HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
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Principi e applicazioni
• L’HPLC (cromatografia liquida ad alte
prestazioni) è la versione strumentale della
cromatografia liquida su colonna
• La fase mobile è un liquido a bassa
viscosità e la fase stazionaria è costituita da
particelle porose eventualmente rivestite da
una fase liquida
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Principi e applicazioni
• La fase stazionaria è impaccata in una
colonna di lunghezza variabile tra 3 e 50 cm
e di diametro interno (ID) di pochi mm.
• Poiché le particelle del riempimento hanno
una granulometria molto piccola (da 3 a 10
mm) il flusso dell’eluente può essere
ottenuto solo esercitando una pressione
relativamente elevata mediante apposite
pompe
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Principi e applicazioni
• Con una colonna di 25 cm, ID 4 mm e fase
stazionaria di 5mm, per ottenere un flusso di
n-esano di 1mL/min è necessaria una
pressione in ingresso di 70 atm
• Ma esistono colonne di 3 cm con ID>1mm
e con granulometria di 3 mm.
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Tecniche HPLC
• Possono essere suddivise
– In base alla polarità delle fasi
– In funzione del meccanismo della separazione
– In base alle caratteristiche della fase stazionaria
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Tecniche HPLC
• In base alla polarità delle fasi
– Cromatografia a fasi normali (NPC)
• Fase stazionaria polare e fase mobile apolare
– Cromatografia a fasi inverse (RPC)
• Fase stazionaria apolare e fase mobile polare
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Tecniche HPLC
• In funzione del meccanismo della separazione
–
–
–
–
–
–
Cromatografia di adsorbimento (LSC)
Cromatografia di ripartizione (LLC)
Cromatografia di esclusione (SEC)
Cromatografia di scambio ionico (IEC)
Cromatografia di affinità (AFC)
Cromatografia di coppia ionica (IPC)
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Tecniche HPLC
• In base alle caratteristiche della fase
stazionaria
– Cromatografia su fase legata (BPC)
– Cromatografia su fase chirale (CPC)
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Tempo e volume di ritenzione
– Dipende dal tempo di ritenzione (tR) a dal volume di
ritenzione (VR) che vengono corretti in base al tempo e
al volume morti (tM, VM)
– VR = tRFc dove Fc è il flusso di fase mobile in mL/min
– V’R = VR – VM e t’R = tR – tM
Poiché si usano pompe molto precise è quindi il flusso
può essere mantenuto rigorosamente costante nelle
analisi ci si può riferire al solo tempo di ritenzione
disinteressandosi del volume.
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Coeff. di distribuzione (Kc), fattore di
ritenzione (k) e rapporto di fase (b).
– Sono collegati tra loro dalle seguenti relazioni:
VM
Kc 
k
VS
VM
b
VS
K c  bk
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Coeff. di distribuzione (Kc), fattore di
ritenzione (k) e rapporto di fase (b).
– Per arricchire la fase mobile dei componenti
eluiti si può operare sulla polarità di entrambe
le fasi modificando il Coeff. di distribuzione
Kc, oppure sulla quantità di fase stazionaria (Vs)
modificando così il fattore di ritenzione k
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Selettività
– La selettività di un sistema cromatografico è la
capacità di eluire sostanze diverse in tempi
diversi. In base ai parametri già visti il fattore di
separazione a viene così definito:
'
R2
'
R1
t
a
t
K c 2 k2


K c1 k1
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Selettività
– Dipende dalla temperatura e dalla natura delle
due fasi.
• Si possono preparare fasi mobili di varie polarità e
si può, inoltre, far variare la polarità nel corso
dell’analisi. Questa procedura si definisce “analisi
in gradiente di polarità”
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Efficienza
– È la capacità di un sistema cromatografico di
eluire una sostanza in una banda stretta
– Tra i fattori determinanti per l’efficienza di un
sistema HPLC, quello più importante è legato ai
fenomeni che si verificano all’interno della
colonna.
