Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
http://www.diagnostics.com
Sistema a componenti
in fase solida per il dosaggio
della Total T4
Catalog No.: 06B-254011 (100 Tube)
06B-254029 (200 Tube)
06B-254030 (500 Tube)
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-431-1237
Customer support and technical information can be
obtained at local ICN Pharmaceuticals offices
Kundenberatung und technische Informationen bei
den ICN Pharmaceuticals Niederlassungen erhältlich
Pour toute aide et information techniques contactez
votre agence locale de ICN Pharmaceuticals
Per qualsiasi informazione o esigenza si prega di
rivolgersi agli uffici locali della ICN Pharmaceuticals
Para información y soporte técnico dirijase a las
oficinas locales de ICN Pharmaceuticals
SISTEMA A COMPONENTI IN FASE SOLIDA PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLA
TIROXINA TOTALE (T 4) NEL SIERO O PLASMA
Per la determinazione quantitativa dei livelli di titoxina totale nel siero o plasma.
Generalita' e Metodologia di Dosaggio
La tiroxina, come è comunemente denominato l'aminoacido iodato 3,5,3',5'-tetraiodo-L-tironina (T4), è la
iodotironina predominante ed è sintetizzata e secreta dalla ghiandola tiroide1. La T4, appena entrata in
circolo, viene legata quasi interamente a specifiche proteine plasmatiche, soprattutto TBG (thyroxin-binding
globulin). Normalmente, stante l'altissima affinità della TBG per la T4, più del 99,9% della T4 è legato, e
meno dello 0,1% è libero. Quest'ultima frazione è quella che prontamente penetra nelle cellule, esercita
l'azione ormonale e subisce poi la trasformazione metabolica. Escludendo i casi di eventuale anormalitá
nel legame della T4, la determinazione dei livelli di T4 circolante presenta un grado di accuratezza (> 90%)
nella diagnosi di ipo o ipertiroidismo.
Principio di Dosaggio
In radioimmunologia, l'antisiero impiegato dovrebbe presentare uguale affinità per la forma standard e per
l'analita presente nel siero. L'analita non marcato compete con il tracciante per i siti anticorpali in difetto,
inducendo pertanto una riduzione della quota di tracciante legato all'anticorpo. Il livello di radioattività
associata agli immunocomplessi risulterà pertanto inversamente correlato alla concentrazione di analita
del campione o dello standard. Al termine di un idoneo tempo di incubazione, le frazioni libera e legata
sono separate e viene per ultimo determinata la radioattività. Il sistema in fase solida ICN Pharmaceuticals
per il dosaggio radioimmunologico della tiroxina (T4) prevede l'impiego di provette sensibilizzate con
anticorpo monoclonale anti-T4 (coated tubes).
Reagenti
Per uso diagnostico in vitro
1.
Provette sensibilizzate con anticorpo monoclonale anti-T 4 (topo). Catalogo n° 06B263676.
Provette in plastica ricoperte con antisiero; 100 provette per confezione. Conservazione:
mantenere a temperatura ambiente (18 - 25°C) al secco. Non scambiare provette provenienti da
lotti diversi. Richiudere le provette rimanenti nella confezione. Stabilità: vedi la data di scadenza
sulla confezione. Stabilità dopo l'apertura: due mesi.
2.
T4 standard in siero A - F. Catalogo No 06B263666. Contenenti L-tiroxina in siero umano*, sodio
azide allo 0,1%** e altri conservanti; 1,5 ml per flacone (volume minimo). Un flacone per ogni
standard. Conservazione: refrigerare a 2-8°C. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
Stabilità dopo l'apertura: due mesi.
1
Standard
A
B
C
D
E
F
T4, µg/dl
0
2
4
8
12
20
T4, nmol/l (SI)
0
25,7
51,5
103
154
257
Catalogo n°
06B263667
06B263668
06B263669
06B263670
06B263671
06B263672
3.
Tracciante T 4 [I 125]. Catalogo n° 06B263673. Contenente meno di 9 µCi (333 kBq) per flacone
di tiroxina-I 125 in tampone, pH 7,9 con ANS, adiuvante della decantazione, colorante, sodio azide
allo 0,1%** e altri conservanti. Un flacone contiene 110 ml ed è sufficiente per l'allestimento di 100
provette. Conservazione: refrigerare a 2-8°C o mantenere a temperatura ambiente. Stabilità:
vedi la data di scadenza sul flacone.
