Review
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
Giancarlo Maria Liumbruno1, Giuliano Grazzini2, Maria Laura Sodini1
1
2
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, AUSL N. 6 – Livorno, Italia
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, AUSL N. 2 – Lucca, Italia
Introduction
Introduzione
Since 1906, the year in which James Homer Wright
demonstrated that megakaryocytes generated platelets, up
to then known as "blood dust", great advances have been
made in the understanding of the molecular mechanisms
controlling thrombopoiesis and in the knowledge of the
structure and mechanisms of the cell receptor that regulates
megakaryocytopoiesis and the production of platelets1-4.
Over 40 years ago Kelemen and colleagues predicted
the existence of a potent growth factor specific for the
megakaryocytic line, contained in the plasma of
thrombocytopenic patients and animals, which they gave
the name thrombopoietin (TPO)5.
Thenextfundamentalstepwasthecloningofthemurine
myeloproliferative leukemia retroviral oncogene (v-mpl)6;
this achievement opened the way to the cloning, in 1992,
of the human homologue, the proto-oncogene c-mpl, which
codes for the TPO membrane receptor (rTPO)7.
Finally, in 1994, TPO was isolated and cloned almost
contemporaneously by five independent groups of
researchers8-12. Subsequently it was demonstrated that this
cytokine, besides playing a major role in
megakaryocytopoiesis, from the formation of
megakaryocytic colonies right up to the production of
platelets, has pleiotropic effects on haematopoiesis.
Following its cloning, various different forms of
recombinant TPO were produced; two molecules in
particular have been the subject of numerous pre-clinical
and clinical studies: recombinant human TPO (rHuTPO)
A partire dal 1906, anno in cui James Homer Wright
dimostrò che erano i megacariociti a generare le piastrine
(PLT), fino ad allora conosciute come "polvere del sangue",
sono stati fatti notevoli progressi nella comprensione dei
meccanismi molecolari che controllano la trombopoiesi e
nella conoscenza della struttura e dei meccanismi di
funzionamento del recettore cellulare che regola la
megacariocitopoiesi e la produzione di piastrine1-4.
Oltre 40 anni fa Kelemen e collaboratori predissero
l'esistenza di un fattore di crescita potente e specifico per
la linea megacariocitaria, contenuto nel plasma di pazienti e
animali piastrinopenici, per il quale coniarono il nome di
trombopoietina(TPO)5.
La tappa fondamentale successiva fu costituita dalla
clonazione dell'oncogene retrovirale della leucemia
mieloproliferativa murina (v-mpl)6; questa scoperta, infatti,
aprìlastradaallaclonazione,nel1992,dell'omologoumano,
il protooncogene c-mpl, che codifica per il recettore di
membranadellaTPO(rTPO)7.
Nel 1994, infine, la TPO fu isolata e clonata quasi in
contemporanea da cinque gruppi di ricercatori
indipendenti8-12. È stato dimostrato in seguito che questa
citochina, oltre ad avere un ruolo da protagonista nella
megacariocitopoiesi, dalla formazione di colonie
megacariocitarie fino alla produzione di PLT, ha un effetto
pleiotropico sull'emopoiesi. Successivamente alla sua
clonazione, sono state prodotte diverse forme di TPO
ricombinante; due molecole in particolare sono state
oggettodinumerosistudipre-clinicieclinici:laTPOumana
ricombinante (rHuTPO) e il fattore di crescita e sviluppo
megacariocitario umano ricombinante e pegilato (PEGrHuMGDF).
A tutt'oggi, diversamente da quanto verificatosi con
Correspondence:
Dr. Giancarlo Maria Liumbruno
Viale Italia, 19
57126 Livorno, Italia
e-mail: [email protected]
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265
GM Liumbruno et al
and pegylated recombinant human megakaryocyte growth
anddevelopmentfactor(PEG-rHuMGDF).
Unlike the other growth factors, such as G-CSF and
erythropoietin(EPO),morethan10yearsafterbeingcloned,
recombinant TPO is still not available for clinical use13. The
numerous studies carried out have, however, enabled a
considerable acceleration in the understanding of the
physiology and biology of thrombopoiesis and
haematopoiesis in general14.
The pharmacological options for the treatment of
thrombocytopenia range from cytokines with a general
thrombopoietic potential to therapies that specifically act
on the TPO receptor (synthetic forms of TPO and TPOmimetic agents). The subject of this review are the rTPO
agonists which seem to be able to produce clinically
significant results in the treatment of idiopathic
thrombocytopenic purpura (ITP) and which are currently
the focus of multiple lines of research.
Cytokines with thrombopoietic action
Thrombocytopenia is a problem commonly found
during the treatment of patients with cancer or
haematological diseases and is also present in other clinical
situations, such as chronic liver failure, AIDS, liver
transplantation and heart surgery.Transfusion therapy with
platelet concentrates, which started in the 1960s with the
commercial production of plastic bags, is still the treatment
of choice for the acute phase of severe thrombocytopenia.
In the last 20 years, numerous growth factors with
thrombopoietic activity in vitro or in animal models,
besides TPO, have been identified; these include
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GMCSF), G-CSF, EPO, leukemia inhibitory factor (LIF), stem
cell factor (SCF) (c-kit ligand or steel factor), IL-1β, IL-3,
IL-6, IL-9 and IL-1114-16. In vitro studies have shown a
synergistic role in various stages of megakaryocytopoiesis
for SCF, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, EPO, LIF and TPO,
although, in the animal models studied, only knocking out
the genes for SCF and TPO has shown a negative impact
on the production of megakaryocytes and platelets; it is
not clear, at the moment, whether these results can be
extrapolated to humans17.
Many of these molecules with thrombopoietic activity
havebeenusedclinically,albeitoftenonlybriefly;examples,
besides TPO, are IL-3, IL-6, SCF and other molecules,
obtained by genetic engineering, such as: 1) the fusion
protein between GM-CSF and IL-3 (PIXY321); 2) the so-
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altrifattoridicrescita,qualiilG-CSFel'eritropoietina(EPO),
a oltre dieci anni dalla sua clonazione, la TPO ricombinante
non è disponibile per impiego clinico13. I numerosi studi
condotti hanno però consentito una notevole accelerazione
nella comprensione della fisiologia e biologia della
trombopoiesi e dell'emopoiesi in generale14.
Le opzioni farmacologiche per il trattamento della
piastrinopenia sono costituite dalle citochine con potenziale
trombopoietico generale e dalle terapie attive sul recettore
dellaTPO(TPOsinteticheeagentiTPO-mimetici).Oggetto
di questa Rassegna sono gli agonisti del rTPO, i quali
sembrano essere in grado di produrre risultati clinici
significativi nel trattamento della porpora trombocitopenica
idiopatica (PTI) e che sono, attualmente, al centro di
molteplici filoni di ricerca.
Citochine con azione trombopietica
La piastrinopenia è un problema di comune riscontro
nel trattamento di pazienti oncologici ed ematologici ed è
presente anche in altri scenari clinici, come l'insufficienza
epatica cronica, l'AIDS, i trapianti epatici o la
cardiochirurgia. La terapia trasfusionale con concentrati
piastrinici, sviluppatasi a partire dagli anni '60, con la
produzione commerciale delle sacche di plastica, rimane
attualmente il presidio terapeutico di elezione, in fase acuta,
per le piastrinopenie gravi.
Nell'ultimo ventennio, oltre alla TPO, sono stati
identificati numerosi fattori di crescita con attività
trombopoietica in vitro o in modelli animali; tra questi il
GM-CSF,G-CSF,l'EPO,illeukemiainhibitoryfactor(LIF),
lo stem cell factor (SCF) (c-kit ligand o steel factor),
l'IL-1β,l'IL-3,l'IL-6,l'IL-9el'IL-1114-16.Studi invitrohanno
identificato un ruolo sinergico nelle varie fasi della
megacariocitopoiesiperSCF,IL-3,IL-6,IL-11,G-CSF,EPO,
LIF e TPO ma, nei modelli animali esaminati, solo
l'eradicazione del gene per SCF e TPO ha mostrato un
impatto negativo sulla produzione di megacariociti e PLT;
non è chiaro, al momento, se questi risultati possano essere
estrapolabili all'uomo17.
Molte di queste molecole con attività trombopoietica
hanno trovato un impiego clinico spesso effimero; tra
queste,oltreallaTPO, l'IL-3,l'IL-6, loSCFealtremolecole,
ottenute con tecniche di ingegneria genetica, quali: 1) la
proteina di fusione tra GM-CSF e IL-3 (PIXY321); 2) la
cosiddetta sintochina, un analogo dell'IL-3 (SC-55494); 3)
l'agonista del recettore dell'IL-3 (Daniplestim); 4) il doppio
agonista chimerico (DAC) dei recettori del G-CSF e
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Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
called synthokine, an anologue of IL-3 (SC-55494); 3) the
agonist of the IL-3 receptor (Daniplestim); 4) the chimeric,
dual G-CSF and IL-3 receptor antagonist (SC70935,
Leridistim); 5) the chimeric, dual TPO and IL-3 receptor
agonist (Promegapoietin-1α). Combined therapeutic
strategies have also been adopted, such as the use of IL-3
togetherwithG-CSForGM-CSF,orIL-6andG-CSF15,16.
The modest results obtained from the clinical use of
interleukins is explained, in part, by the fact that their action
on the multiple stages of thrombopoiesis is not their main
or indeed only physiological function.
Often, besides their modest favourable effect on
thrombocytopenia, they have additional, considerable toxic
side effects such as hyperbilirubinaemia, rapid production
of anaemia, fever, fatigue, shivers, hypotension and
headache. These complications, due to the pleiotropic
effects of interleukins, have limited the clinical use of these
cytokines14.
At present, only IL-11 is used in the USA18-20; this
cytokine, with effects on many tissues (brain, spinal cord
neurones, gut and testis) was isolated in 199018 and, as
oprelvekin(Neumega;Wyeth/GeneticInstitute,Cambridge,
MA, USA), was approved in 1997 by the Food and Drug
Administration (FDA) in the USA for the prevention of
post-chemotherapy thrombocytopenia in adults with solid
tumours or lymphomas19.
Oprelvekin has not been shown to be able to reduce
platelet transfusion needs in patients undergoing
autologous bone marrow transplantation and has caused
a higher incidence of side effects (tachycardia,
hypotension, oedema) in this setting16,19. For adults with
adequate renal function (creatinine clearance >30 mL/min),
the recommended dose is 50 µg/kg/die, started from 6 to 24
hours after chemotherapy and continued for 10-21 days,
until the platelet count (PC) exceeds 50x109/L. It has been
suggested that IL-11 should not be used for more than 21
days and that the cytokine treatment should be interrupted
2 days before the start of chemotherapy19.
