Isolamento, identificazione e attività cellulosolitica di microrganismi fungini associati
al biodeterioramento di un dipinto su tela del XIXesimo secolo
Matteo Montanari, Mirko Iotti, Gloria Innocenti
Alma Mater Studiorum Università degli Studi di Bologna, Dipartimento di
Protezione e Valorizzazione Agroalimentare, Via Fanin 46, 40127, Bologna, Italia
e.mail: [email protected]
Riassunto
Da un dipinto ad olio su tela della prima metà del XIXesimo secolo che
presentava diversi danni di natura microbiologica sulla tela di supporto, sono stati
ottenuti 22 isolati microbici, 21 dei quali fungini ed uno appartenente agli
attinomiceti. I microrganismi sono stati identificati in base ai caratteri biometrici e
morfologici e/o con metodi biomolecolari. Per verificarne il grado di attività
deteriogena, è stato condotto un test in vitro in cui è stata misurata la loro attività
cellulosolitica. Il test ha evidenziato che oltre il 50% dei microrganismi saggiati
possedeva tale attività. Un isolato di Penicillium citrinum ha evidenziato l’attività
cellulosolitica più elevata.
Summary: Isolation, identification and cellulolytic activity of microscopic fungi
associated with the biodeterioration of a XIXth century oil painting on canvas
Twenty two microbial isolates, 21 of them belonging to fungi and one to
actinomycetes, were isolated from an oil painted canvas made in the first half of
XIXth century. The painting exhibited serious damages in several areas of the canvas.
The micro-organisms isolated from deteriorated areas were identified through
biometric and morphological parameters, and/or biomolecolar methods. An in vitro
test for cellulolytic activity assessment was set up to verify their biodegradation
potential ability. The test showed that more than 50 % of the tested micro-organisms
showed a cellulolytic activity. An isolate of Penicillium citrinum showed the highest
cellulolytic activity.
Parole chiave: biodeterioramento, tela antica, funghi, attività cellulosolitica
Keywords: biodeterioration, ancient painting, fungi, cellulolytic activity
Introduzione
I dipinti antichi possono essere soggetti a diversi tipi di attacco da parte di
microrganismi deteriogeni in diversi punti dell’opera sia sul recto, attraverso gli strati
pittorici, sia, soprattutto, sul verso, dove la tela, di origine vegetale si trova spesso in
prossimità di aree con un microclima favorevole allo sviluppo microbico, quale, ad
esempio, un muro poroso ed umido. Il biodeterioramento della tela dei dipinti è un
fenomeno complesso e dinamico che dipende da numerosi fattori ambientali e
coinvolge generalmente più di un gruppo di microrganismi (Ciferri, 1999). L’attacco
alle fibre vegetali può avvenire in momenti diversi della storia del dipinto a seconda
del suo stato di conservazione e in punti diversi della sua superficie. Il risultato finale
di tale attacco può variare a seconda del tipo di organismo coinvolto nel degrado,
portando a danni estetici (efflorescenze e macchie pigmentate di vario colore che
possono estendersi fino alla superficie pittorica) e a danni strutturali (diminuzione del
grado di polimerizzazione della cellulosa e rottura delle fibre) (Caneva et al., 2005). I
fattori biologici del degrado interagiscono con quelli di origine chimico-fisica
portando inevitabilmente ad un’accelerazione degli effetti negativi. La fotoossidazione e i danni meccanici, ad esempio, favoriscono l’accesso da parte dei
microrganismi alle zone amorfe delle fibre di cellulosa, così come l’acidificazione
chimica contribuisce a creare condizioni favorevoli per la maggioranza dei
microrganismi deteriogeni dei tessuti (Sagar, 1988). Per quanto riguarda il degrado
dei dipinti, i microrganismi deteriogeni più pericolosi sono i funghi e gli attinomiceti,
capaci di degradare la celluosa a tenori idrici del substrato relativamente bassi
(Caneva et al., 2005). I meccanismi di degrado biologico dei tessuti, ed in particolare
della cellulosa che rappresenta il principale componente di una tela antica, sono di
due tipi e avvengono simultaneamente: attacco diretto enzimatico mediante una
batteria di enzimi idrolitici (endo ed esoglucanasi, β-glucosidasi) e attacco indiretto di
tipo chimico, mediante acidificazione del substrato per la produzione di metaboliti
secondari acidi (acido ossalico) e conseguente idrolisi acida della cellulosa (Kaneko
et al., 2005). A volte può verificarsi anche un attacco diretto di tipo ossidativo,
attraverso enzimi quali le perossidasi (Montegut et al., 1991; Caneva et al., 2005).
