
cromosomica dell’ereditarietà,
correlando il comportamento in meiosi
dei cromosomi scoperti da Flemming nel
1882 con le modalità di trasmissione dei
caratteri mendeliani. La teoria sarà
dimostrata da Morgan nel 1910 con studi
in Drosophila.
Sutton, W. “The chromosomes in heredity”, Biological Bulletin, 4,
231-251, (1903).
by N.A.
Il principio trasformante : il
DNA
1944: Avery, McCarty e MacLeod
identificano nel DNA la molecola
della informazione ereditaria:
costituisce il “principio
trasformante” che rende lisce le
colonie di batteri a colonie rugose.
Avery, O.T., MacLeod, C.M. and McCarty, M.
“Studies on the chemical nature of the
substance inducing transformation of
pneumococcal types”, J. Exp. Med., 79, 137158, (1944).
by N.A.
1953 - 1984
Da Watson e Cric all’idea del sequenziamento
by N.A.
La doppia elica
1953: Watson e Crick propongono
il modello a doppia elica per
la molecola del DNA.
Watson, J.D. & Crick, F.H.C. “A structure for deoxyribose
nucleic acid”. Nature, 171, 737 - 738, (1953).
 Base molecolare
nota.
 Informazione
illeggibile!
by N.A.
Il codice genetico
1966: Nirenberg, Khorana e Holley determinano il codice genetico -> a ogni tripletta
corrisponde un amminoacido e viceversa (... quasi). In questo stadio della genetica è più
facile sequenziare le proteine e dalla successione degli aminoacidi dedurre la sequenza
nucleotidica.
U
C
A
G
UUU
UCU
UAU
U
S serina
Y tirosina UGU C cisteina
UUC F fenilal
UCC
UAC
UGC
C
U
C
A
G
UUA
UUG
UCA
UCG
S serina
UAA
UAG
STOP
UGA
UGG
STOP
W triptof
P prolina
CAU
CAC
H istidina
CGU
CGC
R arginin
CUU
CUC
L leucina
CCU
CCC
CUA
CUG
L leucina
CCA
CCG
P prolina
CAA
CAG
Q glutam
CGA
CGG
R arginin
AUU
AUC
I isoleuc
ACU
ACC
T treonina
AAU
AAC
N asparag
AGU
AGC
S serina
AUA
AUG
I isoleuc
M metion
ACA
ACG
T treonina
AAA
AAG
K lisina
AGA
AGG
R arginin
V valina
GCU
GCC
A alanina
GAU
GAC
D Acaspar
GGU
GGC
G glicina
V valina
GCA
GCG
A alanina
GAA
GAG
E Acgluta
GGA
GGG
G glicina
GUU
GUC
GUA
GUG
by N.A.
L leucina
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
Tappe
1968: purificazione del primo enzima di restrizione.
1969: le università americane si collegano ad ARPANET,
l’antenato di INTERNET
1973: mappa di restrizione di SV40 e clonaggio del primo plasmide
1974: Ed Southern mette a punto la tecnica che prendera’ il suo nome: il
Southern Blot.
by N.A.
DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr
Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro
ottenuto dopo trasferimento e ibridazione con
sonda marcata radioattivamente(P32)
Tappe
1977:
Gilbert e Sanger inventano un sistema per
sequenziare “rapidamente” una molecola di DNA. Si
determinano alcune decine bp/mese uomo (mu).
1983:
grazie alle nuove sonde e agli RFLP viene mappato per linkage il
locus della Corea di Huntington. Si apre la possibilita’ di mappare
geneticamente anche quegli organismi non accessibili dalla genetica classica
basata sugli incroci e si puo’ fare il linkage utilizzando “il fenotipo” del DNA
1985:
Mullis concepisce la PCR (polymerase chain reaction)
1986:
Hood realizza il primo sequenziamento automatico (-> Mb/mu)
1988:
Vengono costruiti gli YAC che possono contenere fino a 2Mb
by N.A.
Tappe : gli STS
1989:
L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte
sequenze (~200pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR
ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di
contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche
che fisiche e permettono di legarle fra loro
1
DNA genomico
A+,B-,C+..
