La biochimica clinica degli ormoni dell’asse Ipofisi-tiroide e principali test: una overview PROF. FABRIZIO BARBETTI Anatomia della tiroide Thyroid Cartilage Pyramidal Lobe Left Lobe Isthmus Right Lobe Internal Jugular Vein Primitive Carotid Artery Trachea Il follicolo tiroideo Sintesi degli ormoni tiroidei I- DIT/MIT Thyroid deiodinase DIT MIT Trasporto dello iodio all’interno della cellula tiroidea (“iodide trap”) • E’ un trasporto attivo contro un gradiente elettrico e di concentrazione: – Cotrasportatore Sodio/Iodio • La concentrazione dello Iodio nella cellula follicolare è 30 volte la sua concentrazione nel siero • La regolazione avviene attraverso il TSH. Imaging Studies of the Thyroid Grand in Hyperthyroidism and Thyrotoxicosis Tireoglubulina (Tg) • E’ una glicoproteina con 140 tirosine • Si trasferisce all’interno del lume follicolare per esocitosi. • Le tirosine vengono iodate ed accoppiate per formare T4 and T3 (3 residui per molecola di Tg). • Gli ormoni tiroidei vengono “immagazzinati” insieme alla Tg. Tirosina 3 NH3 HO CH2CHCOOH 5 Monoiodotirosina I NH3 HO CH2CHCOOH Diiodotirosina I NH3 HO CH2CHCOOH Tiroxina (T4) I I 3’ 3 NH3 HO O 5’ CH2CHCOOH 5 Accoppiamento di 2 DIT = T4 Triiodotironina (T3) I I 3’ 3 NH3 HO O 5’ CH2CHCOOH 5 “Reverse” T3 (rT3) I I 3’ 3 NH3 HO O 5’ CH2CHCOOH 5 Perossidasi tiroidea (TPO) • Enzima legato alla membrana apicale. • Catalizza l’ossidazione dello iodio I- + H2O2 2 HO- + E – I. • Catalizza l’organificazione/iodazione dei residui di tirosina della Tg. • Catalizza l’accoppiamento delle iodotirosine. Proteine di transporto degli ormoni tiroidei • Globulina legante la T4 (Thyroxine-binding globulin, TBG). La TBG lega circa l’80% della T4. I livelli/la capacità legante della TBG possono modificarsi (ad es. gravidanza, uso di estrogeni=TBG , malattie gravi=TBG ). • Transtiretina (TTR) • Albumina T4 totale (T4) = T4 legata alle proteine + T4 libera (FT4 ; 0.03%) T4 T4 TBG T4 T4 TBG T4 TBG T4 T4 T4 TBG Asse Ipotalamo-Ipofisi-Tiroide • L’ ormone rilasciante la tireotropina (TRH) stimola la secrezione dell’ormone stimulante la tiroide (TSH) dalla ipofisi. • Il TSH stimola la sintesi di T4 e T3 e la loro secrezione dalla tiroide. • La FT4 e la FT3 inibiscono la secrezione di TSH e TRH. Metabolismo extratiroideo degli ormoni tiroidei La T4 viene convertita a T3 nel fegato (ed altri organi) dalla T4 monodeiosidasi. Tests di funzionalità tiroidea • TSH • T3, T4 totali • FT3, FT4 Il dosaggio del TSH E’ test più sensibile (e quindi di “prima linea”) per escludere: - Ipotiroidismo primitivo (TSH) e - Ipertiroidismo primitivo (TSH) Piccoli cambiamenti dell’ FT4 inducono importanti cambiamenti reciproci (su scala logaritmica) del TSH Il dosaggio del TSH: obiettivi ideali e miglioramenti ottenuti. • Sensibilità sufficiente da consentire di distinguere i livelli di TSH propri dell’ ipertiroidsmo primitivo da altre condizioni con basso TSH e risultare utile nel monitoraggio della terapia soppressiva con l-tiroxina sodica dei pazienti operati di carcinoma della tiroide. • RIA (1-2 U/ml) • Dosaggi immunometrici di • 1a (0.1-0.2 mU/ml) • 2a • 3a generazione (<0.02 mU/ml), [ICMA] (0.5-3.8 mU/ml). TSH E’ una glicoproteina composta da due subunità e . La subunità è comune alle glicoproteina LH, FSH e hCG, la subunità conferisce le specifiche proprietà biologiche. Esercita i suoi effetti legandosi a specifici recettori posti sulla superficie della cellula tiroidea ed attivando l’enzima adenilciclasi. Accellera il riassorbimento della tireoglobulina, stimola la crescita delle cellule follicolari, stimola tutte le fasi del metabolismo dello iodio. I principali fattori che controllano la sintesi ed il rilascio del TSH sono il TRH ed i livelli intraipofisari di T3. Dosaggio immunometrico 1a incubazione