PROGETTI RICERCA a livello regionale
Triennio 2014-2017:
Valutazione genetica delle api regine al fine della selezione delle caratteristiche
di tolleranza delle api verso le patologie
SCOPO DELLA SPERIMENTAZIONE
Con questo progetto di ricerca applicata si intende mettere a punto un sistema di valutazioni e test di
campo a scopo di selezione per il miglioramento genetico delle attitudini difensive delle colonie di
api nei confronti delle malattie, in particolare varroasi e peste americana. Il progetto prevede il
coinvolgimento di allevatori di api regine che operano in Emilia Romagna, ponendosi come
obiettivo generale l’introduzione dei metodi della selezione nelle strategie di prevenzione e
profilassi sanitaria delle aziende, in sintonia con le indicazioni del Piano integrato igienico-sanitario
per la tutela delle api in Emilia Romagna (2010) e delle Linee guida per la profilassi della peste americana
in Emilia Romagna (2007).
PROGRAMMA DI ATTIVITÀ NEL TRIENNIO
La selezione è finalizzata al miglioramento delle caratteristiche di tolleranza delle colonie di api nei
confronti di varroasi e peste americana. A questo fine si è scelto il comportamento igienico come
principale parametro di valutazione. Si aggiungono valutazioni sul grado infestazione da Varroa
destructor e sulla presenza di peste americana sia a livello clinico che subclinico.
Questo lavoro di valutazione e selezione viene realizzato in un centro genetico costituito da circa 60
colonie ripartite in due apiari (Fig. 1) e nelle quali sono inserite api regine fornite da allevatori della
regione (complessivamente 6 linee, corrispondenti ad altrettanti allevamenti).
In sintesi il programma di selezione prevede valutazioni di caratteri correlati con la resistenza alla
malattie, in particolare:
1) grado di infestazione da Varroa destructor per mezzo di:
a. esame della caduta naturale degli acari nel cassettino diagnostico;
b. conteggio degli acari caduti dopo trattamento acaricida in assenza di covata;
c. determinazione degli numero di acari presenti in campioni di api
adulte (percentuale
di infestazione);
2) “comportamento igienico” delle colonie mediante applicazione di specifici test di rimozione
della covata;
3) determinazione del livello di contaminazione da spore di Paenibacillus larvae (peste
americana) in campioni di detriti raccolti dal cassettino diagnostico e in campioni di api
adulte (nel corso della stagione).
Ad integrazione delle verifiche sulle
caratteristiche di difesa verso le
malattie, sono presi in considerazione i
parametri produttivi e comportamentali
di interesse economico, come la
produzione miele, la docilità, la forza
numerica.
I risultati delle valutazioni, elaborati in
indici di selezione, vengono utilizzati
per la scelta delle api regine da
riprodurre, secondo predefiniti schemi,
in condizioni di accoppiamento
controllato, conseguito mediante il
ricorso ad una stazione di fecondazione
parzialmente isolata.
Parte delle api regine di seconda
generazione così prodotte sono
destinate ad essere distribuite tra gli
allevatori che hanno aderito al progetto,
in modo che possano essere valutate in apiari commerciali oltre che utilizzate come madri per una
terza generazione. Le le informazioni di ritorno provenienti dalle aziende possono essere utilizzate
nella determinazione del progresso genetico conseguito.
Fig. 1 – Apiario in valutazione situato nel comune di Quattro
castella (Reggio Emilia)
Incontri formativi con allevatori e tecnici delle associazioni regionali sono organizzati presso le
strutture del CRA-API ai fini del trasferimento dei risultati delle ricerche e di istruzione sulle
procedure di valutazione a scopo di miglioramento genetico.
IL COMPORTAMENTO IGIENICO NELLA SELEZIONE PER LA TOLLERANZA VERSO LE
MALATTIE
La selezione di api tolleranti verso le malattie è ritenuto uno strumento strategico con grandi
potenzialità ai fini della prevenzione e della riduzione della dipendenza dal controllo chimico, con
evidenti benefici per la salubrità dei prodotti dell’alveare. Ciononostante, i metodi del
miglioramento genetico trovano una diffusione ancora imitata in apicoltura.