B+,D+,G+
Clonaggio
H+,F+,T-..
Sequenziamento
GACTTAG........CATAGCA ~200bp
A-,B+,C+..
F+,T-,Q+..
screening
library con
PCR
STS A,B,C..
by N.A.
scelta dei primers x A,B,C..
A* C
B*
D G*
H F*
Q
2
mappa fisica: contiguo
A C B D G
H F Q
mappa genetica: A, G e F
sono in linkage il loro
ordine e’ F-A-G
H F Q
A C B D G
I due contigui sono sullo stesso
cromosoma e via cosi....
Tappe
1992:
I BAC:possibilita’ di clonare frammenti molto
grandi (fino a 200Kb) e stabili a differenza degli YAC.
1994:
1998:
I PAC possono sopportare frammenti genomici piu’ piccoli
(fino a 100-120Kb)
Gli SNPs: nuova generazione di polimorfismi del DNA:
sono sostituzioni di singole basi, con frequenza ogni poche centinaia di basi,
sono stati individuati grazie all’automazione del sequenziamento,
permetteranno di generare mappe genetiche ad alta densita’
by N.A.
Studiare un genoma
Studiare un genoma significa :
 clonare le sue sequenze,
 ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione
spaziale delle sequenze
 comprendere l’architettura del genoma identificand
i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione
 identificare i geni e la loro funzione
 studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con
altri genomi
by N.A.
Come identificare i geni
SI
C1:raccolta
cromosomica NO famiglie per
candidata?
mappatura
NO
SI
A2:Omologo
animale
clonato?
A3:Ricerca
nei database
genetici
B2:Verifica
nei database
dei geni della
regione
stato
completamente
caratterizzato?
SI
genetica: ricerca
genomica
la
localizzazione?
SI
E2:
dei punti di
rottura
errore nel tipo
di eredita’ o
eterogeneita’
genetica
D3:nuovi
E3:ripensare
geni
D4:struttura
NO
E1:trovata
D2:clonaggio
umani
identificati
gene
candidato?
TROVATO!!!
by N.A.
o traslocazioni
cromosomiche
B3:Possibile
B4:e’
Analisi al
computer
C2:delezioni
D1:mappatura
NO
animale
mappato?
B1:regione
genomica e
sequenza
completa
ai geni
candidati: vai
A2,A3,D3
NO
A1:Omologo
C5:Raccolta
D5:Ricerca
E5:trovate
Informazioni
cliniche
Informazioni
di laboratorio
SI
pazienti non
imparentati
delle
mutazioni
mutazioni
patogene?
Strategie
 CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio
sono note. Utile in pochi casi
 CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione
cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e
genetica della regione.
STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA
LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o
porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note
STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA
LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per
la possibilita’ di utilizzare le banche dati.
by N.A.

Attenzione
Le strategie sono alternative, la scelta
dipende dalle informazioni di partenza ,
ma ovviamente nel corso dello studio si
integrano: praticamente alla fine si usano
tutte. Non esiste quella giusta in assoluto
esiste quella che mi puo’ dare maggiori
risultati nelle condizioni sperimentali in
cui mi trovo ad operare
by N.A.
Studiare un genoma
Studiare un genoma significa :
 clonare le sue sequenze,
 ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione
spaziale delle sequenze
 comprendere l’architettura del genoma identificando
i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione
 identificare i geni e la loro funzione
 studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con
altri genomi
Bisogna avere delle mappe collegate fra loro perche’
una sola non basta:
by N.A.
Tipi di mappe:
mappe fisiche
 Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche.
Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria
genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro
sequenza
 Se riesco ad allinearle con le mappe genetiche posso
collegare un gruppo di cloni a un locus e cominciare a
rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro:
La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando?
by N.A.
Tipi di mappe:
mappe genetiche
 Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di
ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di
varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale,
fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.
 Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma
corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere,
non si puo’ rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro:
La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando?
by N.A.
Tipi di mappe:
mappe di espressione
 Mappe di espressione: ordinano all’interno
di una regione gli RNA espressi.
