Diagnosi Prenatale II
By NA
1
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
• Cromosomi di cui non è riconoscibile con
le metodiche classiche la provenienza
• Frequenza alla nascita 0.14-0.72/1000
• Difficile correlazione genotipo-fenotipo
in diagnosi prenatale
• Importante il rilievo della
caratterizzazione molecolare
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2
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
In più del 50% dei casi è oggi possibile
fare previsioni fenotipiche corrette:
• Invdup15 (50% ESAC)
• Cromosomi sessuali
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3
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Amniocentesi paziente di 41 aa
Presenza di un ESAC in tutti i cloni
de novo
piccole dimensioni
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4
By NA
5
By NA
6
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
CBG positivo DA/DAPI positivo
FISH centromero 15 positiva
Invdup(15)
Definizione del tipo
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7
By NA
8
By NA
9
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
FISH sonde pericentromeriche
(D15S11; GABR3) NEGATIVA
Invdup(15) tipo I
Assenza di anomalie del fenotipo
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10
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Rischio di Disomia Uniparentale
15q11-q13 da origine postzigotica
del marcatore
Materna
Paterna
s. Prader/Willi
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s. Angelman
11
By NA
12
By NA
13
P
F
M
D15S130
P
F
M
D15S165
Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE
By NA
14
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE
CON MARCATORI POLIMORFICI DEL
CROMOSOMA 15
By NA
15
By NA
16
By NA
17
By NA
18
By NA
19
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Amniocentesi paziente di 35 aa
Presenza di un ESAC
de novo
piccole dimensioni
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20
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
CBG positivo DA/DAPI negativo
FISH 13,14,15,21,22,X,Y negativa
Rischio alterazioni fenotipiche 5%
Ecografia/Ecocardiografia
Riduzione rischio di 1/3
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21
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Paziente in gravidanza di 31 aa

Riscontro ecografico NT aumentata
By NA
22
Toshiba Instruments
By NA
23
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
NT aumentata

 rischio aneuploidie

Prelievo villi coriali a 11 settimane

Presenza di ESAC de novo
piccole dimensioni, bisatellitato
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24
CROMOSOMI MARCATORI
(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
FISH 13,14,15,21,22

Positiva per
centromero 22

invdup(22)

Cat/Eye syndrome
By NA
25
Cat Eye syndrome
Malf. orecchio
Malf.anorettali
Malf. urogenitali
Coloboma occhio
86%
81%
71%
61%
Altre Malformazioni
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26
Cat Eye syndrome
Malformazioni
cardiache
62%
di cui 1/3 Anomalie del
Ritorno Venoso
Polmonare
By NA
27
Cat Eye syndrome
RITARDO MENTALE ??
Severo
Moderato/lieve
By NA
7%
47%
28
Cat Eye syndrome
Assenza di
correlazioni tra
estensione/regioni
geniche presenti nel
cromosoma
invdup(22) ed
anomalie del
fenotipo
By NA
29
Cat Eye syndrome
CES Tipo I vs CES
Tipo II non ha
utilità dal punto
di vista clinico
By NA
30
By NA
31
Cellule normali
DNA
genomico
CGH
estrazione del DNA
Ibridazione
marcatura
DNA di riferimento rosso
Metafase maschile normale
Cellule del paziente
DNA
genomico
marcatura
DNA test verde
microscopio a fluorescenza
acquisizione dell’immagine
elaborazione dell’immagine
analisi del rapporto di fluorescenza
lungo l’asse cromosomico
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32
Intensità di
fluorescenza
area del
cromosoma
Verde/Rosso
area del
cromosoma
amplificazione
Ideogramma
p
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q
delezione
33
By NA
34
By NA
35
Sindrome plurimalformativa
tetraparesi spastica di grado medio
ritardo mentale
turbe comportamentali
stereotipia
microcefalia
dismorfismi cranio facciali
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36
Mosaicismo
• Amniocentesi  cellule dall’epiblasto della
massa cellulare interna.
• Villocentesi – Coltura a breve termine 
cellule del trofoblasto.
• Villocentesi – Coltura a lungo termine 
cellule dello stroma (mesoderma
extraembrionario).
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37
By NA
38
MOSAICISMO
• I Livello: singola cellula
• II Livello: due o più cellule in una flask con
la stessa anomalia o singolo clone
• III Livello: due o più cellule in più flask con
la stessa anomalia o almeno 2 cloni
By NA
39
Liquido Amniotico Mosaicismi
• Livello I  2.5-7 %
• Livello II  0.7-1.1 %
• Livello III  < 0.2 %
By NA
40
MOSAICISMO
• PSEUDOMOSAICISMO
• MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA
(chorion, amnion)
• MOSAICISMO VERO
La grande maggioranza dei mosaicismi in
diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali
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41
Mosaicismo trisomia 11
Paziente di 29 anni
Indicazione: familiarità s. Down

