DUPLIC α RealTime AEAC
Chlamydia trachomatis kit
Ref. EBR031032 - 32 tests
0459
INTENDED USE
DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit is a qualitative assay for the detection
of Chlamydia trachomatis 16s gene and the cryptic plasmid DNA.
PRINCIPLE OF THE TEST
DUPLICα RealTime AEAC (Advanced Extraction/Amplification Control) Dual Easy Chlamydia trachomatis
kit is an assay for the DNA-based detection of Chlamydia trachomatis. The reagents for the amplification
are ready to use and provided in four separate tubes:




AMPLIFICATION MIX with Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology),
nucleotides, MgCl2 and buffer.
OLIGO MIX with different sets of with primers and fluorogenic probes for the amplification of
target DNA and extraction-amplification control (human β-GLOBIN gene).
CONTROL to validate amplification reaction.
Reaction Blank to verify the absence of contaminations.
The Advanced Real Time PCR, patented by EuroClone, exploits the features of a classic PCR reaction as
well as the features of a standard Real Time PCR. Briefly, nucleic acid amplification occurs through two
phases: in the first phase target nucleic acids are pre-amplified by PCR reaction, whereas in the second
phase are further amplified and detected by a Real Time PCR reaction.
From the analytical point of view the use of this technology allows a sharp decrease of the threshold cycle
(Ct) leading to an increase of the system sensitivity as well as the data reproducibility. This features is
extremely useful in case of clinical samples that for several reasons (e.g. the nature of the specimens or
of the target or the efficiency of the purification system) have a low amount of target DNA and/or an high
amount of interfering substances.
Most commonly, PCR is carried out in three steps: denaturation, annealing (primers binding) and
extension. These steps, which are carried out in a thermal cycler that allows heating and cooling,
represent the basic cycle of amplification; the continuous repetition of a basic cycle produces billions of
fragments of the examined DNA. The denaturation of DNA which is carried out at high temperatures is
followed by the annealing of specific primers to the target DNA: the enzyme Taq polymerase recognizes
the 3’-ends of these primers and polymerizes the DNA using the dNTPs, thus creating several copies of
the template. In all real-time PCR systems the amplified products are detected by using a fluorescent dye
that in fluorogenic probes is called “reporter”.
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The DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit allows the detection of bacterial
DNA by using specific fluorogenic sequence probes. The kit uses probes labelled with different dyes for
the target microorganism and for the extraction-amplification control; in particular the probes detecting
the bacterial sequences have a FAM molecule (6-carboxyfluorescein) covalently bound at the 5’-end
whereas the other probe detecting the control gene (β-GLOBIN) has a HEX molecule (hexa-chlorofluoresceine) at 5’-end. All probes have at their 3’-ends a dark quencher.
REAGENTS PROVIDED
Each kit contains sufficient reagents to perform 32 tests. The kit allows to detect a human endogenous
gene (β-GLOBIN), therefore validating the extraction-amplification process. The kit allows to set up 4
analytical runs, each of them including 6 samples, 1 control and 1 reaction blank.
For Real Time PCR
Reagents
Amplification mix (400 ul)
Oligo Mix* (with primes and probes for target DNA along
with endogenous human β-GLOBIN gene) (400 ul)
Control (>50 ul)
Reaction blank (B) (50 ul)
Colour Code
Blue Cap
Green Cap
Red Cap
White Cap
*store the tube away from light
STORAGE AND HANDLING
All reagents have to be stored at -22°C/-18°C. All reagents can be used until the expiration date printed
on the labels. EuroClone Diagnostica recommends freezing and thawing the products at most six times.
Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all
reagents and to resuspend them by pipetting 3 times.
REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
•
Micropipette 1-10 µl with filter tips
•
Micropipette 10-100 µl with filter tips
•
Kit for DNA extraction
•
Bio-hazard hood (bio-safety level 2)
•
Micro-centrifuge
•
Rack for 0.2 ml tubes
•
Optical tubes or microplate for Real-Time PCR
•
Thermal cycler for Real Time PCR
PRECAUTIONS AND WARNINGS
•
Do not use the reagents after the date of expiration.
•
Mix the reagents of the kit before use.
•
Periodically verify the calibration of micropipette and instrumentation.
•
Change gloves frequently.
•
Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to
another.
