Regolazione della replicazione del DNA
durante il ciclo cellulare
Le cellule eucariote durante lo sviluppo e la divisione duplicano il loro genoma
in modo molto fedele. La precisione di questo processo dipende in larga
misura da meccanismi di regolazione che accoppiano la replicazione del DNA
alla progressione del ciclo cellulare. Per duplicare in modo efficiente il
genoma (da 107 a più di 109 bp organizzato in cromosomi) gli organismi
eucarioti hanno sviluppato, durante l’evoluzione, un meccanismo che prevede
l’inizio della replicazione del DNA a livello di siti multipli sul DNA
cromosomale. Questo meccanismo è finemente regolato ed in particolare la
replicazione viene innescata in un preciso stadio del ciclo cellulare, a livello di
centinaia se non di migliaia di siti specifici all’interno dei cromosomi parentali,
ed, inoltre, l’inizio della replicazione deve essere impedita sugli stessi siti
contenuti nel DNA di nuova formazione delle cellule figlie. Questo
meccanismo assicura che ogni segmento del genoma sia duplicato una sola
volta durante il ciclo cellulare.
Inoltre, le cellule eucariote hanno sviluppato dei controlli supplementari,
chiamati checkpoint, che alterano il normale avanzamento del ciclo cellulare
in risposta ad eventi potenzialmente genotossici come il danno al DNA o
anomalie nella sintesi dello stesso. Questi ed altri meccanismi regolatori
collaborano insieme per mantenere l’integrità del genoma durante il processo
di regolazione.
Negli ultimi 15 anni passi da gigante sono stati fatti nella comprensione dei
meccanismi che portano alla replicazione del DNA. Grazie agli studi compiuti
su
semplici
sistemi
modello
come
Saccharomyces
cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe e Xenopus leavis è stato possibile caratterizzare
le proteine che agiscono all’origine di replicazione, responsabili dell’inizio della
REGOLAZIONE DELLA REPLICAZIONE
DEL DNA
DURANTE IL CICLO CELLULARE
Primi studi
Cellule umane a vari stadi del ciclo cellulare vengono fuse per formare un’unica
cellula formata da 2 nuclei
ORIGINE DI REPLICAZIONE
• Sequenza di DNA alla quale si lega
il complesso proteico che
promuove la replicazione del DNA
• Origine di replicazione più
conosciuta è quella del
Saccaromices cervisiae (ARS)
• ARS è costituita da corte sequenze
distribuite in 100-200 bp:
- elemento A →recluta primo
complesso proteico di replicazione
ORC (11 bp ricchi in AT)
- elementi B →B1 B2 B3
B1 recluta ORC
ORC Origin Replication Complex
•
•
•
•
•
Complesso proteico
formato da 6 proteine
(Orc1-6) in S. cerevisiae
Lega per primo origine di
replicazione
Orc1 Orc4 Orc6
possiedono sito AAA+
contenente ATP-binding
domain responsabile
dell’assemblaggio e
rimodellamento del
complesso
ORC identificato in
organismi superiori
Recluta fattore di
replicazione CDC6
REPLICAZIONE DEL DNA
CDC6/CDC18
Promuove l’inizio della replicazione del
DNA
MCM
Complesso proteico costituito da 6
Componenti (Mcm2-Mcm7) caratterizzato
da attività elicasica ed elongazione della
replicazione
Caratteristiche molecolari:
• Sito AAA+ →ATP-binding domain
• Sito di interazione con CDK
CDC45
Lega complesso d’inizio dopo
l’eliminazione di Cdc6
Responsabile del reclutamento della DNA
polimerasiα/primasi
REGOLAZIONE POSITIVA DELLA REPLICAZIONE DEL DNA
• ORC CDC6/CDC18 e MCM appartengono alla famiglia delle
proteine AAA+ con attività ATPasica, queste sono caratterizzate
da una regione conservata che contiene
– il sito di legame all’ ATP responsabile del cambiamento conformazionale
che media la loro interazione con i diversi complessi proteici, attraverso
un meccanismo a cascata.
– Un piccolo dominio di 3 alfa eliche definito AAA+ che è caratteristico di
questo gruppo di proteine.
• In CDC6/CDC18 e MCM contengono inoltre una ulteriore
regione conservata che interagisce con CDK e contiene siti di
fosforilazione CDK – dipendenti
• Cdc7-Dbf4 kinases
Cdc7 è una serina/treonina chinasi la cui attività è essenziale
per la formazione di un attivo complesso di pre-inizio della
replicazione.
L’attività di Cdc7 è mediata dalla proteina Dbf4 la quale sembra
indirizzi Cdc7 verso il complesso di preiniziazione.