Cariotipo fetale
46,XX (10 cloni)/47,XX,+11 (1 clone)

Mosaicismo II livello
By NA
42
Linee Guida work-up
Moderato: altre 10 cellule dalla flask con anomalia oppure altri 12 cloni.
•
•
•
•
•
By NA
Flask
Cr. Sessuale sovra-numerario
(SC,MC)
Trisomia 1,2,3,4,5,6,7,
10,11,16,17,19 (SC, MC)
45,X - Monosomie (MC)
Alt. bilanciate (MC)
Marcatore (SC)
•
•
•
•
•
In situ
Cr. Sessuale sovra-numerario
(SCo,MCo)
Trisomia 1,2,3,4,5,6,7,
10,11,16,17,19 (SCo, MCo)
45,X - Monosomie (SCo, MCo)
Alt. bilanciate (MCo)
Marcatore (SCo)
43
Mosaicismo trisomia 11
Estensione analisi a 41 cloni

Cariotipo
46,XY (39 cloni)/47,XY,+11 (2 cloni)

Mosaicismo III livello
By NA
44
Liquido Amniotico
Mosaicismi - Livello III
• Conferma sino al 40 % alla cordocentesi
ed al 50%(autosomi), 80% (ESAC) e
90% (cr. sessuali) al follow-up
• Tipo di Cromosoma (es. ESAC)
• Utilizzo e limiti della Cordocentesi
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45
Mosaicismo trisomia 11
• Solo 2 casi in letteratura, con bassa
frequenza (2.7 e 5.5%), apparentemente
non associati ad alterazioni fenotipiche
• Rischio s. Beckwith-Wiedemann da
disomia uniparentale 11
By NA
46
Meccanismi UDP
•
•
•
•
By NA
Complementazione gametica
Recupero dello zigote trisomico
Duplicazione mitotica
Errore post-zigotico
47
By NA
48
DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA
11
Regione 11p15.5 eterodisomia paterna

Alterata espressione di geni da imprinting genomico

2 casi di s. Beckwith-Wiedemann
By NA
49
DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA
11
P
F
M
P
F
M
P
F
M
Polimorfismi Cromosoma 11 - Tecnica PAGE
By NA
50
Mosaicismo trisomia 11
• Esame citogenetico:
Cariotipo 46,XY
(150 metafasi)
• Screening molecolare con
microsatelliti cromosoma
11:
Esclusione UDP
Attesa Fenotipo nella norma
(follow-up a 24 mesi)
By NA
51
Mosaicismo trisomia 4
Paziente di 40 anni
Indicazione: età

Cariotipo fetale
46,XX (31 cloni)/47,XX,+4 (9 cloni)

Mosaicismo III livello
By NA
52
Mosaicismo trisomia 4
Solo 3 casi in letteratura:
- 2 con bassa frequenza ( 10%),
apparentemente non associati ad alterazioni
fenotipiche
- 1 con an. faciali e malf. multiple: ad 1 anno
buon follow-up
- Problema UPD
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53
Mosaicismo trisomia 4
Counselling
• Ecografia/Ecocardiografia fetale
• Prelievo sangue funicolare per esame
cariotipo ed esclusione UPD
In caso di interruzione:
Esame citogenetico su tessuti diversi
By NA
54
Mosaicismo trisomia 4
• Ipoplasia cerebellare
• Ventricolomegalia
borderline
Fetal MRI
By NA
55
Mosaicismo trisomia 4
CAV completo
By NA
56
Mosaicismo trisomia 4
• Micrognazia
• Ipotelorismo
• Deformità rachide
(emivertebre)
• s. atresia esofagea
By NA
57
Mosaicismo trisomia 4 DISOMIA
UNIPARENTALE
P
CF
M
D4S243
P
CF
M
D4S175
Polimorfismi Cromosoma 4 - Tecnica PAGE
By NA
58
Diagnosi Malattie DNA
• Numero elevato malattie
• Numero elevato di mutazioni (es.
Fibrosi cistica)
• Coinvolgimento geni diversi (es.
Retinite pigmentosa)
By NA
59
Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti
 Conoscenza gene/i
• Identificazione della specifica
mutazione
By NA
60
Conoscenza geni
Mendeliane
•
•
•
•
By NA
Talassemia
Fibrosi cistica
Chorea di Huntington
Distrofia di
Duchenne
Complesse
(loci suscettibilità)
•
•
•
•
ApoE  Alzheimer
19p13;Xq24  Cefalea
12q;2q  Diabete NID
3q21  Psoriasi
61
Conoscenza geni
8000 malattie