 Il DNA codificante costituisce una frazione del DNA di un
organismo quindi e’ necessario collegare le mappe fisiche e
genetiche a una mappa di espressione per evitare di
concentrarsi su sequenze non idonee a rispondere alla domanda
ultima di tutto il lavoro:
La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando?
by N.A.
Le mappe fisiche
 Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche.
Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria
genomica uno relativamente all’altro sulla base della
loro sequenza
Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni
complementari:
 mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione,
 mappe di restrizione a lungo raggio
 mappe basate su cloni utilizzando STS e EST
 mappe ottenute con FISH
by N.A.
Le mappe fisiche
 Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la
posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente
all’altro sulla base della loro sequenza
Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari:
 mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione,
Si originano dalla fusione in vitro del genoma di due specie
e dalla susseguente origine di una linea cellulare che contiene
nel suo nucleo i cromosomi della linea accetrice e alcuni
cromosomi o parti di essi della donatrice
by N.A.
Creazione degli ibridi somatici
+PEG
Accettrice
Donatrice
XX
XX
X
X
XX X XX X
Selezione
.::. .::.
.::.
by N.A.
.::.
.::.
XXXX
X
X
XX
X
X
Eterocarionte
binucleato
Sincarionte
Ibrido
Pannello di RH per il crom.5
caratterizzato con STS
STS
RH
by N.A.
Tipi di mappe:
mappe genetiche
 Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di
ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di
varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale,
fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.
 Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma
corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere,
by N.A.
Le mappe genetiche
 Si basano sugli studi di linkage cioe’
sull’analisi della segregazione alla meiosi di
marcatori
genetici.
Se
due o piu’ marcatori vengono ereditati
preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che
mappino nella stessa regione genomica
Ricordate? L’unita’ di mappa e’ il centimorgan(cM): 1cM
indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza
pari a 0.01. Si assume che 1cM sia pari a ~1.5Mb anche se
la relazione diretta non c’e’: la mappa genetica puo’ essere
piu’ lunga di quella fisica.
by N.A.
Linkage:fase di piu locus
 Definizione della regione candidata con analisi di linkage:
ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle
famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i
ricombinanti
7
5
4
6
6
2
6
5
2
6
2
2
8
6
3
2
1
8
2
2
1
6
2
2
by N.A.
8
6
3
2
1
8
2
5
2
5
5
5
2
2
1
9
5
5
6
5
2
6
2
2
7
5
4
6
6
2
1
4
1
3
7
5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
5
3
6
5
5
7
8
6
5
2
6
2
2
3
6
5
5
7
8
7
4
4
2
5
4
2
5
2
6
2
2
6
5
2
6
2
2
7
4
4
2
5
4
1
4
1
3
7
5
6
5
2
6
2
2
2
2
1
9
5
8
8
3
8
2
7
10
10
4
6
4
1
6
8
3
8
2
7
10
10
3
2
3
5
8
8
3
8
2
7
10
5
3
5
3
1
7
 Possedere un particolare polimorfismo
non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di
linkage e’ a livello di popolazione, serve ad
individuare una regione non la mutazione
8
3
8
4
2
3
10
3
2
3
5
8
Polimorfismo
 Variazione presente nella popolazione con una frequenza
superiore a 1%
Variazioni nell’aspetto
by N.A.
Polimorfismo
 Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%
Polimorfismi proteici
 Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP),
minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern
blotting o PCR
by N.A.
La connessione fra mappe
Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problema
e’ trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che un
gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di
cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati.
La mappa genetica me lo permetterebbe perche’ non riguarda
specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza.
Non posso pero’ studiare il gene candidato perche’ non ho
la sequenza corrispondente.
La possibilita’ di utilizzare STS e EST polimorfici ha
permesso di risolvere il problema
by N.A.
Gli STS: Sequence Target Site
L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte
sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR
ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di
contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche
che fisiche e permettono di legarle fra loro
1
DNA genomico
A+,B-,C+..
B+,D+,G+
Clonaggio
H+,F+,T-..
Sequenziamento
GACTTAG........CATAGCA ~300bp
B*
D G*
H F*
Q
2
mappa fisica:contiguo
A C B D G
H F Q
A-,B+,C+..
