Prof. Maria Nicola GADALETA
E-mail: [email protected]
Facoltà di Scienze Biotecnologiche
Corso di Laurea in
Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche
Biochimica e Tecnologie Biochimiche
FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA 4
Modello chemiosmotico
Misura del gradiente protonico
Disaccoppianti e ionofori
IPOTESI CHEMIOSMOTICA (Mitchell, 1961)
Il trasporto elettronico e la sintesi di ATP sono accoppiate da un
gradiente protonico piuttosto che da un intermedio ad alto contenuto
energetico, o da una proteina attivata come era stato ipotizzato fino
a quel momento.
Questo modello richiede:
a) che la membrana mitocondriale interna sia impermeabile agli ioni
H+, perchè un compartimento chiuso è essenziale per l’esistenza di un
gradiente.
b) che i carriers elettronici e l’ATPasi siano organizzati
vettorialmente, cioè con un orientamento ben preciso nella
membrana mitocondriale interna (reazioni che sottraggono H+ sul
lato interno, reazioni che generano H+ sul lato esterno);
da: Nelson & Cox
MODELLO CHEMIOSMOTICO (Mitchell, 1961)
L’energia delle reazioni red-ox è
elettrochimica del gradiente protonico.
“conservata”
nell’energia
FORZA MOTRICE PROTONICA
per portare i protoni fuori (contro gradiente di concentrazione) occorre
energia (ENERGIA DELLE REAZIONI RED-OX)
il rientro dei protoni (secondo gradiente di concentrazione) è un
processo spontaneo che libera energia ⇒ SINTESI DI ATP
POTENZIALE ELETTROCHIMICO
∆µH+ = ∆Ψ + ∆pH
∆Ψ = potenziale di membrana (componente elettrica)
∆pH = differenza di pH (componente chimica)
Evidenze sperimentali per l’ipotesi di Mitchell
(modello chemiosmotico)
1) Esistenza di un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale
interna che è stato misurato sperimentalmente.
2) Se, in assenza di trasporto di elettroni (e quindi di substrati ossidabili), si
impone artificialmente un gradiente protonico ai mitocondri, questi
sintetizzano ATP.
3) E’ nota l’esistenza di una proteina della membrana purpurea di un alobatterio
(BATTERIORODOPSINA) in grado di pompare protoni quando viene colpita
dalla luce.
Vescicole sintetiche che contengono questa proteina batterica e una ATP
sintasi mitocondriale purificata sintetizzano ATP quando vengono illuminate.
La RODOPSINA in questo caso sostituisce la CATENA RESPIRATORIA.
Questo dimostra che la C.R. e l’ATP sintasi sono due sistemi separati, legati
solo da un gradiente protonico
4) Sia i carriers elettronici che l’ATPasi sono organizzati vettorialmente, cioè con
un orientamento ben preciso nella membrana mitocondriale interna (reazioni
che catturano H+ sono localizzate sul lato interno, reazioni che generano H+sul
lato esterno)
SECONDO IL MODELLO CHEMIOSMOTICO
La fosforilazione di ADP → ATP è accoppiata al trasporto di elettroni
DIMOSTRAZIONE
1 Mitocondri isolati in presenza di substrati ossidabili e O2
producono ATP
1 NADH + H+ → 2.5 ATP
1 FADH2 → 1.5 ATP
2 fosforilazione di ADP → ATP e trasporto di elettroni sono
accoppiati; l’inibizione di uno dei due processi deve ripercuotersi
sull’altro: inibitori della catena respiratoria abbassano la
produzione di ATP, mentre inibitori della sintesi di ATP a livello di
ATP sintasi bloccano il trasporto di elettroni.
3 trattamenti fisici e/o chimici disaccoppiano i due sistemi (trasporto
di elettroni e sintesi di ATP):
•
rottura della membrana (i frammenti di membrana sono ancora
capaci di trasferire elettroni ma non c’è sintesi di ATP).
•
disaccoppianti e ionofori : 2,3 dinitrofenolo (DNP), valinomicina
L’energia rilasciata dall’ossidazione dei coenzimi ridotti
viene utilizzata inizialmente per generare un gradiente
protonico che è utilizzato poi per la sintesi di ATP e il
trasporto di metaboliti attraverso la membrana
mitocondriale interna
Come si può quantificare un gradiente protonico?
da: Nelson & Cox
∆ pH ≈ 0.75
∆ Ψ ≈ 0.15 V
∆ µ (gradiente protonico)
= ∆ pH + ∆ Ψ
MISURA DEL POTENZIALE
ELETTROCHIMICO .1
∆G = RT ln c2ext / c2int + z F ∆Ψ
variazione di energia libera che
accompagna la formazione di un
gradiente elettrochimico da parte di
una pompa ionica
c2 / c1 = rapporto di concentrazione dello ione
z = carica (1 per il protone)
∆Ψ = differenza di potenziale elettrico transmembrana misurato in volt.
ln(c2 / c1) = 2.3 (log[H+]P – log[H+]N ) = 2.3 (pHN – pHp) = 2.3 ∆pH
∆G = 2.3 RT ∆pH + F ∆Ψ (A)
Poiché il pH esterno è minore del pH interno,il pompaggio di protoni fuori dalla
matrice mitocondriale (contro il gradiente protonico) è un processo endoergonico.
