Spettroscopia e
spettrometria molecolare
UV-visibile
Francesco Nobili
Assorbimento di radiazione nella reg ione UV-Vis corrispondente al range di
lunghezze d’onda 100-800 nm
10 -10
10 -8
Vacuum-UV
UV-vis
10 -6
10
21
10 19
10 15
Elettroni
esterni
Vibrazioni
10 -4
Onde radio
(NMR)
Elettroni interni
10 17
Infrarosso
Micro-onde
ν/Hz
molecole
Raggi X
10
-12
atomi
λ/m
10 13
10 -2
10 11
10 0
10 9
Rotazioni
Spin nucleari
10 2
10 7
I livelli energetici coinvolti sono i L I V E L L I E L E T T R O N I C I
D I A T O M I E M O L E C O L E che abbiano o rbita li es terni
a bba s ta nza vic ini da dare transizioni a questi valori di
energia come:
-m eta lli di tra ns izioni (elettro ni d o f)
-m o lec o le org a nic he (leg a m i m ultipli, elettro ni π ,
σ , n)
-c o m ples s i m eta llo -org a nic i
3
FO R M A Z I O N E D E G L I
OR B ITA LI M OLE C OLA R I
P er combinazione
lineare deg li
orbitali atomici
s or p
atomic
orbital
non-bonding
orbital
σ or π
molecular
orbital
Energy
σ* or π*
molecular
orbital
4
2 orbitali σ da 2 orbitali s
5
2 o rbita li π da 2 o rbita li p y o p z
o rbita li σ da 2 o rbita li p x
6
G li orbitali molecolari n di non legame si formano invece a partire dagli orbitali
atomici popolati dagli elettroni che non partecipano alla formazione di legami
7
•Le trans izioni che richiedono minore energia coinvolgono l’Highes t
O ccupied M olecular O rbital (H O M O ) e il Lowest Unoccupied
M olecular O rbital (L U M O ) e s ono per ques to motivo le più importanti.
•Alcune trans izioni NO N s ono pos s ibili (trans izioni proibite) a caus a di
precise regole di s elezione; in effetti le trans izioni proibite s ono
oss ervate, ma hanno un’intens ità molto bas s a.
8
Trans izioni che riguardano alcuni leg ami chimici:
σ  σ* alcani
σ  π * carbonili
π  π *alcheni, carbonili, alchini, azomposti
n  σ* oss igeno, azoto, zolfo, alogeni
n  π * carbonili
9
T ra ns izio ni elettro nic he m o lec o la ri
Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. E sse si
verificano se nel campione s ono presenti molecole aventi cromofori, cioè gruppi
funzionali in grado di as sorbire la radiazioni UV-sis ibile, come il gruppo – NO 2 (nitro),
-N 2- (azo)
S olo le trans izioni di elettroni n e π hanno energ ie nel rang e 200-800 nm, quindi
rivelabili con l’UV-visibile
10
G ruppi cromofori
Alcuni esempi di g ruppi c rom o fori con i relativi coefficienti di
estinzione molare o ass orbività molare (ε)
Transizione λmax, nm
Cromoforo
Esempio
ε
Solvente
C=C
Etene
π → π*
171
15,000
esano
C≡C
1-Esino
π → π*
180
10,000
esano
C=O
Etanale
n → π*
π → π*
290
180
15
10,000
esano
N=O
Nitrometano
n → π*
π → π*
275
200
17
5,000
etanolo
C-X X=Br
X=I
Metil
bromuro o
ioduro
n → σ*
n → σ*
205
255
200
360
esano
11
Le transizioni elettroniche promosse dalla
radiazione UV-Vis-NIR coinvolgono anche i
vari livelli vibrazionali.