F+,T-,Q+..
screening
library con
PCR
STS A,B,C..
by N.A.
A* C
scelta dei primers x A,B,C..
mappa genetica: A, G e F
sono in linkage il loro
ordine e’ F-A-G
H F Q
A C B D G
I due contigui sono sullo stesso
cromosoma e via cosi....
Studiare un genoma
Studiare un genoma significa :
 clonare le sue sequenze,
 ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione
spaziale delle sequenze
 comprendere l’architettura del genoma identificand
i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione
 identificare i geni e la loro funzione
 studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con
altri genomi
by N.A.
Come identificare i geni
SI
C1:raccolta
cromosomica NO famiglie per
candidata?
mappatura
NO
SI
A2:Omologo
animale
clonato?
A3:Ricerca
nei database
genetici
B2:Verifica
nei database
dei geni della
regione
stato
completamente
caratterizzato?
SI
genetica: ricerca
genomica
la
localizzazione?
SI
E2:
dei punti di
rottura
errore nel tipo
di eredita’ o
eterogeneita’
genetica
D3:nuovi
E3:ripensare
geni
D4:struttura
NO
E1:trovata
D2:clonaggio
umani
identificati
gene
candidato?
TROVATO!!!
by N.A.
o traslocazioni
cromosomiche
B3:Possibile
B4:e’
Analisi al
computer
C2:delezioni
D1:mappatura
NO
animale
mappato?
B1:regione
genomica e
sequenza
completa
ai geni
candidati: vai
A2,A3,D3
NO
A1:Omologo
C5:Raccolta
D5:Ricerca
E5:trovate
Informazioni
cliniche
Informazioni
di laboratorio
SI
pazienti non
imparentati
delle
mutazioni
mutazioni
patogene?
Strategie
 CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio
sono note. Utile in pochi casi
 CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione
cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e
genetica della regione.
STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA
LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o
porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note
STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA
LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per
la possibilita’ di utilizzare le banche dati.
by N.A.
Richiamiamo un po’ di terminologia
Genotipo: costituzione
genetica di un individuo in
relazione ad un particolare carattere
Fenotipo: manifestazione fisica del carattere, non e’
necessariamente una patologia intesa in senso clinico
 La manifestazione fisica dipende dal metodo di rilevazione: es. anemia
falciforme, thalassemia, emoglobinopatie
E’ l’operatore che sceglie il livello di indagine e definisce il fenotipo che
vuole seguire: l’individuo, gli organi, il tessuto, le cellule, il DNA...
 Locus: regione genomica dove mappa la sequenza di DNA coinvolta
nella manifestazione del fenotipo. E’ individuato utilizzando tecniche
laboratoristiche diverse: biochimiche, molecolari, citogenetiche
by N.A.
Gene e fenotipo
 il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata
dalla modalita’ di segregazione e dalla mappatura in un
LOCUS
 il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante
corrispondente ad un trascritto, che mappa nella regione
identificata dal locus
Non esiste necessariamente corrispondenza
1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze
codificanti
by N.A.
Gene e fenotipo
Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e
sequenze codificanti
Charcot Marie Tooth 1A ,fenotipo autosomico dominante: la mutazione
piu’ frequente e’ una duplicazione di un frammento genomico di 1.5Mb che
comprende parecchi geni.
Prader-Willi/Angelmann,fenotipi autosomici dominanti: la mutazione
piu’ frequente e’ la delezione di un segmento genomico che puo’ arrivare a
4Mb
by N.A.
Richiamiamo un po’ di terminologia
Autosomico: locus che mappa su un autosoma
Legato al sesso : locus che mappa sui cromosomi sessuali
Alleli: forme alternative del locus che originano fenotipi distinguibili. Nella
popolazione possono esistere n alleli, ma ogni individuo diploide ne possiede 2 degli
n possibili. Gli alleli si originano per effetto delle mutazioni, e generano
variabilita’ nella popolazione. Non e’ detto che ci sia un allele che genera fenotipo
patologico. (gruppi sanguigni)
Omozigote: individuo in cui entrambi gli alleli sono uguali
Eterozigote: individuo in cui gli alleli di un locus sono differenti
 Ricordare che omozigote ed eterozigote non sono
sinonimi di dominante e recessivo
by N.A.
