Bioreattori
In un reattore di questo tipo, prima ancora di considerare il bilanci di materia, è utile
definire l’espressione cinetica, espressione che coincide (o dipende strettamente) con
quella della velocità di accrescimento della biomassa.
Supponendo che la riproduzione del nostro microrganismo avvenga per via asessuata,
avremo che da una cellula madre si formeranno due cellule figlie in un intervallo di
tempo τ caratteristico del tipo di microrganismo e di altri parametri relativi allo stato
fisiologico delle sue cellule (se giovani oppure invecchiate) e a quello dell’ambiente in
cui esso vive (abbondanza o meno di nutrienti, presenza di sostanze che favoriscono o
inibiscono la crescita). Se il tempo di duplicazione di ogni cellula è sempre lo stesso è
t
evidente che in tempo t si verificheranno
divisioni ed il numero di cellule presenti
τ
sarà diventato:
t
τ
N =2
Partendo da N0 cellule iniziali, invece che da un’unica cellula madre, avremmo, dopo un
intervallo t:
t
N = N0 ⋅ 2 τ
cellule. È possibile modificare la relazione appena trovata, introducendo come base
della potenza il numero “e”:
t
ln(N ) = ln(N0 ) + ⋅ ln (2)
τ
ln(2)
µ=
τ
N
 = µ ⋅ t
ln
N
 0
N = N0 ⋅ e µ⋅t
Il parametro µ viene denominato tasso di crescita specifico del microrganismo
considerato. Il motivo di tale denominazione sta nel fatto che:
dN
= N0 ⋅ e µ⋅t ⋅ µ = N ⋅ µ
dt
1 dN
µ= ⋅
N dt
In tutte le espressioni su scritte il termine N rappresenta il numero totale di cellule
del microrganismo, tuttavia si può facilmente verificare che le formule precedenti
rimangono valide anche utilizzando la concentrazione CN di dette cellule al posto del
loro numero N. L’ultima espressione ricavata ci fa capire che la cinetica di
accrescimento cellulare (se il tasso di crescita specifico µ è costante nel tempo) è del
primo ordine. Ciò significa che, diagrammando la crescita della biomassa (o l’aumento
della concentrazione della biomassa) in funzione del tempo, otterremmo una linea
retta, su un diagramma semilogaritmico, il cui coefficiente angolare è pari proprio a µ:
1
N
 = µ ⋅ t ⇒ ln (N ) = ln(N0 ) + µ ⋅ t
ln
 N0 
Le prove sperimentali dimostrano invece che l’accrescimento delle cellule segue una
legge diversa, rappresentabile da una curva a sigmoide del tipo:
In altri termini il tasso di crescita µ, che rappresenta la pendenza della curva in ogni
punto, cambia continuamente nel tempo, passando da un valore 0 iniziale fino ad un
massimo (in corrispondenza del flesso della curva) per poi decrescere nuovamente e
tornare su valori prossimi a zero.
La parte iniziale del diagramma definisce la cosiddetta fase lag o fase di latenza. In
questo primo periodo (che corrisponde ai minuti successivi all’inoculo nel brodo di
fermentazione) le cellule del microrganismo non si moltiplicano ma semplicemente
adattano il loro metabolismo alle nuove condizioni proprie dell’ambiente in cui sono
state introdotte.
Superata questa fase, l’accrescimento comincia ad essere sempre più rapido fino a
raggiungere un valore massimo, punto nel quale si ha la fase denominata log ossia di
massima crescita esponenziale . Il questa fase la rapidità di duplicazione delle cellule
non è ostacolata da nessun fattore, quale ad esempio la concentrazione di sostanze
nutrienti (substrato) che, anzi, sono disponibili in quantità illimitata.
La durata di questa fase è quindi strettamente legata alla concentrazione iniziale del
substrato nel brodo di fermentazione.
Non appena tale concentrazione tenderà a diminuire, l’accrescimento delle cellule
avverrà sempre meno rapidamente, perché il numero di nuove cellule prodotte
nell’unità di tempo è compensato da un numero sempre maggiore di cellule che muoiono
a causa della ridotta disponibilità di nutrienti.
2
Ad un certo punto il numero di nascite sarà uguale a quello delle morti (nell’unità di
tempo) per cui ha inizio la terza fase, detta stazionaria, in cui non avviene nessun
incremento della popolazione microbica.
A questa normalmente fa seguito una quarta fase (detta di decadimento) in cui
avviene un decremento del numero di cellule poiché le morti superano le nascite.
Per poter prevedere la cinetica di accrescimento batterico (e quindi dimensionare in
maniera opportuna un bireattore) è pertanto indispensabile disporre di una funzione
analitica che rappresenti:
a) l’andamento nel tempo del tasso di crescita µ, oppure
b) l’andamento di µ in funzione della concentrazione della biomassa, oppure
c) l’andamento di µ in funzione della concentrazione del substrato.
Questa funzione (che deve essere ricavata da dati sperimentali), dovendo dare origine
ad una curva a sigmoide come quella rappresentata in figura, dovrà contenere al suo
interno almeno tre parametri che dipenderanno dal tipo di microrganismo preso in
considerazione e dal terreno di coltura in cui tale microrganismo si sta sviluppando.
Tra le decine di funzioni proposte in letteratura per descrivere il tasso di crescita di
un microrganismo, una delle più utilizzate (anche per la sua semplicità ed eleganza) è
senz’altro quella di Monod:
µ ⋅C
µ = max S
KS + CS
In cui CS è la concentrazione del substrato e KS è la costante di mezza vita, ossia il
valore di CS per il quale il tasso di crescita assume un valore pari a metà del suo
massimo. KS esprime, analogamente alla costante KM di Michaelis-Menten nella
omonima equazione, una sorta di affinità esistente tra microrganismo e substrato,
maggiore il valore di KS, minore è tale affinità e viceversa.
Per poter utilizzare la relazione di Monod e ricavare da essa una espressione cinetica
da inserire nella equazione di progetto di un bireattore, occorre trasformare la
dipendenza funzionale di µ da CS (concentrazione del substrato) in termini di CN
(concentrazione della biomassa). Per fare questo introduciamo una nuova grandezza, la
resa (“yield”) YN/S :
numerocellule prodotte
V ⋅ CN − CN0
YN =
=
massasubstrato consumato V ⋅ CS0 − CS
S
(
(
CS =
YN ⋅ CS0 + CN0 − CN
S
YN
S
=
)
)
CNmax − CN
YN
S
E, sostituendo in Monod:
CN − CN
CN − CN
µmax ⋅ max
µmax ⋅ max
YN
YN
µmax ⋅ CNmax − CN
S
S
µ=
=
=
CN − CN KS ⋅ YN + CNmax − CN KS ⋅ YN + CN − CN
max
KS + max
S
S
YN
YN
S
(
(
)
)
S
3
Reattore batch:
l’equazione di progetto, applicata alla biomassa, diviene:
dC
rN = + N
dt
dC
µ ⋅ CN = N
dt