TSH, catena + Ab monoclonale (MAb) anti catena TSH, ancorato in fase solida 2a incubazione TSH, catena + Mab anti catena , marcato per agire da rilevatore Applicazioni dei dosaggi ad alta sensibilità • • • • Screening della popolazione normale Valutazione della terapia soppressiva Eliminazione del test al TRH Identificazione dei casi di ipo- ed ipertiroidismo subclinico • Identificazione dei casi di inappropriata secrezione di TSH. Potenziali problemi nell’uso dei dosaggi ad alta sensibilità • Screening di pazienti in trattamento con corticosteroidi (TSH). • Pazienti con malattie psichiatriche acute (variazioni brusche del TSH). • Monitoraggio delle fasi di transizione dall’ IPO- ed IPERtiroidismo verso l’EUtiroidismo (latenza lunga). Quale diagnosi ? Caso 1 • FT3= 50 pg/ml (v.r.=80-350) • FT4= 0,44 ng/ml (v.r.=0,8-2,4) • TSH= 0,05 U/ml (v.r.=0,5-3,8) Quale diagnosi ? Caso 2 • FT3= 433 pg/ml (v.r.=80-350) • FT4= 3,14 ng/ml (v.r.=0,8-2,4) • TSH= 5,17 U/ml (v.r.=0,5-3,8) Il dosaggio di T4 e T3 Dosaggi immuno enzimatici (EIA) cosiddetti “omogenei”. Non richiedono lavaggi e sono automatizzabili. Questi dosaggi sfruttano le proprietà catalitiche di un enzima (ad es. Fosfatasi alcalina) al fine di rilevare e quantificare la reazione immunologica. La sensibilità della tecnica dipende dal marcatore e dal metodo di rilevamento. Un esempio di dosaggio omogeneo in uso per la determinazione della T4 e T3 è l “Enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT). Il dosaggio EMIT Ag-Enzima + Ab + Ag (siero) Ab: Ag + Ag-Enzima Enzima attivo Assenza di Ag Ab: Ag-Enzima Nessuna attività enzimatica Catalizza l’ossidazione di un composto organico come -ad es.- il luminolo da parte di un agente ossidante (ad es. H2O2). Il prodotto ossidato emette luce che è proporzionale alla reazione. T4 totale (T4) = T4 legata alle proteine + T4 libera (FT4 ; 0.03%) T4 T4 TBG T4 T4 TBG T4 TBG T4 T4 T4 TBG Il dosaggio di FT4 e FT3 Metodi di riferimento: assicurano la separazione fisica della quota libera da quella legata alle proteine di trasporto: 1) Ultrafiltrazione. 2) Dialisi. Metodi di “immuno estrazione”. Ve ne sono di 2 tipi. 1) Quelli basati sull’uso di anticorpi specifici adesi alla fase solida e che richiedono una fase di incubazione seguita da lavaggio e seconda incubazione (2-step). 2) Quelli che utilizzano analoghi del T4 e T3 che mantengono la capacità di competere con questi ormoni per il legame ad anticorpi specifici, ma la cui modificazione chimica impedisce l’interazione con le proteine di trasporto sieriche (1-step). Schema di dosaggio “One-step” Incubazione + Ab in fase solida = Ormone libero = Proteina vettrice + Tx = Analogo marcato Il ruolo della biochimica clinica nella diagnostica differenziale delle comuni cause di IPERtiroidismo • TSH ,T3 ,T4 . Nel Graves sono presenti Ab stimolanti il rTSH. Gli esami strumentali e la clinica permettono di dirimere tra le due condizioni. • Se TSH normale o , T3 , T4 TSHoma. Adenoma tossico Malattia di Graves Common Cause of Thyroid Hormone Overproduction Toxic Adenoma = Toxic Nodule T3 T3 T3 T4 T4 T4 T3 T4 Intrinsic Thyroid Autonomy Common Cause of Thyroid Hormone Overproduction Toxic Multinodular Goiter T3 T3 T3 T3 T4 T4 T4 T4 Intrinsic Thyroid Autonomy Common Cause of Thyroid Hormone Overproduction Diffuse Toxic Goiter = Graves’ Disease T3 T3 T3 T4 T4 T4 T3 T4 Abnormal Thyroid Stimulator Imaging Studies in Hyperthyroidism Pathogenesis of Graves’ Disease Viral Antigen Defective Ts TH Thyroid Antigen B Il recettore del TSH Il sito di legame del TSH sul suo recettore Dosaggio degli Ab anti-TSHR, 3a generazione (2004) • Fase solida • TSHR immobilizzati • Competizione tra siero del paziente e mAb* anti-TSHR marcato* Graves’ Ophthalmopathy • Lid retraction (Wide-eyed stare) • Periorbital edema • Proptosis La biochimica clinica nella diagnostica dell’ IPOtiroidismo congenito ed acquisito Il dosaggio del TSH (seguito dall’ FT4) è utilizzato nello screening dell’ipotiroidismo congenito per instaurare una terapia tempestiva. Il dosaggio del TSH è anche il test di scelta per diagnosticare l’ ipotiroidismo acquisito. Il test non è utile per stabilire le CAUSE di ipotiroidismo congenito. 