Definizione classica
Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi
Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi

SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’
DI TRASMISSIONE E DIPENDONO DAL TIPO DI FENOTIPO CHE
SI CONSIDERA:
ANEMIA FALCIFORME:
Recessivo se considero come fenotipo la presenza dell’anemia:
i portatori non hanno anemia
Codominante se considero le catene dell’emoglobina : sono presenti entrambe
Se guardo la sequenza del DNA non e’ nell’una nell’altra, perche’ non sto
guardando
l’espressione del prodotto
by N.A.
Definizione classica
Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi
Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi

SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’
DI TRASMISSIONE
Da questo deriva che la terminologia A/a che correttamente si usa negli incroci quando
si vuole indicare la relazione fra i prodotti degli alleli e’ una terminologia operativa:
significa che il fenotipo originato da un allele non e’ evidenziabile se c’e’ l’allele A e
quindi mi devo aspettare che soggetti con fenotipo A siano geneticamente Aa e questa
informazione mi viene dall’analisi degli alberi genealogici o dall’incrocio
Inoltre va ricordato che anche utilizzando A/a non vuol dire che a e’ derivato da A e
costituisce un sottoprodotto di A.
La terminologia che si deve usare al di fuori dello studio della trasmissione e’: locus A
alleli A1,A2, A3, An.. (locus white in Drosophila)
by N.A.
Dominanza e recessivita’

SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’
DI TRASMISSIONE
 SONO DOVUTI ALL’INTERAZIONE DEL PRODOTTO DEI SINGOLI
LOCUS CON L’AMBIENTE, IL BACKGROUND GENETICO DEL SINGOLO
INDIVIDUO E IL PERIODO DELLO SVILUPPO E DIFFERENZIAMENTO

SI APPLICANO PERCIO’ ALLA POPOLAZIONE NON ALL’INDIVIDUO

A LIVELLO DI POPOLAZIONE MEGLIO PARLARE DI LOCUS: IL
TERMINE GENE ASSUME SIGNIFICATI DIVERSI A SECONDA DEL TIPO
DI INDAGINE
 LA GENETICA UMANA E’ FORSE L’ULTIMA DISCIPLINA CHE VIENE
APPLICATA AD UNA POPOLAZIONE NATURALE
by N.A.
Dominanza e recessivita’
Non si applicano al gene inteso come sequenza di DNA o locus.
 In alcune patologie (es.Fibrosi Cistica) gli affetti
possono essere definiti eterozigoti composti:questo perche’
esistono mutazioni diverse che provocano la malattia. Di fatto gli affetti non
hanno l’allele normale, ma due alleli patologici. Geneticamente sono
eterozigoti perche’ hanno due alleli diversi, ma dal punto di vista fenotipico sono
indistinguibili dagli omozigoti. Il carattere e’ comunque recessivo

Si puo’ continuare ad usare il termine dominante e
recessivo, ma va tenuto ben presente il significato e soprattutto
non va confuso con: dominante=+diffuso, recessivo=patologico,
dominante=normale etc....
by N.A.
SI
C1:raccolta
cromosomica NO famiglie per
candidata?
mappatura
NO
SI
A2:Omologo
animale
clonato?
A3:Ricerca
nei database
genetici
B2:Verifica
nei database
dei geni della
regione
stato
completamente
caratterizzato?
SI
genetica: ricerca
genomica
la
localizzazione?
SI
E2:
dei punti di
rottura
errore nel tipo
di eredita’ o
eterogeneita’
genetica
D3:nuovi
E3:ripensare
geni
D4:struttura
NO
E1:trovata
D2:clonaggio
umani
identificati
gene
candidato?
TROVATO!!!
by N.A.
o traslocazioni
cromosomiche
B3:Possibile
B4:e’
Analisi al
computer
C2:delezioni
D1:mappatura
NO
animale
mappato?