P er questo motivo lo s pettro è a ba nde
Q ues ta caratteristica complica notevolmente
il riconoscimento e la quantificazione di
composti in miscela
E sempio di spettro UV-visibile di un’aldeide insatura. La
banda a 395 nm rende conto del fatto che il compos to è
colorato in a ra nc io , colore complementare rispetto al
violetto che corris ponde alla regione spettrale interes sata (~
400 nm)
Le bande di assorbimento in UV-Vis-NIR sono in numero minore rispetto all’IR ,
tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare determinazioni quantitative secondo la
12
legge di Lambert-B eer
Il massimo di assorbimento (λmax) di un cromoforo può essere influenzato da:
-s truttura della molecola di cui fa parte
-a m biente (s olvente) di cui fa parte
E sempio
(A) benzene (vapore)
(B ) nitrobenzene (vapore)
(C ) benzene (in acqua)
13
Le molecole organiche presentano
spesso gruppi cromofori dovuti alla
presenza di s is tem i I N S A T U R I
L’energia (frequenza lunghezza
d’onda) della radiazione assorbita
dipende dalla differenza
energ etic a Δ E tra l’o rbita le
H O M O e l’o rbita le L U M O
In generale, la C O N I U G A Z I O N E D I
LE G AM I INS ATUR I provoca una
diminuzione del ΔE e un A U M E N T O
DE LLA ε
14
15
FA T T O R I C H E I N FL U E N Z A N O
L ’I N T E N S I T A ’ D I U N A B A N D A
Il valore del c oeffic iente di es tinzione m ola re ε di un
cromoforo dipende da quattro fattori
1. pro ba bilità della tra ns izione elettronica
2. va ria zione del m om ento di dipolo elettric o ass ociata
alla trans izione
1. natura del s o lvente
2. tipo di s o s tituenti
16
1. P ro ba bilità della tra ns izio ne
G eneralmente, le tra ns izioni π π * s ono più pro ba bili
delle nπ *
:O :
Ad es empio, l’acetone ha due ass orbimenti
ππ* λmax = 188nm ε = 10000
nπ*
λmax = 279nm ε = 14.8
2. V a ria zio ne del m o m ento di dipo lo elettric o
Nella trans izione nπ* lo s tato eccitato coinvolge solo l’atomo di
oss igeno, mentre nella tra ns izione π π * il pa s s a g g io a llo s ta to
ec c ita to c orris ponde a lla form a zione di una s truttura a
s epa ra zione di c a ric a  aumento di ε
17
3. na tura del s olvente
Il s olvente es ercita un’a zione a bba s ta nza lim ita ta s ulla ε
Ad es empio, la banda a 279 nm dell’acetone in n-es ano ha ε =
14.8
In acqua s i s pos ta a 264.5 nm ed ha ε = 17.4
4. tipo di s o s tituenti
I s ostituenti pres enti pos s ono modificare l’as s etto elettronico influendo
direttamente s ui fattori 1 e 2 (probabilità, s eparazione di carica)
Q ua ndo a um enta no la ε s i pa rla di effetto iperc rom o
Q ua ndo dim inuis c ono la ε s i pa rla di effetto ipoc rom o
18
FA T T O R I C H E I N FL U E N Z A N O
LA POS IZ ION E DI U N A B AN DA
La posizione di una banda di ass orbimento nell’UV è influenzata da:
- sos tituenti pres enti nella molecola
- ambiente (solvente) in cui la molecola si trova
S i possono avere vari tipi di effetto
1. effetto ba toc rom o – R E D S H I FT
1. effetto ips oc rom o – B L U S H I FT
1. effetto a ux oc rom o
1. effetto s o lvente
1. effetti s teric i
19
1. E FFE T T O B A T O C R O M O (R E D S H I FT )
S postamento a lunghezze d’onda maggiori (verso il rosso,
energie inferiori) della λmax.
D ovuto a sistemi coniugati insaturi e sostituenti alchilici su
anello benzenico
20
E s em pio: effetto della
c oniug a zione
L’aumento della coniugazione (e della
delocalizzazione degli elettroni) porta
ad una progres s iva diminuzione della
ΔE tra l’orbitale HO M O (s tato
fondamentale) e l’orbitale LUM O
(s tato eccitato)
Ad es empio, per i P O L I E N I
H3C
CH3
H3C
CH3
ecc.