*
ATTENZIONE: MANEGGIARE COME SE FOSSE CAPACE DI TRASMETTERE INFEZIONE. Il
materiale da cui e derivato questo prodotto e stato trovato non reattivo per HBsAg e negativo per
l'anticorpo Anti-HIV quando testato con reagenti autorizzati. Nessun test puo offrire garanzia che i
prodotti derivati da sangue umano non siano infettivi. Fare riferimento alla pubblicazione CDC/NIH
sulla Biosicurezza nei Laboratori di Microbiologia e Biomedica (Pubblicazione HHS n. CDC 848395).
**
ATTENZIONE: i reagenti contengono sodio-azide. Il sodio-azide può reagire con il piombo e il
rame delle tubature idrauliche formando composti metallici altamente esplosivi. All'atto dello scarico,
far fluire grandi volumi d'acqua così da prevenire l'accumulo. Altamente tossico per ingestione. A
contatto con acidi libera gas altamente tossico. In caso di contatto con la pelle lavarsi
immediatemente ed abbondantemente con d'acqua.
IMPIEGO DI MATERIALE RADIATTIVO: AVVERTENZE
L'acquisto, la ricezione, la detenzione, l'uso, il trasfermiento e lo smaltimento di materiale radioattivo, sono
soggetti ai regolamenti ed ai permessi previsti dalle autorità legislative. Nella manipolazione di sostanze
radioattive devono essere osservate le seguenti precauzioni:
Il materiale radioattivo deve essere conservato e manipolato in un'area del laboratorio specificamente
designata a tale uso. L'ambiente di lavoro deve essere ben illuminato e arieggiato. Le superfici di lavoro
devono essere non porose in modo da ridurre al minimo la contaminazione dovuta allo spargimento di
liquidi radioattivi. Considerata la piccola radioattività contenuta nel flacone del tracciante (circa 9 uCi), l'uso
del kit non pone alcun problema di pericolo di radiazioni. Tuttavia per evitare inalazione o ingestione di
materiale radioattivo è necessario rispettare le buone norme generali di laboratorio. In particolare si
raccomanda di: non pipettare con la bocca soluzioni radioattive; non mangiare, bere, fumare o usare
cosmetici nell'area di lavoro designata; pulire immediatamente le superfici di lavoro dai materiali radioattivi
eventualmente versati; raccogliere il materiale contaminato solido e liquido in appositi contenitori ed
effettuarne lo smaltimento secondo le procedure previste; lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso di
materiale radioattivo.
2
Attrezzature richieste ma non fornite
1.
Provette ematologiche.
2.
Aspiratore
3.
Pipette semiautomatiche in grado di dispensare 25 µl e 1,0 ml, oppure un sistema di pipettamento
automatico.
4. Contatore a scintillazione adatto alla rilevazione delle radiazioni dello [125I].
5. Grafici lineari, semilog o logit-log.
Raccolta dei Campioni
Non è necessaria alcuna particolare preparazione del paziente.
1. Preparazione del campione per l'analisi: prelevare il sangue con siringa da 5 - 10 ml. Attendere la
coagulazione. Centrifugare per 10 minuti e raccogliere il siero o plasma.
2. Spedizione dei campioni: il siero dovrebbe essere spedito a 2 - 8°C. Qualora il tempo di spedizione
dovesse superare le 48 ore, si raccomanda il congelamento.
3. Conservazione: prima dell'analisi, il siero può essere conservato fino a 6 ore a temperatura ambiente
(< 30°C) o fino a 48 ore a 2-8°C. Qualora il tempo di conservazione dovesse superare le 48 ore, si
raccomanda di congelare ad almeno - 20°C. Non sgelare e ricongelare ripetutamente.
Procedimento di Dosaggio
Portare i reagenti e i campioni a temperatura ambiente prima dell'uso. Al fine comunque di ridurre il
deterioramento, evitare di mantenerli non refrigerati se non per il tempo necessario al loro uso. Non
scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Qualora sia impiegato un pipettatore automatico, si
raccomanda di seguire le istruzioni per l'uso al fine di evitare contaminazioni fra un campione e l'altro. Si
raccomanda di attenersi strettamente alle istruzioni per l'uso. E' essenziale la precisione nel pipettamento.
L'allestimento delle provette dei campioni e degli standard, così come dei controlli, deve essere
effettuato simultaneamente.
1. Numerare una quantità appropriata di provette per la curva standard e per I campione.
2. Pipettare 25 µl di standard T4 e campioni secondo lo schema che segue.
3. Aggiungere 1.0 ml di tracciante T4-I 125 ad ogni provetta.
4. Incubare contemporaneamente tutte le provette a temperatura ambiente (18 - 25°C) per 60 minuti.
3
5. Al termine dell'incubazione, aspirare tutto il contenuto di ciascuna provetta, oppure decantare, lasciando
le provette capovolte per almeno un minuto. Asciugare il bordo delle provette.
