REPLICAZIONE DEL DNA
Replicazione semi-conservativa
Matthew Meselson
Franklin Stahl
Dimostrazione della replicazione semi-conservativa
N14
N15
lavaggio e
trasferimento
G0
N14
lavaggio e
trasferimento
G1
G2
Colture di Escherichia coli
Generazione 0 (G0), E. coli coltivato in presenza dell’isotopo
pesante N15
G1 e G2, E. coli coltivato in presenza dell’isotopo leggero N14
Dimostrazione della replicazione semi-conservativa
continua
Equilibrio dopo centrifugazione con gradiente di densità
gradiente
La centrifugazione a 100.000 x g per
50-60 min genera un gradiente di
CsCl ed il bandeggiamento del DNA
+
Dimostrazione della replicazione semi-conservativa
continua
N15
N14
leggero
intermedio
pesante
G0
G1
G2
Dimostrazione della replicazione semi-conservativa
Biologia molecolare della
replicazione del DNA nei
procarioti
Replicazione del DNA
Arthur Kornberg
Scoprì la polimerasi I ed il meccanismo della
sintesi del DNA, lavorando con Escherichia coli
Sono necessari quattro componenti:
1.
dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
(deossribonucleoside 5’-trifosfato)
(zucchero-base + 3 fosfati)
2.
DNA stampo
3.
DNA polimerasi I (chiamata anche enzima di Kornberg)
(DNA polimerasi II e III scoperte successivamente)
4.
Mg 2+ (ottimizza l’attività della DNA polimerasi)
DNA polimerasi
Particolarità funzionali
della DNA polimerasi
Caratteristiche principali della reazione di sintesi del DNA
DNA polimerasi III catalizza la formazione di un
legame fosfodiestere tra il 3’-OH del
deossiribosio dell’ultimo nucleotide ed il 5’fosfato del dNTP
legame
fosfodiestere
L’energia per la reazione deriva dal rilascio di due dei tre fosfati.
La DNA polimerasi III “trova” il corretto dNTP complementare in ogni
passo del processo di allungamento.
Velocità ≤ 800 dNTP/secondo.
Direzione della sintesi 5’  3’.
Allungamento del DNA
filamento
stampo
filamento
nuovo
DNA
polimerasi
legame
fosfodiestere
deossribonucleotide
5’-trifosfato
allungamento
5’  3’
Azione della DNA polimerasi III
Origine della replicazione
L’unità di replicazione si chiama replicone e possiede una propria origine di
replicazione
Il sito dove inizia la replicazione è chiamato forcella di replicazione.
La replicazione può essere unidirezionale o, più frequentemente, bidirezionale.
DNA
DNA
RNA d’innesco
forcella di
replicazione
forcella di
replicazione
Replicazione semidiscontinua
I due filamenti di DNA hanno una polarità opposta 5’  3’ e 3’  5’.
La DNA polimerasi sintetizza DNA solo nella direzione 5’  3’.
Il DNA è replicato sui due filamenti stampo in direzioni opposte:
•Filamento leader: sintetizzato da 5’ a 3’ nella direzione del
movimento della forcella di replicazione, la replicazione è
continua e richiede un solo RNA d’innesco
•Filamento tardivo: sintetizzato da 5’ a 3’ nella direzione opposta
del movimento della forcella di replicazione, la replicazione è
discontinua e richiede molti RNA d’innesco
5’ 3’
Replicazione semidiscontinua
continua
Movimento
forcella di
replicazione
3’ 5’
Il filamento leader si replica in modo
continuo
Il filamento tardivo si replica in modo
discontinuo, un enzima unisce i tratti di
DNA (frammenti di Okazaki)
3’ 5’
3’ 5’