•
Periodically clean the working area with hypochlorite 0,5%.
•
Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this
may cause an interference with fluorescence detection.
OPERATING PROCEDURE
a) DNA extraction for clinical specimens
The kit has been validated using the following biological specimens: swabs, urine and seminal fluid.
For extraction from urine is recommended to: collect 10-20 ml of first morning clean-catch, midstream
urine into a clean, sealed container with no preservative; centrifuge at 800g between +2°C and +8°C for
5 minutes; verify the presence of pellet; re-suspend the pellet in 500 ul of PBS or physiological solution.
The specimens should be stored between +2°C and +8°C and ideally tested immediately or within 24
hours. For the extraction EuroClone Diagnostica recommends the automated systems: (1) Duplicα®Prep
Body Fluid kit (ref. EDI004200); (2) Qiagen EZ1 DNA Tissue Kit (48) (ref. 953034).
b) Thermal Cycler set up
EuroClone Diagnostica validated the kit using the flowing Real-Time PCR thermal-cycler:
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(1) SmartCycler® (Cepheid) using FCTC25 dye-set, (2) CFX96™ and DX™ Real-Time PCR Detection
System (Bio-Rad).
Thermal Profile:
Time
Temperature
5 min
95°C
15 sec
95°C
60 sec
68°C
15 sec
95°C
60 sec
54°C
N° of Cycles
1
X 10
Fluorescence Acquisition off
X 50
Fluorescence Acquisition on
c) Preparation of PCR mix
For each run prepare a PCR mix for 1 control (Control), 1 reaction blank, n+1 samples, using the
following volume of PCR reagents for each test:
REAGENT
Amplification mix
Oligo mix
VOLUME (ul)
10
10
Mix well and aliquot 20 µl of Master Mix into the tubes or microplate for PCR and then add to each
tube/well 5 µl of extracted DNA or control (Control); place the tubes/plates inside the instrument and
start the program of amplification you had set before.
Remember at the end of the program to remove the tubes from the thermal cycler.
d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS
The fluorescence signal registered by the instrument detects the presence of the DNA; in particular the
fluorescence detected in the FAM channel reveals the target DNA, whereas the fluorescence detected in
the HEX channel reveals the extraction-amplification control (β-GLOBIN endogenous gene). Results are
interpreted by analyzing the threshold Cycle (Ct) value for each sample.
The Ct is defined as the cycle at which the amplification curve crosses the threshold line.
When a signal at fluorophore FAM (Ct > 0) is detected, the sample is surely positive and the signal
detected by fluorophore HEX (Ct ≥ 0) is not relevant. When no signal at fluorophore FAM (Ct = 0) is
detected, to confirm a negative result, the amplification of extraction-amplification control, and therefore
the appearance of a HEX fluorescent signal (Ct > 0), must occur. Only in this case it can be stated that
the analyzed sample: contains human cells; has been correctly extracted; is definitely negative. The
absence of amplification signal for both fluorophores FAM-HEX (Ct=0) indicates: the presence of PCR
inhibitors or that the analyzed sample does not contain human cells or the extraction failed. In this case
it is suggested to: (1) dilute 1:10 the target DNA (to try to overcome inhibitors presence); (2) repeat
the complete analytical procedure, including the extraction.
FAM
HEX
RESULT
Ct > 0
Not relevant (Ct ≥ 0)
POSITIVE
Ct = 0
Ct > 0
NEGATIVE
Ct = 0
Ct = 0
INHIBITED/ACELLULATED
SAMPLE/EXTRACTION FAILED
EuroClone Diagnostica recommends: for SmartCycler® (Cepheid) to set the threshold line at 10 RFU in
both channels; for Bio-Rad DX™ Real-Time PCR Detection System (software version 1.7)
to
automatically set the threshold line using the “Regression” option.
Warning:
The run is valid only if:
•
•
The Blank is negative in both FAM-HEX channels.
The Control is positive in both FAM-HEX channels.
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If these two conditions have been met, the run is valid and it is possible to analyse the data.
Otherwise the run is not valid.
It is responsibility of the user to validate the run by checking that these conditions have been
met.
