XIX CORSO NAZIONALE PER TECNICI DI LABORATORIO BIOMEDICO
Riccione, 22-25 Maggio 2012
NEXT GENERATION
SEQUENCING
Dr.ssa Antonella Laginestra
Laboratorio di patologia Molecolare,
Sezione di Emolinfopatologia,
Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche "L. and A. Seràgnoli",
Ospedale S. Orsola Malpighi, Università di Bologna
SANGER (1977)
NEXT GENERETION
SEQUENCING
•In 1976–1977, Allan Maxam and Walter Gilbert developed a DNA sequencing method
based on chemical modification of DNA and subsequent cleavage at specific bases.
•Sanger method : chain-termination sequencing
• “Next-Generation" sequencing technologies: bead-based method that used a complex
approach of adapter ligation followed by adapter decoding, reading
•
Dye-terminator sequencing
• Reversible dye-terminators
Applicazioni della Next Generation Sequencing
•La metagenomica
•RNA-seq
•Cancer Genomic
•SNPs Detection
•Epigenomic Studies
Diverse piattaforme di sequenziamento
•
•
•
•
454 Life Sciences Roche
Illumina Sequencing
SOLiD Sequencing Applied Biosystems
Ion semiconductor Sequencing Ion Torrent Systems
Inc
Modalità di sequenziamento
Single Read
Paired-End
100 – 500 bp
Mate Pair
2 – 10 Kb
Preparazione Library e Sequenziamento
Frammentazione casuale del DNA genomico o RNA
Ligazione degli adattatori
Amplificazione clonale dei frammenti
Sequenziamento mediante sintesi
Processamento delle immagini
Mappatura delle reads su un genoma di riferimento
(o assemblaggio de novo)
PREPARAZIONE LIBRARY DI DNA
DNA fragments
Blunting by Fill-in and exonuclease
Phosphorylation
Addition of A-overhang
Adapter ligation
Library
PREPARAZIONE LIBRARY DI RNA
Flow cell
La flow cell è un supporto in vetro delle dimensioni di
un vetrino da microscopio che contiene 8 lane a loro
volta suddivise in 120 tile: dei quadrati in cui è
possibile fissare circa 220.000 oligo di DNA.
Surface of flow
cell coated with
a lawn of oligo
pairs
8 channels
cBot: New automated cluster generation system
•Pre-configured, plug-and-play reagents
•Simple touch screen operation
•Barcode scanner for reagent and sample
tracking
•Real-time run monitoring and selfdiagnostics
•Intervention-free clonal amplification in 4
hours
Cluster generation: Denature double-stranded DNA
Filamento di
nuova
sintesi
Filamento
originale
•La doppia elica di
DNA viene
denaturata
•Il filamento originale
viene lavato via
•Il filamento neo
sintetizzato è
attaccato
covalentemente
sulla superficie della
flowcell
Cluster generation: Bridge amplification
•Single-strand flips over to hybridize to adjacent
primers to form a bridge.
•Hybridized primer is extended by polymerases.
•Double-stranded bridge is denatured.
•Result: Two copies of covalently
bound single-stranded templates.
Sequenziamento: metodologia di sequenziamento è basata sulla ”sintesi
sequenziale" di oligonucleotidi attraverso l’utilizzo di terminatori
dideossi reversibili.
A
T
G
C
A
T
G
C
Sequencing Steps
T
G
A
C
T
G
T
C
A
T
C
G
A
G
C
A
T
C
Up to 250
cycles
C
A
TGCTACGATCCA ....
Prenatal aneuploidy by low depth sequencing
DNA
Sequence
Esempi di Applicazione della Next Generation Sequencing
In Patogenesi in cui sono coinvolti un gran numero di geni (patogenesi
multifattoriale)
•autismo
•tumori
•malattie cardiache
………Grazie a Tutti Per la
Vostra Attenzione…….