Genomi vegetali
Il DNA nella cellula non è contenuto solo nel nucleo
ma anche all’interno di:
Mitocondri DNA mitocondriale MtDNA
Plastidi
(classificabili in base alla loro colorazione):
verdi cloroplasti
di altri colori (rossi, arancioni e gialli) cromoplasti
incolori leucoplasti
mitocondri: struttura…
1 membrana esterna presenza di porina
(passaggio di molecole < 10 KDa)
2 membrana interna (impermeabile,
presenza di trasportatori specifici)
3 spazio intermembrana (risulta più acido
dello matrice, gradiente chemio-osmitoco)
4 matrice (matrice acquosa colloidale
contenente numerosi enzimi, ribosomi e
molecole di DNA mitocondriale (mtDNA)
Dimensioni: 1-2μm cioè la grandezza media di un batterio
Il numero di mitocondri/cellula è correlato con l’attività metabolica cellulare
….e funzione!
Centrale energetica della cellula
trasformazione del piruvato in acetilCoA
ciclo delll’acido citrico (Krebs)
catena respiratoria accoppiata alla sintesi di ATP
catabolismo degli acidi grassi (β ossidazione)
parte del ciclo dell’urea
deposito di calcio…omeostasi del calcio citoplasmatico
Complesso I: NADH deidrogenasi
Complesso II: succinato deidrogenasi
Complesso III: ubichinolo-citocromo c reduttasi
Complesso IV: citocromo c ossidasi
Complesso V: ATP sintasi
DNA mitocondriale mtDNA
La maggior parte dei genomi mitocondriali sono molecole di DNA circolare,
a doppia elica e superavvolte
Presenza di diversi nucleoidi all’interno della cellula
Alcuni mtDNA sono lineari (protozoi ciliati, alga verde unicellulare
Chlamydomonas reinhardtii )
Anche per le Angiosperme si ritiene che mtDNA sia circolare, tuttavia
i genomi mitocondriali vegetali sono fisicamente eterogenei e caratterizzati
da una particolare complessità strutturale.
mtDNA non è associato a istoni o a proteine simili
Dimensioni del mtDNA
Dimensioni: mtDNA animale 14-42 Kbp, funghi 17-176 Kbp, piante 187-2400 Kbp
Dimensioni dei DNA mitocondriali
Organismo
Homo sapiens
Saccharomyces cerevisiae
Kbp
16,6
65-85
Arabidopsis thaliana
372
Oriyza sativa (riso)
492
Merchantia polyorpha (epatica)
Cucumis melo (melone)
187 (minimo)
2400
Non c’è correlazione tra le dimensioni dei genomi nucleari e mitocondriali
nelle piante: Arabidopsis possiede uno dei genomi nucleari più piccoli, ma
il suo genoma mitocondriale è di dimensioni medie
Geni identificati in DNA mitocondriali
1 RNA ribosomale
Subunità grande
Subunità piccola
5S
2 RNA transfer
3 proteine della catena respiratoria
ComplessoI
Complesso III
Complesso IV
Complesso V
4 proteine ribosomali
5 biogenesi del citocromo c: geni presenti solo nelle piante
Contenuto di geni del mtDNA di Chlamydomonas
Geni che codificano per
proteine
Geni di rRNA
Geni di tRNA
Gene
Prodotto genico
cob
Apocitocromo
coxI
Subunità I della citocromo
ossidasi
Nad1, nad2, nad4, nad5,
nad6
Subunità della NADH
deidrogenasi
L1-L8
Segmenti che codificano
subunità grandi di rRNA
S1-S4
Segmenti che codificano
subunità piccole di rRNA
W
tRNA del triptofano
Q
tRNA della glutammina
M
tRNA della metionina (di
allungamento, non di inizio)
Complessità fisica e instabilità strutturale del
genoma mitocondriale vegetale
Profili di restrizione con endonucleasi dell’mtDNA sono caratterizzati da
un elevato numero di frammenti, alcuni dei quali presenti in quantità molto
piccole rispetto agli altri
Studi di mappaggio e di sequenziamento hanno rivelato sequenze ripetute
presenti in poche copie nel genoma
Queste sequenze ripetute hanno un’importante funzione
nel produrre gran parte dell’eterogeneità che caratterizza
mtDNA vegetale
Plant mitochondrial
genome organization
I e II rappresentano
le sequenze ripetute
One Master Circle or Several
Smaller Circles?
One master circle?
Several smaller circle?
sublimons
Vs.
Multipartite organization!
Restricted
mtDNA
La complessità globale dell’intero mtDNA può essere riassunta all’
interno di una singola molecola circolare detta cromosoma principale
(master circle).
All’interno del cromosoma principale si possono distinguere le zone
ripetute.
