Gebrauchsinformation
ImmunoCAP ISAC® Assay Kit IgE
ImmunoCAP ISAC® Starter Kit IgE
20-01-02-3-CH
Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/
Marchi despositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradas
Die folgenden Bezeichnungen sind registrierte Warenzeichen der Phadia AB: ImmunoCAP®,
ImmunoCAP ISAC®
Die folgenden Bezeichnungen sind registrierte Warenzeichen der Phadia Multiplexing Diagnostics
GmbH:
ISAC
Die folgenden Bezeichnungen sind registrierte Warenzeichen der CapitalBio Corporation: LuxScan
Referenzen
Siehe Seite 12
Entwickelt von:
Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Donau-City-Strasse 1, A-1220 Wien, Österreich
Ausgabe April 2008
Überarbeitet September 2009
© Phadia AB, Uppsala, Schweden
Seite 2
ANWENDUNGSGEBIET
ImmunoCAP ISAC® ist ein In-vitro-Test zur quantitativen Bestimmung von spezifischen IgEAntikörpern im menschlichen Serum oder Plasma. ImmunoCAP ISAC® ist für die In-vitroDiagnostik in Verbindung mit anderen klinischen Befunden bestimmt und wurde für den Einsatz
durch medizinisches Fachpersonal in klinischen Laboratorien entwickelt.
TESTPRINZIP
ImmunoCAP ISAC® ist ein Festphasen-Immunoassay. Für den Nachweis spezifischer IgEAntikörper werden Allergenkomponenten, die im Mikroarray-Format auf einem festen Träger
immobilisiert wurden, mit humanen Serum- oder Plasmaproben inkubiert. Durch Zugabe eines
Fluoreszenz-markierten anti-humanen IgE-Antikörpers werden die, an die immobilisierten Allergenkomponenten gebundenen spezifischen IgE-Antikörper, nachgewiesen. Die Fluoreszenz wird
mittels eines geeigneten Mikroarray-Scanners gemessen. Die ISAC-Standardeinheiten (ISAC
Standardized Units, ISU) werden ermittelt und die Testergebnisse mit einer speziellen Software
(MIA - Microarray Image Analysis Software) analysiert.
Abb. 1.
Oben links: Schematische
Darstellung der MikroarrayAnordnung der Allergenkomponenten.
Oben rechts: Schematische
Darstellung des Testprinzips.
Allergenkomponenten werden
kovalent an die feste Phase
gebunden. Allergenspezifische
IgE-Antikörper werden durch
Fluoreszenz-markierte antihumane
IgE-Antikörper nachgewiesen.
Unten links: Scan des
Fluoreszenz-Laser-Scanners,
der die unterschiedlichen
Fluoreszenzintensitäten auf einer
Falschfarbenskala farblich von
schwarz (negativ) bis weiss (stark
positiv) darstellt.
Unten rechts: Schematische
Darstellung des ImmunoCAP ISAC®
Patientenberichts.
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REAGENZIEN
Die ImmunoCAP ISAC® Assay Kits oder Starter Kits enthalten 5 Glasträger und alle für die
Testausführung
notwendigen
Reagenzien.
Das
Verfallsdatum,
die
Charge
und
die
Lagertemperatur des jeweiligen Kits sind auf dem äußeren Etikett verzeichnet. Jeder Bestandteil
der Packung ist so lange haltbar, wie es auf dem jeweiligen Etikett angegeben ist.
Das Vermischen von Reagenzien wird nicht empfohlen.
ImmunoCAP ISAC® Starter Kit IgE (Art.-Nr. 81-1001-01)
(für 20 Bestimmungen)
ImmunoCAP ISAC®
5 Glasträger
Gebrauchsfertig
mit je 4
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Analysenfeldern
Verfallsdatum
Bitte den Kit auf Zimmertemperatur
bringen, bevor das Vakuumsiegel
geöffnet wird.
Nach dem Öffnen des Vakuumsiegels
können die Chips für 6 Wochen
aufbewahrt werden, wenn sie trocken,
dunkel und bei 18 – 32°C gelagert
werden.
Komponente A
1 Flasche
(20fach konzentrierter Puffer)
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
200 ml
IgE-Detektionsantikörper
1 Fläschchen
Gebrauchsfertig.
(fluoreszierendes anti-humanes IgE-
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Konjugat) 0,5 ml
Verfallsdatum.
Vor Licht geschützt lagern!
IgE-Kontrollserum
1 Fläschchen
Gebrauchsfertig.
(humanes Serum)
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Natriumazid < 0,1%, 50 µl
Verfallsdatum.
Kontrollserum nicht verdünnen!
Waschschale
2 Schalen für 10
Gebrauchsfertig
Glasträger
Magnetrührstab
2
Gebrauchsfertig
Feuchtkammer
1 Kammer für 26
Gebrauchsfertig
Glasträger
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ImmunoCAP ISAC® Test Kit IgE (Art.-Nr. 81-1000-01)
(für 20 Bestimmungen)
ImmunoCAP ISAC®
5 Glasträger
mit je 4
Analysenfeldern
Gebrauchsfertig
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
Bitte den Kit auf Zimmertemperatur
bringen, bevor das Vakuumsiegel
geöffnet wird.
Nach dem Öffnen des Vakuumsiegels
können die Chips für
6 Wochen aufbewahrt werden, wenn
sie trocken, dunkel und bei 18 – 32°C
gelagert werden.
Komponente A
(20fach konzentrierter Puffer)
200 ml
1 Flasche
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
IgE-Detektionsantikörper
(fluoreszierendes anti-humanes IgEKonjugat) 0,5 ml
1 Fläschchen
Gebrauchsfertig.
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum.
Vor Licht geschützt lagern!
IgE-Kontrollserum
1 Fläschchen
Gebrauchsfertig.
(humanes Serum)
Natriumazid < 0,1%, 50 µl
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum.
Kontrollserum nicht verdünnen!
Sonstige Materialien
Erforderliche Materialien, die nicht von Phadia AB mitgeliefert werden:
•
Messzylinder (1000 ml, 100 ml)
•
Destilliertes Wasser
•
Magnetrührer
•
Pipetten
Y
•
VORSICHTSMASSNAHMEN
Nur zur In-vitro-Diagnostik. Nicht zur inneren und äußeren Anwendung bei Mensch und
Tier.
•
Reagenzien nicht nach dem Verfallsdatum benutzen.
•
Bei der Vorbereitung der Reagenzien und Proben sowie bei der Arbeit mit den Reagenzien
und Proben sollten Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille getragen sowie die
Grundsätze guter Laborpraxis befolgt werden.
•
Diese Kits enthalten Reagenzien, die aus Komponenten menschlichen Blutes hergestellt
wurden. Die Ausgangsbestandteile wurden mittels Immuno-Assay negativ auf das
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Hepatitis-B-Oberflächenantigen sowie negativ auf Antikörper gegen HIV1, HIV2 und
Hepatis-C-Virus getestet. Dennoch sind alle empfohlenen Vorsichtsmassnahmen zum
Umgang mit Blutderivaten zu befolgen. Bitte beachten Sie die Richtlinien der Publikation
Nr. (CDC) 93-8395 des Human Health Service (HHS) oder die lokalen/nationalen
Richtlinien zu den Sicherheitsverfahren für Laboratorien.
•
Achtung! Die Reagenzien enthalten zum Teil Natriumazid als Konservierungsmittel und
müssen mit besonderer Vorsicht behandelt
Sicherheitsdatenblatt von Phadia AB erhältlich.
werden.
Auf
Anfrage
ist
ein
Umgang mit dem ImmunoCAP ISAC®
Verzichten Sie auf eine Kennzeichnung mit wasserlöslichen oder mit lösungsmittelhaltigen Stiften
oder Markern. Andernfalls könnten Rückstände der Kennzeichnung die fluoreszenzbasierte
Analyse des ImmunoCAP ISAC® beeinträchtigen. Zur Kennzeichnung ggf. einen Bleistift
verwenden. Vermeiden Sie während der einzelnen Reaktionsschritte den direkten Kontakt mit der
Oberfläche des ImmunoCAP ISAC®. Achten Sie darauf, dass Sie den ImmunoCAP ISAC®
grundsätzlich nur am Rand des Glasträgers berühren.