Il più noto fattore di tolleranza alle malattie attiene l’immunità sociale della colonie di api ed è ben
noto nella comunità scientifica come “hygienic behavior”, definizione coniata nel 1956 da
Rothenbuhler, traducibile in “comportamento igienico”. Esso consiste nella abilità espressa dalle
api operaie di individuare, disopercolare e rimuovere le larve infette o parassitizzate.
Sulla base di evidenze sperimentali, il comportamento igienico è considerato il principale fattore di
tolleranza verso peste americana e covata calcificata nonché una componente del sistema di difesa
contro la varroasi.
Il comportamento igienico è ereditabile e può pertanto essere migliorato con la selezione. Per
quanto riguarda la genetica del carattere, per lungo tempo è prevalso un modello interpretativo
basato sull’effetto di singoli geni, a eredità di tipo mendeliano, sulla scorta degli studi di
Rothenbuhler nei primi anni sessanta del secolo scorso. Studi più recenti, basati anche su tecniche
molecolari, suggeriscono un modello ben più complesso e di tipo quantitativo, dove le colonie
igieniche e le non igieniche sono due estremi di un carattere che varia in maniera continua.
La selezione per il comportamento igienico è oggetto di attenzione da almeno cinquant’anni.
Programmi di ricerca, estesi anche a livello di apiari commerciali, hanno evidenziato che seguendo
appropriati programmi di selezione il carattere può essere migliorato rapidamente, con effetti
R9
R7
R8
R6
R4
R5
R2
R3
colonie
infestazione giugno
media rimozione %
Fig. 2 -Variabilità del livello di comportamento igienico in un apiario in valutazione. Il valore di rimozione
espresso in percentuale è la media di due test successivi.
rimozione
0%
R10
10%
0,0%
C9
R1
20%
1,0%
C8!
2,0%
C6
C7
30%
C5
40%
3,0%
C4
50%
4,0%
C10
C2
C3
5,0%
B9
60%
C1
70%
6,0%
B7
B8
80%
7,0%
B6
90%
8,0%
B4
B5
9,0%
B3
100%
B1
10,0%
B10
(B2)
infestazione
benefici sulla salute degli alveari: minore incidenza di malattie infettive, come peste americana e
covata calcificata, e riduzione del tasso di infestazione da Varroa destructor. E’ stato inoltre
dimostrato che la selezione per il comportamento igienico non inficia le altre caratteristiche di
interesse economico, come la produzione di miele.
Sono stati messi a punto specifici test di valutazione del carattere applicabili in campo e alla portata
delle aziende di produzione di api regine. Essi permettono di individuare le colonie igieniche, cioè
quelle che esprimono il carattere al massimo livello e che vanno quindi adibite alla riproduzione
(Fig. 2).
Si stima che nelle popolazioni non selezionate, ovvero nella comune realtà apistica, il livello del
comportamento igienico sia generalmente basso e che le colonie igieniche rappresentino una solo
una piccola percentuale, non superiore al 10%. In queste condizioni iniziali la selezione per il
comportamento igienico può portare ad un progresso genetico relativamente rapido ed è importante
che il lavoro sia intrapreso da molti allevatori sia per mantenere la variabilità genetica all’interno e
tra le linee selezionate sia per garantire un miglioramento del carattere a favore della generalità
degli apicoltori.
Malgrado le potenzialità evidenziate messe in luce dalla ricerca e dalla sperimentazione, la
selezione per il comportamento igienico è una pratica ancora poco diffusa nelle aziende di
produzione di api regine a livello commerciale. Esempi di applicazione aziendale provengono
soprattutto dagli Stati Uniti, anche se è difficile valutare in maniera scientifica e quindi
indipendente il progresso conseguito nella gestione sanitaria degli alveari presso gli apicoltori che
si approvvigionano di regine appartenenti a linee igieniche.
Uno dei fattori che ostacola una maggior diffusione della selezione per il comportamento igienico è
probabilmente insito nella difficoltà di applicare metodi di valutazione standardizzati e ripetibili,
che garantiscano individuare in modo attendibile le colonie effettivamente dotate delle prerogative
ricercate.. In effetti l’espressione del comportamento igienico di una colonia è il risultato di una
complessa interazione tra genotipo, fattori interni e ambiente. Di conseguenza, può variare
notevolmente sia a livello di colonia che a livello individuale, cioè tra le api della stessa famiglia.