TROUBLESHOOTING
Problem 1: No signal
1. Wrong channel/filter was chosen.
2. Pipetting error due to omitted reagents or samples.
3. Inhibitory effect of the sample: insufficient DNA purification
4. Insufficient DNA extraction or acellulated sample
5. Check if the kit was stored correctly.
6. Assess the performance of the thermal cycler
Problem 2: Fluorescence intensity too low
1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to incorrect storage conditions.
2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA.
Problem 3: Fluorescence intensity varies
1. The prepared PCR master mix is not well mixed
2. Air bubbles trapped in the PCR tubes
“THE
PURCHASE
OF
THIS
PRODUCT
GRANTS
THE
PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN ROCHE PATENTS TO
USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO
DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER
LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT
OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY”
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DUPLIC α RealTime AEAC
Chlamydia trachomatis kit
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FINALITA’ D’USO
DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit è un test qualitativo, impiegato per la
ricerca del gene 16s e del plasmide criptico di Chlamydia trachomatis.
PRINCIPIO DEL TEST
DUPLICα RealTime AEAC (Advanced Extraction/Amplification Control) Dual Easy Chlamydia trachomatis
kit é un test molecolare basato sul riconoscimento del DNA di Chlamydia trachomatis. I reagenti per la
reazione di amplificazione sono pronti all’uso e suddivisi in quattro mix di reazione:




AMPLIFICATION MIX: contenente Taq DNA polymerase, nucleotidi, MgCl2 e buffer.
OLIGO MIX contenente distinti set di primers e le sonde fluorogeniche per l’amplificazione del
DNA target del controllo di estrazione-amplificazione (gene umano β-GLOBINA)
CONTROLLO per validare la reazione di amplificazione.
BIANCO DI REAZIONE per verificare l’assenza di contaminazioni
La nuova tecnologia Advanced Real Time PCR brevettata da EuroClone Diagnostica sfrutta le
caratteristiche di una classica reazione di PCR e quelle della standard Real Time PCR. Brevemente
l’amplificazione degli acidi nucleici avviene attraverso due fasi: nella prima fase vengono pre-arricchiti gli
acidi nucleici bersaglio attraverso una PCR, mentre nella seconda i target vengono amplificati
ulteriormente e poi rilevati grazie ad una Real Time PCR. Da un punto di vista analitico, l’applicazione di
questa tecnologia si traduce in una netta diminuzione del ciclo soglia (Ct) e quindi accresce la sensibilità
del sistema così come la riproducibilità dei dati. Questa caratteristica risulta estremamente vantaggiosa
per quei campioni clinici che per vari motivi (quali ad esempio la natura stessa del campione o del target
o l’efficienza del sistema estrattivo) sono caratterizzati da una scarsa quantità di DNA target nel
campione di partenza e/o da elevata quantità di sostanze interferenti.
La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di
DNA generando numerose copie di un templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi:
denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers) ed estensione. Queste fasi, che si
realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore,
rappresentano un ciclo di amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo base porta alla produzione di
miliardi di frammenti del DNA in studio. Alla denaturazione del DNA che avviene ad alte temperature
segue l’appaiamento di specifici primers al DNA target: l’enzima Taq polymerase riconosce le estremità 3'
di questi primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dNTPs) polimerizza il DNA, creando in questo modo
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numerose copie del templato. In tutti i sistemi PCR real-time la rivelazione dell’ amplificato avviene
utilizzando un marcatore fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato “reporter”.
DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit permette di rilevare il DNA batterico
mediante l’impiego di sonde fluorogeniche sequenza specifiche. Le sonde fluorogeniche sono costituite da
una sequenza oligonucleotica che presenta all’estremità 5’ un marcatore fluorescente chiamato
«reporter », mentre all’estremità 3’ legano un secondo marcatore chiamato « quencher ». Il saggio è in
grado di rilevare il prodotto specifico di amplificazione andando a monitorare l’incremento del segnale di
fluorescenza che risulta essere direttamente proporzionale alla quantità di prodotto amplificato; l'elevata
specificità del sistema consente alla sonda di discriminare tra frammenti che differiscono di un solo
nucleotide.