VORBEREITUNG DER PROBEN, REAGENZIEN UND DES ZUBEHÖRS
Proben
Für diesen Test können Serum- oder Plasmaproben von venösem Blut oder Kapillarblut verwendet
werden. Die Entnahme der Blutproben erfolgt unter Anwendung des Standardverfahrens. Die
Proben dürfen nur für Transportzwecke bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden. Die
Lagerung sollte für einen Zeitraum von bis zu einer Woche bei 2 – 8°C erfolgen, im Falle einer
längerfristigen Aufbewahrung bei –20°C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Lösung A
Für die Lösung A werden 700 ml einer frischen Lösung (Mischungsverhältnis: 1:20) aus der
Komponente A und destilliertem Wasser zubereitet (665 ml destilliertes Wasser werden zu 35 ml
der Komponente A gegeben). Die Kalkulation der Menge basiert auf 3 Waschschritten mit jeweils
220 ml unter Verwendung der im Starter Kit enthaltenen Waschschalen. Die Menge der Lösung
muss an die verwendeten Behälter angepasst werden.
Detektionsantikörperlösung
Der IgE-Detektionsantikörper ist gebrauchsfertig. Vor Licht schützen und Einfrieren vermeiden.
Feuchtkammer
Legen Sie ein frisches Papiertuch auf den Boden der Feuchtkammer und tränken Sie es mit
destilliertem Wasser. Vermeiden Sie ein Verdunsten der Feuchtigkeit, indem Sie die
Feuchtkammer bis zur weiteren Nutzung geschlossen halten.
ImmunoCAP ISAC®
Geben Sie den ImmunoCAP ISAC® in dem herausnehmbaren Halter für Glasträger (bis zu 10
Glasträger) in die Waschschale, geben Sie zirka 220 ml der Lösung A in die Schale und
positionieren Sie einen Magnetrührstab am Boden der Schale. Stellen Sie die Schale auf einen
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Magnetrührer und sorgen Sie dafür, dass die Lösung 60 Minuten lang bei 600 U/Min gerührt wird.
Geben Sie den Glashalter mit dem ImmunoCAP ISAC® in eine separate Waschschale mit zirka
220 ml destilliertem Wasser. Geben Sie einen Magnetrührstab hinzu und sorgen Sie dafür, dass
die Schale auf einem Magnetrührer 5 Minuten lang 600 U/Min gerührt wird. Nehmen Sie den
Glashalter mit dem ImmunoCAP ISAC® aus der Schale und stellen Sie ihn zum Trocknen an der
Luft auf ein Papiertuch. Warten Sie, bis die Glasträger vollständig trocken sind. Setzen Sie das
ImmunoCAP ISAC® Testverfahren direkt nach dem Trocknen der Glasträger fort. Entsorgen Sie
alle verwendeten Waschlösungen.
TESTVERFAHREN
•
Geben Sie den vorbereiteten ImmunoCAP ISAC® in die Feuchtkammer und achten Sie darauf,
dass sich die Analysenfelder an der nach oben gerichteten Seite befinden.
•
Pipettieren Sie 20 µl Probe auf ein Analysenfeld (auf jedem Glasträger befinden sich 4
Analysenfelder für 4 Proben). Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze beim Dispensieren
der Probe keinen direkten Kontakt mit der Oberfläche des ImmunoCAP ISAC® hat. Jedes
Analysenfeld muss vollständig bedeckt sein. Schliessen Sie die Feuchtkammer vorsichtig und
achten Sie darauf, dass die Proben dabei nicht vermischt werden. Pro ImmunoCAP ISAC® Kit
sollte ein Kontrollserum eingesetzt werden. Wenn Änderungen des Tests oder des ScanningVerfahrens eingeführt werden, ist der Einsatz des Kontrollserums obligatorisch.
•
Lassen Sie den ImmunoCAP ISAC® 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
•
Nehmen Sie den ImmunoCAP ISAC® vorsichtig aus der Feuchtkammer und achten Sie darauf,
dass die Proben dabei nicht vermischt werden. Entfernen Sie das überschüssige
Probenmaterial, indem Sie die Glasträger unter schwach fließendem Wasser abspülen (halten
Sie dabei den Glasträger waagerecht, um eine Probenkontamination zu vermeiden).
•
Waschen Sie den ImmunoCAP ISAC® 10 Minuten lang mit zirka 220 ml der Lösung A (unter
Verwendung der Waschschale und des Magnetrührers in der zuvor beschriebenen Form).
•
Geben Sie den Halter für Glasträger mit dem ImmunoCAP ISAC® in eine Waschschale mit
zirka 220 ml destilliertem Wasser. 5 Minuten lang waschen.
•
Entsorgen Sie alle verwendeten Waschlösungen.
•
Lassen Sie den gewaschenen ImmunoCAP ISAC® an der Luft vollständig trocknen.
•
Der ImmunoCAP ISAC® kann jetzt mit der Detektionsantikörperlösung inkubiert werden. Geben
Sie den trockenen ImmunoCAP ISAC® in die Feuchtkammer und achten Sie darauf, dass sich
die Analysenfelder an der nach oben gerichteten Seite befinden.
•
Pipettieren Sie 20 µl der Detektionsantikörperlösung auf jede der verwendeten Analysenfelder
des ImmunoCAP ISAC®. Überzeugen Sie sich davon, dass der ImmunoCAP ISAC®
ordnungsgemäss in die Feuchtkammer gegeben wurde und schließen Sie dann die
Feuchtkammer.
•
Lassen Sie bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren, vor Licht schützen.
•
Nehmen Sie den ImmunoCAP ISAC® vorsichtig aus der Feuchtkammer. Entfernen Sie die
überschüssige Detektionsantikörperlösung, indem Sie die Glasträger unter schwach
fließendem Wasser abspülen (halten Sie dabei den Glasträger waagerecht, um eine
Kontamination zu vermeiden).
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•
Waschen Sie den ImmunoCAP ISAC® 10 Minuten lang mit zirka 220 ml der Lösung A (unter
Verwendung der Waschschale und des Magnetrührers in der zuvor beschriebenen Form).
•
Geben Sie den Halter für die Glasträger mit dem ImmunoCAP ISAC® in eine Waschschale mit
zirka 220 ml destilliertem Wasser. 5 Minuten lang waschen.
•
Entsorgen Sie alle verwendeten Waschlösungen.
•
Lassen Sie den gewaschenen ImmunoCAP ISAC® an der Luft vollständig trocknen.
•
Der ImmunoCAP ISAC® kann jetzt gescannt werden. Geben Sie den ImmunoCAP ISAC® für
die Datengewinnung direkt in einen geeigneten Mikroarray-Scanner oder bewahren Sie den
ImmunoCAP ISAC® für eine spätere Messung trocken und lichtgeschützt auf. Die Messung
sollte innerhalb von sieben Tagen erfolgen.
PARAMETER FÜR DAS VERFAHREN
Volumen je Bestimmung:
Probe
20 µl
Detektionsantikörper
20 µl
Lösung A
660 ml
Die Gesamtdauer für einen Test beträgt 5 Stunden.
Die Inkubationen erfolgen bei Raumtemperatur.
Referenzmaterial
Die interne Kalibrierung von ImmunoCAP ISAC® erfolgt gegen ein In-house-Referenzserum. Die
gemessenen Konzentrationen an IgE-Antikörpern werden als arbiträre Einheiten – ISAC
Standardized Units (ISU) – ausgedrückt. Das ImmunoCAP ISAC® In-house-Referenzserum wird
gegen ImmunoCAP® Specific IgE standardisiert. ImmunoCAP® Specific IgE Kalibratoren sind
(durch eine ununterbrochene Kette von Kalibrierungen) gegen die 2. Internationale Referenzpräparation
(IRP)
75/502
für
Immunglobulin
E
im
Humanserum
der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) kalibriert. Folglich stehen Ergebnisse für IgE-Antikörper (ISU), die
mit dem ImmunoCAP ISAC® ermittelt wurden, indirekt mit der WHO IRP 75/502 IgE in Verbindung.
Messbereich
Bereiche 0 – 3 entsprechen ungefähr dem Messbereich
Die ImmunoCAP ISAC®
0 – 100 kUA/l der spezifischen IgE-Bestimmung mit dem ImmunoCAP® Specific IgE-Test.
Qualitätskontrolle
Dokumentation für jeden Test: Gemäß den Grundsätzen guter Laborpraxis werden die
Chargennummern der eingesetzten Komponenten sowie das Datum der ersten Öffnung und das
Restvolumen notiert.