H3C
n
CH3
21
Un analogo andamento si ha per gli A N E L L I A R O M A T I C I
C ON DE N S A TI
22
2. E FFE T T O I P S O C R O M O (B L U E S H I FT )
E ’ dovuto ad un sostituente (ipsocromo) che s posta l’assorbimento del cromoforo a
λ più ba s s e (energie coinvolte maggiori)
E sempio: a nilina in ambiente acido
in s o luzione a c quos a
leg g erm ente a c ida
per HC l
in n-pro pa nolo
in s o luzione
netta m ente a c ida
23
3. E FFE T T O A U X O C R O M O
E ’ dovuto ad un gruppo funzionale (auxocromo) s aturo (senza elettroni π) che
quando è legato ad un cromoforo determina una variazione, in genere un
a um ento , s ia della λ c he della ε
Q ues to effetto è dovuto alla presenza di do ppietti liberi di no n leg a m e (come
nei gruppi – O H, -NH 2, -C l, ecc.) che di per sé non assorbono nella regione UV-Vis,
ma po s s o no P A R T E C I P A R E A L L A C O N I U G A Z I O N E degli elettroni
contenuti nei cromofori
24
4. E FFE T T O S O L V E N T E
Il solvente può variare i livelli energetici in una molecola. Le proprietà determinanti a
questo proposito sono la po la rità e la c a pa c ità di fo rm a re leg a m i
idro g eno
Il solvente influisce stabilizzando o destabilizzando lo stato fondamentale o lo stato
eccitato.
Lo s ta to ec c ita to è uno s ta to a s epa ra zio ne di c a ric a , quindi l’effetto
della polarità è nell’a bba s s a re l’energ ia dello s ta to ec c ita to e quindi
fa vo rire una tra ns izio ne π π * (red s hift)
In generale, qua ls ia s i intera zio ne dipo la re (c om e il leg a m e idro g eno )
pro vo c a una s ta bilizza zio ne dello s ta to ec c ita to
Inoltre, l’instaurarsi di interazioni tra un solvente polare e un soluto aromatico può
portare ad a ltera zio ni del s is tem a a ro m a tic o (visibili ad esempio con la
scomparsa della “struttura fine” dei segnali generati dagli anelli benzenici)
25
spettri di assorbimento del feno lo
in n-penta no
λmax = 271 nm
struttura fine
in a c qua
λmax = 271 nm
perdita della struttura fine
in N a O H 0.5 N
λmax = 285 nm
red-shift
26
Q uando si parla di solvente,
ovviamente dobbiamo tenere
in considerazione anche la
T R A S P A R E N Z A del
solvente nell’intervallo di λ in
es ame
27
5. E FFE T T I S T E R I C I
Anche le interazioni dovute all’ingombro sterico dei gruppi funzionali possono
influenzare i livelli energetici delle transizioni elettroniche
S e la c o pla na rità dei s is tem i π viene perturba ta da lla pres enza di
g ruppi di g ra ndi dim ens io ni, λm a x viene s po s ta to vers o lung hezze
d’o nda più c o rte in seguito a diminuzione della delocalizzazione (e diminuisce
anche ε perché diminuisce la probabilità della transizione)
R R'
λmax = 246 nm
εmax = 20000
λmax = 250 nm
εmax = 2000
28
C L A S S I FI C A Z I O N E D E L L E
PR IN C IPA LI TR A N S IZ ION I E LE TTR ON IC H E
T ra ns izio ni R trans izioni n  σ * e n  π * di S I N G O L I G R U P P I
C R O M O FO R I (ra dic a lic he)
come il carbonile o il nitro gruppo. S ono
trans+Oizioni Oproibite dalle
regole di selezione  bassa assorbività
N
molare
O
T ra ns izio ni K
(di c o niug a zione)
trans izioni π  π * di S I S T E M I C O N I U G A T I (es. butadiene).
Appaiono anche negli spettri di molecole aromatiche con sostituenti
c
romofori. Non sono influenzate dalla polarità del solvente
T ra ns izio ni B
trans izioni π  π * caratteristiche di molecole A R O M A T I C H E ed
(ba nde benzenoidi)
eteroaromatiche. Il benzene ha ad esempio una banda nel
vicino
UV tra 230 e 270 nm. P resentano s truttura fine dovuta
all’interazione dei sottolivelli vibrazionali
T ra ns izio ni E trans izioni π  π * caratteristiche di molecole A R O M A T I C H E .
Nel
(ba nde etilenic he) benzene tra 180 e 200 nm. E teroatomi con doppietti 29
elettronici
spostano la λmax a valori più alti
T ra ns izio ni σ σ *
S ono quelle che richiedono le energie più elevate perché
corrispondono alla ro ttura di leg a m i σ .