Nel kit vengono usate sonde marcate con fluorofori differenti per il microorganismo bersaglio e per il
controllo di estrazione-amplificazione; in particolare le sonde che vanno a rilevare le sequenze batteriche
hanno legato in modo covalente come fluoroforo all’estremità 5’ la molecola FAM (6-carbossifluoresceina) mentre la sonda che va a rilevare il controllo di estrazione-amplificazione (gene β-GLOBINA)
ha legato come fluoroforo all’estremità 5’ la molecola HEX (Esa-cloro-fluoresceina). Le due sonde hanno
all’estremità 3’ un dark quencher. Se eccitata, la sonda integra non emette fluorescenza, in quanto la
vicinanza del quencher al reporter, impedisce a quest’ ultimo l’emissione della fluorescenza (effetto di
quenching).
COMPOSIZIONE DEL KIT
Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni. Il Kit permette di rilevare un gene umano
endogeno (β-GLOBINA) validando così il processo di estrazione-amplificazione. Il kit permette di
effettuare 4 corse, ciascuna delle quali include: 6 campioni, 1 controllo e 1 bianco di reazione.
Per Real Time PCR
Reagenti
Mix di Amplificazione (400 ul)
Codice Colore
Tappo Blu
Oligo Mix* (con primers e sonde per DNA target e controllo di estrazioneamplificazione gene endogeno umano β-GLOBINA) (400 ul)
Tappo Verde
Controllo (>50 ul)
Tappo Rosso
Bianco di Reazione (B) (50 ul)
Tappo Bianco
*Proteggere la fiala da fonti luminose
CONSERVAZIONE E STABILITA’
Tutti i reagenti devono essere conservati a -22°C/-18°C fino alla data di scadenza riportata sulla
confezione. EuroClone Diagnostica raccomanda di non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte.
Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell’utilizzo si raccomanda di
centrifugare tutti i reagenti e risospenderli pipettandoli 3 volte.
MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO
•
Micropipette 1-10 ul e relativi puntali con filtro
•
Micropipette 10-100 ul e relativi puntali con filtro
•
Kit di estrazione del DNA
•
Cappa biologica bio-hazard (bio-safety level 2),
•
Microcentrifuga da banco
•
Rack per tubi da 0.2 ml
•
Micropiastra ottica per Real-Time PCR
•
Tubi per PCR da 0.2 ml con tappi ottici
•
Termociclatore Real-Time PCR
PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO
•
La strumentazione di laboratorio (pipette, tubi, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro
all’altra.
•
Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza.
•
Miscelare i reagenti del kit prima dell’utilizzo.
•
Periodicamente verificare la precisione delle pipette, e il corretto funzionamento della
strumentazione.
•
Cambiare spesso i guanti.
•
Lavare periodicamente il banco di lavoro con Ipoclorito al 0,5%.
•
Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare ditate sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi,
questo potrebbe creare dei problemi nella rivelazione della fluorescenza.
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PROTOCOLLO OPERATIVO
a) Estrazione DNA Batterico da campioni clinici
La validazione del kit è stata effettuata utilizzando i seguenti campioni biologici: tamponi, urine e liquido
seminale. Per l’estrazione dell’urina si consiglia di: raccogliere 10-20 ml della prima urina del mattino in
un contenitore pulito e chiuso senza alcun conservante; centrifugare a 800g a +2°/+8°C per 5 minuti;
verificare la presenza di pellet; rispospendere il pellet in 500 ul di PBS o fisiologica. I campioni possono
essere conservati tra +2° C e +8° C e, preferibilmente estratti immediatamente o entro le 24 ore.
EuroClone Diagnostica raccomanda per l’estrazione del campione biologico i sistemi automatici: (1)
Duplicα®Prep Body Fluid kit (ref. EDI004200), (2) Qiagen EZ1 DNA Tissue Kit (48) (ref. 953034).
b) Amplificazione e Rilevazione
EuroClone Diagnostica ha validato il kit utilizzando i seguenti termociclatori con tecnologia Real Time:
(1) SmartCycler® (Cepheid) con dye-set FCTC25, (2) CFX96™ e DX™ Real-Time PCR Detection System
(Bio-Rad).
Profilo termico:
Tempo
Temperatura
5 min
95°C
15 sec
95°C
60 sec
68°C
15 sec
95°C
60 sec
54°C
N° di Cicli
1
X 10 Acquisizione Fluorescenza off
X 50 Acquisizione Fluorescenza on
c) Preparazione della PCR mix
Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per 1 controllo, 1 bianco di reazione, n campioni più uno.