Le sequenze ripetute:
non sono conservate tra le diverse specie
possono avere lo stesso orientamento oppure direzione opposta
possono generare inversioni
possono generare anche molecole sub-genomiche in seguito a
delezioni, alcune delle molcole generate sono presenti in quantità
molto esigue (sublimoni)
determinano infine una struttura genomica multi partita
Recombination across inverted repeats leads to inversions
1
2
1’
3
2’
1
4
3’
4’
2
1’
3’
2’
4’
3
4
Recombination across direct repeats leads to deletions
1
2
4’
3
3’
4
2’
1’
3
1
2’
2
3’
4’
1’
4
Various Sizes of DNA molecules in Plant
Mitochondria
mtDNA molecules in Chenopodium album
Dato che il cromosoma principale e le molecole sub-genomiche
circolari sarebbero di notevoli dimensioni, è probabile che non resistano
all’isolamento in forma integra, e ciò può spiegare l’elevata proporzione
di molecole lineari eterogenee, rispetto alle circolari, che vengono isolate
dall’mtDNA vegetale.
Il modello multipartito spiega l’esistenza e i rapporti strutturali di molte
sequenze ripetute che sono state identificate negli mtDNA mitocondriali,
tuttavia apre una serie di quesiti:
come si replica il DNA mitocondriale vegetale?
come segrega durante la divisione cellulare?
Geni del DNA mitocondriale delle Angiosperme
RNA ribosomali e relativi geni
I ribosomi dei mitocondri vegetali sedimentano a circa 78S e contengono
rRNA 18S (subunità piccole) e rRNA 26S (subunità grande).
Queste dimensioni sono più vicine a quelle degli rRNA eucariotici che a
quelle degli omologhi batterici (12S e 23S) e molto maggiori rispetto
agli rRNA dei mitocondri animali (12S e 16S).
I mitocondri vegetali inoltre contengono un particolare rRNA 5S che è
assente dai ribosomi di quasi tutti gli eucarioti.
organizzazione insolita dei geni per rRNA mitocondriale vegetale:
18S-5S a una certa distanza… 26S
solitamente, in eubatteri e coloroplasti si ha:
16S-23S-5S……….organizzati in cluster
RNA transfer e i relativi geni
il numero di geni per tRNA non è sufficiente a produrre tutti i tRNA
necessari alla lettura del codice
il numero e il tipo di tRNA varia da specie a specie, tuttavia è sempre
inferiore a quello di mammiferi e funghi dove sono presenti 22-25 geni
per tRNA
alcuni tRNA sono codificati da geni nucleari e successivamente
importati nel mitocondrio (meccanismo sconosciuto)
vi è somiglianza tra tRNA mitocondriali e cloroplastici: ipotesi di loro
derivazione da DNA promiscuo plastidico e successiva perdita del gene
originale mitocondriale
i tRNA mitocondriali delle angiosperme possono avere 3 derivazioni
1. tRNA “nativi” codificati dall’mtDNA
1. tRNA di tipo plastidico codificati da DNA promiscuo
1. tRNA di tipo citosolico codificati dal genoma nucleare e importati
dal citosol nel mitocondrio
geni che codificano per proteine
introni in geni mitocondriali di angiosperme:
presenza di introni nella stessa posizione in geni di piante “vicine”
esempio monocotiledoni e gene della citocromo ossidasi
introni spesso autocatalitici
presenza di una RNA maturasi che consente lo splicing
la struttura primaria dei geni dei mitocondri vegetali che codificano per
proteine è molto conservata, la somiglianza cala drasticamente al di
fuori delle sequenze codificanti.
Codice genetico universale e mitocondriale
Differenze tra i codici genetici nucleari e
mitocondriali di uomo e lievito
Codone
aminoacido
Codice nucleare
Codice
Codice
mitocondriale mitocondriale
lievito
mammiferi
UGA
Terminazione
Triptofano
Triptofano
AUA
Isoleucina
Metionina
Isoleucina
CUN
Leucina
Leucina
Treonina
AGG,AGA
CGN
Arginina
Arginina
Terminazione Arginina
Arg
Terminazione
?
NB attenzione nella produzione eterologa di proteine mitocondriali
Meno del 10% delle proteine che
compongono un mitocondrio
sono sintetizzate dal
DNA mitocondriale
Vi sono meccanismi
di importazione di proteine
verso il mitocondrio
e i suoi comparti interni
Cloroplasti:
La famiglia dei plastidi
Buchannan et al. Fig. 1.44
Foglia
Funzione del cloroplasto:
sede della fotosintesi negli organismi vegetali
sede, non unica, della biosintesi di amminoacidi fenilpropanoidi,
sito di azione di erbicidi, incluso il glifosate
sede, non unica, della biosintesi degli acidi grassi
DNA cloroplastico ctDNA
Il numero di copie di cpDNA per cloroplasto dipende dalla specie
ci sono molte copie di cpDNA per cloroplasto, generalmente distribuite in
un certo numero di regioni nucleoidi.
I cloroplasti crescono e si dividono come i mitocondri.
Plant Plastid Genome Organization
Physical map (e. g. restriction map or DNA sequence) indicates a 120-160 kb
circular genome
Large inverted repeat (LIR) commonly 20-30 kb divides genome into large single
copy (LSC) region and small single copy (SSC) region
Inversion of genome segments indicates active recombination within the LIR
Expansion and contraction of LIR is the primary length polymorphism in land
plants (10-76 kb)
Conifers and some legumes have no LIR
DNA cloroplastico di riso
LSC
long single copy
LIR
LIR
SSC
short single copy
Le regioni invertite contribuiscono all’eterogeneità dei cpDNA
L’organizzazione genica del DNA
cloroplastico
Il genoma cloroplastico contiene i geni per tutti gli rRNA cloroplastici
(16S, 23S, 4,5S e 5S).