Good results have recently been reported with the use
of oprelvekin at a reduced dose (10 µg/kg/die for two twiceweekly cycles separated by an interval of 2 weeks) in
patients with thrombocytopenia due to bone marrow failure
[myelodysplastic syndromes (MDS) and aplastic anaemia]
and also in paediatric patients with solid tumours or
lymphomas, although in these cases treated with standard
doses15,20,21.
A not negligible incidence of side effects has been
reported in the paediatric setting; in particular anti-IL-11
antibodies have developed in 4% of the patients20,21.
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dell'IL-3(SC70935,Leridistim);5) ilDACdeirecettoridella
TPOeIL-3(Promegapoietin-1α).Sonostateinoltreadottate
strategie terapeutiche combinate, come l'utilizzo di IL-3
insiemeaG-CSFoGM-CSF,oppureIL-6eG-CSF15,16.
I modesti risultati, ottenuti con l'impiego clinico di
queste IL, si spiegano anche con il fatto che la loro azione
sul processo a stadi multipli della trombopoiesi non
costituisce la loro principale ed unica funzione fisiologica.
Spesso, inoltre, al modesto effetto favorevole sulla
piastrinopenia, si sono aggiunti importanti effetti di
tossicità collaterale quali iperbilirubinemia, anemizzazione
rapida, febbre, fatigue, brividi, ipotensione e cefalea,
imputabili all'effetto pleiotropico delle IL, che ne hanno
condizionato il limitato impiego14.
Attualmente soltanto l'IL-11 è utilizzata negli USA18-20;
questa citochina, con effetti su molti tessuti (cervello,
neuroni del midollo spinale, intestino e testicolo), fu isolata
nel199018 eapprovatanel1997comeoprelvekin(Neumega;
Wyeth/GeneticInstitute,Cambridge,MA,USA)dallaFDA
(Federal Drug Administration) degli USA, per la
prevenzione della piastrinopenia post-chemioterapia negli
adulti con tumori solidi e linfomi19. Nei pazienti sottoposti
ad autotrapianto di midollo osseo, invece, l'oprelvekin non
ha evidenziato la capacità di ridurre il fabbisogno
trasfusionale piastrinico e ha causato una maggiore
incidenza di effetti collaterali (tachicardia, ipotensione,
edemi)16,19. Per gli adulti con funzionalità renale adeguata
(clearance della creatinina >30 mL/min), la dose
raccomandata è 50 µg/kg/die, da iniziare da 6 a 24 ore dopo
la chemioterapia e da proseguire per 10-21 giorni, finché la
conta piastrinica (CP) non supera le 50x109/L. Altre
indicazioni suggeriscono di non usare l'IL-11 per più di 21
giorniediinterrompereiltrattamento2giorniprimadell'inizio
della chemioterapia19. Recentemente, sono stati riportati
buoni risultati con l'impiego di oprelvekin, a dosaggio
ridotto (10 µg/kg/die per 2 cicli bisettimanali, intervallati da
2 settimane di pausa), in pazienti con piastrinopenia da
insufficienza midollare [sindrome mielodisplastica (SMD)
e anemia aplastica] e anche in pazienti pediatrici con tumori
solidi o linfomi, trattati però con dosaggi standard15,20,21; in
ambito pediatrico è tuttavia segnalata una non trascurabile
incidenza di effetti collaterali, tra i quali soprattutto la
comparsa di anticorpi anti-IL-11 nel 4% dei pazienti20,21.
La trombopoietina
La TPO, mediante lo specifico recettore, stimola la
cellula staminale emopoietica a indirizzarsi verso la linea
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Thrombopoietin
TPO, through its specific receptor, stimulates the
haematopoietic stem cell towards the megakaryocyticplatelet line and also controls the proliferation and
differentiation of megakaryocytes. In anucleated platelets,
the action of TPO on its receptor is translated into control
of platelet aggregation and secretion22.
TPO is a growth factor that is synthesised
predominantly in the liver; its mRNA can be found not
only in the sites of its synthesis, such as the liver
(parenchymal cells and the endothelium of sinusoids) and
the kidney, but also in skeletal muscles, in the spleen, bone
marrow, placenta and brain, although the physiological
relevance of its presence in these sites is unknown17,19.
The molecule of mature TPO is formed of 332 amino acids,
divided into two regions. The N-terminal domain, which is
the receptor site, is formed of a sequence of 153 amino
acids that has 23% homology with the amino acid sequence
of EPO; this domain contains two distinct receptor binding
sites:onehighaffinity,theotherlowaffinity.TheC-terminal
domain is formed of a sequence of 179 amino acids, rich in
carbohydrates, which is involved in the secretion and
stability of TPO. TPO binds to its receptor with a
stochiometric ratio of 1:2 and induces its dimerisation with
consequent intracellular transduction of the differentiating
and proliferative signals, through the activation of a
complex network, which starts with the phosphorylation
of the intracellular domain of the rTPO and various
secondary signalling molecules such as: a) the JAK family
kinases (an acronym derived from the original name just
another kinase, then changed into Janus kinase); b)
transcription factors called signal transducers and
activators of transcription (STATs); c)
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K/Akt); d) Ras/MAPK
(rat sarcoma virus/mitogen-activated protein kinase). The
activation of these molecules gives rise to a signal that
induces megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis4,22-24.
rTPO, also known as MPL (from myeloproliferative
leucaemia), TPOR, CMPL and CD110, belongs to a
superfamily of type I cytokine receptors and has two
extracellular domains named CHR (cytokine receptor
homology). TPO binds to the receptor through the distal
CHR domain, while it does not interact in any way with the
proximal domain; this has led to the hypothesis, albeit
completely speculative, that there is another, as yet
unidentified, cytokine that can interact with rTPO19,4.
The mechanisms that regulate the levels of TPO and
the ways that this latter controls thrombopoiesis have been
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megacariocitaria-piastrinica e controlla anche la
proliferazioneedifferenziazionedeimegacariociti;nellePLT
anucleate,invece,l'azionedellaTPOsulmedesimorecettore
si traduce in un'azione di controllo su aggregazione e
secrezione22.
La TPO è un fattore di crescita a sintesi prevalentemente
epatica; il suo RNAm è rilevabile, oltre che nei siti di sintesi,
come il fegato (cellule parenchimali e endotelio dei
sinusoidi) e il rene, anche nel muscolo scheletrico, nella
milza, nel midollo osseo, nella placenta e nel cervello, ma
non è noto quale sia il significato fisiologico di questa
presenza17,19. La molecola della TPO matura è costituita da
332 aminoacidi, suddivisi in due regioni. Il dominio Nterminale, che è il sito recettoriale, è costituito da una
sequenza di 153 aminoacidi, con il 23% di omologia alla
sequenza dell'EPO; questo dominio contiene 2 distinti siti
di legame con il recettore: uno ad alta affinità ed uno a
bassa affinità. Il dominio C-terminale è costituito da una
sequenza di 179 aminoacidi, ricca di carboidrati, che è
implicata nella secrezione e nella stabilità della TPO. La
TPO si lega al suo recettore con un rapporto stechiometrico
pari a 1:2 e ne induce la dimerizzazione; ne consegue la
trasduzione del segnale differenziativo e proliferativo a
livello intracellulare, mediante l'attivazione di un di un
complesso network, il quale ha inizio con la fosforilazione
del dominio intracellulare del rTPO e di diverse molecole di
comunicazionesecondariecome:a)lechinasidellafamiglia
JAK (acronimo derivante dal nome originale just another
kinase, poi trasformato in Janus kinase); b) i fattori di
trascrizione denominati "trasduttori di segnale e attivatori
della trascrizione" [signal transducers and activators of
transcription (STATs)]; c) la fosfatidilinositolo-3-chinasi
(PI3K/Akt); d) la Ras/MAPK (rat sarcoma virus/mitogenactivated protein kinase). L'attivazione di queste molecole
di comunicazione dà origine al segnale che induce la
megacariocitopoiesi e la trombopoiesi4,22-24.
Il rTPO, noto anche come MPL (da myeloproliferative
leukemia), TPOR, CMPL e CD110, appartiene alla
superfamiglia dei recettori delle citochine di tipo I ed è
dotatodi2dominiextracellularidenominatiCHR(cytockine
receptor homology); il recettore, mediante il dominio CHR
distale, lega la TPO, mentre il dominio prossimale non
interagisce in alcun modo con la stessa; questo, secondo
alcuni, potrebbe fare ipotizzare, sebbene in modo del tutto
speculativo, l'esistenza di un'altra citochina, ancora non
identificata, in grado di interagire con il rTPO19,4.
ImeccanismicheregolanoilivellidellaTPOelemodalità
con le quali quest'ultima controlla la trombopoiesi, pur
essendo stati identificati in modelli animali, si applicano
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Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
identified in animal models but are applicable also in
humans25-27. Thrombocytopenic mice, with levels of TPO
up to ten times normal, show no changes in the expression
of mRNA for TPO in either the liver or the kidney and the
induction of thrombocytosis does not cause a reduction in
TPO mRNA expression28,29. These and other observations
support the conclusion that most circulating TPO is
synthesised in a constant manner by the liver and kidney,
independently of the PC; as long as the PC remains normal,
only a limited quantity of the TPO produced is not absorbed
by the circulating platelets and remains available to
stimulate the production of new platelets. In contrast, in
patients with an abnormal PC, the level of TPO in the
circulation varies in inverse proportion to the number of
platelets: this constitutes the stimulus that induces
precursor cells and megakaryocytes to restore normal levels
of platelets. This is a so-called sponge regulation model,
originally described by De Gabriele and Penington in 1967
and subsequently revisited by Kuter and Rosenberg in
1995, according to which the main mechanism regulating
the levels of TPO is based on its clearance by the platelets
themselves30-32.
In fact, after binding with the rTPO on platelets and
megakaryocytes, the TPO is internalised and broken down;
the endocytosis of the TPO-receptor complex interrupts
the transduction of the proliferative signal at the
intracellular level and, based on the rate of this, regulates
both the number of rTPO expressed on the cell surface and
the levels of TPO in the circulation. The inverse relationship
between plasma levels of TPO and the numbers of
circulating platelets is an example of feedback regulation,
although there are some anomalies. In contrast to what
happens with the control of red blood cells by EPO, there
is no sensor of the amount of circulating platelets that
controls the production of TPO; rather, the plasma level of
this cytokine is determined by the rate of its clearance by
the rTPO on platelets and megakaryocytes. Thus, in ITP,
even in the presence of marked thrombocytopenia, there
are normal, rather than increased, levels of TPO, because
the break down of the TPO continues as a result of the
poolofmegakaryocytesfromthehypertrophicbonemarrow.
In myeloproliferative disorders, on the other hand, because
of an abnormal rate of endo-exoctyosis of the rTPO and
the consequent reduced extracellular expression of the
receptor, there is reduced degradation of TPO, which is,
therefore, present in the circulation at normal or even
increased levels, despite increased numbers of platelets
and megakaryocytes13,14,17,19,22,33-37.