S ono caratteristiche di molecole come gli a lc a ni s a turi
che contengono solo legami C -C o C -H.
D anno assorbimenti nella zona dell’UV lontano, detto
anche U V s o tto vuo to (l’O 2 dell’aria assorbirebbe nella
stessa regione)
T ra ns izio ni do vute a tra s ferim ento di c a ric a
S ono le più intense dello spettro.
Nell’intervallo 220-370 nm  a ro m a tic i s o s tituti
Nel vis ibile  c o m po s ti di c o ordina zio ne
30
31
A S S OR B IM E N TO DA
S PE C IE IN OR G A N IC H E
M olti metalli di trans izione liberi,
s otto forma di ioni o
c o m ples s i, as s orbono nella
regione vis ibile dello s pettro
32
tribuzione della dens ità elettro nic a neg li o rbita li d che caratterizzano i metalli
ransizione
Q uando lo ione è “nudo”, i 5 orbitali d sono D E G E NE R I: hanno tutti la stessa
energia indipendentemente dall’orientamento spaziale
I n pres enza di leg a nti, a seconda della geometria (ottaedrica, tetraedrica,
planare quadrata) s i c rea una differenzia zio ne tra le energ ie deg li
o rbita li d.
La radiazione UV-Vis può essere assorbita per promuovere transizioni di elettroni
tra questi orbitali
33
34
35
D ifferenti leg a nti c a us a no differenti s plitting Δ E per le
tra ns izio ni d-d
I-<B r-<C l-<F -<H 2O <NH 3<etilen diammina<C N C olori dei complessi del C o2+ :
c o n C l -1 (blue) Δ E m a g g io re
c o n B r-1 (blue/verde) Δ E m o dera to
c o n I -1 (g reen/yello w ) Δ E m ino re
36
S TR U M E N TA Z ION E - A PPLIC A Z ION I
S pettrofotometri a singolo o doppio raggio possono essere utilizzati per misurare
l’assorbanza o la trasmittanza dei campioni
S i può operare a lunghezza d’onda fissa o in funzione della lunghezza d’onda, si
possono effettuare a na lis i qua lita tive (s truttura li) o qua ntita tive
37
R I C E R C A D E I C R O M O FO R I E D E L L A
S TR U TTU R A M OLE C OLA R E
D a un punto di vis ta Q U A L I T A T I V O , l’a na lis i in a s s o rbim ento U V -V is
è in grado di fornire indicazioni (tramite la λmax e la ε) solo sulla presenza di alcuni
gruppi funzionali ma no n può po rta re a ll’identific a zio ne di una m o lec o la
Alcuni punti da tenere presenti:
-assorbimenti molto forti nell’intervallo 200-300 nm : sistemi di almeno due
c ro m o fo ri c o niug a ti
-assorbimenti piuttosto forti nella zona 270-370 nm : sistemi a ro m a tic i c o n
s o s tituenti po la ri
-assorbimenti deboli o di media forza nell’intervallo 210-300 nm : sistemi
a ro m a tic i c o n s o s tituenti a lc hilic i, ma anche transizioni nσ * di a to m i
c he po s s iedo no do ppietti di no n leg a m e
-assorbimenti molto deboli nella zona 200-300 nm : transizioni nπ * a carico dei
gruppi N =O , C =O , N =N , C =S , ecc.