geni noti 30%
(60-70% pazienti)
By NA
62
Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti
• Conoscenza gene/i implicati
 Identificazione della
specifica mutazione
By NA
63
Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)
•Una delle più comuni malattie genetiche dell’infanzia
•Ubiquitariamente diffusa nel mondo
•Colpiti pressochè esclusivamente maschi
•Ereditata come malattia recessiva X-linked
Si manifesta con debolezza muscolare progressiva.
I muscoli mostrano una pseudo-ipertrofia, molto
evidente nel polpacci: in realtà le fibre muscolari
sono rimpiazzate da tessuto grasso/adiposo.
By NA
64
DIAGNOSI DMD
• Progressiva perdita
muscolare e debolezza.
• Ridotta contrazione
muscolare.
• Incurvamento della colonna
vertebrale.
• Posizionamento doloroso
delle articolazioni.
• Difficoltà nei movimenti
quotidiani.
By NA
 livelli CK
Biopsia muscolare
65
DIAGNOSI DMD
• ANALISI DI DELEZIONE (60% circa dei casi):
– PCR multipla per 26 esoni dei 79 presenti nel gene.
– Evidenziazione degli amplificati su gel-elettroforesi
– Si diagnostica la delezione quando un prodotto di
amplificazione è assente in due separate reazioni di
amplificazione.
• ANALISI COMPLETA DEL GENE:
– Se non è presente una delezione ampia, allora si ricorre ad
uno studio dettagliato del gene mediante tecniche analitiche,
sino al sequenziamento diretto.
– Una volta trovata la mutazione nel probando, è possibile
testare rapidamente qualsiasi soggetto della famiglia a rischio.
By NA
66
MULTIPLEX P.C.R.
By NA
67
DIAGNOSI DMD
Paziente di 27 anni in gravidanza
con fratello affetto da DMD

Analisi Fratello

Delezione degli esoni 45-52

Studio familiare di linkage
(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

Paziente Portatrice della Mutazione
By NA
68
DIAGNOSI DMD
Paziente 27 anni portatrice in gravidanza

Prelievo dei Villi coriali a 10 settimane
90% dei villi
ESTRAZIONE DNA
Analisi molecolare
con PCR multipla
By NA
10% dei villi
(se possibile)
Analisi cariotipo
69
DIAGNOSI DMD
Paziente di 23 anni in gravidanza
con due nipoti deceduti per DMD

Studio familiare di linkage
(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)
By NA
70
DIAGNOSI DMD
By NA
71
DIAGNOSI DMD
Paziente non Portatrice dell’Aplotipo associato
alla DMD

DIAGNOSI PRENATALE
NON NECESSARIA !!!
By NA
72
DIAGNOSI DMD
Paziente di 26 anni in gravidanza (13 settimane)
con due figli affetti da DMD

Analisi Figli

No Delezione degli esoni

Studio di linkage
By NA
73
DIAGNOSI DMD
Aplotipo fetale
ricombinante
Rischio DMD
per il feto: 14%
(62/79 esoni derivano
dal materno normale)
By NA
74
Fibrosi cistica
1000 variazioni di sequenza
- 83% (>800) mutazioni - 17% polimorfismi
Caucasici 70% F508
By NA
75
By NA
31 Mutazioni
più frequenti
D.R. = 80%
76
Caratterizzazione clinica complessa
Ragazza 17 anni
Alla età di 12 anni:
Iridi stellate
Ritardo mentale
Personalità cocktail party
By NA
s. Williams
77
• Dismorfismo faciale (“elfin
facies”)
• Ritardo di crescita pre e
postnatale
• Deficit cognitivi (alt.
integrazione spazio-visiva);
lieve RM
• Stenosi aortica
sopravalvolare, s.
polmonare, difetti di
setto, prolasso mitrale
• Ipercalcemia infantile
DELEZIONE 7q11.23
gene ELN
By NA
SINDROME DI WILLIAMS
78