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Grandezze, parametri e
prestazioni
• Efficienza
– Il modello della teoria dei piatti introduce le grandezze
di riferimento più usate a questo proposito: il numero di
piatti teorici N e l’altezza equivalente al piatto teorico
H che sono correlate tra loro tramite la seguente
relazione:
L
H
N
dove L è la lunghezza della colonna.
– Una colonna è tanto più efficiente quanto più elevato è
il numero di piati teorici. A parità di lunghezza ciò che
conta è che sia piccolo il valore di H ( in genere è
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compreso tra 0,01 e 0,02 mm).
Grandezze, parametri e
prestazioni
•
Efficienza
– Per aumentare l’efficienza si può intervenire in due modi:
1.
aumentare la lunghezza
2.
abbassare il valore di H agendo su parametri operativi
– Per abbassare H si può intervenire su:
1.
La velocità lineare della fase mobile che deve essere
sufficientemente alta
2.
Il diametro delle particelle della fase stazionaria che deve essere
piccolo
3.
Lo spessore del liquido o dello strato attivo che deve essere sottile
4.
La viscosità della fase mobile che deve essere bassa
5.
La temperatura che deve essere relativamente alta
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Risoluzione
• La risoluzione (Rs) fra due picchi adiacenti è espressa dal
rapporto fra la loro distanza (tR2 – tR1) e la semisomma
delle rispettive larghezza alla base (wb1 + wb2)/2
2( t R2 - t R1 )
Rs 
w b1  w b2
• Un aumento di temperatura fa aumentare l’efficienza ma fa
diminuire la selettività per cui la risoluzione peggiora. Per
questo la maggior parte delle determinazioni si fa avvenire
a temperatura ambiente ottimizzando la risoluzione
mediante variazioni di composizione dell’eluente o con
determinazioni in gradiente di polarità.
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Capacità
• La capacità di carico di una colonna varia
secondo che sia di tipo analitico o
preparativo.
• Nel primo caso si possono iniettare da
poche decine a centinaia di nanogrammi di
sostanza, nel secondo si arriva fino a 500
mg.
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MATERIALI
Caratteristiche generali delle fasi
Fase stazionaria
• La fase stazionaria è costituita da materiale granulare che può
interagire con la fase mobile o fare da supporto alla fase stazionaria
liquida vera e propria (che può essere depositata sul supporto o legata
ad esso chimicamente)
• I riempimenti sono di due tipi: a) particelle pellicolari e b)
microparticelle porose
a) sono costituite da un nucleo sferico non poroso (vetro) rivestito da un
sottile strato di materiale microporoso
b) possono essere di forma irregolare o sferiche con diverso grado di
porosità e diametri compresi tra 3 e 10 mm e oltre.
• Le microparticelle consentono una migliore efficienza e una capacità
più elevata, ma tendono a rigonfiarsi e sono più difficili da impaccare.
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MATERIALI
Caratteristiche generali delle fasi
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MATERIALI
Caratteristiche generali delle fasi
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Caratteristiche generali delle fasi
A) fase mobile
• I requisiti generali sono:
 bassa viscosità
 bassa volatilità
 immiscibilità con la fase stazionaria
 minima tossicità
 capacità di solubilizzare il campione
 basso costo e facile reperibilità
 compatibilità con il rivelatore
 elevata purezza
 bassa corrosività
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Cromatografia Liquido-Solido
(LSC)
• La cromatografia liquido solido utilizza fasi
stazionarie granulari a varia porosità,
generalmente polari, che vengono
accoppiate a fasi mobili non polari
(cromatografia a fasi normali).