Kontrollproben: Die Grundsätze guter Laborpraxis erfordern, dass in einem Durchlauf pro Kit
Kontrollproben zur Qualitätskontrolle entnommen werden müssen.
Das mitgelieferte IgE-Kontrollserum muss in festgelegten Intervallen eingesetzt werden, damit das
System genaue ISU-Messungen liefert.
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ImmunoCAP ISAC® DATENANALYSE
Scanning-Verfahren
Für die Analyse des Biochips ImmunoCAP ISAC® empfehlen wir den Einsatz eines konfokalen
Laser-Scanners, speziell des Mikroarray-Scanners CapitalBio LuxScan™ 10K.
Spezifikationen für den Mikroarray-Scanner
Chipformat
26 mm × 76 mm
Scanauflösung
10 µm
Sensitivität
0,1 fluoreszierende Moleküle /μm2
Dynamischer Messbereich
16 Bit
Maximaler Scanbereich
22 × 72 mm
Exzitationswellenlänge
532 nm und/oder 635 nm (Grün- und Rotlaser)
Fluoreszierende Farbstoffe
Alexa Fluor 546 nm, Alexa Fluor 647 nm
Bilddateiformat
16 Bit Grauskala TIFF
Während der Installation des Systems wird von dem Systemtechniker ein Scanprotokoll für
ImmunoCAP ISAC® eingerichtet. Damit auf dem Scan keine gesättigten (außerhalb des
Messbereichs liegenden) Signale erscheinen, sollten die Darstellungen im Allgemeinen bei
maximaler Laserstärke (laut Herstellerempfehlungen) und den entsprechend gewählten
Einstellungen erstellt werden. Falls der ImmunoCAP ISAC® mehr als zweimal gescannt wird,
können infolge der Bleichung des Fluoreszenz Farbstoffes durch den Laser eine Abnahme des
Fluoreszenzsignals beobachtet werden.
Verfahren zur Bildanalyse
Für die Analyse des ImmunoCAP ISAC® raten wird zum Einsatz der MIA-Software (Microarray
Image Analyzer), die während des Setups für das Gerät von unserem Servicemitarbeiter installiert
wird. Die MIA-Software ermöglicht eine automatische Analyse des ImmunoCAP ISAC®. Die
gescannten Bilder werden analysiert. Die Ergebnisse werden in einer Datenbank gespeichert und
dem Anwender direkt mitgeteilt. Die MIA-Software verfügt über eine Schnittstelle, über die
ImmunoCAP ISAC®-Daten an den ImmunoCAP® Information Data Manager (IDM) weitergeleitet
werden.
Ergebnisse
ImmunoCAP ISAC® ist eine quantitative Testmethode, bei der allergen-komponentenspezifische
IgE-Antikörper in ISU (ISAC Standardized Units) gemessen werden. Die Ergebnisse werden auch
in semi-quantitativer Form in 4 Bereichen ausgedrückt (0 = unter der Nachweisgrenze oder sehr
niedrig, 1 = niedrig, 2 = erhöht bis hoch, 3 = sehr hoch). Die Berechnung wird von der MIASoftware automatisch ausgeführt.
ImmunoCAP ISAC Bereiche
Beurteilung: Konzentration der IgE-Antikörper
Entspricht ISU
0
unter der Nachweisgrenze oder sehr niedrig
<0,3
1
niedrig
≥0,3 - <1
2
erhöht bis hoch
≥1 - <15
3
sehr hoch
≥15
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Abb. 2A. Beispiel für ein
ImmunoCAP ISAC® Scan.
Alle Allergene sind als
vertikale Triplikate
angeordnet. Die bildliche
Darstellung der Fluoreszenz
erfolgt in einer
Falschfarbenskala. Die lineare
Skala der Falschfarben ist
unter dem Bild dargestellt.
0
65.535
Abb. 2B. ImmunoCAP ISAC®
Anordnung.
Die Anordnung zeigt die
Positionen und
Bezeichnungen von den 103
Allergenkomponenten. Die
Anordnung und das AllergenPanel können Veränderungen
unterliegen.
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GRENZEN DES VERFAHRENS
Eine endgültige klinische Diagnose sollte nicht auf die Ergebnisse einer einzigen diagnostischen
Methode gestützt, sondern vom Arzt erst nach Auswertung aller klinischen und labortechnischen
Befunde gestellt werden.
Bei Nahrungsmittelallergien könnten zirkulierende IgE-Antikörper unentdeckt bleiben, obwohl eine
überzeugende Anamnese vorliegt; denn diese Antikörper können gegen Allergene gerichtet sein,
die erst während der industriellen Verarbeitung, während des Kochens oder der Verdauung
entstehen oder verändert werden und deshalb nicht in dem Lebensmittel vorkommen, auf das der
Patient getestet wird.
Insektengift-Ergebnisse innerhalb des Bereichs 0 deuten auf keine zirkulierenden Insektengiftspezifischen IgE-Antikörper oder eine Konzentration der spezifischen IgE-Antikörper unter der
Nachweisgrenze hin. Diese Ergebnisse schließen das Vorliegen einer gegenwärtigen oder
zukünftigen Überempfindlichkeit gegen Insektenstiche aber nicht aus.
Die Charakteristika des Tests wurden basierend auf repräsentativen Allergenkomponenten
bestimmt und gelten möglicherweise nicht für alle Allergenkomponenten in gleicher Weise.
CHARAKTERISTKA DES TESTS
Nachweisgrenze: Die Nachweisgrenze wurde in Übereinstimmung mit der CLSI-Richtlinie EP17-A
für repräsentative Allergenkomponenten bestimmt. Die allgemeine Nachweisgrenze wurde mit 0,3
ISU veranschlagt, was ungefähr 0,3 kUA/l entspricht.
Präzision: Die Präzision wurde in Übereinstimmung mit der CLSI-Richtlinie EP5-A2 für
repräsentative Allergenkomponenten bestimmt. Während eines Durchlaufs ergaben sich ein
Variationskoeffizient von 15 % und ein Gesamt-Variationskoeffizient von 25 %.
Analytische Spezifität: Der IgE-Detektionsantikörper reagiert nicht mit anderen Immunglobulinen
im humanen Serum.
GARANTIE
Die hier angegebenen Testdaten wurden mit der beschriebenen Testdurchführung ermittelt. Jede
von Phadia AB nicht empfohlene Änderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Resultate
beeinträchtigen. Phadia AB lehnt in diesem Falle jede explizite, implizite oder gesetzliche Garantie
ab, die implizite Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen. Phadia AB und deren Vertreter
können in diesem Fall weder indirekt noch konsekutiv für Schäden haftbar gemacht werden.
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REFERENZEN
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Seite 12
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Symbols/Symboles/Symbole/Symboler/Simboli/Simbolos/Symboler/Símbolos/ Symbolen
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Chargennummer
E
Biologische Risiken
h
Katalognummer
Y
Warnhinweis
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Siehe Gebrauchsanweisung
X
Enthält ausreichende Menge für <n> Tests
D
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Mode d’emploi
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ImmunoCAP ISAC® Starter Kit IgE
Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/
Marchi despositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradas
Les désignations suivantes sont des marques de fabrique enregistrées appartenant à Phadia AB :
ImmunoCAP
Les désignations suivantes sont des marques de fabrique enregistrées appartenant à Phadia
Multiplexing Diagnostics GmbH :
ISAC
Les désignations suivantes sont des marques de fabrique appartenant à CapitalBio Corporation :
LuxScan
Bibliographie
Voir page 26
Développé par :
Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Donaucitystrasse 1, A-1220 Vienna, Austria
Publication Avril 2008
Mise à jour Septembre 2009
© Phadia AB, Uppsala, Sweden
Page 16
BUT DU DOSAGE
ImmunoCAP ISAC est un test in vitro qui permet la détermination quantitative d’IgE spécifiques
dans le sérum ou le plasma humain. ImmunoCAP ISAC est destiné à une utilisation diagnostique
in vitro en parallèle avec les investigations cliniques. Il est conçu pour une utilisation en laboratoire
d’analyse médicale.
PRINCIPE DE LA METHODE
ImmunoCAP ISAC est un immuno-dosage sur phase solide. Les composants allergéniques
immobilisés sur un substrat solide en format biopuce sont incubés avec des échantillons sériques
ou de plasma d’origine humaine pour détecter les IgE spécifiques. La liaison des IgE spécifiques
aux composants allergéniques est révélée par l’ajout d’un anticorps anti-IgE humaine sur lequel
est fixé un marqueur de fluorescence secondaire. La procédure est suivie de l’acquisition d’une
image avec un scanner de biopuce adapté. Les unités standardisées (ISAC Standardized Units ISU) sont déterminées et les résultats des tests sont analysés avec le logiciel MIA (Microarray
Image Analysis Software).