B1:regione
genomica e
sequenza
completa
ai geni
candidati: vai
A2,A3,D3
NO
A1:Omologo
Clonaggio funzionale si parte da D3
C5:Raccolta
D5:Ricerca
E5:trovate
Informazioni
cliniche
Informazioni
di laboratorio
SI
pazienti non
imparentati
delle
mutazioni
mutazioni
patogene?
Clonaggio funzionale
2 Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione
2 Produzione di anticorpi specifici
2 Screening della library di espressione e isolamento della colonia
2 Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato
2 Sequenza dei cDNA cercando una ORF
2 Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa
2 Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni
Albinismo: Tirosinasi
EMOFILIA A: deficienza del fattore VIII
FENILCHETONURIA: deficienza fenilalanina-idrossilas
by N.A.
SI
C1:raccolta
cromosomica NO famiglie per
candidata?
mappatura
NO
SI
A2:Omologo
animale
clonato?
A3:Ricerca
nei database
genetici
B2:Verifica
nei database
dei geni della
regione
stato
completamente
caratterizzato?
SI
genetica: ricerca
genomica
la
localizzazione?
SI
E2:
dei punti di
rottura
errore nel tipo
di eredita’ o
eterogeneita’
genetica
D3:nuovi
E3:ripensare
geni
D4:struttura
NO
E1:trovata
D2:clonaggio
umani
identificati
gene
candidato?
TROVATO!!!
by N.A.
o traslocazioni
cromosomiche
B3:Possibile
B4:e’
Analisi al
computer
C2:delezioni
D1:mappatura
NO
animale
mappato?
B1:regione
genomica e
sequenza
completa
ai geni
candidati: vai
A2,A3,D3
NO
A1:Omologo
Clonaggio funzionale si parte da A1
C5:Raccolta
D5:Ricerca
E5:trovate
Informazioni
cliniche
Informazioni
di laboratorio
SI
pazienti non
imparentati
delle
mutazioni
mutazioni
patogene?
Variante: identificazione
conoscendo la funzione normale
Complementazione nel topo transgenico:il gene DFNB3 identificato grazie al gene
di topo. Il topo shaker2 ha una patologia vestibolare che si riconosce perche’ gira
su se stesso e scuote la testa.
X
topo shaker2
topo sh2/sh2
Wild type
Si iniettano uova sh2/sh2 con BAC
di topo wt.
Mappato per linkage in 1cM
del cromosoma11 di topo(17 umano)
topo sh2/sh2
topo sh2/sh2
Si isola il BAC umano con primer esonici e si
isola la sequenza umana, cercano le mutazioni nei pazienti
topo sh2/sh2
Wild type
Si sequenzia il BAC murino e si
cercano le mutazioni nei topi mutanti
si identifica il gene e la sua funzione
by N.A.
BAC###
Variante: identificazione
conoscendo la funzione normale
Isolamento di oncogeni attivati: cellule di topo vengono trasfettate con
DNA derivato da un tumore umano, se crescono in maniera incontrollata
vuol dire che contengono un oncogene
Trasfezione di frammenti
di DNA umano da tumore
Selezione di una
colonia trasformata
Alcune cellule sono
trasformate
Coltura di cellule
NIH-3T3 di topo
fagi che potrebbero
contenere l’oncogene
by N.A.
ricerca sequenze
Alu
Strategie
CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la
localizzazione cromosomica del locus. Richiede la
costruzione di una mappa fisica e genetica della
regione. Si utilizza sempre meno
by N.A.
Clonaggio posizionale
*CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce
solo la localizzazione cromosomica del locus.
richiede la costruzione di una mappa fisica e
genetica della regione.
Definizione della regione candidata con analisi di linkage:
ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle
famiglie
Anomalie cromosomiche: ricerca del coinvolgimento di una stessa
regione in affetti con lo stesso fenotipo
Screening della perdita di eterozigosi: utilizzata di solito per i
tumori o quando vi sono indicazioni di delezioni
 Corea di Huntington, distrofia di Duchenne, fibrosi cistica,
neurofibromatosi, cancro colon-rettale…..
by N.A.