-assorbimenti molto forti verso il vis ibile: bande di tra s ferim ento di c a ric a
intermolecolari o intramolecolari
-l’unic a info rm a zio ne dec is iva è il da to N E G A T I V O : se queste bande 38
sono assenti, si può escludere la presenza nella molecola dei corrispondenti
39
40
C A R A T T E R I Z Z A Z I O N E E D I D E N T I FI C A Z I O N E
In linea di massima lo spettro elettronico non è abbastanza selettivo per
caratterizzare una molecola; per distinguere tra sostanze molto simili si possono
comunque utilizzare due accorgimenti per a um enta re la “qua lità ”
dell’info rm a zio ne fornita :
(1) Q uo zienti di a s s o rba nza
(2) S pettri in deriva ta
QU OZ IE N TI DI A S S OR B A N Z A
S i misura il ra ppo rto tra l’a s s o rba nza a d una lung hezza d’o nda
nell’into rno del punto di m a s s im o e l’a s s orba nza a lung hezze
d’o nda vic ino a i punti a m età a ltezza (in sostanza si misura la FO R M A del
picco)
I valori ottenuti sono valori TAB ULATI e C AR ATTE R IS TIC I P E R O G NI S P E C IE
C HIM IC A
41
S PE TTR I IN DE R IV A TA
S e il rumore di fondo è abbastanza basso, registrando le derivate del segnale
(solitamente la derivata seconda) si possono ottenere dei vantaggi:
-a um ento della ris o luzio ne: picchi parzialmente sovrapposti pos sono essere
separati
-dis c rim ina zio ne vers o la la rg hezza della ba nda : bande più s trette
presenteranno derivate più pronunciate  si esalta la differenza tra bande strette e
bande larghe
42
A N A LIS I QU A N TITA TIV A
S i basa sulla legge di Lambert-B eer:
A = εlc
La specie chimica deve essere in grado di assorbire la radiazione UV-Vis, quindi:
-deve contenere un c ro m o fo ro
oppure
-deve essere opportunamente tra tta ta per contenere un cromoforo
eliminazione interferenti
regolazione pH
(tamponi)
stabilizzazione
specie chimica
aggiunta reattivo per
formazione cromoforo
43
S C E L T A D E L L A L U N G H E Z Z A D ’O N D A
Il monocromatore non lascia mai passare
una singola lunghezza d’onda, ma un
range di lunghezze d’onda
A seconda della zona dello spettro, allo
stesso range Δλ possono corrispondere
diversi errori nell’assorbanza ΔA
Le zone migliori (Δ A m inim o ) sono s ui
m a s s im i o s ui m inim i  meglio il
massimo perché A è maggiore
Inoltre, è preferibile scegliere una λ
tale che l’assorbimento da parte di
interferenti (matrice) sia minimo
Q uindi B è meglio di R
1 spettro di ass orbimento della s ostanza
2 spettro di ass orbimento della matrice
44
DE V IA Z ION I DA LLA LE G G E DI B E E R
S ono deviazioni apparenti e possono es sere:
- s trum enta li : derivano
dalla larghezza di banda del
monocromatore  la radiazione
non è mai puramente
monocromatica, e l’assorbività è
variabile. A s econda della pos izione
sul picco, questa deviazione
dipenderà in mis ura maggiore o
minore dalla larghezza di banda. In
assoluto, comunque, è il rapporto
tra la larghezza di banda e la
larghezza del picco ad influire s ulla
deviazione
In questa zona
l’assorbanza media
non dipende dalla
larghezza di banda
In questa zona
l’assorbanza media
dipende dalla
larghezza di banda,
ma le variazioni in
assoluto sono
minori
45
-c him ic he: sono dovute allo spostamento di un equilibrio che coinvolge una
specie assorbente
E sempio:
2C rO 42- + 2H +
2HC rO 4-
C r2O 72- + H 2O
Lo ione bicromato assorbe a 450 nm
D iluendo la soluzione, l’equilibrio si sposta verso sinistra
All’aumentare del pH l’equilibrio si sposta verso sinistra: aggiungendo KO H 0.05 M
tutto il cromo è convertito a cromato
Il controllo del pH è necessario
O ppure, se sono presenti complessi, dobbiamo ess ere certi che la formazione del
complesso sia quantitativa: legante libero in un eccesso di circa 100 volte rispetto
all’analita in esame
46
A N A LIS I A L PU N TO IS OS B E S TIC O
R osso fenolo:
Forma acida gialla massimo a 433 nm
Forma basica rossa
massimo a 558 nm
P unti is o s bes tic i a 338, 367, 480
nm
(
480
480
A480 = ε HIn
b [ HIn ] + ε In480- b  In -  = ε HIn
b [ HIn ] +  In - 
)
A l punto is o s bes tic o l’a s s orbività
m o la re no n dipende da lla
c o nc entra zio ne rela tiva delle
s pec ie c o invo lte m a S O L O
DA LLA LOR O C ON C E N TR A Z ION E
TOTA LE
L’esistenza di un punto isos bestico
durante una reazione chimica costituisce
una buona prova del fatto che sono
presenti due specie principali
47
M E TODI DI A N A LIS I
1. M E T O D O D E G L I S T A N D A R D E S T E R N I
2. M E T O D O D E L L E A G G I U N T E D I S T A N D A R D
(1)
(2)
48
T I T O L A Z I O N I FO T O M E T R I C H E
Il cambiamento dell’assorbanza di una soluzione durante una titolazione può ess ere
utilizzato per seguirne il decorso.