Figure 1.
En haut, à gauche : Schéma
d’organisation de la biopuce à
composants allergéniques.
En haut, à droite : Schéma
du principe du dosage. Les
composants allergéniques
sont couplés de façon
covalente à la phase solide.
Les IgE spécifiques
d’allergènes sont détectées
par des anti-IgE fluorescents.
En bas, à gauche : Image
acquise par le microscope à
balayage laser à fluorescence,
montrant les différentes
intensités sur une échelle de
fausse couleur, du noir
(négatif) au blanc (fortement
positif).
En bas, à droite : Schéma du
compte rendu du dosage
ImmunoCAP ISAC
Page 17
REACTIFS
ImmunoCAP ISAC est un élément de l’Assay kit (trousse de dosage) ou du Starter kit (trousse de
démarrage) contenant les réactifs requis pour réaliser un dosage. La date de péremption et la
température de stockage de chaque trousse sont indiquées sur l’étiquette extérieure. Cependant,
chaque composant est stable jusqu’à la date indiquée sur son étiquette individuelle. Il est
recommandé de ne mélanger aucun des réactifs.
ImmunoCAP ISAC Starter Kit IgE (Art. No. 81-1001-01)
(pour 20 déterminations)
ImmunoCAP ISAC
incluant 4 sites réactionnels
5 lames
Prêt à l’emploi
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Attendre le retour à température
ambiante avant d’ouvrir le joint
de vide. Une fois que le joint de
vide est retiré, les lames
peuvent être stockées 6
semaines si elles sont
conservées entre 18 et 32°C,
au sec et à l’obscurité.
Composant A
(tampon concentré 20 fois)
200 ml
1 bouteille
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Anticorps de détection des IgE 1 flacon
(Anti-IgE humaine conjugué à
un fluorophore)
0,5 ml
Prêt à l´emploi.
Sérum de contrôle IgE
(Sérum humain)
Azide de Sodium <0,1%
50 µl
Prêt à l’emploi.
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Ne pas diluer le sérum de
1 flacon
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Conserver à l’abri de la lumière.
contrôle !
Récipients de lavage
2 récipients pour 10 lames
Prêts à l’emploi.
Barreaux magnétiques
2
Prêts à l’emploi.
Chambre humide
1 chambre pour 26 lames
Prête à l’emploi.
Page 18
ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgE (Art. No. 81-1000-01)
(pour 20 déterminations)
ImmunoCAP ISAC
incluant 4 sites réactionnels
5 lames
Composant A
1 bouteille
(tampon concentré 20 fois)
200 ml
Anticorps de détection des IgE 1 flacon
(Anti-IgE humaine conjugué à
un fluorophore)
0,5 ml
Sérum de contrôle IgE
(Sérum humain)
Azide de Sodium <0,1%
50 µl
1 flacon
Prêt à l’emploi
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Attendre un retour à
température ambiante avant
d’ouvrir le joint de vide.
Une fois que le joint de vide
est retiré, les lames peuvent
être stockées 6 semaines si
elles sont conservées entre 18
et 32°C, au sec et à
l’obscurité.
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Prêt à l´emploi.
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Conserver à l’abri de la
lumière.
Prêt à l’emploi.
Conserver entre 2 et 8°C
jusqu’à la date de péremption.
Ne pas diluer le sérum de
contrôle !
Autre matériel
Matériel nécessaire mais non fourni par Phadia AB :
•
Eprouvette de 1 000 ml
Y
•
Eau distillée
•
Agitateur magnétique
PRECAUTIONS
•
Pour usage diagnostique in vitro uniquement. Ne pas administrer en interne ou externe chez
l’homme ou l’animal..
•
Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption..
•
Il est recommandé de se protéger les mains et les yeux et de suivre les bonnes pratiques de
laboratoire au cours de la préparation et la manipulation des réactifs et des échantillons.
•
Cette trousse contient des réactifs fabriqués à partir de composants du sang humain. Les
matières premières concernées ont donné des résultats négatifs aux tests immunologiques
de recherche de l’antigène de surface de l’hépatite B, des anticorps anti-VIH 1 et 2 et du
virus de l’hépatite C. Cependant, toutes les précautions recommandées pour les
manipulations des dérivés du sang doivent être respectées. Se référer aux réglementations
nationales ou locales sur les procédures de sécurité dans les laboratoires.
Page 19
•
Attention ! Les réactifs qui contiennent comme conservateur de l’azide de sodium doivent
être manipulés avec précaution. La fiche de sécurité est disponible sur demande auprès de
Phadia AB.
Manipulation des ImmunoCAP ISAC
Ne pas écrire sur les ImmunoCAP ISAC avec des stylos ou des marqueurs solubles dans l’eau ou
des solvants organiques. Des résidus de marquage peuvent interférer sur l’analyse de
fluorescence. Si nécessaire, utiliser un crayon. Eviter tout contact direct avec la surface de
l’ImmunoCAP ISAC à toutes les étapes de la réaction. Saisir toujours ImmunoCAP ISAC par le
bord de la lame.
PREPARATION DES ECHANTILLONS, DES REACTIFS ET DU MATERIEL
Echantillons
Il est possible d’utiliser des échantillons de sérum ou de plasma provenant d’un prélèvement de
sang veineux ou capillaire. Prélever les échantillons sanguins selon les procédures habituelles. Ne
conserver les échantillons à température ambiante que pour le transport. Sinon, les conserver
entre 2 et 8 °C jusqu’à une semaine ou à –20 °C pour une conservation plus longue. Eviter les
congélations et décongélations répétées.
Solution A
Préparer au moment de la manipulation 700 ml d’une dilution au 1/20 du Composant A dans de
l’eau purifiée pour obtenir la Solution A (ajouter 665 ml d’eau purifiée à 35 ml du composant A). Ce
volume est calculé pour 3 lavages de 220 ml à l’aide du récipient de lavage fourni dans la trousse
de démarrage (Starter kit). Le volume de dilution doit être ajusté au récipient utilisé.
Solution d’anticorps de détection
La solution de détection d'Anticorps de détection d’IgE est prête à l'emploi.
Elle doit être conservée à l'abri de la lumière et du gel.
Chambre Humide
Placer une serviette en papier propre au fond de la chambre humide et l’imbiber d’eau distillée.
Fermer le couvercle de la chambre humide pour éviter une évaporation avant son usage.
ImmunoCAP ISAC
Mettre les ImmunoCAP ISAC dans le récipient de lavage contenant le support de lames amovible
(jusqu’à 10 lames) et approximativement 220 ml de Solution A. Ajouter un barreau magnétique au
fond du récipient. Le placer sur un agitateur magnétique et agiter fortement pendant 60 minutes à
600 T/min. Déplacer le support de lames contenant les ImmunoCAP ISAC dans un autre récipient
de lavage contenant approximativement 220 ml d’eau distillée. Ajouter un barreau magnétique et
agiter fortement sur un agitateur magnétique pendant 5 minutes à 600 T/min. Retirer le support de
lames contenant les ImmunoCAP ISAC, placer les lames sur une serviette en papier et laisser
sécher à l’air. Attendre que les lames soient complètement sèches. Poursuivre la procédure de
test des ImmunoCAP ISAC immédiatement après. Jeter toutes les solutions de lavage utilisées.
Page 20
PROCEDURE DE DOSAGE
•
Placer les ImmunoCAP ISAC préparés dans la chambre humide en orientant les sites
réactionnels vers le haut.
•
Pipeter 20 µl de chaque échantillon sur un site réactionnel (il y a 4 sites par lame). Eviter le
contact direct de l’embout de la pipette avec la surface de l’ImmunoCAP ISAC pendant la
distribution des échantillons. Fermer la chambre humide avec précaution, pour ne pas
mélanger les échantillons. Il est recommandé d’utiliser un sérum de contrôle par trousse
ImmunoCAP ISAC. Le dosage du sérum de contrôle est obligatoire si des changements sont
introduits dans la procédure de dosage ou de mesure. Incuber à température ambiante
pendant 120 minutes.