KS ⋅ YN + CNmax − CN  ⋅ dCN
dCN
S

dt =
=
CN ⋅ µmax ⋅ CNmax − CN
CN ⋅ µmax ⋅ CNmax − CN
KS ⋅ YN + CNmax − CN
(
(
(
)
)
)
(
)
S
t
∫ dt = µ
CN
1
⋅
max
0
∫
CN0


KS ⋅ YN + CNmax − CN  ⋅ dCN
S


CN ⋅ CNmax − CN
(
(
)
)
L’integrale a secondo membro può essere calcolato col metodo dei coefficienti
indeterminati, ottenendo:


KS ⋅ YN + CNmax − CN 
B
S

= A +
CN ⋅ CNmax − CN
CN CNmax − CN
(
(
(
)
)
)
(
(
)
A ⋅ CNmax − CN + B ⋅ CN = KS ⋅ YN + CNmax − CN
)
S
KS ⋅ YN


S
 − A + B = −1
B=

− A ⋅ CN + B ⋅ CN = −CN

CNmax


KS ⋅ YN
⇒
A ⋅ CN = KS ⋅ YN + CN ⇒ 
S
max
max
KS ⋅ YN
+1 

A =
S
CNmax
S

A =
+1
CNmax



 KS ⋅ YN
 CN
 KS ⋅ YN
CN KS ⋅ YN + CNmax − CN  ⋅ dCN

1
1 
dCN 
S


S
S
⋅
=
⋅ 
+ 1 ⋅
+
µmax C
CN ⋅ CNmax − CN
µmax  CNmax
C
C
 CN0 N  Nmax
N0



∫
(
(
)
)
Per cui l’equazione differenziale integrata fornirà:
 KS ⋅ YN

K ⋅Y 

  CN   S NS   CNmax − CN
S
−
µmax ⋅ t = 
+ 1  ⋅ ln
 ⋅ ln


C
C
C
 Nmax
  N0   Nmax   CNmax − CN0




Ponendo, in tale equazione:
KS ⋅ YN
CN
S
P=
Q = max
CN0
CNmax
∫




 CN

dCN
⋅
 CN0 CNmax − CN

∫(
(7)
Otterremo:
4




)
C 

Q− N 
C 
CN0 
(8)
µmax ⋅ t = (P + 1) ⋅ ln N  − P ⋅ ln

 CN 
Q
−
1
 0




C 

C 
(9)
µmax ⋅ t = (P + 1) ⋅ ln N  − P ⋅ ln Q − N  + P ⋅ ln (Q − 1)
 CN 


C
N0 
 0

Le relazioni (7), (8) e (9) rappresentano tutte l’equazione della sigmoide che lega la
concentrazione della biomassa contenuta nel reattore al tempo. Come si può notare
tale equazione contiene tre parametri, KS , YN e µmax , che dipendono dal tipo di
S
microrganismo (rappresentano in qualche modo la sua carta di identità) e
dall’interazione tra questo e il substrato su cui si sta sviluppando, più altri due
parametri, CN0 e CS0 (che è implicitamente definito in CNmax ) che invece dipendono dalla
nostra scelta.
Reattore CSTR
Applicando l’equazione di progetto al sistema in questione:
VCSTR CN − CN0
=
rN
Q
VCSTR CN − CN0
=
Q
µ ⋅ CN
Supponendo, come è logico, che nella corrente in ingresso non sia presente biomassa,
otterremo:
VCSTR 1
=
Q
µ
5
VCSTR
rappresenta il tempo di permanenza dell’alimentazione
Q
all’interno del reattore. Se introduciamo la variabile D, detta rapporto di diluizione,
Q
definita come: D =
, l’equazione di progetto si riduce a:
VCSTR
Si noti che il rapporto
D=µ
(10)
L’uguaglianza ora ricavata esprime questa situazione: in condizioni di regime, in un
reattore CSTR la velocità di crescita specifica di un microrganismo è uguale alla
velocità di diluizione, ossia maggiore è la quantità di sostanze nutritive immesse,
maggiore sarà la rapidità con cui si accresce il microrganismo.
In altre parole, supponiamo di essere partiti con un reattore batch con una certa CN0 e
CS0 . Dopo un certo tempo t, quando le concentrazioni hanno assunto i valori CN e CS e il
tasso di crescita sia diventato µ, alimentiamo il reattore con una portata costante Q
Q