The fact that platelets reduce the amount of circulating
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
anche all'uomo25-27.Topi piastrinopenici, con livelli diTPO
fino a 10 volte quelli normali, non mostrano alcun
cambiamento nell'espressione dell'RNAm per la TPO a
livello epatico o renale e, analogamente, l'induzione di
piastrinosi non ne determina una riduzione28,29. Queste e
altre osservazioni supportano la conclusione che la maggior
parte della TPO in circolo è sintetizzata in maniera costante
da fegato e rene, indipendentemente dalla CP; finché
quest'ultima si mantiene normale, solo una limitata quantità
di TPO prodotta non viene assorbita dalle PLT in circolo e
rimane disponibile per stimolare la produzione di nuove
PLT;invece,neipazienticonCPalterate,sihaunavariazione
del livello di TPO in circolo inversamente proporzionale al
numero di PLT: questo costituisce lo stimolo che induce le
cellule precursori ed i megacariociti a ripristinare normali
livelli di PLT. Si tratta del cosiddetto modello di regolazione
a spugna, descritto originariamente da De Gabriele e
Penington nel 1967 e successivamente ripreso da Kuter e
Rosemberg nel 1995, secondo il quale il meccanismo
principalecheregolailivellidiTPOèbasatosullaclearance
della stessa da parte delle PLT30-32.
Infatti, dopo il legame con il rTPO sulle PLT e sui
megacariociti, la TPO viene internalizzata e degradata;
l'endocitosi del complesso recettore-TPO interrompe la
trasduzione del segnale proliferativo a livello intracellulare
e, con il suo ritmo, regola sia il numero di rTPO espressi
sulla superficie cellulare, che i livelli di TPO in circolo. La
relazione inversa che esiste tra il livello plasmatico di TPO
e il numero di PLT circolanti è un esempio di regolazione a
feedback,chepresentaperòalcuneeccezioni.Diversamente
da quanto accade con il controllo dei globuli rossi da parte
dell'EPO, non esiste un sensore della quantità di PLT
circolanti che controlla la produzione di TPO, ma il livello
plasmatico di questa citochina è determinato dal ritmo della
sua clearance da parte dei rTPO su PLT e megacariociti.
Pertanto nella PTI, anche in presenza di una spiccata
piastrinopenia, si riscontrano livelli di TPO normali, invece
che aumentati, perché la degradazione della TPO prosegue
ad opera del pool dei megacariociti midollari ipertrofico.
Nei disordini mieloproliferativi, invece, a causa di
un'anomalia nel ritmo di endo-esocitosi del rTPO e della
conseguente ridotta espressione extracellulare dello stesso,
si assiste ad una ridotta degradazione della TPO, presente
in circolo a livelli normali o addirittura superiori alla norma,
pur in presenza di un numero di PLT e megacariociti
aumentato13,14,17,19,22,33-37.
Il fatto che le PLT riducano la TPO in circolo,
assorbendola e degradandola, ha almeno due risvolti clinici.
IlprimoèchelatrasfusionediPLTpuòrallentareilrecupero
269
GM Liumbruno et al
TPO, by absorbing and degrading it, has at least two clinical
consequences. The first is that platelet transfusions can
slow down the recovery of megakaryocytes. The second
is that the binding of TPO to circulating platelets can
attenuate the response to endogenous TPO during
myelosuppressive treatment. In fact, the first effect of
cytotoxic treatment is not a drop in the PC, but rather
reduced production of platelets by the megakaryocytes
and their precursors, which are the first to be destroyed;
given that the still circulating platelets bind and degrade
the TPO, the plasma levels of the TPO increase only after
several days, when the thrombocytopenia develops. This
isthereasonwhytreatmentwithrecombinantTPO,ifstarted
immediately after myelosuppressive therapy,canaccelerate
haematopoietic recovery17.
Two molecules of recombinant TPO have been
produced and studied in depth. rHuTPO, produced in
Chinese hamster ovary cells [Genentech (South San
Francisco,CA,USA),Pharmacia&Upjohn(London,UK)],
is a glycosylated molecule with an amino acid sequence
identical to that of endogenous TPO but with a molecular
weight of 90 kDa, which is less than the 95 kDa of the
nativemolecule.PEG-rHuMGDF[Amgen(ThousandOaks,
CA, USA), Kirin (Tokyo, Japan), Zymogenetics (Seattle,
WA, USA)], on the other hand, is produced in strains of
Escherichia coli; it is formed of the 163 amino acids of the
amino-terminalpartofthenativeTPOmolecule(thereceptor
site), to which a polyethyleneglycol fraction of 20 kDa is
conjugated, with the aim of increasing the molecule’s halflife in the circulation and its potency, which is in fact 10
times greater than that of rHuTPO14, 38-42.
The clinical use of these molecules has produced
effective responses in patients undergoing nonmyeloablative treatments, but disappointing results in
myeloablative treatments, which reduces the potential
market for these compounds and, therefore, the clinical
interest in them. Other areas of potential use that have
been identified are in the treatment of MDS, in
thrombocytopenia due to liver failure or HIV infection, and
in some sectors of transfusion medicine (mobilisation of
stem cells, in vitro expansion of stem cells and productive
plateletpheresis); finally, as a results of the anti-apoptotic
effect of TPO, a potential radioprotective action has been
notedinanimalmodels14,40.On11th September,1998Amgen
withdrew pegylated TPO because it caused the
development of IgG-type antibodies to PEG-rHuMGDF;
since these antibodies were cross-reactive with
endogenous TPO, they were able to neutralise this latter
and, therefore, accentuate the thrombocytopenia because
270
da parte dei megacariociti. In secondo luogo, il legame tra
la TPO e le PLT circolanti può attenuare la risposta alla
TPO endogena in corso di terapia mielosoppressiva. Infatti,
il primo effetto della terapia citotossica non è un calo della
CP, ma una ridotta produzione di PLT da parte dei
megacariocitiedeiloroprecursori,chesonoiprimiadessere
distrutti; dato che le PLT ancora circolanti legano e
degradano la TPO, ne consegue che i livelli plasmatici della
stessa si innalzano solo dopo diversi giorni, quando si
instaura la piastrinopenia. Questa è la ragione per cui un
trattamento con TPO ricombinante, se attuato subito dopo
la terapia mielosoppressiva, può accelerare il recupero
emopoietico17.
Le molecole di TPO ricombinante prodotte e studiate in
modo più approfondito sono due. La rHuTPO, prodotta in
cellule di ovaio di criceto cinese [Genentech (South San
Francisco,CA,USA),Pharmacia&Upjohn(Londra,UK)],è
unamolecolaglicosilataconsequenzaaminoacidicaidentica
aquelladellaTPOendogenaeconpesomolecolareparia90
kDa,inferioreai95kDadellamolecolanativa.IlPEG-rHuMGDF
[Amgen (Thousand Oaks, CA, USA), Kirin (Tokyo,
Giappone), Zymogenetics (Seattle, WA, USA)] è prodotto
invece in ceppi di Escherichia coli; esso è costituito dai 163
aminoacidi della porzione amino-terminale della molecola
nativa di TPO (il sito recettoriale), ai quali è stata coniugata
una frazione di polietilenglicole di 20 kDa, allo scopo di
aumentarnel'emivitaincircoloelapotenza,cheèinfatticirca
10 volte superiore a quella della rHuTPO14, 38-42.
L'impiegoclinicodiquestemolecolehaevidenziatouna
risposta efficace nei pazienti sottoposti a terapie nonmieloablative,maunadeludenteperformanceneitrattamenti
mieloablativi, fattore questo determinante nella riduzione
del potenziale mercato e, conseguentemente, dell'interesse
clinico. Altre aree di potenziale utilizzo sono state
identificate nella SMD e, nella piastrinopenia da
insufficienza epatica o HIV-correlata, in alcuni settori della
medicina trasfusionale (la mobilizzazione delle cellule
staminali, l'espansione in vitro delle stesse o la
piastrinoaferesi produttiva) e infine, a causa dell'effetto
antiapoptotico della TPO, è stata segnalata, in modelli
animali, la potenziale azione di radioprotezione14,40. L'11
settembre 1998 la TPO pegilata fu ritirata dalla Amgen,
perché causava l'insorgenza di anticorpi anti-PEGrHuMGDF di tipo IgG, che accentuavano la piastrinopenia
perché cross-reattivi e in grado, quindi, di neutralizzare
anche la TPO endogena, prodotta in quantità costante. La
produzione di anticorpi da parte del PEG-rHuMGDF
sembrerebbe essere imputabile più alla via di
somministrazione sottocutanea (sc), che alla diversa
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
endogenous TPO is produced at a constant rate. The
production of antibodies by PEG-rHuMGDF seems to be
due more to the subcutaneous (sc) route of administration,
than to its molecular conformation being different from that
of rHuTPO; since TPO is, in fact, also a potent mobiliser of
dendritic cells, sc injection increases its
immunogenicity13,14,39.Antibody development has not been
described in patients treated with intravenously
administered rHuTPO, but a non-neutralising antibody was
reported after sc administration14. rHuTPO continues to be
developed as a therapeutic agent in China19.
conformazione molecolare rispetto alla rHuTPO; essendo,
infatti, la TPO anche un potente mobilizzatore di cellule
dendritiche, l'iniezione sc ne aumenterebbe
l'immunogenicità13,14,39. Lo sviluppo di anticorpi non è stato
invece descritto nei pazienti trattati con la rHuTPO per via
endovenosa, ma è stato segnalato un anticorpo non
neutralizzante dopo somministrazione sc14. La rHuTPO
continua ad essere sviluppata come agente terapeutico in
Cina19.
I nuovi approcci farmacologici
The new pharmacological approaches
Haematopoietic growth factors are glycoproteins with
a molecular weight between 15 and 95 kDa; their
recombinant homologues have very high production costs,
must be administered parenterally, and, furthermore, can
cause the development of cross-reactive, neutralising
antibodies. The creation of molecules differing from the
endogenous growth factors, but able to bind to their specific
receptors, is now a consolidated strategy for pharmaceutical
companies19.
The process of developing TPO-mimetic agents is
currently being pursued in three different sectors of
research: a) peptide agonists; b) non-peptidyl agonists; c)
antibodies against epitopes of rTPO.
Peptide agonists
The technique of phage display (PD), that is, the
exposure of polypeptides on the surface of bacteriophages,
enables the creation of a broad repertoire of ligands, from
which the proteins with the desired characteristics can be
selected. In this technique, nucleotide sequences coding
for a library of mutant enzymes are inserted in frame with a
gene coding for a phage coating protein, such that once
the structure of the phage has been formed, the
polypeptides coded for by the library are exposed on its
surface. The subsequent selection of phagic particles that
expose peptide ligands of specific receptors is based on
affinity chromatography, in which the receptor is
immobilised on a matrix or support. This technique has
been found to be particularly suitable for identifying peptide
ligands of various cytokines and receptors of growth
factors. Kaushansky has recently published a review of
this subject43.