•
Retirer les ImmunoCAP ISAC de la chambre humide avec précaution, sans mélanger les
échantillons. Eliminer le reste d’échantillon en rinçant les lames délicatement à l’eau courante.
Tenir la lame inclinée mais en longueur afin d’éviter toute contamination.
•
Laver les ImmunoCAP ISAC avec environ 220 ml de Solution A pendant 10 minutes (en
utilisant le récipient de lavage et le barreau magnétique comme décrit précédemment).
•
Déplacer le portoir de lames contenant les ImmunoCAP ISAC dans un autre récipient de
lavage contenant environ 220 ml d’eau distillée. Laver pendant 5 minutes.
•
Laisser sécher les ImmunoCAP ISAC à l’air jusqu’à séchage complet.
•
Les ImmunoCAP ISAC sont maintenant prêts pour l’incubation avec la Solution d’anticorps de
détection. Placer les ImmunoCAP ISAC secs dans la chambre humide en orientant les sites
réactionnels vers le haut.
•
Jeter toutes les solutions de lavage utilisées.
•
Pipeter 20 µl de Solution d’anticorps de détection sur chaque site réactionnel des ImmunoCAP
ISAC. S’assurer que les ImmunoCAP ISAC sont correctement placés dans la chambre humide
et fermer le couvercle.
•
Incuber à température ambiante pendant 60 minutes, à l’abri de la lumière.
•
Retirer les ImmunoCAP ISAC de la chambre humide avec précaution. Eliminer le reste de
solution d’anticorps de détection en rinçant les lames délicatement à l’eau courante. Tenir la
lame inclinée mais en longueur afin d’éviter toute contamination.
•
Laver les ImmunoCAP ISAC avec environ 220 ml de Solution A pendant 10 minutes (en
utilisant le récipient de lavage et le barreau magnétique comme décrit précédemment).
•
Déplacer le portoir de lames contenant les ImmunoCAP ISAC dans un autre récipient de
lavage contenant environ 220 ml d’eau distillée. Laver pendant 5 minutes.
•
Laisser sécher les ImmunoCAP ISAC à l’air jusqu’à séchage complet.
Page 21
•
Les ImmunoCAP ISAC sont maintenant prêts pour la lecture. Les utiliser tout de suite pour
l’acquisition des données avec un scanner de biopuce approprié ou les conserver au sec en
les protégeant de la lumière pour une lecture ultérieure.
PARAMETRES DE LA PROCEDURE
Volumes par détermination :
Echantillons
20 µl
Anticorps de détection
20 µl
Solution A
660 ml
Le temps total pour un dosage est de 5 heures.
Les incubations sont réalisées à température ambiante.
MATERIEL DE REFERENCE
La calibration d’ImmunoCAP ISAC est réalisée par rapport à un sérum de référence interne et les
concentrations d’IgE mesurées sont exprimées en unités arbitraires, ISAC Standardized Units
(ISU). Le sérum de référence interne ImmunoCAP ISAC est standardisé par rapport à la méthode
ImmunoCAP Specific IgE. Les calibrateurs ImmunoCAP Specific IgE sont calibrés (via une chaine
ininterrompue d’étalonnage) par rapport à la 2ème Préparation Internationale de Référence (IRP)
75/502 d’Immunoglobulines E sériques de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). En
conséquence, les résultats d’IgE (ISU) obtenus avec ImmunoCAP ISAC sont indirectement liés à
l’IRP 75/502 IgE de l’OMS.
Gamme de mesure
Les classes 0 – 3 d’ImmunoCAP ISAC correspondent approximativement à 0 – 100 kUA/l d’IgE
mesurées avec ImmunoCAP Specific IgE.
Contrôle de la Qualité
Enregistrements pour chaque dosage : une bonne pratique de laboratoire consiste à conserver
les numéros de lot des composants utilisés, ainsi que les dates de première ouverture et les
volumes restants.
Sérums de contrôle : une bonne pratique de laboratoire requiert l’ajout de contrôles de qualité
dans une série par trousse. Pour obtenir des mesures ISU précises, le sérum de contrôle fourni
doit être dosé à des intervalles définis pour le système.
Page 22
ANALYSE DES DONNEES ImmunoCAP ISAC
Procédure de mesure
Pour l’analyse des ImmunoCAP ISAC, nous recommandons l’utilisation d’un système à balayage
laser confocal, tel que le scanner de biopuce CapitalBio LuxScan™ 10K.
Spécifications du scanner
Format de la lame
26mm × 76mm
Précision de balayage
10 µm
Sensibilité
0,1 molécule fluorescente /μm2
Plage dynamique
16 bits
Aire maximum de balayage
22×72 mm
Longueur d’onde d’excitation
532 nm et/ou 635 nm (laser vert et rouge)
Marqueurs fluorescents
Alexa Fluor 546 nm, Alexa Fluor 647 nm
Format du fichier image
TIFF échelle de gris 16 bits
Un protocole de balayage de l’ImmunoCAP ISAC est paramétré par un spécialiste produit au
moment de l’installation du système. En général, les images doivent être acquises avec la
puissance laser maximum recommandée par le fabricant de l’instrument, et tous les autres
paramètres choisis pour éviter une saturation (hors limite) des images. Si les ImmunoCAP ISAC
sont scannés plus de deux fois, on observe une décroissance des signaux de fluorescence due au
photoblanchiment du marqueur de fluorescence par le laser.
Procédure d’analyse de l’image
Pour analyser les ImmunoCAP ISAC, nous recommandons d’utiliser le logiciel MIA – Microarray
Image Analyzer software, qui a été installé par notre spécialiste produit lors du paramétrage de
l’instrument. MIA facilite l’analyse automatique d’ImmunoCAP ISAC. Les images de balayage des
puces sont analysées et les résultats sont à la fois enregistrés dans une base de données et
directement fournis à l’utilisateur. MIA a une interface d’export des données d’ImmunoCAP ISAC
vers ImmunoCAP Information Data Manager (IDM).
Résultats
ImmunoCAP ISAC est une méthode quantitative qui mesure les IgE spécifiques de composants
allergéniques en unités ISU (ISAC Standardized Units). Les résultats sont également présentés
semi-quantitativement en 4 classes (0 = indétectable ou très faible, 1 = faible, 2 = modéré à élevé,
3 = très élevé). Le logiciel MIA réalise automatiquement les calculs.
Scores ImmunoCAP ISAC (Taux d’IgE)
0 (Indétectable ou très faible)
Correspondance avec les ISU
<0,3
1 (Faible)
≥0,3 - <1
2 (Modéré à élevé)
≥1 - <15
3 (Très élevé)
≥15
Page 23
Fig. 2A.
Exemple d’image
d’ImmunoCAP ISAC
acquise. Tous les
allergènes sont mesurés en
triplets verticaux. Pour
visualiser la fluorescence,
l’image est affichée en mode
fausse couleur.
L’échelle linéaire d’affichage
en fausse couleur est
indiquée en dessous de
l’image.
0
65.535
Fig. 2B.
Matrice du test
ImmunoCAP ISAC. Ce
schéma montre les positions
et les noms des 103
composants allergéniques.
La répartition et le contenu
en allergènes peuvent être
soumis à des changements.
Page 24
LIMITES DE LA PROCEDURE
Un diagnostic clinique ne peut être fondé uniquement sur les résultats d’une seule méthode
diagnostique mais doit être établi par le praticien après évaluation de tous les résultats cliniques et
de laboratoire.
En allergie alimentaire, les IgE circulantes peuvent être indétectables en dépit d’une histoire
clinique convaincante parce que ces anticorps peuvent être dirigés vers des allergènes révélés ou
altérés au cours d’un traitement industriel, de la cuisson ou de la digestion, de sorte qu’ils
n’existent pas dans l’aliment d’origine pour lequel le patient est testé.
Des résultats de classe 0 pour les venins indiquent l’absence ou un taux indétectable d’IgE
spécifiques circulantes de venin. De tels résultats ne préjugent pas d’une hypersensibilité clinique
actuelle ou future aux piqûres d’insectes.
Les performances indiquées sont des données générales qui peuvent varier pour un composant
allergénique individuel. Les performances ont été déterminées pour des composants allergéniques
représentatifs et ne peuvent pas être appliquées à tous les composants allergéniques.
PERFORMANCES CARACTERISTIQUES
Limite de détection : La limite de détection a été déterminée en accord avec les
recommandations CLSI EP17-A pour les composants allergéniques représentatifs. La limite de
détection générale est estimée à 0,3 ISU ce qui correspond à 0,3 kUA/L approximativement.