Infatti la rapidità e l’efficienza della rimozione può essere influenzata da fattori esterni come le
condizioni di raccolto, il momento stagionale, ma anche da fattori interni come la proporzione di api
della stessa colonia capace di mettere in atto l’attività igienica. Quest’ultima è legata
sostanzialmente alla composizione genetica della colonia, notoriamente eterogenea a causa della
poliandria. I fattori di variabilità del carattere hanno in definitiva una diretta influenza sul risultato
dei test di valutazione e una attenta pianificazione stagionale delle verifiche di campo è necessaria
al fine dell’attendibilità dei risultati.
VALUTAZIONE DEL COMPORTAMENTO IGIENICO
Il parametro alla base della valutazione del comportamento igienico è la velocità di rimozione della
covata morta. Non potendo, per ovvi motivi epidemiologici, eseguire prove di rimozione su covata
infetta o infestata ad hoc, si ricorre a metodi indiretti che prevedono l’uccisione delle pupe mediante
congelamento oppure mediante perforazione con spilli entomologici. Più recentemente è stato
descritto un sistema di verifica della attitudine igienica specificatamente indotta dalla presenza nelle
celle di varroe in riproduzione, conosciuto con l’acronimo VSH (Varroa Sensitive Hygiene =
comportamento igienico sensibile alla varroa).
Metodo della covata congelata
Questo metodo è particolarmente valido per individuare le colonie dotate di buona capacità di difesa
contro peste americana e covata calcificate mentre è moderata la correlazione con la protezione
verso la varroasi.
La procedura è la seguente: da ogni alveare sottoposto a valutazione, si taglia una sezione di favo di
5 x 6 cm, composta da circa 100 celle di covata opercolata per lato; si congela la sezione a – 20°C
per 24 ore dopodiché la si reintroduce nell’alveare sfruttando l’apertura nel favo creata dal taglio;
dopo 24 ore si procede al conteggio delle celle disopercolate e completamente ripulite dalle pupe; si
ripete il test una seconda volta; si considerano “igieniche” le colonie che rimuovono più del 95%
della covata morta entro 24 ore, in entrambe le prove (Fig. 2).
Il test descritto è comunemente utilizzato a scopo di ricerca, ed è applicabile anche presso gli
allevamenti che intraprendono programmi di selezione di linee tolleranti. Tuttavia benchè non
richieda particolare attrezzatura, il metodo risulta piuttosto laborioso ed è per questo che è stato
messo a punto un metodo di congelamento alternativo che ricorre all’uso dell’azoto liquido. Questo
viene dispensato mediante appositi serbatoi dotati di valvola. Si estrae un favo di covata
dall’alveare in valutazione e con il supporto di un tubo del diametro di 75 mm e una lunghezza di
100 mm si somministra l’azoto liquido ad una porzione di covata opercolata in modo da provocarne
il congelamento rapido (Fig.3). Si reintroduce il favo nell’alveare di origine e lo si controlla dopo
24 ore, procedendo come indicato sopra. In sintesi, il metodo di congelamento con l’azoto liquido
risulta vantaggioso perché meno laborioso, più rapido e meno distruttivo nei confronti dei favi.
Fig. 3 – Test del comportamento igienico: operazioni di congelamento della covata con azoto liquido.
Metodo dello spillo
Adottato in Europa, questo test è correlato con la capacità di rimozione della covata infestata dalla
varroa.
La procedura è relativamente semplice e
prevede l’utilizzo di telaietto romboidale
della misura di 10 x 10 celle (Fig. 4 punto
2), che viene posto su una porzione di
covata opercolata con pupe giovani (occhi
bianchi-rosa) (Fig. 4 punto 1); con un
pennarello vengono marcate la prima cella
in alto a sinistra e l’ultima in basso a destra
(Fig. 4 punto 3); mediante uno spillo
entomologico vengono perforate 50 celle
Fig. 4
(Fig. 4 punto 4; fig. 5), marcando la 51°
cella (Fig. 4 punto 3) per indicare il termine
dell’area trattata; il favo viene riposizionato nell’alveare e dopo un termine di tempo che può andare
da 8 a 24 ore ma che comunque deve essere il medesimo per tutte le colonie sottoposte al test, si
procede al conteggio delle celle ancora opercolate nell’intervallo che comprende le celle che sono
state perforate (Fig.6); sottraendo questo valore al numero di celle perforate, si ottiene la quantità di
pupe rimosse, che si traduce in valore percentuale con una semplice proporzione.