The first rTPO agonists were synthesised in the second
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
I fattori di crescita emopoietici sono glicoproteine con
pesomolecolaretra15e95kDa;iloroomologhiricombinanti
hanno costi di produzione piuttosto elevati, devono essere
somministrati per via parenterale e, inoltre, possono
determinare l'insorgenza di anticorpi neutralizzanti
crossreattivi. La creazione di molecole diverse dai fattori di
crescitaendogeni,maingradodilegarsiairecettorispecifici,
è ormai una strategia consolidata per le aziende
farmaceutiche19.
Il processo di sviluppo degli agenti TPO-mimetici è
attualmente orientato verso tre diversi settori di ricerca:
a) gli agonisti peptidici; b) gli agonisti non-peptidici; c) gli
anticorpi contro epitopi del rTPO.
Gli agonisti peptidici
La tecnica del phage display (PD), ossia l'esposizione
di polipeptidi sulla superficie di batteriofagi, permette di
creare ampi repertori di ligandi, dai quali si possono
selezionare le proteine con le caratteristiche desiderate.
Questa tecnica prevede che le sequenze nucleotidiche,
codificanti per una libreria di enzimi mutanti, siano inserite
in frame con un gene che codifica una proteina di
rivestimento fagica, in modo che, una volta formatasi la
struttura del fago, i polipeptidi codificati dalla libreria siano
esposti sulla sua superficie. La successiva selezione delle
particelle fagiche, che espongono peptidi ligandi di specifici
recettori, si basa sulla cromatografia di affinità, nella quale
il recettore sia stato immobilizzato su matrici o supporti.
Questa tecnica si è rivelata di particolare efficacia per
individuare ligandi peptidici di diverse citochine e recettori
di fattori di crescita. Kaushansky ha recentemente
pubblicato una Review sull'argomento43.
La sintesi dei primi agonisti del rTPO risale alla seconda
metàdeglianni'90.Cwirlaecollaboratori[AffymaxResearch
Institute(PaoloAlto,CA,USA),GlaxoWellcomeResearch
271
GM Liumbruno et al
half of the 1990s. In 1997, Cwirla and colleagues [Affymax
ResearchInstitute(PaoloAlto,CA,USA),GlaxoWellcome
Research Institute (Research Triangle Park, NC, USA)], by
searching L-peptide libraries with the PD technique, chose
30 small peptides. These peptides had no sequence
homology with endogenous TPO, but were not only able
to bind in vitro to human and murine rTPO, expressed by
cell lines, but also to activate the receptor by dimerisation.
The peptides were grouped into two families on the basis
of their amino acid sequence homology. One of the smallest
peptides (14 amino acids), AF12505, was dimerised by
covalent bonding to a lysine residue in order to increase
its potency; the dimer (AF13948) thus obtained was 4,000
times more effective than the monomer at activating the
celllinesexpressingrTPO,reachingthepotencyofrHuTPO,
despite being about one tenth of the size of this latter.
Thus, on the basis of molecular weight, AF13948 is ten
times more potent than rHuTPO. The greater potency of
the dimer, compared to the monomer, adds further support
to the role of dimerisation of rTPO in the mechanism of
action of these peptides. Furthermore,AF13948 was able
to stimulate invitro proliferationofbonemarrowprogenitor
cells and maturation of megakaryocytes in humans as well
as increase the PC in animal models44,45.
Almost at the same time Kimura et al.46, in Japan
(Hokuriku Seiaku Research and Development Division,
Katsuyama, Fukui), isolated a family of peptides which was
verysimilar,both intermsofstructureandabilitytoactivate
rTPO, to one of the two families described by Cwirla and
colleagues44.
Two years later, in 1999,AF13948 was modified by an
amino acid substitution to produceAF15075, which was
then conjugated with a 20 kDa fraction of
polyethyleneglycol, with the aim of reducing its in vivo
immunogenicity, giving rise to the pegylated peptide
GW395058. GW395058 was used in pre-clinical studies in
animalmodels,producingfavourableresultsfromthepoints
of view of both immunogenicity and its thrombopoietic
effect, even if, for parity of dose, the haematological
response differed in the various animal species16,47-49. These
peptides have not, however, passed the pre-clinical stage
of testing.
AMG531,thenewTPO-likeagentproducedbyAmgen
(OncologyDevelopment,ThousandOaks,CA,USA),arose
from a combination between peptides and antibodies and
is also known as a peptibody; this protein is, in fact, formed
of a random sequence of peptides, which activate the rTPO,
conjugated to a carrier domain formed of the Fc fragment
of the immunoglobulins, which has the function of
272
Institute, Research Triangle Park, NC, USA)] nel 1997,
vagliando delle librerie di L-peptidi con la tecnica del PD,
selezionarono 30 piccoli peptidi, senza alcuna omologia di
sequenza con la TPO endogena, in grado non solo di legarsi
in vitroal rTPO umano e murino, espresso su linee cellulari,
maanchediattivarlomediantedimerizzazione.Questipeptidi
eranoraggruppabiliinduefamiglie,sullabasedell'omologia
nella sequenza aminoacidica. Uno dei peptidi più piccoli
(14aminoacidi),l'AF12505,fudimerizzato,mediantelegame
covalente ad un residuo di lisina, allo scopo di aumentarne
lapotenza;ildimero(AF13948)cosìottenutoera4.000volte
più potente, rispetto al monomero, nell'attivare le linee
cellulari esprimenti i rTPO e raggiungeva la potenza della
rHuTPO, pur avendo dimensioni pari a circa 1/10 rispetto
ad essa; l'AF13948 dunque, sulla base del peso molecolare,
si rivelava 10 volte più potente rispetto alla rHuTPO.
L'incremento di potenza del dimero, rispetto al monomero,
suffragaulteriormenteilruolodelladimerizzazionedelrTPO
nel meccanismo d'azione di questi peptidi. L'AF13948 era,
inoltre, in grado di stimolare in vitro la proliferazione delle
celluleprogenitricimidollarielamaturazionedimegacariociti
umani, nonché di innalzare la conta delle PLT in modelli
animali44,45.
QuasicontemporaneamenteKimuraetal.46,inGiappone
(Hokuriku Seiaku Research and Development Division,
Katsuyama, Fukui), isolarono una famiglia di peptidi molto
simili, sia per la struttura, che per la capacità di attivare il
rTPO, ad una delle due famiglie descritte da Cwirla e
collaboratori44.
A distanza di circa due anni, nel 1999, l'AF13948 fu
modificato, con una sostituzione aminoacidica, ottenendo
l'AF15075, il quale fu poi coniugato con una frazione di
polietilenglicole di 20 kDa, allo scopo di ridurne
l'immunogenicità in vivo, dando luogo al peptide pegilato
GW395058. Il GW395058 fu impiegato in studi pre-clinici
su modelli animali, ottenendo risultati favorevoli sia sotto
il profilo dell'immunogenicità, che per l'effetto
trombopoietico, anche se la risposta ematologica differiva,
a parità di dose, nelle varie specie animali16,47-49. Questi
peptidi non hanno comunque superato la fase di
sperimentazione pre-clinica.
L'AMG 531, il nuovo agente TPO mimetico prodotto
dallaAmgen (Oncology Development, Thousand Oaks,
CA, USA), nasce invece dalla combinazione tra peptidi e
anticorpi ed è anche conosciuto come peptibody; questa
proteina è, infatti, costituita da una sequenza random di
peptidi, che attivano il rTPO, coniugata ad un dominio
carrier,costituitodalframmentoFcdelleimmunoglobuline,
che ha la funzione di aumentare l'emivita del farmaco in
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
prolonging the half-life of the drug in the circulation. The
peptide sequence has no homology with endogenous TPO
but nevertheless has, in common with this, the ability to
bind to the rTPO, giving rise to potent stimulation of
megakaryocytopoiesis in vitro. This translates in vivo, 35 days after parenteral administration (intravenous or sc),
into a dose-dependent increase in the PC; the latency in
the response is similar to that for other rTPO ligands and
reflects the time necessary for megakaryocytes to complete
cytoplasmic and nuclear maturation and to produce
platelets. The tolerability, after parenteral administration to
healthy volunteers in a phase I study, was found to be
good. The different amino acid composition, compared to
endogenous TPO, limits the problem of the development
of antibodies against TPO50-52.
In 2003 Bussel and colleagues presented the results of
a phase I/II (dose-finding/safety) trial onAMG 531. This
study enrolled pre- and post-splenectomy adults with ITP
and a PC <30x109/L, if untreated, or <50x109/L,ifreceiving
steroid therapy; the median PC was 11x109/L. Six cohorts
of four patients were treated with different doses ofAMG
531(0.2,0.5,1,3,6and10µg/kg);thesubjectswereobserved
for 15 days after the first dose and then a second dose was
given on day 15 or day 22 unless the PC had not exceeded
50x109/L. The patients were followed-up for 8 weeks after
the last dose of AMG; no anti-AMG 531 or anti-TPO
antibodies were detected. The most frequently found side
effect was a mild to moderate headache. With the dose of
3 µg/kg eight of 12 patients (67%) reached a PC >50x109/L,
which was at least double their baseline values, and five
out of these eight responders (63%) had a PC >150x109/L53.
In 2004 Kuter et al. presented the results of a phase II
trial in 21 patients with ITP, who had a median PC of
16x109/L prior to treatment withAMG 531. The patients
were treated with weekly doses of 1 µg/kg or 3µg/kg for 6
weeks and then followed-up for a further 6 weeks; the aim
was to reach a PC between 50 and 450x109/L. The median
time to a response was 8 days; 7/8 patients (88%) treated
with the lower dose reached the target PC, compared to
3/7 (38%) in the group treated with the higher dose; in this
latter group the PC in another two patients exceeded the
level of 450x109/L. The treatment was interrupted early in
three of the 21 patients: in two because of an excessive rise
inthePCoverthelimitof450x109/Landinone,inthegroup
treated with placebo, because of intracranial haemorrhage.
No changes were found in the monitored haematological
parameters, coagulation tests or clinical chemistry.
Headache, occurring in 29% of the patients, was confirmed
to be the main side effect.
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
circolo. La sequenza peptidica non ha alcuna omologia con
la TPO endogena e ha, in comune con essa, la capacità di
legarsi al rTPO, dando luogo ad una potente stimolazione
della megacariocitopoiesi in vitro. Questo si traduce in
vivo, dopo 3-5 giorni dalla somministrazione parenterale
(endovenosa o sc), in un incremento dose-dipendente della
CP; la latenza nella risposta è simile a quella di altri ligandi
del rTPO e riflette il tempo necessario ai megacariociti per
completare la maturazione citoplasmatica e nucleare e
produrre le PLT; la tollerabilità, dopo somministrazione
parenterale a volontari sani in uno studio di fase I, si è
rivelata buona; la diversa composizione aminoacidica
rispetto alla TPO endogena ha limitato il problema
dell'insorgenza di anticorpi anti-TPO50-52.