SI
C1:raccolta
cromosomica NO famiglie per
candidata?
mappatura
NO
SI
A2:Omologo
animale
clonato?
A3:Ricerca
nei database
genetici
B2:Verifica
nei database
dei geni della
regione
stato
completamente
caratterizzato?
SI
genetica: ricerca
genomica
SI
dei punti di
rottura
errore nel tipo
di eredita’ o
eterogeneita’
genetica
D3:nuovi
E3:ripensare
geni
genomica e
sequenza
completa
C5:Raccolta
D5:Ricerca
Informazioni
cliniche
Informazioni
di laboratorio
pazienti non
imparentati
la
localizzazione?
E2:
D4:struttura
NO
E1:trovata
D2:clonaggio
umani
identificati
gene
candidato?
TROVATO!!!
by N.A.
o traslocazioni
cromosomiche
B3:Possibile
B4:e’
Analisi al
computer
C2:delezioni
D1:mappatura
NO
animale
mappato?
B1:regione
delle
mutazioni
ai geni
candidati: vai
A2,A3,D3
NO
A1:Omologo
Clonaggio posizionale si parte da C1
E5:trovate
mutazioni
patogene?
SI
Come identificare i geni
SI
C1:raccolta
cromosomica NO famiglie per
candidata?
mappatura
NO
SI
A2:Omologo
animale
clonato?
A3:Ricerca
nei database
genetici
B2:Verifica
nei database
dei geni della
regione
stato
completamente
caratterizzato?
SI
genetica: ricerca
genomica
la
localizzazione?
SI
E2:
dei punti di
rottura
errore nel tipo
di eredita’ o
eterogeneita’
genetica
D3:nuovi
E3:ripensare
geni
D4:struttura
NO
E1:trovata
D2:clonaggio
umani
identificati
gene
candidato?
TROVATO!!!
by N.A.
o traslocazioni
cromosomiche
B3:Possibile
B4:e’
Analisi al
computer
C2:delezioni
D1:mappatura
NO
animale
mappato?
B1:regione
genomica e
sequenza
completa
ai geni
candidati: vai
A2,A3,D3
NO
A1:Omologo
C5:Raccolta
D5:Ricerca
E5:trovate
Informazioni
cliniche
Informazioni
di laboratorio
SI
pazienti non
imparentati
delle
mutazioni
mutazioni
patogene?
Cos’e’ il tumore
Le alterazioni genetiche acquisite che portano alla trasformazione
maligna sono un esempio di variazione genetica somatica (oltre al
mosaicismo per i caratteri genetici nucleari e all’eteroplasmia per le
mutazioni mitocondriali).
Il tumore ha un’origine clonale, essendo il suo
sviluppo innescato da un’alterazione genetica in una
singola cellula
 E’ l’accumulo di alterazioni genetiche in una
singola cellula che produce gli effetti fenotipici
caratteristici del termine “malignita’ ”.
by N.A.
I geni nei tumori
 I geni alterati nel cancro sono definiti oncogeni:
questo nome deriva dalla scoperta di geni virali
responsabili della trasformazione in tumore delle cellule
infettate
oncosoppressori
proto-oncogeni
caretaker
(addetti alla manutenzione)
Gene Rb del retinoblastoma
by N.A.
landscapers
(architetti del paesaggio)
Retinoblastoma
e’ un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi
anni di vita
puo’ essere monolaterale (solo un occhio colpito) o
bilaterale (entrambi gli occhi)
si puo’ manifestare in forme sporadiche o ereditarie
diagnosticate a 7-10 anni,
generalmente monofocali (solo
in un punto dell’occhio)
by N.A.
diagnosticate nel primo
anno di vita, multifocali
(piu’ punti di un occhio)
Genetica del retinoblastoma
retinoblastoma bilaterale
retinoblastoma monolaterale
non-penetrante
Apparente trasmissione dominante...
by N.A.
Alfred Knudson
Nel 1971 Alfred Knudson analizzo’ casi di bambini con
retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale
Osservo’ che:
al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero
sviluppato tumori bilaterali erano piu’ piccoli di quelli per i
quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali;
con l’aumentare dell’eta’, la frequenza con cui
venivano diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera
esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali
aumentava molto piu’ lentamente.
by N.A.