Infatti, entrambi i termini sul lato destro dell’equazione (A) hanno valore
positivo per cui il ∆G è +
quando i protoni fluiscono spontaneamente nella direzione del gradiente
elettrochimico una quantità di energia potenziale pari a ∆G diviene disponibile
per compiere un lavoro chimico ⇒ FORZA MOTRICE PROTONICA.
MISURA DEL POTENZIALE ELETTROCHIMICO.2
∆pH ≈ 0.75 unità(matrice alcalina)
∆Ψ ≈ 0.15 – 0.2V ( negativo all’interno),dipende dai tessuti
sostituendo in (A) si ottiene
∆G = ∼ 20 KJ/mole di H+ ;
Trasporto di H+ :∼
∼10/NADH;
per 10 H+ pompati ⇒ ∆G ≈ 200 KJ (quasi tutti i 220 KJ/mole rilasciati
dalla ossidazione di 1 NADH).
Sperimentalmente si è visto che 4 H+ che rientrano attraverso il canale
F0 dell’ATP sintasi (c. V) sono necessari per la sintesi di 1mole di
ATP ,di cui 1 è usato per il trasporto del Pi attraverso la m.m.i.
La forza motrice protonica permette il trasporto attivo di
substrati e precursori
ATRATTILOSIDE
X
ATP sintasi
3
3
La stechiometria della reazione di consumo di ossigeno e di sintesi di
ATP secondo il modello dell’accoppiamento chemiosmotico
x
ADP + x Pi +1/2 O2 + NADH + H+
x ATP + H2O + NAD+
x = rapporto P/O (ossia quanto P è consumato per O ridotto)
Qual è il valore del rapporto P/O?
Misurare il P/O richiede misurare i flussi protonici attraverso la membrana mitocondriale:
è tecnicamente complicato (capacità tamponante dei mitoc., perdita non produttiva di H+,
uso del gradiente protonico per funzioni diverse dalla sintesi di ATP)
Si è stabilito che il numero di H+ pompati fuori per coppia di elettroni trasferiti è
10 per il NADH e 6 per il succinato (FADH2).
Il numero di H+ che rientrano per la sintesi di 1 ATP è 4 H+ ( 1 H+ è usato per il
trasporto di Pi all’interno dei mitocondri).
quindi
10 H+ / 4H+ = 2.5 ATP per 1 NADH
6 H+ / 4H+ = 1.5 ATP per 1 succinato (FADH2)
rapporto P/O
SOLUBILI NEI LIPIDI
Il gradiente protonico può essere annullato parzialmente o completamente
da alcune sostanze come gli ionofori e i disaccoppianti.
Ioni (H+, K+, Na+…) sono insolubili nella membrana
lipidica:possono entrare attraverso composti liposolubili
DISACCOPPIANTI
DNF
trasportano H+ all’interno dei mitocondri
FCCP
∆ µ = ∆ pH + ∆ Ψ
CCCP
IONOFORI
valinomicina → K+ (int)
nigericina
gramicidina A
(est) H+
∆ µ = ∆ pH + ∆ Ψ
K+ (int)
K+, Na+, H+
∆ µ = ∆ pH + ∆ Ψ
∆ µ = ∆ pH + ∆ Ψ
La gramicidina A è un antibiotico che forma nella m.m.i. un canale
permeabile a cationi monovalenti.
Disaccoppianti : nel grasso bruno → calore; → dimagranti
AZIONE DEL 2,4 DINITROFENOLO: acido debole idrofobico
H+
Lato acido= spazio intermembrana
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
H+
Lato alcalino= matrice mitoc.
2,4 dinitrofenolo:un disaccoppiante della fosforilazione ossidativa mitocondriale.
In sua presenza,nei mitocondri isolati, il trasporto di elettroni prosegue, la
respirazione viene stimolata ma la sintesi di ATP si blocca.
DIMOSTRAZIONE FUNZIONALE DELL’ACCOPPIAMENTO
OXPHOS
da: Nelson & Cox
I MITOCONDRI DISACCOPPIATI PRODUCONO
CALORE
La proteina UCP1 (uncoupling protein 1),detta anche termogenina,
presente nei mitocondri del tessuto adiposo bruno,forma un canale
che permette l’ingresso di protoni nella matrice mitocondriale senza
passare dall’ATP sintasi :l’energia che si libera dall’ossidazione
degli acidi grassi sotto forma di NADH viene dissipata sotto forma
di calore. Questo calore contribuisce per es. a mantenere costante la
temperatura corporea degli animali in letargo.
Importanza centrale del gradiente protonico nel fornire l’energia per
diverse attività cellulari
Trasporto di ADP e ATP
Sintesi di ATP
Trasporto
di Ca2+
Trasporto di
fosfato, acidi
dicarbossilici e
tricarbossilici
∆µH+
gradiente di
membrana
calore
Rotazione dei
flagelli dei
batteri
L’energia del gradiente protonico è usata anche per il trasporto di
metaboliti contro gradiente di concentrazione
Parte dell’energia
conservata nel
gradiente protonico è
utilizzata per questi
scopi, per cui 2,5
molecole di ATP sono il
limite massimo per ogni
NADH riossidato
M.Roberti