Nel 2003 Bussel e collaboratori hanno presentato un
trial di fase I/II (dose-finding/safety) sull'AMG 531. Questo
studio riguardava adulti con PTI pre- e post-splenectomia
con CP <30x109/L, se non trattati, o <50x109/L,seinterapia
steroidea; la CP mediana era pari a 11x109/L; 6 coorti di 4
pazienti furono trattati con dosi diAMG 531 differenziate
(0,2;0,5;1;3;6e10µg/kg);dopolaprimasomministrazione,
seguì un'osservazione di 15 giorni e un'ulteriore dose, al
15° o 22° giorno, a meno che la CP non avesse superato
50x109/L.Ipazientisonorimastiinfollow-upper8settimane
dopol'ultimasomministrazionediAMG;nonèstatarilevata
l'insorgenzadianticorpianti-AMG531oanti-TPO;l'effetto
collateralepiùfrequentementeriscontratoèstataunacefalea
da lieve a moderata. Con la dose di 3 µg/kg 8/12 pazienti
(67%) hanno raggiunto una CP >50x109/L, e comunque
raddoppiata rispetto ai valori di base, e 5/8 dei responder
(63%)unaCP>150x109/L53.
Nel 2004 Kuter et al. hanno presentato un trial di fase
II in 21 pazienti con PTI, con CP mediana, prima del
trattamentoconAMG531,paria16x109/L;ipazientifurono
trattati con dosi settimanali di 1 µg/kg o 3 µg/kg per 6
settimane e poi seguiti per ulteriori 6 settimane; l'obiettivo
eraquellodiraggiungereunaCPtra50e450x109/L;iltempo
mediano di risposta fu di 8 giorni; 7/8 pazienti (88%) trattati
con il dosaggio inferiore raggiunsero la CP target, rispetto
a 3/7 (38%) nel gruppo trattato con dosaggio superiore; in
quest'ultimo gruppo addirittura altri 2 pazienti superarono
il limite di 450x109/L. Il trattamento fu interrotto
precocemente in 3 pazienti su 21: in 2 per eccessivo rialzo
della CP oltre il limite di 450x109/Leinuno,appartenenteal
gruppo trattato con placebo, per emorragia intracranica.
Nonfuronoriscontratealterazionideiparametriematologici
e dei test di coagulazione o di chimica clinica monitorati; la
cefalea, riscontrata nel 29% dei pazienti, si confermava
l'effetto collaterale principale e, anche in questo studio,
273
GM Liumbruno et al
In this study, too, no development of anti-AMG 531 or
anti-TPO antibodies was detected54. Contemporaneously,
Newland et al. presented another phase I study in which
fourcohortsoffourpatientswithITP(withaPC<30x109/L,
ifuntreated,or<50x109/L,ifreceivingsteroidtherapy)were
treated with two single doses of 30, 100, 300 or 500 µg
AMG 531, repeated after 15 days, or 22, if the PC on day 15
was >50x109/L; the patients were followed-up for 8 weeks
after the last dose. The aim was to double the baseline PC
and to reach a PC between 50 and 450x109/L. This study,
which confirmed the previous findings of tolerability and
lack of immunogenicity ofAMG 531, suggested dosing the
drug according to the weight of the patient and identified
the dose of >1µg/kg as the most appropriate for increasing
the PC in patients with ITP55. More information on the side
effects of long-term treatment are beginning to emerge,
albeit in abstract form, presented at theAmerican Society
of Hematology Congress in December 2005 and at the IX
European Symposium on Platelet and Granulocyte
Immunobiology,heldinJune2006.AMG531,afterabout3
years of trials and almost 200 patients treated with
favourable outcomes, has shown good efficacy in patients
with ITP, in whom it has produced stable responses lasting
more than 48 weeks; indeed, there are now patients who
have been receiving long-term weekly sc maintenance
therapy for about 2 years. In the context of a generally
good tolerability and safety profile, the most frequently
reported side effects are bone pain and headache in a flulike syndrome, worsening thrombocytopenia in three cases,
a rise in lactate dehydrogenase level in one case and a few
cases of myelofibrosis, reversible 3 months after
interrupting treatment, in patients treated long-term. The
formation of reticulin has been attributed to the production
of cytokines by the megakaryocytes accumulated in the
bone marrow. No cases of antibody formation have been
reported56-59.
Following the favourable results of the first trials in
patients with ITP, interest has also been given to
thrombocytopeniarelatedtolymphomas,solidtumoursand
MDS. At present there are 11 trials involving AMG 531
listed in one of the main public international registries,
which covers the role of a worldwide archive of clinical
trials, that is, the registry of the "National Institutes of
Health" in the USA. Two trials in ITPstarted in 2005 have
been completed: one was a phase I/II study, the other a
phase II study. Enrolment in three phase III trials in ITP,
begun in 2005, has been closed; one is an extension study
on patients already enrolled in previous trials, the second
involves patients refractory to splenectomy, while the third
274
non fu rilevata l'insorgenza di anticorpi anti-AMG 531 o
anti-TPO54.
Contemporaneamente Newland et al. presentarono un
altro studio di fase I nel quale 4 coorti di 4 pazienti con PTI
(conCP<30x109/L,senontrattati,o<50x109/L,seinterapia
steroidea) venivano trattate con 2 singole dosi di AMG
531,paria30,100,300o500µg,daripetersidopo15giorni,
oppure22,selaCPal15°giornoera>50x109/L;dopol'ultima
somministrazione seguiva un follow-up di 8 settimane.
L'obiettivo era quello di raddoppiare la CP di base e
raggiungere valori di PLTtra 50 e 450x109/L. Questo studio
confermava quanto già evidenziato in tema di tollerabilità e
immunogenicità, suggeriva di dosare il farmaco in base al
peso e individuava nella posologia >1µg/kg la più idonea
ad aumentare le PLT nei pazienti con PTI55. Maggiori
informazioni sugli effetti collaterali del trattamento a lungo
termine cominciano a intravedersi in lavori, anche se sotto
forma di Abstracts, presentati al Congresso del dicembre
2005dell'AmericanSocietyofHematologyealIXSimposio
Europeo sull'Immunobiologia Piastrinica e Leucocitaria,
tenutosi nel giugno 2006. L'AMG 531, dopo circa tre anni
di trials e quasi 200 pazienti trattati con esito favorevole,
ha mostrato una buona efficacia nei pazienti con PTI, nei
quali ha prodotto una risposta stabile nel tempo per oltre
48 settimane; ci sono attualmente pazienti in terapia di
mantenimento settimanale sc a lungo termine da circa 2
anni. Tra gli effetti indesiderati segnalati, pur nell'ambito di
una buona tollerabilità e sicurezza, i più frequenti sono
dolori ossei e cefalea tipo flu-like syndrome, aggravamento
della piastrinopenia in 3 casi, innalzamento dell'LDH in un
caso e pochi casi di mielofibrosi reversibile, dopo 3 mesi
dall'interruzione della terapia, in pazienti trattati a lungo
termine. La formazione di reticolina è stata imputata alla
produzione di citochine da parte dei megacariociti
accumulatisi a livello midollare; non sono stati segnalati
casi di insorgenza di anticorpi56-59.
Dopo i risultati favorevoli, registrati nei primi trials su
pazienti con PTI, l'interesse si è spostato anche verso la
piastrinopenia correlata a linfomi, tumori solidi e SMD.
Attualmente, l'elenco dei trials sull'AMG 531, reperibile in
unodeiprincipaliregistriinternazionalipubblici,chericopre
il ruolo di archivio globale delle sperimentazioni cliniche,
cioè il registro dell'NIH (National Institutes of Health) degli
USA, comprende 11 trials. Sono stati completati 2 trials
iniziati nel 2005 nella PTI, dei quali uno di fase I/II e uno di
fase II. Hanno chiuso l'arruolamento tre trials di fase III
nella PTI, iniziati nel 2005: uno riguardava uno studio di
prolungamento su pazienti già arruolati in precedentitrials,
il secondo riguardava pazienti refrattari alla splenectomia,
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
is being conducted on patients who have not yet been
splenectomised. Six trials are still recruiting patients: a) one
phase I/II trial on patients treated with carboplatin for
(advanced stage) cancer of the gastrointestinal tract,
genito-urinary apparatus, gynaecological system or head
and neck: this trial began inAugust 2005 and aims to enrol
18 patients; b) one phase I/II trial in patients with nonHodgkin’s lymphoma, started in March 2006, which aims
to enrol 36 patients; c) four phase II trials: one on Japanese
patients with ITP, started in February 2006 and intended to
enrol 16 patients; one on patients with relapsed aggressive
lymphoma started in January 2006; one on patients with
low- to moderate-risk MDS, started in January 2006 and
aiming to enrol 55 patients; and, finally, one on patients
with MDS treated with hypomethylating drugs, started in
August 200660.
The latest peptide agonist to appear on the scene is a
pegylated molecule produced by Johnson & Johnson
(Pharmaceutical Research and Development, Beerse,
Belgium). Cerneus and colleagues recently presented the
results of a phase I study conducted in 40 healthy
volunteers who were randomised to receive a single dose
of the drug as an intravenous bolus; the doses investigated
were 0.375, 0.75, 1.5, 2.25 and 3µg/kg; the increase in PC
peaked 10-12 days after the injection, then returned to
baseline values after 3-4 weeks. The mean values of the
peak PC ranged from 315x109/L, with the lowest dose, to
685x109/L, with the highest dose. The only side effects
seen were headache and fatigue. There were no reports of
the development of specific antibodies61.
mentre il terzo è stato condotto su pazienti non ancora
splenectomizzati. Sei trials stanno ancora arruolando
pazienti: a) 1 trial di fase I/II su pazienti trattati con
carboplatino per neoplasie (in stadio avanzato)
gastrointestinali, genito-urinarie, ginecologiche o della testa
e del collo: questo trial è iniziato nell'agosto 2005 e prevede
di arruolare 18 pazienti; b) un trial di fase I/II in pazienti
con linfoma non-Hodgkin, iniziato nel marzo 2006 e che
prevede di arruolare 36 pazienti; c) quattro trials di fase II:
1 su pazienti giapponesi con PTI, iniziato nel febbraio del
2006 e che prevede di arruolare 16 pazienti; 1 su pazienti
con linfoma aggressivo recidivante, iniziato nel gennaio
2006;1supazientiaffettidaSMDarischiobasso-intermedio,
iniziato nel gennaio 2006 e che prevede di arruolare 55
pazienti; 1 su pazienti affetti da quest'ultima patologia e
trattati con farmaci ipometilanti, iniziato nell'agosto 200660.