Précision : La précision a été déterminée en accord avec les recommandations CLSI EP5-A2
pour les composants allergéniques représentatifs. Le CV intra-série a été estimé à 15 % et le CV
total à 25 %.
Spécificité Analytique : L’anticorps de détection des IgE ne réagit pas avec les autres
immunoglobulines du sérum humain.
GARANTIE
Les performances décrites ici ont été obtenues en suivant la procédure indiquée. Toute
modification de la procédure non recommandée par Phadia AB peut affecter ces résultats. Dans
ce cas, Phadia AB rejette toute garantie explicite, implicite ou prévue par la loi, et notamment toute
garantie implicite concernant l’aptitude à la vente ou à l’utilisation. Dans cette éventualité, Phadia
AB rejette toute responsabilité en cas de dommages indirects ou liés pouvant en résulter.
Page 25
BIBLIOGRAPHIE
Allergy. 2006 May;61(5):633-9. The performance of a component-based allergen-microarray in clinical
practice. Wohrl S, Vigl K, Zehetmayer S, Hiller R, Jarisch R, Prinz M, Stingl G, Kopp T.
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atopy. Ott H, Schroeder CM, Stanzel S, Merk HF, Baron JM.
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major pollen allergens Phl p 5a and Bet v 1a: discrepancy between IgE and IgG binding strength. Hantusch
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gatekeepers for allergy treatment. Hiller R, Laffer S, Harwanegg C et al.
Page 26
AUSTRIA Phadia Austria GmbH
Floridsdorfer Hauptstraße 1, AT-1210 VIENNA
Tel: +43 1 270 20 20, Fax: +43 1 270 20 20 20
BELGIUM Phadia NV/SA
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FINLAND Phadia Oy
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FRANCE Phadia SAS
BP 610, FR-78056 ST QUENTIN YVELINES CEDEX
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GERMANY Phadia GmbH
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Tel: +49 761 47805 0, Fax: +49 761 47805 338
IRELAND Phadia Ltd (Irish Branch)
Beaghbeg, Carrigallen, LEITRIM
Tel: +44 1908 84 70 34, Fax: +44 1908 84 75 54
ITALY Phadia S.r.l.
Via Libero Temolo, 4, IT-201 26 MILAN
Tel: +39 02 64 163 411, Fax: +39 02 64 163 415
JAPAN Phadia K.K.
Tokyo Opera City Tower, 3-20-2, Nishi-shinjuku Shinjuku-ku, TOKYO 163-1431
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KOREA Phadia Korea Co. LTD.,
20 Fl, IT Mirea Tower, 60-21, Gasan-dong Geumcheon-gu, Seoul 153-801
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THE NETHERLANDS Phadia B.V.
Postbus 696, NL-3430 AR NIEUWEGEIN
Tel: +31 30 602 37 00, Fax: +31 30 602 37 09
NORWAY Phadia AS
Postboks 4814, Nydalen, NO-0422 OSLO
Tel: +47 21 67 32 80, Fax: +47 21 67 32 81
PORTUGAL Phadia Sociedade Unipessoal Lda.
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OTHER COUNTRIES Phadia AB
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Page 27
Symbols/Symboles/Symbole/Symboler/Simboli/Simbolos/Symboler/Símbolos/
Symbolen
g
Code de lot
E
Risques biologiques
h
Numéro de catalogue
Y
Avertissement
i
Consulter le mode d'emploi
X
Contenu suffisant pour <n> tests
D
Ne pas réutiliser
V
Appareils médicaux pour diagnostic In Vitro
M
Fabricant
l
Limite de température
H
A utiliser avant
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Tel: +46 18 16 50 00
Fax: +46 18 14 03 58
C
Page 28
Istruzioni per l’uso
ImmunoCAP ISAC® Assay Kit IgE
ImmunoCAP ISAC® Starter Kit IgE
Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/
Marchi depositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradas
I seguenti marchi sono registrati ed appartengono a Phadia AB:
ImmunoCAP
I seguenti marchi sono registrati ed appartengono a Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH:
ISAC
I seguenti marchi sono registrati ed appartengono a CapitalBio Corporation:
LuxScan
Riferimenti bibliografici
Vedere a pag. 40
Sviluppato da:
Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Donau-City-Strasse 1, A-1220 Vienna, Austria
Preparato Aprile 2008
Revisione Settembre 2009
© Phadia AB, Uppsala, Svezia
Pagina 30
APPLICAZIONE CLINICA
ImmunoCAP ISAC è un test in vitro per la determinazione quantitativa degli anticorpi IgE specifici
nel plasma o siero umano. ImmunoCAP ISAC è destinato all’uso diagnostico in vitro in
combinazione con altri dati clinici ed il suo utilizzo è rivolto ai medici ed ai laboratori clinici.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
ImmunoCAP ISAC è un test immunologico in fase-solida. Le componenti allergeniche,
immobilizzate in formato di microarray su un substrato solido, sono incubate con siero o plasma
umano al fine di identificare gli anticorpi IgE specifici. Il legame tra gli anticorpi IgE Specifici e le
componenti allergeniche legate alla fase solida, è rilevato grazie ad un anticorpo secondario antiIgE umane marcato con un composto fluorescente. Una scansione con un appropriato scanner per
microarray permetterà l’acquisizione dell’immagine. Il programma MIA (Microarray Image Analysis
Software) consentirà poi l’analisi dei risultati e alla determinazione delle ISU (ISAC Standardized
Units).
Figura 1.
Sinistra in alto: Disposizione in
microarray delle componenti
allergeniche.
Destra in alto: Principio del test.
Le componenti allergeniche sono
covalentemente legate alla fase
solida. Gli anticorpi IgE specifici
sono rilevati grazie ad anti-IgE
marcati in fluorescenza.
Sinistra in basso: Immagine
acquisita con uno scanner laser
per fluorescenza. Le differenti
intesità si distribuiscono su una
scala di pseudo colori che va dal
nero (negativo) al bianco
(positivo intenso).
Desta in basso: Esempio di
report.
Pagina 31
REAGENTI
ImmunoCAP ISAC fa parte dell’Assay Kit o dello Starter Kit in cui si trovano tutti i reagenti richiesti
per l’esecuzione del test. La data di scadenza e la temperatura di conservazione sono indicate
sull’etichetta esterna. Ogni componente comunque è stabile fino alla data riportata sulla specifica
etichetta.
Si raccomanda di non fare pool di reagenti.
ImmunoCAP ISAC Starter Kit IgE (Cod. 81-1001-01)
(per 20 determinazioni)
ImmunoCAP ISAC
5 vetrini
4 siti di reazione ciascuno
Pronti per l’uso.
Conservare a 2-8°C fino alla
data di scadenza.
Lasciare raggiungere la
temperatura ambiente prima di
aprire la confezione stagna.
Una volta aperta la confezione
i vetrini possono essere
conservati a 18 – 32°C per 6
settimane in luogo asciutto e al
riparo dalla luce.
Component A
1 flacone
(Tampone 20x)
Conservare a 2-8°C fino alla
data di scadenza.
200 ml
IgE Detection Antibody
1 flacone
Pronto per l’uso.
(Anticorpo monoclonale di topo
Conservare a 2-8°C fino alla
anti-IgE umano coniugato con
data di scadenza.
fluoroforo) 0,5 ml
Conservare al riparo dalla
luce!
IgE Control Serum
1 flacone
Pronto per l’uso.
(siero umano)
Conservare a 2-8°C fino alla
Sodio azide <0,1%, 50 µl
data di scadenza.
Non diluire il siero di
controllo!
Camere di lavaggio
2 camere per 10 vetrini
Pronte per l’uso
Barrette magnetiche
2
Pronte per l’uso
Camera umida
1 camera per 26 vetrini
Pronta per l’uso
Pagina 32
ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgE (Cod. 81-1000-01)
(per 20 determinazioni)
ImmunoCAP ISAC
4 siti di reazione ciascuno
5 vetrini
Pronti per l’uso.
Conservare a 2-8°C fino alla data di
scadenza.
Lasciare raggiungere la temperatura
ambiente prima di aprire la
confezione stagna. Una volta aperta
la confezione i vetrini possono
essere conservati a 18 – 32°C per 6
settimane in luogo asciutto e al
riparo dalla luce.
1 flacone
Conservare a 2-8°C fino alla data di
scadenza.