REGOLAZIONE DELLA REPLICAZIONE:
ad ogni ciclo cellulare si ha una sola replicazione del DNA
CDK Ciclin-dependent kinases
Famiglia di proteine la cui funzione catalitica è attivata da cicline
Promuovono l’inizio della replicazione e prevengono fenomeni di re-iniziazione
della replicazione durante lo stesso ciclo cellulare
CDC6/CDC18
Fosforilazione dei CDK-phosphorilation sites contribuisce all’inibizione del
fenomeno di re-iniziazione della replicazione promuovendo il distacco della
proteina dal complesso ORC, l’esporto dal nucleo, ubiquitinazione e la
successiva eliminazione mediante proteaosoma
Il distacco di Cdc6 favorisce il legame di Cdc45 al complesso d’inizio e quindi
l’elongazione della replicazione
MCM
L’attivita’ delle CDK (Cdk2) durante le fasi G2 ed M del ciclo cellulare previene
l’associazione delle proteine Mcm alla cromatina inibendo la formazione del
complesso d’inizio della replicazione
nuova sintesi di DNA. Sebbene non siano stati ancora svelati tutti i dettagli
molecolari che caratterizzano il pathway dell’iniziazione della replicazione, è
chiaro che un unico set proteico di inizio si assembla sull’origine di
replicazione di tutti gli organismi eucarioti e che le attività di queste proteine
sono regolate da specifiche proteine chinasi.
ORIGINE DI REPLICAZIONE
La replicazione dei cromosomi viene innescata a partire da precise sequenze
di DNA, conosciute come ORIGINE DI REPLICAZIONE. Negli organismi
eucarioti le sequenze più caratterizzate sono quelle presenti nei S. cerevisiae,
le ARS (autonomously replicating sequences), le quali sono costituite da
diverse sotto-sequenze molto conservate di circa 100-200 bp, chiamate
ELEMENTI A ed ELEMENTI B. La sotto-sequenza più importante è l’elemento
A formato da un dominio di 11 bp ricco in AT, il quale è essenziale per il
legame delle proteine ORC (origin recognition complex) che costituiscono il
primo complesso proteico necessario per l’inizio della replicazione. L’elemento
B è costituito da 3 domini, B1 B2 e B3 che rispettivamente hanno le funzione
di rappresentare il secondo sito di legame per le proteine ORC, aprire la
molecola di DNA e stimolare il processo di iniziazione. Le origini di
replicazione degli organismi eucarioti diversi da S. cerevisiae sono
strutturalmente molto simili anche se salendo lungo la scala evolutiva, fino ad
arrivare all’uomo, la loro complessità aumenta.
COMPLESSO PROTEICO DI INIZIAZIONE
L’iniziazione della replicazione nelle cellule eucariote è un processo che si
sviluppa in due diversi steps. In fase G1 la cellula diventa competente
all’iniziazione della replicazione grazie al legame sull’origine di replicazione
delle diverse proteine che compongono il complesso. Grazie all’azione di
specifiche proteine chinasi CDKs (cyclin-dependent kinases) ed a proteine
chinasi della famiglia delle cdc7, il complesso ormai completamente
assemblato viene attivato favorendo, così, l’inizio della sintesi del DNA,
durante la fase S. Oltre all’innesco della replicazione del DNA, le CDKs
impediscono il ri-assemblaggio delle proteine sull’origine di replicazione. Così,
grazie all’azione delle CDKs
la cellula inizia la sintesi di DNA e
simultaneamente perde la competenza ad un secondo ciclo di replicazione. La
competenza è ripristinata attraverso l’eliminazione dell’attività delle CDKs
durante la fase M del ciclo cellulare.
Origin recognition complex (ORC)
Il complesso proteico ORC gioca un ruolo centrale nell’iniziazione della
replicazione del DNA poiché per primo lega l’origine di replicazione ed inoltre
recluta gli altri complessi importanti per questo meccanismo. L’ORC più
caratterizzato è quello appartenente a S. cerevisiae il quale è costituito da 6
proteine (ScORC1-6) che sono conservate anche in organismi superiori al
lievito come Drosophila e uomo; questo suggerisce che il meccanismo di
inizio replicazione sia molto simile nei diversi eucarioti. La formazione di un
ORC stabile richiede ATP che
una volta reclutata viene idrolizzata dal
complesso condizionandone il legame con gli altri fattori di iniziazione.
Cdc6
Fattore proteico, altamente conservato nei diversi organismi eucarioti, che si
lega ad ORC ed è essenziale per il processo di iniziazione della replicazione
ma non per la vera e propria sintesi di DNA.
Cdc6 è una proteina ATPasi caratterizzata da una regione conservata AAA+
che contiene 2 domini: ATP-binding domain e una piccola sequenza composta
da tre “helix bundle”. Il legame e l’idrolisi dell’ATP regola le conformazione
della proteina influenzando la stabilità del complesso di iniziazione. Queste 2
domini sono presenti anche in altre proteine coinvote nel processo di
iniziazione della replicazione del DNA come ORC e MCM. Oltre alla regione
AAA+, Cd6 contiene all’estremità N-terminale un sito di fosforilazione
dipendente da CDK.