L'ultimo agonista peptidico apparso sulla scena è una
molecola pegilata prodotta dalla Johnson & Johnson
(Pharmaceutical Research and Development, Beerse,
Belgio). Cerneus e collaboratori hanno recentemente
presentato i risultati di uno studio di fase I su 40 volontari
sani randomizzati a ricevere una singola dose in bolo
endovenoso; i dosaggi esplorati erano 0,375; 0,75; 1,5; 2,25
e3µg/kg;ilpiccodiinnalzamentodellaCPvenivaraggiunto
dopo 10-12 giorni, per poi ritornare ai valori di base dopo 34 settimane. I valori medi del picco piastrinico variavano da
315x109/L, con la dose inferiore, a 685x109/L, con la dose
superiore. Gli effetti collaterali riscontrati erano solo cefalea
e fatigue; non è stata segnalata l'insorgenza di anticorpi
specifici61.
Non-peptidyl agonists
Gli agonisti non-peptidici
The non-peptidyl agonists of rTPO are small organic
molecules which, compared to the peptide agonists, have
the advantages of oral bioavailability and of being highly
unlikely to cause immunogenicity62.
The screening strategies for these molecules are based
on functional tests on cell lines that express the functioning
receptor; the compounds found to be active on the receptor
are then evaluated with in vitro and in vivo biological tests.
The main difference with respect to the PD technique –
which identifies peptides that bind to the receptor, but that
may not have the desired biological activity – is that the
molecules identified with the functional tests, besides being
ligands for the specific receptor, have the desired biological
activity, that is, the ability to activate the receptor43.About
1 year after the synthesis of the two families of peptide
agonists of rTPO by Cwirla et al. 44, it was again Kimura
Gli agonisti non-peptidici del rTPO sono piccole
molecole organiche che, rispetto a quelli peptidici, hanno il
vantaggio della biodisponibilità orale e dell'improbabile
immunogenicità62.
Le strategie di screening di queste molecole sono basate
su test funzionali su linee cellulari che esprimono il recettore
funzionante; i composti identificati come attivi sul recettore
vengono successivamente valutati con test biologici in
vitro e in vivo. La differenza principale rispetto alla tecnica
del PD - che permette di identificare peptidi che, pur
legandosi al recettore, possono non avere l'attività
biologica desiderata - è che le molecole identificate con i
test funzionali, oltre ad essere ligandi dello specifico
recettore, hanno l'attività biologica ricercata, cioè la capacità
di attivarlo43. Dopo circa un anno dalla sintesi, da parte di
Cwirla etal,delle2famigliediagonistipeptidicidelrTPO44,
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
275
GM Liumbruno et al
and colleagues in Japan who demonstrated in vitro on cell
lines that two non-peptidyl molecules derived from
benzodiazepineswereabletocompetewithTPOforbinding
to the rTPO and that one of these stimulated, in vitro, the
proliferation of a human leukemic cell line which expresses
rTPOandis,therefore,sensitivetohumanTPO(UT-7/TPO).
This demonstrated for the first time that also non-peptidyl
compounds that bind to rTPO can act as TPO-mimetics63.
In2001,Duffyetal.(GlaxoSmithKline,Collegeville,PA,
USA) demonstrated that non-peptidyl molecules with a
molecular weight below 500 Da, derived from
hydrazinonaphthalene and azonaphthalene, acted as
TPO-mimetics on cell lines in vitro64. The following year,
the same researchers identified the pharmacophores, that
is, the critical regions responsible for the pharmacological
action of some non-peptidyl molecules with TPO-like
activity, derived from thiosemicarbazone and from
naphthimidazole65,66.
These molecules have not, however, been shown to be
able to produce platelets in in vivo animal models and have
not yet overcome the pre-clinical phase of development,
despite intense research, also focused on identifying the
relationship between the molecular structure and biological
activity. Recently, the three elements essential for a
pharmacophore with potent TPO antagonist activity were
identified in a series of small molecules, derived from
benzimidazole, which are active in vitro on TPO-sensitive
cell lines. These three elements are a lipophilic domain and
an acidic moiety on the opposite end of the molecule,
separated by a heteroatom metal chelate in the central
portion67.
Inagaki and colleagues68 were the first, in July 2004, to
describe a non-peptidyl molecule with in vivo TPO-like
activity in animal models. This molecule, synthesised in
Japan by the "Japan Tobacco Inc. Central Pharmaceutical
ResearchInstitute"inOsaka,wasnamedJTZ-132andfrom
a chemical point of view is an (S)-7-hydroxyimino-3-(3methyl-[1, 2, 4]oxadiazol-5-yl)-5-propyl-4, 5, 6, 7tetrahydrobenzo[c]thiophene-1-sulphonamide. This rTPO
agonist was identified by screening, in cell proliferation
tests, a library of over 100,000 chemical compounds; the
UT-7/TPO cell line was used for this purpose. JTZ-132 was
shown to be able to stimulate, in vitro, the growth and
differentiation of both murine and human megakaryocytic
progenitor cells; furthermore, after sc administration, it was
abletostimulatemegakaryocytopoiesisandthrombopoiesis
in vivo, in two different murine models in which
myelosuppression was induced by X-ray irradiation or by
bulsulphan treatment. It was also demonstrated that JTZ-
276
ancora Kimura e collaboratori, in Giappone, hanno
dimostrato, su linee cellulari in vitro, che due molecole
non-peptidiche, derivate dalle benzodiazepine, sono in
grado di competere con la TPO per il legame con il rTPO e
che una di queste stimolava, in vitro, la proliferazione di
una linea cellulare di leucemia umana, che esprime il rTPO
edèpertantosensibileallaTPO umana (UT-7/TPO): questo
testimoniava, per la prima volta, che anche un composto
non-peptidico, legandosi al rTPO, poteva fungere da
TPO-mimetico63.
Nel 2001 Duffy et al. (GlaxoSmithKline, Collegeville,
PA, USA) hanno dimostrato che molecole non-peptidiche
di peso molecolare inferiore a 500 Da, derivate
dall'idrazinonaftalene e dall'azonaftalene, agivano da TPOmimetici su linee cellulari in vitro64. L'anno successivo gli
stessiAutori hanno identificato i farmacofori, cioè le regioni
critiche responsabili dell'azione farmacologica, di alcune
molecole non-peptidiche con attività TPO-mimetica,
derivate del tiosemicarbazone e del naftimidazolo65,66.
Queste molecole non hanno però dimostrato di essere
in grado di produrre PLT in modelli animali in vivo e, a
tutt'oggi, non hanno ancora superato la fase di sviluppo
pre-clinico, nonostante l'intensa ricerca sviluppatasi, anche
per identificare il rapporto tra struttura molecolare e attività
biologica. Recentemente, in una serie di piccole molecole
derivate del benzimidazolo, attive in vitro su linee cellulari
TPO sensibili, sono stati identificati i tre elementi essenziali
per un farmacoforo con potente attività TPO-agonista: un
dominio lipofilo e una frazione acida dalla parte opposta
della molecola, separati da un eteroatomo metallo-chelato
nella parte centrale67.
Inagaki e colleghi68 sono stati i primi, nel luglio 2004,
a descrivere una molecola non-peptidica con attività
TPO-mimetica,invivo,sumodellianimali.Questamolecola
è stata sintetizzata in Giappone dal "Japan Tobacco Inc.
Central Pharmaceutical Research Institute" di Osaka, è stata
denominata JTZ-132 e, dal punto di vista chimico, è un
(S)-7-idrossimino-3-(3-metil-[1, 2, 4]ossadiazolo-5-yl)-5propil-4, 5, 6, 7-tetraidrobenzo[c]tiofene-1-sulfonamide.
Questo agonista del rTPO è stato identificato selezionando,
intestdiproliferazionecellulari,unalibreriadioltre100.000
composti chimici; a questo scopo è stata utilizzata la linea
cellulare UT-7/TPO. Lo JTZ-132 si è rivelato in grado di
stimolare, in vitro, la crescita e la differenziazione di cellule
progenitricimegacariocitarieditopoeumane;inoltreèstato
in grado di stimolare, dopo somministrazione sc, la
megacariocitopoiesi e la trombopoiesi in vivo, in 2 diversi
modelli animali di topi, nei quali veniva indotta una
mielosoppressioneconirradiazionemedianteraggi-X,ocon
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
132 activates rTPO in the same way as endogenous TPO
does, that is, through phosphorylation of the receptor,
which subsequently triggers the complex cascade of
intracellularsignals.Inthese in vivoexperimentsanincrease
in red cells was also seen, presumably due to the supportive
role that TPO plays in erythropoiesis and, therefore,
reflecting the TPO-like activity of the molecule68.
Inthemeantime,Erickson-Milleretal.(GlaxoSmithKline)
had described SB 394725, a derivative of hydrazine with a
molecular weight of 424.5 Da, identified from among cell
lines sensitive to TPO (UT-7/TPO and BAF-3/TPO). In
vitro, this molecule behaves as an agonist of the rTPO,
stimulating megakaryocytopoiesis and platelet production
but, unlike JTZ-132, it is specific for platelets from human
and chimpanzees62.
The same species specificity was subsequently found
in another compound with a molecular weight of 442 Da,
SB-497115; this molecule, like the others, was obtained
bysearchingalibraryof260,000smallmoleculeswithaTPOsensitive cell line (BAF-3/TPO). In this way a class of TPOmimetic molecules was identified: the diazonaphthalene
sulphonic acids. These were subsequently chemically
modified giving rise to a series of biphenyl carboxylated
compounds with excellent pharmacokinetic properties and,
aboveall,oralbioavailability.SB-497115(eltrombopag)was
then selected from over 200 analogues to be used in clinical
studies, because of its excellent results in cell proliferation
tests with the BAF-3/TPO and UT-7/TPO cell lines, and its
markedcapacitytostimulatemegakaryocytedifferentiation
in cultures of human bone marrow cells69-72. Furthermore,
SB-497115, unlike rHuTPO, does not cause activation of
platelets73. Jenkins et al. used eltrombopag in a phase I
trial on 72 healthy male volunteers in the United Kingdom.
The drug, in oral capsules, was administered once on the
firstdayandthen(afteraweekofwashout)dailyfor10 days;
various doses were used: 5, 10, 20, 30, 50, and 75 mg/die.
Eltrombopag was well tolerated and the most frequently
reported side effect was mild to moderate headache. Doses
from 30 mg/die upwards for 10 days caused a dosedependent increase in the PC; the maximum peak increase
in platelet numbers occurred between day 14 and day 16,
and,followingthedoseof75mg/die,itsmeanvaluereached
357x109/L, with the mean increase being 118x109/L. The
safety, pharmacokinetics and pharmacodynamic properties
of the drug would allow research on its use to be extended
to productive plateletpheresis58,74,75.
Eltrombopag is currently the object of five different
international, multicentre trials for which enrolment is still
underway. In February 2005 a phase II trial intending to
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
trattamento con busulfano. Gli Autori hanno anche
dimostrato che lo JTZ-132 attiva il rTPO in modo analogo
alla TPO endogena, mediante la fosforilazione del
recettore, che successivamente innesca la complessa
cascata di segnali intracellulari. In questi esperimenti in
vivo è stato rilevato anche un aumento dei globuli rossi,
riferibile al ruolo di supporto che la TPO esprime nei
confronti dell'eritropoiesi, e che riflette, dunque, l'attività
TPO-mimetica della molecola68.