6. Determinare la radioattività delle provette per almeno mezzo minuto in un contatore a scintillazione
gamma. Il tempo di conteggio richiesto per accumulare circa 20.000 - 60.000 colpi per lo standard zero
può indicare il Schema
tempo necessario
di Dosaggio
per ilRadioimmunologico
contatore in dotazione.
in Fase Solida Della T 4
Aspirazi
Standard Traccia
one o
125
Provetta
T4
nte
T4 - I
Incubazi decantazi
Siero
one
one
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
Campio
ne
25 µl A
25 µl B
25 µl C
25 µl D
25 µl E
25 µl F
---
--aggiung
--ere
--1000 µl
--a tutte le
--provette
--per 60
25 µl
min.
Incubare Aspirare
tutte le
o
provette decantare
a temp. tutte le
amb.
provette
- Determinare la radioattività di tutte le provette.
- Procedere al calcolo.
- Tracciare la curva standard e determinare il valore di dosaggio dei campioni.
Calcolo dei Risultati
Nota: i dati di conteggio non necessariamente devono essere espressi come colpi per minuto (cpm).
L'unità di tempo comunque deve essere costante per tutte le provette contate.
1. Mediare i conteggi delle provette 1 e 2 ottenendo così il conteggio "Bo" del saggio.
2. Dividere i conteggi di ciascuna provetta ("B") per il conteggio B o ottenendo così la percentuale rispetto
a B o (B/B o).
3. La curva standard può essere riportata su grafico logit-log interpolando i valori B/B o in funzione delle
concentrazioni di T4 standard in µg/dl sulla scala logaritmica. In tabella 1 (page 32) sono riportati dati
tipici di conteggio e calcolo dei valori B/B o. In figura 1 (page 33) è illustrata la curva standard derivata
da tali dati.
4. La concentrazione di T4 dei campioni è determinata per interpolazione sulla curva (figura 1, page 33).
5. Possono essere impiegati anche altri metodi di elaborazione della curva standard, come ad esempio
conteggi per minuto in funzione dei livelli di T4 in µg/dl.
Considerazioni Procedurali
1. Qualora si debba determinare il valore basale di T4 circolante, eventuali terapie tiroidee in atto,
dovrebbero essere sospese almeno un mese prima del dosaggio.
2. Molti farmaci e patologie coincidenti alterano i livelli di T4 nel siero. Perciò i risultati devono essere
interpretati tenendo in considerazione la situazione clinica del paziente.
3. Gli effetti fisiologici della T4 sono basati sulla concentrazione serica della T4 libera, una frazione molto
4
piccola della T4 totale. La T4 totale dovrebbe sempre essere associata al test T-Uptake che evidenzia
le anomalie delle proteine leganti T4.
4. La radioattività residua in pazienti sottoposti a procedimenti scintigrafici recenti può interferire con il
dosaggio.
5
5. I campioni a concentrazione superiore a 20 µg/dl dovrebbero essere diluiti 1:1 usando Standard A al fine
di ottenere risultati più accurati.
6
Valori Attesi
205 sieri normali sono stati dosati per la T4 con il kit radioimmunologico T4 MAb ICN Pharmaceuticals.
Inoltre sono stati dosati sieri di pazienti ipotiroidei diagnosticati clinicamente (n=57) e di ipertiroidei (n=34).
Sono stati ottenuti i seguenti valori (± 2 DS):
Popolazione
Normali
Ipotiroidei
Ipertiroidei
Media
8,33 µg/dl
2,21 µg/dl
15,6 µg/dl
Intervallo
5 - 12 µg/dl
0 - 4,8 µg/dl
11,7 - 19,5
µg/dl
Soggetti trattati con estrogeni e in gravidanza hanno mostrato valori più alti di quelli attesi per gli individui
eutiroidei.
Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i suoi propri valori normali su un gruppo di soggetti eutiroidei.