1 flacone
IgE Detection Antibody
(Anticorpo monoclonale di topo
anti-IgE umano coniugato con
fluoroforo) 0,5 ml
Pronto per l’uso.
Conservare a 2-8°C fino alla data di
scadenza.
Conservare al riparo dalla luce!
1 flacone
Pronto per l’uso.
Conservare a 2-8°C fino alla data di
scadenza.
Non diluire il siero di controllo!
Component A
(Tampone 20x)
200 ml
IgE Control Serum
(siero umano)
Sodio azide <0,1%, 50 µl
Altri materiali
Materiale necessario non fornito da Phadia AB:
•
•
Cilindro da 1000 ml
•
Acqua purificata
•
Agitatore magnetico
Y
PRECAUZIONI
Per uso diagnostico in vitro. Non per uso interno o esterno su persone o animali.
•
Non usare i reagenti dopo la loro data di scadenza.
•
E’ raccomandato l’utilizzo di guanti e occhiali protettivi e l’applicazione della buona pratica di
laboratorio quando si preparano o si maneggiano reagenti e campioni.
•
Il kit contiene reagenti ottenuti da componenti di sangue umano. I materiali di origine
biologica sono stati controllati mediante immunoassay e trovati negativi per l´Antigene di
Superficie dell´epatite B e per gli anticorpi ai virus HIV1, HIV2 e del virus dell´epatite C. Si
consiglia ugualmente di osservare tutte le norme cautelari previste per la manipolazione dei
derivati ematici. Vedere la
pubblicazione n° (CDC) 93-8395 del Human Health Service
(HHS) o altre direttive locali/nazionali riguardanti le procedure di sicurezza nei laboratori.
Pagina 33
•
Attenzione! I reagenti che contengono sodio azide come conservante devono essere
maneggiati con cura. Le Schede di Sicurezza dei prodotti sono richiedibili presso Phadia.
Precauzioni per l’utilizzo di ImmunoCAP ISAC
Non utilizzare pennarelli con inchiostro solubile in acqua o solventi organici per scrivere su
bottiglie, provette o vetrini. L’inchiostro può interferire nell’analisi della fluorescenza di ImmunoCAP
ISAC. Se necessario utilizzare una matita per contrassegnare i reagenti. Evitare di toccare la
superficie di ImmunoCAP ISAC durante tutte le fasi della reazione: prendere sempre i vetrini dai
bordi.
PREPARAZIONE DI CALMPIONI, REAGENTI ED EQUIPAGGIAMENTO
Campioni
Possono essere usati campioni di siero o plasma da sangue venoso o capillare prelevato con
procedure standard. I campioni sono conservabili a 2-8° C fino a 1 settimana o a -20° C per periodi
più lunghi. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. I campioni possono essere spediti a
temperatura ambiente.
Soluzione A
Preparare 700 ml di Soluzione A aggiungendo 665 ml di Acqua deionizzata a 35 ml di Component
A. Si ottiene così una diluzione 1:20 di Component A. Il volume preparato è sufficiente per 3
lavaggi con 220 ml ciascuno da effettuarsi all’interno delle camere di lavaggio fornite con lo Starter
Kit.
Detection Antibody Solution
La Detection Antibody Solution é pronta per l’uso.
Conservare al riparo dalla luce ed evitare di congelarla.
Camera umida
Ricoprire il fondo della camera umida con tovaglioli di carta e inumidire con acqua distillata. Se non
utilizzata, rimettere sempre il coperchio per evitare l’evaporazione.
ImmunoCAP ISAC
Posizionare i vetrini ImmunoCAP ISAC nel rack rimuovibile della camera di lavaggio (fino a 10
vetrini), aggiungere approssimativamente 220 ml di Soluzione A e collocare la barretta magnetica
sul fondo. Agitare per 60 minuti a 600 giri/min su un agitatore magnetico. Spostare il rack con i
vetrini nell’altra camera di lavaggio preventivamente riempita con circa 220 ml di acqua distillata.
Agitare con un agitatore magnetico per 5 minuti a 600 giri/min. Rimuovere il rack e posizionarlo su
un tovagliolo di carta per lasciarlo asciugare. Attendere finché i vetrini siano completamente
asciutti. Procedere con il passaggio seguente nella preparazione del test. Eliminare tutte le
soluzioni di lavaggio utilizzate fin’ora.
Pagina 34
PROCEDURA DEL TEST
ƒ
Posizionare i vetrini ImmunoCAP ISAC nella camera umida con i siti di reazione verso l’alto.
ƒ
Dispensare 20 μl di campione in ciascun sito di reazione (ogni vetrino contiene 4 siti di
reazione), evitando di toccare la superficie dei vetrini con il puntale mentre si dispensano i
campioni. Posizionare delicatamente il coperchio sulla camera umida facendo attenzione a
non mischiare i campioni. Si raccomanda di effettuare una calibrazione con Control Serum
per ogni kit. L’esecuzione di una calibrazione è necessaria se sono state fatte modifiche alla
procedura di preparazione del test o ai parametri di scansione dei vetrini.
ƒ
Incubare a temperatura ambiente per 120 minuti.
ƒ
Togliere i vetrini ImmunoCAP ISAC dalla camera umida prestando attenzione a non
mescolare i campioni. Rimuovere i sieri sciacquando i vetrini sotto un debole getto d’acqua.
(Tenerli orizzontalmente per evitare una contaminazione dei campioni)
ƒ
Lavare i vetrini con 220 ml circa di Soluzione A per 10 minuti (utilizzare la camera di lavaggio
e l’agitatore magnetico come descritto precedentemente).
ƒ
Spostare il rack con i vetrini nell’altra camera di lavaggio contenente circa 220 ml di acqua
distillata. Lavare per 5 minuti.
ƒ
Rimuovere il rack e lasciare asciugare i vetrini all’aria finché non siano completamente
asciutti.
ƒ
I vetrini ImmunoCAP ISAC sono ora pronti per l’incubazione con la Detection Antibody
Solution. Posizionare i vetrini completamente asciutti nella camera umida con i siti di reazione
rivolti verso l’alto.
ƒ
Eliminare tutte le soluzioni di lavaggio utilizzate precedentemente.
ƒ
Dispensare 20 μl della Detection Antibody Solution in ogni sito di reazione ImmunoCAP
ISAC. Chiudere quindi la camera umida col suo coperchio.
ƒ
Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti, proteggendo i vetrini dalla luce.
ƒ
Rimuovere delicatamente i vetrini ImmunoCAP ISAC dalla camera umida. Rimuovere la
Detection Antibody Solution sciacquando i vetrini sotto un debole getto d’acqua. (Tenerli
orizzontalmente per evitare una contaminazione)
ƒ
Lavare i vetrini ImmunoCAP ISAC con circa 220 ml di Soluzione A per 10 minuti (utilizzare la
camera di lavaggio e l’agitatore magnetico come descritto precedentemente).
ƒ
Spostare il rack con i vetrini ImmunoCAP ISAC nell’altra camera di lavaggio contenente circa
220 ml di acqua distillata. Lavare per 5 minuti.
ƒ
Eliminare tutte le soluzioni di lavaggio utilizzate precedentemente.
ƒ
Lasciare asciugare i vetrini all’aria finché non siano completamente asciutti.
ƒ
I vetrini ImmunoCAP ISAC sono ora pronti per la lettura. Utilizzare uno scanner di microarray
per l’acquisizione delle immagini o conservarli in luogo asciutto e al riparo dalla luce per
successiva lettura.
Pagina 35
PARAMETRI DELLA PROCEDURA
Volumi per singola determinazione:
Campione
20μl
Detection Antibody
20μl
Solution A
660ml
Tempo totale per un dosaggio: 5 ore.
Le incubazioni vengono effettuate a temperatura ambiente.
Riferimento
La calibrazione di ImmunoCAP ISAC è effettuata con un siero di riferimento interno e le
concentrazioni di anticorpi IgE sono espresse in unità arbitrarie, ISAC Standardized Units, (ISU). Il
siero di riferimento interno ImmunoCAP ISAC è standardizzato verso ImmunoCAP Specific IgE. I
calibratori di ImmunoCAP Specific IgE sono riferiti (tramite un’ininterrotta catena di calibrazioni)
alla 2a Preparazione di Riferimento Internazionale (IRP) 75/502 di Immunoglobuline E di Siero
Umano del WHO (World Health Organization). Conseguentemente i risultati degli anticorpi IgE
ottenuti con ImmunoCAP ISAC sono indirettamente riferiti allo standard WHO IRP 75/502 delle
IgE.