Il genoma contiene anche i geni che codificano per i tRNA e per alcune
ma non tutte le proteine necessarie per la trascrizione e la traduzione
dei geni codificati dal cpDNA (quali proteine ribosomali,
subunità della RNA polimerasi e fattori di traduzione) o per la fotosintesi.
In alcuni geni che codificano proteine e per quelli dei tRNA ci sono introni.
Altre proteine che si trovano nel cloroplasto sono codificate da geni nucleari
Una caratteristica del genoma del cloroplasto è quella di contenere
2 copie di ciascuno dei geni per l’rRNA.
Le due serie di geni ribosomali del cloroplasto si trovano in due
identiche sequenze ripetute di 20-30 Kb, orientate nel genoma in senso
inverso.
In queste due sequenze ripetute ci sono altri geni che così risultano
duplicati.
La presenza di queste 2 regioni ripetute individua una breve regione
a DNA a singola copia (short single copy, SSC)
e una regione lunga a singola copia (long single copy, LSC).
Tabacco e riso hanno entrambi 30 geni per tRNA mentre in Marchantia ,
una epatica, ce ne sono 32.
L’analisi al calcolatore delle sequenze dei cpDNA ha evidenziato
circa 100 ORF.
Una sessantina di queste sono state correlate con geni che codificano
per proteine a funzione nota, mentre per le altre la funzione deve essere
ancora definita.
Le ORF sono piuttosto conservate nelle piante, almeno per quelle delle
quali sono disponibili dati di sequenza.
Geni codificati dal DNA plastidico
geni di decodificazione del DNA
trascrizione: subunità della RNA polimerasi
traduzione: RNA ribosomali, tRNA, fattori di inizio
geni implicati nella fotosintesi
subunità grande della Rubisco
subunità del PSI
subunità del PSII
complessso citocromo b6-f
subunità della ATP sintetasi
sintesi della clorofilla
altri geni
NADH ossido-reduttasi
La traduzione nei cloroplasti
Per la sintesi delle proteine cloroplastiche sono utilizzati ribosomi 70S
specifici dei cloroplasti, che sono composti da una subunità 50S ed
una subunità 30S.
La subunità 50S contiene una copia per ciascuno degli rRNA 23S, 4,5S
e 5S.
La subunità 30S è costituita da una copia di rRNA 16S.
ll numero delle proteine ribosomali di ciascuna subunità è meno definito,
ma è noto che solo alcune sono codificate nel nucleo, mentre altre
sono codificate dal cloroplasto.
La sintesi proteica nei cloroplasti assomiglia al processo di sintesi
proteica nei procarioti.
Il tRNA per la formil-metionina usato per cominciare la sintesi di tutte
le proteine e il cloroplasto utilizza fattori di inizio(IF),
fattori di allungamento (EF) e di rilascio (RF) specifici del cloroplasto.
Per la sintesi proteica è usato il codice genetico universale.
I ribosomi cloroplastici, come quelli mitocondriali, sono sensibili a tutti
gli inibitori della sintesi proteica nei procarioti mentre risultano resistenti
alla cicloesimide che colpisce selettivamente i ribosomi citoplasmatici.
La RUBISCO, il più importante enzima plastidiale coinvolto
nella fotosintesi è formata da 8 subunità proteiche grandi e 8
subunità piccole.
L’informazione genica per costruire la subunità grande è
contenuta nel DNA dei cloroplasti mentre quella per
costruire la subunità piccola nel DNA del nucleo.
Importazione di proteine dal citoplasma al
cloroplasto
DNA promiscuo
L’origine degli organelli sarebbe riconducibile all’ipotesi dell’endosimbionte:
un cianobatterio per il cloroplasto e un proteobatterio per i mitocondri.
Entrambi hanno mantenuto caratteristiche del loro genoma batterico,
ma hanno mantenuto più della loro biochimica che del loro DNA.
Trasferimento genico endosimbiontico: i geni sono stati trasferiti
dall’endosimbionte al nucleo, ma le proteine codificate sono poi
reimportate nell’organulo tramite segnali di transito e un apparato di import.
La regolazione dei due sistemi non è autonoma, anche l’organulo è
soggetto a meccanismi di regolazione nucleari.
Quali geni?
I geni cloroplastici sono da 60 a 200 (i cianobatteri non simbionti unicellulari
arrivano a 3200)
Le proteine nel cloroplasto sono circa 2000.
Quanti geni nucleari sono chiaramente derivati dal cloroplasto?
al momento ne sono stati identificati solo 44.
Il genoma dei mitocondri vegetali è più grande del genoma mitocondriale
animale.
Questa espansione non significa un maggior numero di geni.
Sono noti almeno 11 casi di chiara derivazione mitocondriale