Le aree attaccate più rapidamente sono le cosiddette zone amorfe: quelle in cui
le fibre di cellulosa, per motivi sia ambientali, sia intrinseci al processo di
fabbricazione della tela stessa, hanno una dislocazione non ordinata e lassa nello
spazio. Le zone cristalline, invece, caratterizzate da una dislocazione delle fibre assai
serrata e ordinata, resistono meglio agli attacchi chimici ed alla maggior parte degli
attacchi biologici, sebbene alcuni gruppi fungini, fra cui alcune specie di Chaetomium
e Trichoderma, siano in grado di degradare lentamente anche queste zone attraverso
l’azione combinata di eso ed endo-β-glucanasi (Szostak-Kotowa, 2004; Caneva et al.,
2005).
In collaborazione con il Centro di Studio sui Materiali per il Restauro
(Cesmar7, Verona), è stato considerato il caso studio di una tela dell’800 soggetta a
un forte degrado biologico a livello del tessuto di supporto. Tale studio fa parte di una
ricerca più ampia finanziata dalla Regione Emilia Romagna (Sovvenzione Globale
Spinner 2013) avente lo scopo di mettere a punto metodologie per la diagnosi e la
prevenzione del deterioramento di opere d’arte. Lo scopo del presente studio è stato
quello di (i) identificare i microrganismi presenti nelle zone più degradate della tela;
(ii) costituire una collezione di microrganismi deteriogeni da utilizzare per successive
prove di laboratorio; (iii) caratterizzazione la loro capacità di degradare la cellulosa al
fine di adottare corrette procedure di disinfezione e consolidamento per il futuro
restauro definitivo dell’opera.
Materiali e Metodi
Descrizione dell’opera e tipologia del danno
Il dipinto Crocifissione”(155,5 x 90 cm) è opera del pittore veronese
Giovanni Caliari vissuto nella prima metà del XIXesimo secolo (Fig. 1). Dal punto di
vista artistico, il dipinto ripercorre la tradizione rinascimentale delle preparazioni
brune pigmentate con ocre e terre, contenenti anche bolo. La tela è fitta e di
produzione artigianale con presenza di sottile cimosa. La vernice, quasi certamente
originale, è di natura proteica probabilmente albumina (Bajocchi et al., 2009). A
causa delle pessime condizioni di conservazione (il dipinto si trovava nella sagrestia
di una chiesa veneta i cui muri erano soggetti a frequenti percolazioni di acqua) la tela
mostrava la presenza di numerose gore, macchie pigmentate di vario colore dal bruno
al grigio e nero ed un indebolimento del supporto tessile in diversi punti del supporto,
con la formazione, talvolta, di lacerazioni e strappi (Fig. 2).
Campionamento
Il campionamento è stato effettuato mediante l’impiego di tamponi sterili
applicati sul verso del dipinto, in quattro zone della tela che mostravano lacerazioni e
macchie pigmentate di diversa intensità e colore. Dopo l’applicazione sulla tela, ogni
tampone è stato posto in una provetta contenente 5 ml di soluzione fisiologica sterile
agitata con vortex per 1 minuto alla massima velocità. Aliquote di 0,1 ml per provetta,
sono state poste su piastre Petri ampie 9 cm di diametro contenenti agar Sabureau
(SA) e agar Patata Destrosio (PDA; Difco) con/senza l’aggiunta dei seguenti
antibiotici: streptomicina e clorotetraciclina (100 e 10 mg/l rispettivamente). Sono state
predisposte quattro repliche (piastre) per ogni substrato.
Il campionamento è stato effettuato anche mediante espianti eseguiti con
pinzette sterili di singole fibre di tessuto o di frammenti legnosi di telaio a contatto
con la tela. I frammenti di fibra di circa 3 mm di lunghezza, sono stati posti
singolarmente su piastre Petri ampie 9 cm di diametro contenenti SA e PDA
con/senza antibiotici. I frammenti legnosi sono stati posti all’interno di scatole Petri
contenenti carta bibula sterile bagnata con acqua anch’essa sterile al fine di creare una
camera umida. Tutte le piastre sono state poste alla temperatura di 20± 2°C, in
condizioni di luce naturale. Dopo 4-7 giorni di incubazione, le colonie fungine o
batteriche sviluppatesi sul substrato agarizzato sono state isolate in coltura pura su SA
o PDA. Dalle camere umide dopo 7 giorni di incubazione, il micelio presente sui
frammenti legnosi è stato isolato in coltura pura utilizzando gli stessi substrati sopra
indicati.
Identificazione dei microrganismi
L’identificazione dei microrganismi ottenuti in coltura pura è stata condotta
sulla base dei caratteri biometrici e morfologici con l’ausilio di opportune chiavi
analitiche (Ellis, 1971; 1976; Domsh et al., 1993). Alcuni isolati fungini sono stati
sottoposti a sequenziamento della regione ITS (Internal trascribe squence) del DNA
ribosomiale amplificata mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) con i primers
ITS1f e ITS4 (White et al., 1990; Gardes e Bruns, 1993). Le sequenze ottenute sono
state
confrontate
con
le
sequenze
nel
data
base
GenBank
(http//www.ncbi.nlm.nih.gov).