• È poco usata
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Cromatografia Liquido-Solido
(LSC)
Fase stazionaria
• Si usano: Gel di silice, gel di silice
pellicolare o allumina
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Cromatografia Liquido-Solido
(LSC)
Fase mobile
Si definisce
Forza eluotropa
la forza del
solvente rispetto
alla fase
stazionaria
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Cromatografia Liquido-Solido
(LSC)
Criteri per la scelta della coppia fase
mobile/fase stazionaria
• Si può procedere ad una separazione
preliminare in TLC per valutare la scelta. In
genere si usa gel di silice come fase
stazionaria e un solvente apolare mescolato
con piccole percentuali di un solvente polare.
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Cromatografia su Fase legata
(BPC)
• Nella cromatografia su fase legata la fase
stazionaria è legata chimicamente al
supporto solido con cui forma un tutt’uno
particolarmente stabile.
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Cromatografia su Fase legata
(BPC)
• Fase stazionaria:
microparticelle di gel di silice, di zircone,
di materiali contenenti legami C-F,
polimeriche.
• La fase legata può essere di tipo polare e
quindi con fase mobile non polare o di tipo
non polare con fase mobile polare.
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Cromatografia su Fase legata
(BPC)
• Fase stazionaria:
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Cromatografia su Fase legata
(BPC)
• Fase mobile
• Nella fase di messa a punto di un metodo di
separazione si inizia variando la conc. del
solvente polare partendo dall’1% e
aumentando via via i modo opportuno.
Nella C a fase inversa si usa una miscela di
acqua con un solvente idromiscibile meno
polare
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Cromatografia di esclusione
(SEC)
• Si tratta di una cromatografia su una fase stazionaria
formata da un gel che non permette la permeazione
alle molecole che superano una determinata
dimensione (che quindi vengono eluite per prime).
• La fase stazionaria è costituita quindi da Gel che
possono essere rigidi o semirigidi. Il solvente deve
avere i seguenti requisiti: deve sciogliere
completamente il campione, non deve interagire con
esso e neppure con il gel, non deve causare fenomeni
di ripartizione e deve essere compatibile con il
rivelatore.
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Cromatografia di esclusione
(SEC)
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Cromatografia di scambio ionico
(HPIEC)
• Si usa per analizzare le specie elettricamente cariche.
Per separare queste specie si devono usare fasi
stazionarie in grado di scambiare ioni con l’eleuente
cioè degli scambiatori ionici. Non sono però esclusi
meccanismi diversi come la ripartizione e
l’adsorbimento.
• Due sono le applicazioni principali:
1) separazione di molecole organiche elettricamente
cariche
2) separazioni di ioni inorganici.
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Cromatografia di scambio ionico
(HPIEC)
Fase stazionaria:
• scambiatori cationici forti (analisi di cationi
metallici)
• scambiatori cationici deboli (proteine e
polipeptidi)
• scambiatori anionici forti (proteine)
• scambiatori anionici deboli.
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Cromatografia di scambio ionico
(HPIEC)
I supporti sono di vario tipo:
• particelle di silice porosa
• particelle di silice porosa legate a un
copolimero
• particelle pellicolari di resina scambiatrice
• particelle porose polimeriche
• altri tipi
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Cromatografia di scambio ionico
(HPIEC)
Fase mobile
• Si devono prendere in considerazione le
variabili: pH, forza ionica e l’eventuale
modificatore organico
• Si tratta quasi sempre di soluzioni tampone
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Cromatografia di scambio ionico
(HPIEC)
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STRUMENTAZIONE
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IL CROMATOGRAFO PER
HPLC
• Il cromatografo per HPLC può assumere
varie configurazioni secondo che sia
destinato a funzionare in condizioni
isocratiche oppure in gradiente di eluizione.