E’ stato osservato sia in S. cerevisiae che in S. pombe che una overespressione di questa proteina è sufficiente ad innescare passaggi multipli di
replicazione di DNA all’interno dello stesso ciclo cellulare.
Cdt1
Proteina altamente conservata nei vari organismi eucarioti che, come Cdc6,
lega il complesso ORC. La sua struttura molecolare comprende diversi siti di
fosforilazione dipendenti da CDK ed inotre è caratterizzata da 2 regioni con
conformazione ad α-elica che si presume siano importanti per l’ interazione
con altre proteine.
La sua espressione è molto alta durante la fase G1, mentre durate la fase G2
e S si abbassa notevolmente.
COMPLESSO MCM (Minichromosome Maintenance Proteins)
Le MCM sono una famiglia di 6 proteine (da mcm2 a mcm7) la cui funzione
nel processo di replicazione del DNA è duplice.
• Le MCM, in presenza di Cdc6 e Cdt1, si legano all’origine di
replicazione, dove prendono parte al complesso di iniziazione.
• La presenza di questo complesso
è stata riscontrata anche in siti
progressivamente più distanti da quello dell’origine di replicazione,
correlabili alla posizione nel tempo della DNA polimerasi ε, suggerendo
che MCM possa avere un ruolo anche a livello della forcella di
replicazione. Studi biochimici, infatti, hanno confermato come il
complesso MCM sia necessario per l’elongazione della nuova molecola
di DNA in quanto caratterizzato da proprietà elicasiche (mcm4-mcm5mcm6).
CdC45
La proteina Cdc45 si associa alla all’origine di replicazione del DNA durante la
fase G1 del ciclo cellulare. Come per MCM, la sua presenza viene anche
riscontrata in sito lontani da quelli dell’origine di replicazione, suggerendo che
Cdc45 abbia un ruolo importante nella forcella di replicazione. Questa
proteina, infine, è coinvolta nel processo di reclutamento della DNA
polimerasi α/ primasi sul complesso di iniziazione.
REGOLAZIONE DEL COMPLESSO DI INIZIAZIONE
CDK e Cdc7-Dbf4 sono proteine chinasi importanti per la regolazione del
processo di iniziazione della replicazione nelle cellule eucariote, ed agiscono
in differenti momenti e su differenti substrati. CDK, inoltre, ha un ruolo di
regolazione negativa su tale meccanismo, bloccando la re-iniziazione della
replicazione del DNA.
CDK(cyclin-dependent Kinases)
Le proteine CDK sono una famiglia di proteine chinasi che per svolgere la loro
funzione catalitica hanno bisogno dell’interazione con proteine cicline
attivanti. Grazie alla fosforilazione di siti specifici sui substrati proteici
mediano il processo della replicazione.
Cdc7-Dfb4 kinase
Cdc7 è una proteina
serina-treonina chinasi espressa a livelli costanti
attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare, la cui attività è influenzata dal
fattore proteico Dfb-4, che si lega ad essa. L’attività di Cdc7 è bassa durante
la fase G1 , aumenta durante la transizione G1/S, rimane alta durante tutta la
fase G2 perpoi abbassarsi durante la fase M.
INIZIAZIONE DELLA REPLICAZIONE E SUA REGOLAZIONE
All’origine di replicazione è legato costitutivamente il complesso ORC al quale
si legano le proteine Cdc6 e Cdt1. Durante la fase G1, Cdc6 e Cdt1 reclutano il
complesso MCM; queste 3 componenti
formano il complesso di pre-
replicazione (pre-RC).
La fase S è poi innescata dalle proteine CDK e Cdc7 che fosforilando siti
specifici di Cdc6 e MCM attivano il complesso pre-RC. La fosforilazione di
Cdc6, ad opera di Cdc7-Dbf4 provoca un cambiamento conformazionale della
proteina che conduce al suo successivo distacco dal complesso e al legame di
Cdc45. In modo analogo, la fosforilazione di MCM produce il suo distacco dal
complesso durante il processo di sintesi del DNA. Una volta che la
replicazione è stata completata MCM rimane nel nucleo come complesso
solubile durante le fasi G2 e M.
Il meccanismo che porta alla sintesi di una sola molecola di DNA per ogni
ciclo cellulare coinvolge le proteine CDK e l’inattivazione dei fattori che
compongono il complesso di pre-RC.
La fosforilazione di Cdc6 provoca il distacco dal complesso della proteina, la
sua successiva esportazione nel citoplasma e alla degradazione per mezzo del
proteosoma.
Anche la fosforilazione di Cdt1 comporta la distruzione della proteina, ed in
caso di mancata degradazione Cdt1 viene inibita da un’altra proteina , la
Geminina, la quale è espressa durante le fasi S, G2 e mitosi.
Durante la mitosi le condizioni del complesso MCM cambiano profondamente.
La rottura della membrana nucleare permette Cdc6 e Cdt1, non legato alla
geminina, di legarsi al complesso. Questo processo permette il reclutamento
di MCM che lega la cromatina di entrambe le cellule figlie.