NelfrattempoErickson-Milleretal.(GlaxoSmithKline),
avevano descritto l'SB 394725, un derivato dell'idrazina del
peso molecolare di 424,5 Da, identificato vagliando linee
cellularisensibiliallaTPO(UT-7/TPOeBAF-3/TPO).Questa
molecola si comporta in vitro come agonista del rTPO,
stimolando megacariocitopoiesi e piastrinopoiesi, ma, a
differenzadelloJTZ-132,haunaspecificitàdispecielimitata
alle PLTumane e di scimpanzé62.
La medesima specificità di specie è stata
successivamente riscontrata anche in un altro composto
delpesomolecolaredi442Da,l'SB-497115;questamolecola,
analogamente alle altre, è stata ottenuta selezionando una
libreria di 260.000 piccole molecole con una linea cellulare
TPO sensibile (BAF-3/TPO). In questo modo è stata
inizialmente identificata una classe di molecole TPOmimetiche:gliacididiazonaftalensulfonici.Questiultimisono
stati successivamente modificati chimicamente, originando
una serie di composti bifenil carbossilati, con parametri
farmacocineticiottimalie,soprattutto,biodisponibilitàorale.
L'SB-497115 (eltrombopag), è stato quindi selezionato, tra
oltre 200 analoghi, per essere sottoposto a studi clinici,
grazie alla sua ottimale risposta nei test di proliferazione
cellulare,conlelineeBAF-3/TPOeUT-7/TPO,eall'elevata
capacità di stimolare la differenziazione dei megacariociti,
incolturedicellulemidollariumane69-72.L'SB-497115inoltre,
a differenza della rHTPO, non determina attivazione delle
PLT73. Jenkins et al. hanno utilizzato l'eltrombopag in un
trial di fase I su 72 volontari maschi sani nel Regno Unito.
Il farmaco, in capsule orali, è stato somministrato una volta
il primo giorno e poi (dopo una settimana di washout)
quotidianamente per 10 giorni; sono stati impiegati vari
dosaggi: 5, 10, 20, 30, 50, 75 mg/die. L'eltrombopag è stato
ben tollerato e l'effetto collaterale più frequentemente
descritto è stato una cefalea lieve-moderata. Le dosi da 30
mg/die in su per 10 giorni determinavano un aumento dosedipendente della CP; il picco massimo di aumento delle
PLT si verificava tra il 14° e 16° giorno e si attestava, per il
dosaggio di 75 mg/die, su valori medi di 357x109/L, con un
incrementomedioparia118x109/L.Lasicurezzadelfarmaco,
la farmacocinetica e la farmacodinamica potrebbero fare
277
GM Liumbruno et al
enrol 422 patients with thrombocytopenia and HCV-related
hepatitis was started; another phase II trial, opened inApril
2005 for patients with advanced stage solid tumours treated
withthree-weeklycyclesofcarboplatinandplaclitaxel,plans
to recruit 164 patients.Also inApril 2005 a phase II/III trial,
on patients with refractory ITP, was started: 99 patients
should be enrolled in this study. One year after this study,
recruitment started for an observational phase I study on
the tolerability and safety of an oral dose of 50 mg/die in
healthy volunteers and in patients with mild, moderate and
severe liver failure. This study aims to enrol 32 volunteers.
Finally, in June 2006, the EXTEND study (Eltrombopag
eXTENded Dosingstudy) was started: this is a continuation
study aimed at enrolling 200 patients with ITP already
recruited in previous trials on eltrombopag60.
A phase II multicentre trial on SB-497115 is currently
underway in Italy in which doses of 50, 75 and 100 mg are
being administered to cancer patients treated with multiple
cycles of chemotherapy. Meanwhile, another multicentre
phase II study, using the same drug administered to patients
with ITP, at doses of 30, 50 and 75 mg once daily for 6
weeks, is currently awaiting approval76.
In 2004, Kalota and colleagues (GlaxoSmithKline)
presented another molecule, derived from hydrazone, with
in vitro TPO-mimetic activity: SB559457. The pre-clinical
data on this small molecule have provided the rationale for
evaluating it, and its related analogues, in clinical studies77.
In fact, in June 2005, GlaxoSmithKline and its partner
company, Ligand Pharmaceuticals (San Diego, CA, USA),
announced the start of clinical development for SB-559448,
which is currently being used in phase I trials19,78.
Research carried out in Japan in the last two years has
produced three other non-peptidyl agonists of rTPO, which
are still in the phase of pre-clinical development.
Suzuki et al. (Drug Discovery Research, Astellas
PharmaInc.Tsukuba,Ibraki)havedescribedYM477,anew
molecule which is active when administered orally and, as
evaluated in in vivo animal models, is species-specific for
humans and chimpanzees79.
Nakamura and colleagues (Biological Research
Laboratories, Nissan Chemical Industries, Saitama), who
had previously synthesised SB-497115 by screening a
library of about 50,000 molecules on TPO-sensitive cell
lines, synthesised NIP-004, or the molecule of 5-[(2-{1-[5(3,4-dichlorophenyl)-4–hydroxy-3thienyl]ethylidene}hydrazino)carbonyl]-2thiophenecarboxylic acid.
This compound has a molecular weight of 455 Da and a
strong specificity for the human species. NIP-004 has
278
estendere la ricerca anche al settore della piastrinoaferesi
produttiva58,74,75.
L'eltrombopag è attualmente oggetto di cinque diverse
sperimentazioni multicentriche internazionali, per i quali è
ancora in corso l'arruolamento. Nel febbraio 2005 è iniziato
un trial di fase II, che si propone di arruolare 422 pazienti
con piastrinopenia e epatite HCV-correlata; un altrotrial di
fase II, iniziato nell'aprile 2005 e rivolto a pazienti con
neoplasie solide in fase avanzata, trattati con cicli
trisettimanali di carboplatino e placlitaxel, mira a reclutare
164 pazienti. Nell'aprile 2005 è stato, inoltre, intrapreso un
trial di fase II/III, su pazienti con PTI refrattaria, con
l'obiettivo di arruolare 99 pazienti.Adistanza di un anno da
quest'ultimo studio, è iniziato il reclutamento per una
sperimentazione osservazionale di fase I, su tollerabilità e
sicurezza della dose orale di 50 mg/die, in volontari sani e
pazienti con insufficienza epatica lieve, moderata o grave.
Questo studio ha l'obiettivo di arruolare 32 volontari. Infine,
nel giugno 2006, è stato dato inizio allo studio EXTEND
(Eltrombopag eXTENded Dosing study): si tratta di uno
studio di proseguimento che mira ad arruolare 200 pazienti
con PTI già reclutati per precedenti trials su eltrombopag60.
Attualmente, in Italia, è in corso un trial multicentrico
difaseIIsull'SB-497115,somministratoalladosedi50,75e
100 mg a pazienti oncologici, trattati con cicli multipli di
chemioterapia; è invece in attesa di approvazione un altro
studio multicentrico di fase II sul medesimo farmaco,
somministrato a pazienti con PTI, alle dosi di 30, 50 e 75 mg
una volta al giorno per 6 settimane76.
Kalotaecollaboratori(GlaxoSmithKline)nel2004hanno
presentato un'altra molecola, derivata dall'idrazone, con
attivitàTPO-mimeticainvitro:l'SB559457.Idatipre-clinici
di questa piccola molecola hanno fornito il razionale per la
valutazione della stessa, o di suoi analoghi consimili, in
studiclinici77.Infatti,nelgiugno2005,laGlaxoSmithKlinee
la sua azienda partner, la Ligand Pharmaceuticals (San
Diego, CA, USA), hanno annunciato l'avvio dello sviluppo
clinicoperl'SB-559448,cheattualmenteèutilizzatointrials
di fase I19,78.
Dalla ricerca condotta nell'ultimo biennio in Giappone
provengono altri 3 agonisti non-peptidici del rTPO, i quali
sono ancora nella fase di sviluppo pre-clinico.
Suzuki et al. (Drug Discovery Research, Astellas
Pharma Inc.Tsukuba, Ibraki) hanno descritto l'YM477, una
nuova molecola attiva per via orale, dotata di specificità di
specie per l'uomo e lo scimpanzé, valutatain vivoin modelli
animali79.
Nakamuraecolleghi(BiologicalResearchLaboratories,
Nissan Chemical Industries, Saitama), che avevano
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
shown TPO-agonist activity in vitro and in vivo after sc
administration, in mice subjected to xenotransplantation
and, therefore, able to produce human platelets80-82.
Finally, using proliferation tests on the UT-7/TPO cell
line, Sakai and the same Nakamura and their colleagues
selected strains of a marine fungus, Basipetospora sp.; in
this way they identified four molecules, derived from
xanthocillin X, which showed agonist activity for rTPO in
the in vitro studies conducted,83.
Antibodies
Oneoftheapproachesaimedatovercomingtheproblem
of the immunogenicity of recombinant TPO is that of
producing agonist antibodies, which dimerise the receptor
and cause signal transduction at the level of the target
cell84,85. In 1998 Deng et al. produced a murine monoclonal
antibody, named BAH-1, against the rTPO of human
megakaryoctes, which expressed its agonistic activity by
stimulating megakaryocytopoiesis in vitro. This bivalent
antibody dimerised the rTPO without, however, binding to
the same site as TPO. Its in vivo stimulation of
megakaryocytopoiesis in animal models was, however,
limited, perhaps because of species specificity86.
In 2003 Su and colleagues (Alexion Pharmaceuticals
Inc.,Cheshire,CT,USA)developedanewclassofmodified
antibodies, which contain a TPO-like peptide inserted into
the variable region. In vitro, these antibodies bound to
rTPO and stimulated the proliferation and differentiation
of megakaryocytes. In vivo, they were able to accelerate
recovery of the PC in animal models of chemotherapyinduced thrombocytopenia. The lack of structural
homology between the peptide introduced into the
antibody and the TPO should reduce the risk of
immunogenicity and cross-reactivity with endogenous
TPO87. This antibody is, however, still in a preclinical stage
of development88.
Orita and colleagues (Chugai Pharmaceutical Co. Ltd.,
Fuji-Gotemba Research Laboratory, Shizuoka, Japan) have
introduced the so-called minibody (MB) agonists of rTPO,
producing these starting from an IgG type antibody to
rTPO89. MB are dimeric antibody fragments, with
dimensions similar to those of the Fab fragment of IgG,
which should dimerise the rTPO more efficiently than the
whole IgG, precisely because of the removal of the possible
steric hindrance between the Fc portion of the IgG and the
receptor; they are produced by genetic engineering and
formed of the variable regions of the heavy chain (VH) and
the light chain (VL) of IgG. MB are divided into diabodies,
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
precedentementesintetizzatoanchel'SB-497115,vagliando
una libreria di circa 50.000 molecole su linee cellulari TPO
sensibili, hanno sintetizzato il NIP-004, ovvero la molecola
dell'acido 5-[(2-{1-[5-(3,4-diclorofenil)-4–idrossi-3tienil]etilidene}idrazino)carbonil]-2- tiofenecarbossilico.