In quest’ultimo caso la miscelazione può
avvenire prima (bassa pressione) oppure
dopo (alta pressione) dell’ingresso nella
pompa
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IL CROMATOGRAFO PER
HPLC
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Riserva della fase mobile
• Sono contenitori di materiale inerte, per non inquinare
il solvente, con una capacità tale da assicurare
l’esecuzione di un certo numero di analisi. I materiali
usati sono in genere: vetro, acciaio inox o PTFE. La
capacità in genere non supera mai i 2 L per la chimica
analitica (con flussi medi di 1-2 mL/min e durata
dell’analisi di pochi minuti), mentre possono essere
necessari volumi maggiori per la preparativa.
• Il solvente passa al Cromatografo attraverso un
piccolo tubicino che contiene in genere un filtro in
vetro sinterizzato per trattenere eventuali impurità
grossolane.
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Pompe - requisiti
• Fornire elevate pressioni in ingresso (fino a 400 atm, cioè circa 5800
psi);
• Mantenere il flusso di eluente il più costante e riproducibile possibile;
• Consentire un’ampia gamma di flussi ( da 0,5 a 10 mL/min);
• Avere un volume morto molto piccolo (minima variazione di
composizione dell’eluente in determinazioni in gradiente);
• Avere un adeguato sistema di smorzamento delle pulsazioni;
• Avere una notevole inerzia chimica;
• Avere una elevata autonomia;
• Consentire rapide operazioni di ricambio della fase mobile e di pulizia;
• Essere poco rumorosa, poco ingombrante, priva di vibrazioni eccessive
e sicura quando si manipolano solventi infiammabili.
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Pompe - schema
• Oramai si usano solo pompe a doppio effetto (reciprocanti
a due pistoni)
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Filtri
• Per impedire che granelli di materiale di
qualunque tipo entrino in colonna si usa un
sistema di filtri (diametro pori di 5-10µm) a
monte dell’iniettore
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Sistemi per realizzare il gradiente
di concentrazione
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Sistemi di iniezione
• Il campione può essere inserito mediante
una microsiringa (sistema oramai
abbandonato) o mediante una apposita
valvola azionata manualmente o
meccanicamente.
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Sistemi di iniezione
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Colonne
• Le colonne sono in acciaio o in vetro borosilicato
con pareti molto spesse.
• Si usano di preferenza colonne corte che
eventualmente possono essere collegate in serie.
• Per proteggere la colonna vera e propria talvolta si
usano delle precolonne con la stessa fase
stazionaria ma di granulometria più grande.
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Termostato
• Per assicurare la riproducibilità dell’analisi,
la variazione di temperatura deve essere
molto inferiore all’1%. La termostatazione
della colonna avviene o per circolazione
forzata dell’aria o per immersione in un
bagno termostatico (in questo caso la
colonna è incamiciata.
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Raccoglitori di frazioni
• Nelle separazioni preparative si utilizzano
sistemi automatici altrimenti si sostituisce il
contenitore di raccolta manualmente
utilizzando un corto tubicino flessibile di
uscita.
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Misuratori di flusso
Si usano:
• Sistemi a bolle
• Sistemi volumetrici
• Flussometro
• Sistema gravimetrico
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Rivelatori
• Non esistono rivelatori universali (unico tentativo il Tridet
della PE). Le loro caratteristiche si giudicano in base ai
seguenti parametri:
–
–
–
–
–
–
–
–
Selettività
Risposta o segnale
Stabilità (deriva)
Limite di rivelabilità
Rumore di fondo
Linearità
Sensibilità
Volume morto (volume del rilevatore stesso) che deve essere il più
piccolo possibile
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Rivelatori
• Vengono alloggiati un una apposita cella
detta cella di flusso
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Spettrofotometri UV-Vis
• Si distinguono:
– rivelatori a lunghezza d’onda fissa (i più
diffusi)
– rivelatori a lunghezza d’onda variabile
– rivelatori a serie di diodi (diode array)
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Spettrofotometri UV-Vis
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Sistema di elaborazione dei
segnali
• Di solito un PC o un registratore si su carta
che a display
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METODI DI ANALISI
• Analisi qualitativa
• Analisi quantitativa
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