Knudson propose un modello (two-hit hypothesis) secondo il quale,
affinche’ si abbia il retinoblastoma, e’ necessario che in una
linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi
mutazionali
I evento (“hit”)
II evento (“hit”)
I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la
quale, pertanto, e’ presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e’ necessario un
secondo evento perche’ si produca il tumore.
Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali
indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio’ si realizza piu’ raramente, per cui
l’insorgenza e’ piu’ tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali.
by N.A.
Il gene del retinoblastoma (Rb)
Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e’ stato
fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali,
concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita’
delezione
13q13-q14
by N.A.
L’analisi cromosomica di questi
pazienti ha dimostrato la presenza
di una delezione del braccio lungo
del cromosoma 13 di dimensione
variabile ma con condivisione delle
bande 13q13-q14: questa
osservazione suggeriva che in tale
regione si localizzasse un gene
predisponente al retinoblastoma
Rb ed esterasi
Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del
gene per l’enzima esterasi D, enzima di funzione sconosciuta ma
facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli,
evidenziabile mediante elettroforesi di proteine.
I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta’
della quantita’ normale di esterasi D ed esprimevano invariabilmente
un solo allele.
L’esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento
ideale per studiare il gene del retinoblastoma
by N.A.
Linkage di esterasi e Rb
L’analisi di linkage esaminando la segregazione del polimorfismo dell’esterasi D in famiglie
con retinoblastoma ereditario e prive di delezione:
gli alleli dell’esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere retinoblastoma (lod
score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente alla malattia fosse localizzato a livello
della banda 13q14.
by N.A.
Verifica dell’ipotesi di Knudson
Una mutazione in un gene del cromosoma 13 che
costituirebbe al primo evento secondo l’ipotesi di Knudson e’
presente nelle cellule normali dei portatori
Il secondo evento sarebbe consistito nella perdita della copia normale
rimanente di questo gene...
Per testare questa ipotesi si e’ usata nuovamente l’esterasi D, espressa
nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero
espressi
I tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti
eterozigoti per il polimorfismo dell’esterasi D e non portatori
di delezione costituzionale del cromosoma 13.
by N.A.
Verifica dell’ipotesi di Knudson
 Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi
 Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati
?
il secondo evento consisteva probabilmente in una
delezione che includeva i loci sia dell’esterasi D che del
retinoblastoma
Per la verifica del secondo evento, si puo’ ricorrere a tecniche di
biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una
famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la
perdita di eterozigosita’ (LOH)
by N.A.
Perdita di eterozigosita’ LOH
famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D
Cellule
tumorali
omozigote
by N.A.
eterozigote
eterozigote
LOH
LOH
La LOH si puo’ applicare sia ai tumori familiari che a quelli sporadici,
suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che conducono allo sviluppo
del tumore interessino un locus sul cromosoma 13.
 C’e’ una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo
stesso background genetico delle normali perche’ appartengono allo
stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo
tumorale, non alla variabilita’ genetica e questo permette di utilizzare
anche gli sporadici
Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano
invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto
by N.A.
Clonaggio del gene del retinoblastoma
la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14
e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule
retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti
affetti da retinoblastoma familiare
il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un
gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote
corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla
regione 13q14
by N.A.
Clonaggio del gene del retinoblastoma
Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto
diversi dal normale
pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con
delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti
costituzionali.....
Ipotesi di Knudson confermata!
Rb e’ un
oncosoppressore
by N.A.
Ricerca delle mutazioni
In molti casi le mutazioni non consistono in delezioni
o alterazioni a carico del gene tali da poter essere
individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi
piu’ difficili da evidenziare
test molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per
rivelarle
by N.A.
Altri oncosoppressori
by N.A.
Modalita’ di espressione
Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche?
Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi
gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse)
Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della
cellula non dell’individuo!
Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismo
ci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno
un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allele
wild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore
Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile
alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne
pregiudica la funzione.
by N.A.
by N.A.