Questo composto ha un peso molecolare di 455 Da e una
stretta specificità per la specie umana. Il NIP-004 ha rivelato
attività TPO-agonista, in vitro e in vivo, dopo
somministrazione sc, in modelli animali, costituiti da topi
sottoposti a xenotrapianto e, pertanto, in grado di produrre
PLTumane80-82.
Sakai e lo stesso Nakamura e i loro collaboratori, infine,
hanno selezionato, con test di proliferazione sulla linea
cellulare UT-7/TPO, dei ceppi di un fungo marino, la
Basipetospora sp.; in questo modo hanno identificato 4
molecole, derivate dalla xantocillina X, che, negli studi in
vitrocondotti,hannomostratoattivitàagonistaperilrTPO83.
Gli anticorpi
Uno degli approcci volti a superare il problema
dell'immunogenicità della TPO ricombinante è stato quello
diprodurreanticorpiagonisti,iqualidimerizzanoilrecettore
e determinano la trasduzione del segnale a livello delle
cellule bersaglio84,85. Nel 1998 Deng et al. hanno prodotto
un anticorpo monoclonale murino, denominato BAH-1,
rivolto contro il rTPO delle cellule megacariocitarie umane,
che esprimeva la sua attività agonista stimolando la
megacariocitopoiesi in vitro. Questo anticorpo bivalente
dimerizzava il rTPO senza però legarsi allo stesso sito della
TPO. La sua attività di stimolo della megacariocitopoiesi in
modelli animali in vivo era però limitata, forse dalla
specificità di specie86.
Nel 2003 Su e collaboratori (Alexion Pharmaceuticals
Inc., Cheshire, CT, USA) hanno sviluppato una nuova
classe di anticorpi modificati, che contenevano un
peptide TPO-mimetico inserito nel contesto della regione
variabile. In vitro, questi anticorpi si legavano al rTPO e
stimolavano la proliferazione e la differenziazione dei
megacariociti. In vivo, erano in grado di accelerare il
recupero della CP in modelli animali di piastrinopenia da
chemioterapia. La mancanza di omologia strutturale, tra il
peptide inserito nell'anticorpo e la TPO, dovrebbe ridurre,
inoltre, il rischio di immunogenicità e cross-reattività con la
TPO endogena87.Atutt'oggi però questo anticorpo è ancora
nella fase di sviluppo preclinico88.
Orita e colleghi (Chugai Pharmaceutical Co. Ltd., FujiGotembaResearchLaboratory,Shizuoka,Giappone)hanno
introdotto i cosiddetti minibody (MB) agonisti del rTPO,
279
GM Liumbruno et al
if the bond between the antibody fragments is not covalent,
and single chain variable region fragment antibodies
[sc(Fv)2], if the fragments are bound covalently90. In vitro,
these MB, both the diabodies and the sc(Fv)2, have shown
an agonistic activity very similar to that of TPO in tests of
proliferation and differentiation on human and monkey
cells,. Furthermore, in the in vivo evaluation on an animal
model, one of these MB, VB22B sc(Fv)2, significantly
increased the PC, without causing the development of
antibodies against endogenous TPO.Another MB, TA136
sc(Fv)2, has shown agonist activity, in vitro, for two types
of mutant rTPO, derived from patients with congenital
amegakaryocytic thrombocytopenia. This finding, besides
demonstrating that the binding site of antibodies to the
rTPO does not necessarily have to be same as that for
endogenous TPO, could suggest that there is a therapeutic
strategy for patients with disorders caused by
dysfunctional receptors89.
It is to be hoped that, in the near future, it will be possible
to demonstrate the therapeutic efficacy of these antibodies
in clinical studies.
Table I reports the new rTPO agonists and their current
stage of clinical development.
Conclusions
After the disappointing clinical debut of recombinant
TPO, more than 10 years after its cloning, the discovery of
peptide and non-peptidyl agonists of rTPO and the
production of modified and unmodified agonist antibodies
seem to be giving a new impulse and fresh hopes for the
pharmacological treatment of thrombocytopenia.
These new therapies appear to be free of the problem
of immunogenicity, which was one of the major reasons for
abandoning the development of recombinant TPO.
The goal of clinical use seems to be approaching for
drugs such asAMG 531 and eltrombopag, which have now
reached phase III trials. Furthermore, the use of these drugs
might be extended beyond ITP to the treatment of
thrombocytopenia secondary to chemotherapy for solid
tumours, MDS and liver failure. Wider clinical
experimentation on these two molecules will also provide
further information on their potential adverse effects.
The discovery of these new drugs has undoubtedly
contributed to improving the understanding of the
biological and molecular mechanisms underlying
thrombopoiesis; the identification of new agonists, with
different chemical structures, is a process that, thanks to
280
producendoli a partire da un anticorpo di tipo IgG contro il
rTPO89. I MB sono, infatti, frammenti anticorpali dimerici,
con dimensioni simili al frammento Fab dell'IgG, che
dovrebbero dimerizzare in modo più efficiente il rTPO
rispetto all'IgG intera, proprio in virtù della rimozione del
possibileimpedimentostericotrailframmentoFcdell'IgGe
il recettore; sono prodotti con tecniche di ingegneria
genetica e sono costituiti dalle regioni variabili della catena
pesante (VH) e della catena leggera (VL) dell'IgG; si
distinguono in diabody, se il legame tra i frammenti
anticorpali è non covalente, e in single chain variable
region fragment antibody [sc(Fv)2], se i frammenti sono
legati in modo covalente90. Questi MB, sia i diabody che
gli sc(Fv)2, hanno mostrato in vitro, in test di proliferazione
e differenziazione su linee cellulari umane e di scimmia,
un'attività agonista molto simile a quella della TPO. Inoltre,
nella valutazione in vivo su modello animale, uno di questi
MB, il VB22B sc(Fv)2, ha aumentato in modo significativo
la CP, senza determinare insorgenza di anticorpi contro la
TPOendogena.UnaltroMB,ilTA136sc(Fv)2,hamostrato,
invece, attività agonista, in vitro, con 2 tipi di rTPO mutati,
derivati da pazienti affetti da trombocitopenia congenita
amegacariocitica; questo, oltre a dimostrare che il sito di
legame degli anticorpi sul rTPO non deve necessariamente
essere lo stesso della TPO endogena, potrebbe fare
intravedere una strategia terapeutica per pazienti con
patologie causate da disfunzioni di recettori89.
È auspicabile che, in un futuro prossimo, sia possibile
dimostrare l'efficacia terapeutica di questi anticorpi anche
in studi clinici.
Nella tabella I sono riepilogati i nuovi agonisti del rTPO
e la loro attuale fase di sviluppo clinico.
Conclusioni
Dopo il deludente esordio della TPO ricombinante sullo
scenario clinico, a oltre 10 anni dalla sua clonazione, la
scoperta degli agonisti peptidici e non-peptidici del rTPO e
la produzione di anticorpi agonisti, modificati e non,
sembrano essere in grado di dare nuovo impulso e nuove
speranze al trattamento farmacologico della piastrinopenia.
Queste nuove terapie sembrano esenti dal problema
dell'immunogenicità,chehagiocatounruolonondisecondo
piano nell'abbandono della TPO ricombinante.
Il traguardo dell'utilizzo clinico sembra essere più vicino
per farmaci come l'AMG 531 e l'eltrombopag, i quali sono
arrivati ormai aitrials di fase III e per i quali sembra potersi
prospettare anche un allargamento dell'impiego, oltre che
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
Thrombocytopenia and new pharmacological treatments
Table I – New rTPO agonists
Class
Name
Phase of clinical
development
Peptide agonists
AMG531 (Amgen)50-60
Pegylated peptide (Johnson & Johnson)61
Phase III trial
Phase I trial
Non-peptidyl agonists
JTZ-132 (Japan Tobacco Inc.) 68
SB-497115 (eltrombopag) (GlaxoSmithKline) 60,69-76
SB-559448 (GlaxoSmithKline)19,77,78
YM477 (Astellas Pharma Inc.)79
NIP-004 (Nissan Chemical Industries)80-82
Xanthocillins 1-4 (Nissan Chemical Industries)83
Pre-clinical development
Phase III trial
Phase I trial
Pre-clinical development
Pre-clinical development
Pre-clinical development
Antibodies against epitopes
of the rTPO
Modified antibody (peptides in the Fab)
(Alexion Pharmaceuticals)87,88
Minibody [diabody and sc(Fv)2] (Chugai Pharmaceuticals)89
Pre-clinical development
Pre-clinical development
genetic engineering and molecular biology, currently seems
almost unstoppable. Besides producing new molecules,
this stimulates the characterization of the different binding
sites and various methods of activating the rTPO, for each
new agonist identified, thus contemporaneously providing
a further impulse to the design and synthesis of new
molecules.
It does, therefore seem that William Osler’s complaint,
made in 1892, of a lack of an efficient, reliable treatment for
purpura, might soon lose its validity after having remained
true (at least in some aspects) for over a century 91.
Acknowledgements
The authors thank ProfessorAlberto Grossi, lecturer at
the School of Specialisation in Haematology at the
University of Florence, for his supervision of this
manuscript.
nella PTI, anche nelle piastrinopenie secondarie a
chemioterapiapertumorisolidi,SMDeinsufficienzaepatica.
Lasperimentazioneclinicaallargatasuquesteduemolecole
contribuirà ad approfondire, inoltre, le informazioni anche
sui possibili effetti collaterali.
La scoperta di questi nuovi farmaci ha sicuramente
contribuito a migliorare la comprensione dei meccanismi
biologici e molecolari alla base della trombopoiesi;
l'identificazione di nuovi agonisti, con strutture chimiche
diverse, è un processo che, grazie all'ingegneria genetica e
alla biologia molecolare, attualmente sembra quasi
inarrestabile. Questo, oltre alla produzione di nuove
molecole, stimola a caratterizzare, per ogni nuovo agonista
identificato, i diversi siti di legame e le varie modalità di
attivazione del rTPO, fornendo contemporaneamente un
ulteriore impulso alla progettazione e sintesi di nuove
molecole.
Sembra dunque che l'affermazione del 1892 di William
Osler,ilqualelamentavalamancanzadiunaterapiaefficace
e affidabile per la porpora, dopo aver mantenuto la sua
validità (seppure limitatamente ad alcuni aspetti), per oltre
un secolo, si stia avviando verso una definitiva
archiviazione91.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Professor Alberto Grossi,
docente alla Scuola di Specializzazione in Ematologia
dell'Università di Firenze, per la supervisione del
manoscritto.
Blood Transfus 2006; 4: 265-84
281
GM Liumbruno et al
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