7
Caratteristiche Tecnologiche
Accuratezza:
1. Studi di recupero eseguiti arricchendo con L-tiroxina un pool di sieri a basso contenuto, hanno fornito i
seguenti risultati:
T4
endogena
µg/dl
T4
aggiunta
µg/dl
T4 totale
trovata
µg/dl
% di
Recupero
in T4
5,34
5,34
5,34
5,34
2,0
4,0
6,0
8,0
7,41
9,04
10,8
13,0
103
92
92
96
2. Studi di parallelismo eseguiti diluendo un campione con standard A hanno fornito i seguenti risultati:
% di diluzione
Atteso µg/dl
T4 trovata (µg/dl)
diluzione con
Standard A
0
25
50
75
87,5
15,6
12,4
8,56
4,07
1,94
--106
110
104
99
3. Campioni da 42 pazienti clinicamente diagnosticati iper e ipotiroidei e 70 volontari sani sono stati dosati
con il kit radioimmunologico T4 MAb ICN Pharmaceuticals e con un altro kit per la T4 disponibile in
commercio. Sono stati ottenuti i seguenti parametri di correlazione.
N = 111
Coefficiente di correlazione (r) = 0,974
Pendenza (b) = 0,76
Intercetta Y = 0,71 µg/dl
Un grafico di regressione lineare di tali dati é illustrato in Fig 2 (page 34).
8
Precisione:
1. Precisone "nel saggio"
Campioni
Campione n°
1
n° determinazioni
Media µg/dl
D.S.
CV %
2
20
8,88
0,51
5,7
20
2,84
0,23
8,1
3
4
20
10,4
0,45
4,3
20
14,3
0,47
3,3
2. Precisione "fra i saggi"
Campioni
Campione
n°
n° di
determinazi
oni
Media µg/dl
D.S.
CV %
1
2
150
2,82
0,32
11,3
3
150
8,78
0,61
7,0
150
14,0
0,74
5,3
Sensibilità:
La sensibilità del dosaggio è 0,76 µg/dl T4, calcolata sulla base di 20 replicati dello standard zero - 2DS.
Specificità:
In questo test allo standard zero è stata aggiunta una dose variabile delle sostanze potenzialmente
interferenti sotto elencate. Lo standard zero è stato poi dosato con il kit T4 MAb. E' stata costruita una
curva standard T4. La % di reazione crociata è stata calcolata come rapporto delle concentrazioni al 50
% del legame.
Composto
% di reazione crociata (in peso)
L-Tiroxina
D-Tiroxina
3,3'5-triiodo-L-Tironina
3,5-diiodo-L-Tironina
3,5-diiodo-L-Tirosina
3-Iodo-L-Tirosina
Fenotina
100
30,9
1,0
<0,002
<0,002
<0,002
<0,002
9
TABLE 1
[125I] T4 Monoclonal Solid Phase Radioimmunoassay
Tabulated Data
Tube No.
Trace
Level
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Clinical13
Sample14
Coun
ts
per
Minut
e
A
4320
8
4322
2
3519
8
3566
9
2871
8
2853
7
1940
2
1997
6
1526
6
1523
6
Avera
ge
Count
s
B
% of
Trace
Level
A/B x
100
T4
µg/d
L
T4
nmol/
L
81.4
82.5
66.5
66.0
44.9
46.2
35.3
35.3
23.1
24.8
0
0
2
2
4
4
8
8
12
12
20
20
0
0
25.7
25.7
51.5
51.5
103
103
154
154
257
257
45.2
46.0
8.48
8.23
109
106
43215
9968
1071
5
1951
6
1988
5
10
Figure 1
11
Figure 2
12
REFERENCES
1. Chopra, I. J., Nature, source and biologic significance of thyroid hormones in blood. The Thyroid 4th
ed., edited by S.C. Werner and S.H. Ingbar, Harper & Row, Hagerstown, 1978 p. 100.
2. Data on file at ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, N.Y.
3. Chopra, I. J., A radioimmunoassay for measurement of thyroxine in unextracted serum. J. Clin.
Endocrinol. Metab., 34, 938-947, 1972.
4. Larsen, P.R., Dockalova, J., Sipula, D. and Wu, F.M., Immunoassay of thyroxine in unextracted human
serum. J. Clin. Endocrinol. Metab,. 37, 177-182, 1973.
13
Manufactured by:
Hergestellt von:
Fabriqué par:
Fabbricato da:
Fabicado por:
ICN Pharmaceuticals, Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, New York 10962-1294
USA
(914) 359-2700
(800) 431-1237
FAX (914) 359-2188
Distributed By:
Vertrieb Durch:
Distribué par:
Distrubuito da:
Distrubuido por
ICN Pharmaceuticals, Inc.
Costa Mesa, CA 92626
USA
ICN Biomedicals GmbH
Thüringer Straße 15
37269 Eschwege
Telefon 05651/921-0
FAX 05651/921-151
Auftragsannahme:
Tel: 0180/2306160
FAX 0130/868366
LB-06B56100-R6
QER 97-699
Revised 1/98
14