Range di misura
Le classi 0-3 di ImmunoCAP ISAC, corrispondono approssimativamente a 0 – 100 kUA/l di
anticorpi IgE misurati col metodo ImmunoCAP Specific IgE.
Controllo di qualità
Registrazione di ogni analisi: è buona pratica di laboratorio registrare i numeri di lotti dei
componenti utilizzati, le date in cui sono stati aperti e i volumi residui.
Campioni di controllo: la buona pratica di laboratorio richiede che un controllo di qualità sia
effettuato almeno in un dosaggio per kit. Il siero di controllo per IgE fornito dovrebbe essere testato
ad intervalli definiti in modo da garantire una misura accurata delle ISU.
Pagina 36
ANALISI DEI RISULTATI ImmunoCAP ISAC
Acquisizione delle immagini
Per l’analisi di ImmunoCAP ISAC è consigliato utilizzare uno scanner laser confocale, in
particolare è raccomandato lo scanner per microarray CapitalBio LuxScan™ 10K.
Specifiche dello scanner per microarray
Dimensioni vetrino
26mm × 76mm
Risoluzione di scansione
10 µm
Sensibilità
0.1 molecole fluorescenti/μm2
Range Dinamico
16 bit
Massima area di
22×72 mm
scansione
Lunghezza d’onda laser
532 nm e/o 635 nm (Laser Verde e Rosso)
Fluorofori
Alexa Fluor 546 nm, Alexa Fluor 647 nm
Formato file
TIFF 16 bit in scala di grigi
Il protocollo di scansione per i vetrini ImmunoCAP ISAC viene approntato durante l’installazione
del sistema da parte di nostro personale qualificato. In generale, le immagini dovrebbero essere
acquisite utilizzando la massima potenza laser consigliata dal produttore dello strumento, mentre
gli altri valori andranno regolati in modo da evitare segnali a saturazione (fuori range)
sull’’immagine acquisita. Se si scansiona un vetrino ImmunoCAP ISAC per più di due volte è
possibile notare una diminuzione del segnale fluorescente dovuto al fenomeno di photo-bleaching
del fluoroforo.
Analisi delle immagini
Per l’analisi di ImmunoCAP ISAC, si raccomanda l’uso del programma MIA – Microarray Image
Analyzer che viene attivato da nostro personale qualificato al momento dell’installazione del
sistema. MIA consente l’analisi automatica dei vetrini ImmunoCAP ISAC. Le immagini dei vetrini
vengono analizzate e i risultati ottenuti sono memorizzati in un database o stampati per la
refertazione. MIA inoltre ha un’interfaccia che permette l’esportazione dei dati al programma
ImmunoCAP Information Data Manager (IDM).
Risultati
ImmunoCAP ISAC è un metodo quantitativo in cui gli anticorpi IgE specifici alle componenti
allergeniche sono misurati in ISU (ISAC Standardized Units). I risultati vengono presentati anche in
modo semiquantitativo divisi in 4 classi (0 = Non misurabile o molto basso, 1 = Basso, 2 =
Moderato o Alto, 3 = Molto alto). Il programma MIA effettua tale misurazione in modo automatico.
Range ImmunoCAP ISAC (Livello di anticorpi IgE)
0 (Non misurabile o molto basso)
Equivalenti a ISU
<0.3
1 (Basso)
≥0.3 - <1
2 (Moderato o Alto)
≥1 - <15
3 (Molto alto)
≥15
Pagina 37
Fig. 2A.
Esempio di scansione di
un’immagine di
ImmunoCAP ISAC
Ogni allergene è riportato
verticalmente in triplicato.
L’immagine è visualizzata in
pseudo colori per
apprezzare meglio le
differenze di intensità. Una
scala lineare di pseudo colori
è indicata sotto l’immagine.
0
65.535
Fig. 2B.
Schema di ImmunoCAP
ISAC.
Lo schema indica le
posizioni e le sigle dei 103
allergeni.
La disposizione e il pannello
degli allergeni posso subire
modifiche.
Pagina 38
LIMITI DELLA PROCEDURA
Una diagnosi clinica definitiva non deve basarsi sui risultati di un solo test, ma deve essere
formulata dal medico curante dopo la sua valutazione di tutti i referti clinici e di laboratorio.
Nelle allergie alimentari, è possibile che gli anticorpi IgE specifici circolanti non siano rilevabili
nonostante un’anamnesi chiara. Questi anticorpi possono essere infatti diretti contro allergeni che
vengono evidenziati o alterati durante i processi di preparazione industriale, di cottura o di
digestione, e che pertanto non sono presenti nell’alimento allo stato naturale per il quale viene
eseguito il test.
Risultati di classe 0 per i veleni indicano assenza o livelli non rilevabili di anticorpi IgE specifici per i
veleni. Tali risultati, tuttavia, non precludono l’esistenza di ipersensibilità clinica attuale o futura alle
punture di insetti.
Le caratteristiche riportate devono essere considerate parametri generali che possono variare per
componenti allergeniche singole. Queste caratteristiche sono state determinate solo per
componenti allergeniche rappresentative e potrebbero non essere applicabili per tutte le
componenti allergeniche.
CARATTERISTICHE DEL TEST
Limite rilevabilità: Il limite di rilevabilità (LoD) è stata determinato in accordo alle Linee Guida
EP5-A2 del CLSI per alcune componenti allergeniche rappresentative. Il limite di rilevabilità
generale è stato stimato essere al massimo 0.3 ISU che corrispondono approssimativamente a 0.3
kUA/L
Precisione: La precisione è stata determinata in accordo alle Linee Guida EP5-A2 del CLSI per
alcune componenti allergeniche rappresentative. Il CV intradosaggio ha mostrato valori fino al 15%
e il CV totale fino al 25 %.
Specificità analitica: IgE Detection Antibody non reagisce con altre immunoglobuline nel siero
umano.
GARANZIA
Le prestazioni qui riportate sono state ottenute utilizzando le procedure indicate. Ogni
cambiamento o modifica del procedimento operativo non raccomandato da Phadia AB può inficiare
il risultato finale. In tal caso Phadia AB declina ogni responsabilità, implicita od esplicita, inclusa
quella implicita di commerciabilità ed idoneità all’uso. In tale evenienza, Phadia AB ed i suoi
distributori autorizzati non saranno responsabili per danni indiretti o consequenziali.
Pagina 39
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Allergy. 2006 May;61(5):633-9. The performance of a component-based allergen-microarray in
clinical practice. Wohrl S, Vigl K, Zehetmayer S, Hiller R, Jarisch R, Prinz M, Stingl G, Kopp T.
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patients with atopy. Ott H, Schroeder CM, Stanzel S, Merk HF, Baron JM.
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diseases: state-of-the-art and future development. Harwanegg C, Hiller R.
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against the major pollen allergens Phl p 5a and Bet v 1a: discrepancy between IgE and IgG
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gatekeepers for allergy treatment. Hiller R, Laffer S, Harwanegg C et al.
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AUSTRIA Phadia Austria GmbH
Floridsdorfer Hauptstraße 1, AT-1210 VIENNA
Tel: +43 1 270 20 20, Fax: +43 1 270 20 20 20
BELGIUM Phadia NV/SA
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FINLAND Phadia Oy
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BP 610, FR-78056 ST QUENTIN YVELINES CEDEX
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GERMANY Phadia GmbH
Postfach 1050, DE-79010 FREIBURG
Tel: +49 761 47805 0, Fax: +49 761 47805 338
IRELAND Phadia Ltd (Irish Branch)
Beaghbeg, Carrigallen, LEITRIM
Tel: +44 1908 84 70 34, Fax: +44 1908 84 75 54
ITALY Phadia S.r.l.
Via Libero Temolo, 4, IT-20126 MILANO
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JAPAN Phadia K.K.
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KOREA Phadia Korea Co. LTD.,
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THE NETHERLANDS Phadia B.V.
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NORWAY Phadia AS
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Tel: +47 21 67 32 80, Fax: +47 21 67 32 81
PORTUGAL Phadia Sociedade Unipessoal Lda.
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SOUTH AFRICA Laboratory Specialities (PTY)
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SWEDEN Phadia AB
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g
Numero di lotto
E
Rischio biologico
h
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Y
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D
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