L’assorbanza (additiva) di ogni specie chimica coinvolta (analita, titolante, prodotto) è
direttamente proporzionale alla sua concentrazione
La curva A vs V di titolante fornirà il punto equiva lente a ll’inters ezio ne di
due tra tti rettilinei
(a) S olo il titolante as sorbe: titolazione di As(II)
con bromato-bromuro
(b) Il prodotto di reazione assorbe: titolazione
di C u(II) con E D TA
(c) L’analita (assorbente) è convertito in un
prodotto che non as sorbe: titolazione di ptoluidina in butanolo con HC lO 4 a 290 nm
(e) L’analita colorato è convertito in un
prodotto incolore da un titolante colorato
(d)-(f) Il legante aggiunto forma due complessi
successivi a differenti as sorbività
L’assorbanza va corretta per il FA T T O R E
D I D I L U Z I O N E : A corr=A obs ·(V+v)/V
49
S P E T T R O FO T O M E T R I A D I FL U O R E S C E N Z A E
FO S FO R E S C E N Z A
Q ues to tipo di spettrofotometria sfrutta i pro c es s i di fo to lum ines c enza :
-fluo res c enza  riemessa una radiazione a lunghezza d’onda maggiore ris petto a
quella as sorbita, senza transizioni di spin
-fo s fo res c enza  riemessa una radiazione a lunghezza d’onda maggiore rispetto a
quella as sorbita, C O N TR ANS IZIO NI D I S P IN  tempi più lunghi
50
A s s o rbim ento  passaggio dal livello vibrazionale fondamentale del livello
elettronico fondamentale ad un livello vibrazionale eccitato del livello elettronico
eccitato
E m is s io ne  pass aggio dal livello vibrazionale fondamentale del livello elettronico
eccitato ad un livello vibrazionale eccitato del livello elettronico fondamentale
 picchi simmetrici che riflettono la spaziatura simile, nei
due livelli elettronici, dei livelli vibrazionali
51
T em po di vita di uno stato di s ing o letto ec c ita to : 10-8 - 10 -4 s  tempo di
vita della fluo res c enza
T em po di vita di uno stato di tripletto ec c ita to :
10 -4 - 10 2 s  tempo di
vita della fo s fo res c enza : è una transizione proibita. Altri processi possono
verificarsi più velocemente  resa molto bassa
La radiazione di fotoluminescenza è
sempre a lunghezza d’onda
maggiore (energia minore) della
radiazione incidente
Nel caso della fosforescenza, la
lunghezza d’onda è ancora
maggiore perché lo stato di tripletto
deve trovarsi ad energia minore
rispetto al primo stato di singoletto
eccitato affinché si verifichi
l’intersytem crossing
52
C a ra tteris tic he delle s pettro s c o pia di fluores c enza :
-
A lta s ens ibilità  misurata rispetto ad un background pari a circa zero
-
A lta s pec ific ità  doppia selettività in eccitazione ed emissione
 possibilità di misurare il tempo di vita della fluorescenza
 possibilità di monitorare una radiazione di fluorescenza sopra
ad un background non fluores cente
P rocedura comunemente seguita per misurare gli spettri di eccitazione e di
emissione:
1) C i si posiziona, tramite il monocromatore di ec c ita zio ne, ad una qualsiasi
lunghezza d’onda di eccitazione capace di provocare fluorescenza
2) S i effettua una s cansione con il m o no c ro m a to re di em is s io ne e si registra
uno s pettro
di em is s ione
53
1) C i si posiziona con il
m o no c ro m a to re di
em is s io ne alla lunghezza
d’onda per cui l’intensità di
fluorescenza è mas sima
2) S i effettua una s cansione con
il m o noc ro m a to re di
ec c ita zio ne registrando lo
s pettro di
ec c ita zio ne
3) C i si posiziona con il
m o no c ro m a to re di
ec c ita zio ne alla lunghezza
d’onda per cui
l’a s s o rbim ento è
m a s s im o
4) S i effettua una s cansione con
il m o noc ro m a to re di
em is s io ne registrando lo
s pettro di
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R E L A Z I O N E C O N C E N T R A Z I O N E -I N T E N S I T A ’ D I
FO T O L U M I N E S C E N Z A