tale che D = = µ . Il sistema da questo momento in avanti permane indefinitamente
V
nelle stesse condizioni senza modificare né le concentrazioni né il tasso di crescita.
Potrebbe essere interessante cercare di capire quello che succederebbe, a questo
punto, se modificassimo la portata di alimentazione Q (cioè il fattore D).
Supponiamo quindi che in un certo istante t (in cui la situazione all’interno del reattore
sia di regime e la concentrazione di biomassa sia CN ) la velocità di diluizione sia
modificata e portata ad un nuovo valore D’ ≠ µ. Applicando l’equazione di bilancio
avremo:
INbiomassa − OUTbiomassa + GENbiomassa = ACC
0 − Q'⋅CN + µ ⋅ V ⋅ CN = V⋅
dCN
dt
dCN
dt
Separando le variabili ed integrando:
− D'⋅CN + µ ⋅ CN =
C'N
∫
CN
dCN
=
CN
t + ∆t
∫ (µ − D')⋅dt
t
 C' 
ln N  = (µ − D')⋅ ∆t
 CN 
C'N = CN ⋅ e (µ−D')⋅∆t
Nel calcolo dell’integrale abbiamo supposto per semplicità che il tasso di crescita µ
non si modifichi e rimanga costante nell’intervallo di tempo ∆t preso in considerazione.
Il calcolo quindi ci porta quindi ad una conclusione prevedibile anche solo sulla base
dell’intuizione. Se la velocità di diluizione D’ è aumentata rispetto al valore iniziale µ’,
l’esponente avrà segno meno per cui la concentrazione di biomassa tenderà a
diminuire. Viceversa, se la velocità di diluizione è diminuita, la concentrazione di
biomassa tenderà a crescere in misura esponenziale.
Tutto ciò si traduce, ai fini pratici, nella seguente considerazione:
6
1. Se il reattore, in condizioni di regime, opera nel ramo superiore della sigmoide,
tra la zona di crescita illimitata (µ=µmax) e quella stazionaria (µ=0), il
funzionamento sarà stabile, nel senso che piccole variazioni della portata in
ingresso (e quindi del rapporto di diluizione D) comporteranno un adeguamento
del tasso di crescita µ della popolazione microbica. Dopo un certo tempo il
sistema si autoregolerà ritornando in una nuova situazione di regime µ = D. In
un reattore operante in queste condizioni (detto chemostato), portata in
ingresso e concentrazione della biomassa non richiedono quindi necessariamente
un controllo esterno.
2. Se il reattore opera nel tratto inferiore della curva, tra la zona di latenza (µ=0)
e quella di crescita illimitata (µ=µmax) compresa, il funzionamento non sarà più
stabile, nel senso che mentre una diminuzione del rapporto di diluizione
determinerà una nuova situazione di regime, un suo aumento porterà il sistema
al completo esaurimento della biomassa (condizione di dilavaggio o “wash-out”).
Un reattore che lavori in tali condizioni (detto turbidostato) richiede, per un
corretto funzionamento, un sistema di controllo della concentrazione della
biomassa che agisca modificando opportunamente la portata in ingresso.
3. la condizione di wash-out si verificherà in ogni caso se il rapporto di diluizione
D dovesse essere maggiore di µmax
7