Si raccomanda di ripetere il test per due o tre volte durante la stagione attiva.
Fig. 5 – perforazione delle pupe mediante spillo all’interno
del telaio guida
Fig. 6 – Porzine di favo sottoposta a test dello spillo,
pronta per la lettura
VARROASI. METODO RAPIDO DI VALUTAZIONE DEL LIVELLO DI INFESTAZIONE DELLE
COLONIE
Il monitoraggio regolare della popolazione di varroa che infesta le colonie non è solo una
condizione importante per la lotta integrata alla parassitosi, ma anche uno strumento per la
selezione di colonie tolleranti verso la stessa.
Sono disponibili diversi metodi per stimare il grado di infestazione da varroa, distinti per
ripetibilità, precisione, difficoltà di applicazione. La scelta della metodica dipende dalla finalità del
test oltre che da altre variabili come il momento della stagione in cui viene praticata.
In generale, per saggiare le performance delle colonie rispetto alla capacità di difesa dal parassita, è
opportuno eseguire più verifiche del livello di infestazione nel corso della stagione. In periodi di
bassa infestazione, come all’inizio della primavera, la mortalità naturale degli acari (valutata
attraverso la caduta sul fondo dell’arnia) può costituire una stima soddisfaciente della popolazione
complessiva. Invece, l’esame di campioni di api adulte è preferibile nei momenti più avanzati della
stagione, quando la popolazione di acari cresce.
La stima del tasso di crescita della popolazione di acari durante la stagione fornisce un
informazione importante nel valutare singolarmente le colonie per la capacità di tolleranza verso la
varrosi. A questo scopo si può fare riferimento al livello di infestazione a inizio stagione,
determinato per mezzo della caduta naturale in un intervallo di 3-4 settimane, al quale rapportare il
livello di infestazione di campioni di api adulte raccolti durante l’estate. La misurazione ripetuta
dell’infestazione delle api ad intervalli di 3-4 settimane migliora l’accuratezza della stima.
Un metodo semplice per valutare il tasso di infestazione richiede il trattamento di un campione di
api con zucchero a velo al fine di distaccare le varroe (Fig. 7). La procedura è di seguito descritta..
Materiale necessario
-zucchero a velo (conservato in ambiente secco);
-cucchiaio;
-barattolo tipo 1Kg miele dotato di tappo modificato con griglia che non fa passare api (per es.
griglia fondo arnia);
-barattolo da 100ml circa, tarato mediante prove preliminari per un contenuto di circa 300 api
-foglio di cartoncino o di plastica bianco.
Procedura
-scegliere un favo di covata opercolata;
-scrollare le api su un l foglio ed inserirle nel contenitore da 100ml (circa 300 api);
-trasferire le api nel barattolo piu grande;
-aggiungere 2 cucchiai zucchero a velo e chiudere il barattolo con il coperchio dotato di griglia;
-per 1 minuto agitare delicatamente con movimento rotatorio per distribuire lo zucchero sulle api;
-lasciare fermo il barattolo per 3 minuti
-sopra ad un foglio bianco agitare vigorosamente per 1 minuto il barattolo capovolto, onde far
uscire zucchero e varroe;
-contare e annotare il numero di varroe cadute;
- calcolare la percentuale di infestazione delle api.
Oltre alla semplicità di esecuzione il metodo presenta
il vantaggio di non essere distruttivo e le api
campionate ed esaminate possono essere restituite
all’alveare di provenienza; il test può pertanto essere
ripetuto più volte nel corso della stagione senza
arrecare danni alle colonie di api.
Ai fini della selezione di colonie dotate di
caratteristiche di tolleranza verso la varroasi, la prova
dello zucchero a velo qui descritta fornisce con buona
aprossimazione un parametro di valutazione del
livello di infestazione delle colonie. In generale, la
precisione della stima non è soddisfaciente per bassi
livelli di infestazione (< 2%) e per colonie piccole o
con poca covata.
