REPLICAZIONE DEL DNA Replicazione semi-conservativa Matthew Meselson Franklin Stahl Dimostrazione della replicazione semi-conservativa N14 N15 lavaggio e trasferimento G0 N14 lavaggio e trasferimento G1 G2 Colture di Escherichia coli Generazione 0 (G0), E. coli coltivato in presenza dell’isotopo pesante N15 G1 e G2, E. coli coltivato in presenza dell’isotopo leggero N14 Dimostrazione della replicazione semi-conservativa continua Equilibrio dopo centrifugazione con gradiente di densità gradiente La centrifugazione a 100.000 x g per 50-60 min genera un gradiente di CsCl ed il bandeggiamento del DNA + Dimostrazione della replicazione semi-conservativa continua N15 N14 leggero intermedio pesante G0 G1 G2 Dimostrazione della replicazione semi-conservativa Biologia molecolare della replicazione del DNA nei procarioti Replicazione del DNA Arthur Kornberg Scoprì la polimerasi I ed il meccanismo della sintesi del DNA, lavorando con Escherichia coli Sono necessari quattro componenti: 1. dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (deossribonucleoside 5’-trifosfato) (zucchero-base + 3 fosfati) 2. DNA stampo 3. DNA polimerasi I (chiamata anche enzima di Kornberg) (DNA polimerasi II e III scoperte successivamente) 4. Mg 2+ (ottimizza l’attività della DNA polimerasi) DNA polimerasi Particolarità funzionali della DNA polimerasi Caratteristiche principali della reazione di sintesi del DNA DNA polimerasi III catalizza la formazione di un legame fosfodiestere tra il 3’-OH del deossiribosio dell’ultimo nucleotide ed il 5’fosfato del dNTP legame fosfodiestere L’energia per la reazione deriva dal rilascio di due dei tre fosfati. La DNA polimerasi III “trova” il corretto dNTP complementare in ogni passo del processo di allungamento. Velocità ≤ 800 dNTP/secondo. Direzione della sintesi 5’ 3’. Allungamento del DNA filamento stampo filamento nuovo DNA polimerasi legame fosfodiestere deossribonucleotide 5’-trifosfato allungamento 5’ 3’ Azione della DNA polimerasi III Origine della replicazione L’unità di replicazione si chiama replicone e possiede una propria origine di replicazione Il sito dove inizia la replicazione è chiamato forcella di replicazione. La replicazione può essere unidirezionale o, più frequentemente, bidirezionale. DNA DNA RNA d’innesco forcella di replicazione forcella di replicazione Replicazione semidiscontinua I due filamenti di DNA hanno una polarità opposta 5’ 3’ e 3’ 5’. La DNA polimerasi sintetizza DNA solo nella direzione 5’ 3’. Il DNA è replicato sui due filamenti stampo in direzioni opposte: •Filamento leader: sintetizzato da 5’ a 3’ nella direzione del movimento della forcella di replicazione, la replicazione è continua e richiede un solo RNA d’innesco •Filamento tardivo: sintetizzato da 5’ a 3’ nella direzione opposta del movimento della forcella di replicazione, la replicazione è discontinua e richiede molti RNA d’innesco 5’ 3’ Replicazione semidiscontinua continua Movimento forcella di replicazione 3’ 5’ Il filamento leader si replica in modo continuo Il filamento tardivo si replica in modo discontinuo, un enzima unisce i tratti di DNA (frammenti di Okazaki) 3’ 5’ 3’ 5’