La mix deve essere preparata miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati:
REAGENTI
Amplification mix
Oligo mix
VOLUME (ul)
10
10
Terminata la preparazione della mix, aliquotare 20ul della Master Mix nei tubi o nelle micropiastre per
PCR e aggiungere in ogni tubo 5 µl di DNA estratto o del controllo; disporre i tubi all’interno dello
strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente impostato.
Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere i tubi dal termociclatore.
d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI
Il segnale di fluorescenza registrato dalla strumentazione identifica la presenza del DNA, in particolare la
fluorescenza rilevata dal CANALE FAM identifica il DNA target, mentre la fluorescenza rilevata dal canale
HEX identifica l’amplificazione del controllo di estrazione-amplificazione (gene endogeno βGLOBINA). I risultati sono interpretati attraverso l’analisi del ciclo soglia Ct (Threshold Cycle Ct) per
ciascun campione.
Il ciclo soglia è definito come il ciclo, a livello del quale, la curva di amplificazione interseca la linea soglia
(Threshold line).
Quando si registra un segnale a livello di fluoroforo FAM (Ct > 0), il campione è sicuramente positivo, ed
il segnale rilevato dal fluoroforo HEX (Ct≥ 0) non è rilevante. Quando non si registra segnale a livello di
Fluoroforo FAM (Ct = 0), per confermare la negatività del risultato, si deve verificare l’avvenuta
amplificazione del controllo di estrazione-amplificazione e quindi la comparsa di un segnale di
fluorescenza a livello di Fluoroforo HEX (Ct>0). Solo in questo caso si può affermare che il campione
biologico utilizzato: contiene cellule umane; è stato correttamene estratto; è sicuramente negativo.
L’assenza di segnale di amplificazione a livello dei due fluorofori FAM-HEX (Ct=0) indica che: sono
presenti inibitori della reazione PCR o che il campione non è cellulato o che l’estrazione è fallita. In questo
caso si suggerisce di: (1) effettuare una diluizione 1:10 del DNA target (per cercare di ovviare alla
presenza di inibitori); (2) ripetere l’analisi del campione a partire dalla fase di estrazione.
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FAM
HEX
RISULTATO
Ct > 0
Non rilevante (Ct ≥ 0)
POSITIVO
Ct = 0
Ct > 0
NEGATIVO
Ct = 0
Ct = 0
INIBITO/CAMPIONE
ACELLULATO/ESTRAZIONE
FALLITA
EuroClone Diagnostica raccomanda: per SmartCycler® di posizionare la linea threshold a 10RFU in
entrambi i canali; per Bio-Rad DX™ Real-Time PCR Detection System (versione del software 1.7) di
utilizzare la funzione “Regression” per il posizionamento automatico della threshold.
Attenzione:
La corsa é valida solo se:
•
•
Il Bianco é negativo in negativi entrambi i canali FAM ed HEX.
Il Controllo è positivo in entrambi i canali FAM ed HEX.
Se si verificano queste due condizioni la corsa risulta valida ed é possibile analizzare i dati,
altrimenti la corsa non é valida.
É responsabilità dell’operatore convalidare la corsa controllando che queste due condizioni si
siano verificate.
TROUBLESHOOTING
Problema 1: Mancanza completa di segnale
1. E’ stato scelto il canale/filtro sbagliato.
2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione.
3. Effetti inibitori del campione: insufficiente purificazione del DNA.
4. Estrazione insufficiente del DNA o campione non cellulato.
5. Controllare la corretta conservazione del kit.
6. Controllare le prestazioni del termociclatore.
Problema 2: Intensità di fluorescenza è troppo bassa
1. Deterioramento dei fluorofori e/o dei primers dovuto ad una errata conservazione del Kit.
2. Quantità di DNA non idonea e/o di bassa purezza.
Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile
1. La PCR Master Mix non è stata miscelata in modo corretto.
2. Presenza di bolle d’aria intrappolate nei tubi di PCR.
“L’acquisto di questo prodotto assicura all’acquirente i diritti coperti
da alcuni brevetti Roche allo scopo unico di offrire servizi di
diagnostica umana in vitro. L’acquisto di questo prodotto non concede
nessun altro brevetto generale, diritto o licenza di alcun tipo, al di
fuori dello specifico diritto di utilizzo”.
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