Fig. 7 – Una fase di esecuzione del test dellz zucchero in
polvere per la valutazione del livello di infestazione di
campioni di api adulte
PESTE AMERICANA. METODI DI VALUTAZIONE DEL LIVELLO DI INFEZIONE DELLE
COLONIE
Il test del comportamento igienico effettuato mediante il metodo del congelamento della covata è
stato messo a punto prima di tutto per la selezione di colonie dotate di meccanismi di resistenza alla
peste americana. Quindi, nell’ambito di un programma di selezione di linee di api “igieniche”, il
monitoraggio del livello dell’infezione nelle colonie è uno strumento importante per verificare
direttamente il progresso conseguito nella capacità di difesa contro l’agente patogeno. Le colonie
igieniche sono particolarmente efficienti nel rimuovere le larve malate prima della formazione delle
spore, che rappresentano la forma infettiva del batterio responsabile ed è presumibile che in linea
generale ci sia una proporzionalità inversa tra il livello di comportamento igienico e la
contaminazione dell’alveare con le spore di Paenibacillus larvae.
Per questo, la determinazione della carica di spore presente in alcune matrici dell’alveare costituisce
uno strumento ddi diagnosi indiretta non solo per valutare il rischio di sviluppo clinico della
malattia ma anche per valutare l’efficcienza del controllo dell’infezione da parte della colonia.
La ricerca delle spore può essere effettuata in
diverse matrici: miele, polline, cera, api.
Quando l’indagine diagnostica riguarda singoli
alveari, è preferibile l’esame delle api, dato che il
relativo metodo è dotato di sensibilità ottimale e
consente inoltre di individuare e valutare con più
precisione le infezioni subcliniche.
Le api si possono prelevare sia dal nido sia dal
melario in numero di 50-100 a campione, in
qualsiasi momento della stagione attiva.
Recentemente è stata messa a punto una metodica
per la ricerca delle spore di P. larvae nei detriti
cerosi raccolti sul fondo dell’alveare. L’aspetto Fig. 8 – Campionamento dei detriti caduti sul
innovativo di questa tecnica risiede nel fatto che fondo dell’alveare.
non è necessario aprire gli alveari e di conseguenza
il campionamento può essere eseguito anche nel periodo invernale. La raccolta del materiale
prevalentemente ceroso che si deposita sul fondo dell’arnia può essere effettuata agevolmente
mediante il cassettino diagnostico di cui oggi sono dotate tutte le arnie (Fig. 8). La praticità
dell’operazione di campionamento rende questo metodo particolarmente adatto a campagne di
monitoraggio sul territorio che possono essere organizzate anche nell’ambito di programmi di
selezione, dove il riscontro analitico fornisce una informazione complementare rispetto ai risultati
dei test di valutazione del comportamento igienico.
I grafici delle figure 9 e 10 riportano i risultati di una indagine biennale condotta nel territorio
regionale sul valore predittivo rispetto allo sviluppo primaverile della peste americana dei risultati
degli esami analitici di campioni di api e di detriti raccolti nel periodo autunno-invernale. La
validità previsionale del controllo di queste matrici è confermata: rischio di sviluppo della malattia
conclamata cresce proporzionalmente al grado di contaminazione con spore.
frequenza (n. alveari)
Esame delle api
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
n = 140 (PA: 20,0%)
9
19
37
32
15
SANI
PA
9
10
1
neg
3
5
< 1000
1000 - 10000
10001- 100000
> 100000
livello contaminazione (UFC/ape)
Fig. 9 – Livello di contaminazione da spore delle api raccolte in inverno e rischio di
sviluppo della peste americana nella primavera successiva.
Esame dei detriti
n = 351 (PA: 15,1 %)
frequenza (n. alveari)
100%
90%
6
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10
28
102
152
20
9
12
10%
0%
3
neg
9
< 1000
1000 - 10000
10001100000
> 100000
livello contaminazione (UFC/g)
Fig. 10 – Livello di contaminazione da spore dei detriti raccolti in inverno e rischio di
sviluppo della peste americana nella primavera successiva.
SANI
PA
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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