! "##$ % & ' () #* "##$ $ & % Modello di Progressione del Tumore Colorettale "# ! ' ( ) )* APC Met (p16) APC Met (p16) K-RAS Iper proliferazione Adenoma tipo I Adenoma tipo II APC Met (p16) K-RAS DCC APC Met (p16) K-RAS DCC p53 + + "# ! # $ * # &&$ ) * * $ * ,) " ' "# !% & APC & + + ! + Carcinoma in situ + Metastasi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ttggagctggtggcgtaggca K-ras esone 1 (" +8 & 8 sequenza wt 5' 3' ttggagctgatggcgtaggca 7 sequenza mutata 7 7 7 7 7 Un primer modificato introduce un sito di restrizione BstN I (in rosso) ttggacctggtggcgtaggca PCR 8 5' 3' Il sito di restrizione BstN I non si crea a causa della mutazione preesistente ttggacctgatggcgtaggca "( "" "B "@ "* "A Digestione c on l’enzima di restrizione BstN I e separazione su gel di poliacrilammide al 7%. wt mut 140bp 111bp 7 +8 +8 +8 N 8 D& "$ +8 wild-type sequence mutated sequence (" 445 4 5 @ C(# J @ #I (" $#I (" 445 4 5 "C(# J "#I (B 44 4 (" 4 5 ($ C"$ J ABI (#C"$ J B$ I (" 445 45 (C(# J (#I BC(# J B#I 10 LEU ALA THR VAL LYS SER ARG +8 O CTAGCTACAGTGAAATCTCGA ' > P ? F 5 : ) (:Q (:Q 75 ( "Q : "(Q "##* P .6 ? 4 O F 5 (( (" ((Q B#Q 58 6 >4 R? 6 E A## (($ 8+ 75 # #Q B AQ &J# #@ Q' (* 5 ' 1 O ' P O CTAGCTACAGTGAAATCTCGA A "##A +8 +8 > (* N LEU ALA THR VAL LYS SER ARG GLU &J# #@ Q O ? "##$ 4 6 R 4 ' 6 R 1 O 5 5 5 P (# > P ? 5 8 # A (( &M# ##( & 1 S 5 O 1 "##@ 9B*( "BB$ 8"BB) 11 (), 8 & 8& 8 & (B (( & 3. 1 8; 6 H & 1 +8 & 1 T S ! 1 & 8 , , &*B 66 "##A9"@ *B(B8*B"$ S S (::@ 9 BB(9"(B8""( (), 8 & 8 (" & 6 % & " & T (), 1 !; %(), % 66 , % (A P S 6 1 6 ! % & 6 "##A9"@ *B(B8*B"$ !; %(), ' ! "##A9(( :$ B8:)# 12