La P O T E N Z A E M E S S A in fluorescenza o fosforescenza è direttamente
proporzionale alla potenza as sorbita (Φ F = resa di fluorescenza)
PF = Φ
F
( P٠ − P )
P er valori di assorbanza molto piccoli (A<0.07), si arriva ad una relazione di
proporzionalità diretta tra potenza di fluores cenza e concentrazione
PF = Φ F P٠ε bc
All’aumentare della concentrazione oltre certi limiti si ha autoassorbimento e la
curva cambia pendenza, finché tutta la radiazione incidente viene as sorbita, ed
una frazione viene riemes sa indipendentemente dalla concentrazione della
soluzione
PF = Φ F P٠ε bc
PF = Φ F P٠
Range di linearità piuttosto stretto
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In pratica il segnale registrato dal detector è ridotto di altri contributi, dovuti
all’A N G O L O S O L I D O visto dal detector e dall’E FFI C I E N Z A del detector (funzione
della lunghezza d’onda)
F = P٠ f ( Φ ) g( λ ) Φ F ε bc
L’intensità di fluorescenza registrata sarà data dal prodotto dei tre fattori (potenza
emessa, angolo solido, efficienza del detector)
Nell’equazione di Lambert-B eer che descrive l’assorbimento il termine geometrico b
non si riferisce al cammino ottico del raggio incidente, ma al vo lum e s o lido
interc etta to da lle fenditure in ing res s o ed in us c ita , che definiscono la
parte di soluzione direttamente coinvolta nei processi di assorbimento-emissionerilevazione del segnale
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S TR U M E N TA Z ION E
P revede il detector posizionato fuori asse rispetto al raggio incidente (di solito a 90°)
ed un doppio monocromatore per garantire la doppia selettività in eccitazione ed in
emissione
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S P E T T R O FL U O R I M E T R I
S elezionano le lunghezze d’onda di eccitazione e di fluorescenza mediante
monocromatori a reticolo nel range UV-vis 200-800nm
Il monocromatore in eccitazione di solito è centrato a lunghezze d’onda più bas se
rispetto a quello in emis sione. E s.: 300 vs 500nm
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Negli s pettro fluo rim etri a s ing o lo ra g g io gli spettri di eccitazione e di
emissione saranno una combinazione degli spettri “veri”, della distribuzione spettrale
dell’emissione della lampada, dell’efficienza dei monocromatori, e della distribuzione
spettrale della risposta del detector
Nel “ra tio m o de”, una parte della luce di eccitazione è inviata al detector 
correzione relativa all’emissione della lampada
Nella s pettro fluo rim etria differenzia le si opera analogamente agli
spettrofotometri a doppio raggio: correzione per tutti gli elementi (lampada,
monocromatori, detector)  limite della velocità del chopper
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S PE TTR OC OPIA DI LU M IN E S C E N Z A TOTA LE
S i registra l’intens ità in
funzio ne di T U T T E le
lung hezze d’o nda di
ec c ita zio ne di
em is s io ne
 spettri bidimens ionali che
permettono di correlare
direttamente i risultati e di
osservare simmetrie ed
anomalie
 impronta digitale del
campione dovuta alla
DOPPIA S E LE TTIV ITA ’
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S TR U M E N TA Z ION E PE R M IS U R E DI
FO S FO R E S C E N Z A
S i utilizzano celle che possono essere refrigerate  basse temperature per
registrare la fosforescenza: la molecola eccitata ha più tempo prima di tornare allo
stato fondamentale ed aumenta così la probabilità che si verifichi la transizione di
inter-system crossing
D elay tra l’eccitazione e la registrazione del segnale di fosforescenza per tagliare
la radiazione di fluorescenza (che è più rapida)
P er ottenere il delay si può rotare la
cella (a) o lo shutter (b)
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