1) Disgenesia tiroidea da causa ignota o da mutazioni di PAX-8, TTF-1, TTF-2; 2) Ipotiroidismo centrale da mutazioni del recettore del TRH, della subunità b del TSH, di Pit-1, di Prop1; 3) Sintesi difettosa degli ormoni tiroidei da mutazioni del recettore del TSH, del co-importatore I/Na, della TPO, della TG. Neurologic Effects of TH • Necessary for normal fetal and neonatal brain development • Critical period from gestation to 2-3 years of age • Congenital hypothyroidism can result in irreversible brain damage • Reversible impairment of intellectual functions in adults Il cartoncino di Guthrie Lo screening dell’ipotiroidismo neonatale: dimensioni del problema e risultati pratici • • • • • 1:3000/1:4000 nati (qualsiasi paese) SCOZIA 1979-1993 Prelievo: a 6-7 giorni di vita Notificazione del risultato: a 11 gg. di vita Inizio del trattamento:tra 11 e 15 gg di vita • Su 149 casi scozzesi: • 1.4% dei bambini in scuole speciali • 11.5% insegnante di sostegno (18% generale). La biochimica clinica nella diagnostica dell’ IPOtiroidismo acquisito Tiroidite cronica autoimmune: distruzione dei follicoli tiroidei ed infiltrazione linfocitaria. Stadi iniziali: Diffusamente ingrandita, indurita, gommosa, nodulare. Stadi tardivi: Atrofica, fibrotica. La biochimica clinica nella diagnostica dell’ IPOtiroidismo acquisito:gli autoanticorpi Anticorpi anti microsomiali/antiTPO. Di elevata specificità (>90%) nella tiroidite cronica autoimmune, soprattutto se in alto titolo, sono presenti anche in circa l’85% dei pazienti con Graves. Anticorpi antiTg. Di minor specificità, se presenti possono interferire con il dosaggio della Tg. La determinazione degli autoanticorpi può essere effettuata mediante tecnica ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Il ruolo della biochimica clinica nel monitoraggio dell’esito della terapia chirurgica dei tumori della tiroide Il dosaggio della Tg è utile nel rilevare la presenza di metastasi o di recidive dopo la ablazione chirurgica di un carcinoma differenziato della tiroide. Una quota rilevante (15-35%) di pazienti con tumori della tiroide hanno anche anticorpi anti-Tg, che possono falsare l’analisi. Il dosaggio deve essere effettuato dopo la sospensione della terapia soppressiva con L-tiroxina fino al raggiungimento di un TSH elevato in grado di stimolare la produzione di Tg. I livelli di riferimento della Tg circolante sono tra 3 e 42 ng/ml. La maggior parte degli individui ha livelli inferiori a 10 ng/ml. La citologia nello studio delle lesioni tiroidee • Lo FNA è utile nella diagnosi differenziale tra carcinoma tiroideo e nodulo benigno • La citologia convenzionale tuttavia, spesso NON è in grado di distinguere tra carcinoma follicolare ed “iperplasia follicolare” • L’immunodiagnostica con un mAb anti-galectin-3 (espressa solo nei tumori) conferisce una accuratezza diagnostica del 99% (Bartolazzi, Lancet, 2001). That’s all Folks ! e occhio alla tiroide !! FABRIZIO BARBETTI [email protected] o [email protected] www.diabeteneonatale.it Sintesi degli ormoni tiroidei Apporto di iodio alla ghiandola tiroidea (desiodazione ormoni tiroidei, agenti iodati, alimenti, acqua o farmaci). Assunzione di iodio raccomandata: 150 g/die. • Uptake: 115 g/die (75 g per sintesi ormonale). • Pool tiroide: 8-10 mg. • Assorbimento gastrointestinale, distribuzione nei liquidi extracellulari, clearance tiroidea e renale. •