Attività cellulosolitica
Tutti gli isolati ottenuti dal campionamento sulla tela sono stati saggiati per la
loro attività cellulosolitica mediante la tecnica della crescita su colonna di agar
cellulosa acida amorfa, seguendo il protocollo di Tansey (1971). La cellulosa
utilizzata è stata preparata secondo il metodo di Walseth (1952) e di Rautela e
Cowling (1966). Il test ha avuto una durata di 21 giorni, la crescita dei microrganismi
su colonna di agar è stata misurata ogni sette giorni. L'attività cellulosolitica è
espressa come velocità di crescita su cellulosa amorfa (mm/giorno). Sono state
effettuate quattro ripetizioni per ogni isolato.
Risultati
Nella tabella sono elencati i microrganismi fungini isolati ed identificati
tramite caratteri morfologici/biometrici o sequenziamento della porzione genomica
ITS. L’unico microorganismo non fungino isolato dalla tela è stato un attinomicete
non ulteriormente identificato a livello di genere e privo di attività cellulosolitica. Gli
isolati sono conservati presso la micoteca del dipartimento di Protezione
Valorizzazione Agroalimentare (codice MM) e conservati in coltura pura sia su PDA
a 4° C, sia in PD Broth 15% in glicerolo a -80° C. Nella stessa tabella per ogni fungo
è indicata l’attività cellulosolitica media su cellulosa amorfa. La comparazione delle
sequenze ITS dei sei funghi sottoposti ad analisi biomolecolare con le sequenze
disponibili nei data base (GenBank), ha permesso il riconoscimento tassonomico
dell'isolato MM 231 come Penicillium citrinum (100% di indice di similarità), MM
230 come Penicillium roseopurpureum (100% di indice di similarità), MM 233 come
Thelebolus microsporus (99% di indice di similarità), MM 241 come Cladosporium
cladosporioides (100% di indice di similarità), MM 232 come Torula sp. (100% di
indice di similarità), MM 246 come Penicillium griseofulvum (100% di indice di
similarità). Per quanto riguarda l’attività cellulosolitica, 12 isolati dei 22 saggiati
hanno evidenziato tale attività. Penicillium citrinum è l’isolato che ha mostrato la
massima attività cellulosolitica (0,70 mm/giorno).
Conclusioni
Il campionamento effettuato sul verso del dipinto del Caliari ha evidenziato la
presenza sulla tela di una comunità microbica fungina piuttosto variegata, dominata in
particolare da funghi appartenenti ai generi Penicillium e Cladosporium,
frequentemente segnalati dalla letteratura specializzata come potenziali degradatori
dei tessuti di origine vegetale (Ciferri et al., 1999). L’analisi dell’attività
cellulosolitica, ha infatti evidenziato per alcuni di essi, una notevole capacità di
crescita su cellulosa amorfa, in condizioni di laboratorio ed in vitro. E’, quindi,
ipotizzabile che questi microorganismi abbiano un ruolo nel degrado della tela
pittorica e che rappresentino un fattore rischio di deterioramento da contenere con
interventi di disinfezione. Ciò non implica, tuttavia, che questi funghi siano i soli
responsabili del degrado in atto sulla tela. Le analisi sono state, infatti, effettuate in
condizioni ambientali e sperimentali diverse da quelle che si riscontrano sul verso di
un dipinto conservato in una sagrestia. Inoltre nel presente studio è stata determinata
la sola capacità cellulosolitica; non sono state considerate altre attività biodeteriogene
che potrebbero contribuire al degrado del dipinto, deteriorando altri substrati e
componenti presenti nell’opera, quali emicellulose e lignina, componenti delle fibre
della tela e leganti organici presenti nel film pittorico e negli strati preparatori
(Caneva et al., 2005). L’isolamento di Aureobasidium pullulans, ad esempio,
potrebbe indicare un’attività biodeteriogena sul film pittorico della tela nei confronti
dei leganti ad olio come affermato da O’Neill (1988) e Caneva et al. (2005).
Un’analisi più approfondita del profilo fisiologico dei potenziali biodegradatori
attraverso l’uso, ad esempio, della metodologia Biolog ed un’analisi della loro attività
su idonei provini con metodologie più sofisticate quale RT-PCR Real Time con sonde
specifiche, potrebbero fornire ulteriori indicazioni sul loro ruolo nel degrado delle tele
antiche. I risultati ottenuti nel presente lavoro, per quanto preliminari, hanno
comunque permesso di allestire una serie di prove tutt’ora in corso e parzialmente
pubblicate su Bajocchi et al., 2009, con provini di tela antica per la messa a punto di
una metodologia idonea alla disinfezione e consolidamento della tela per il restauro
finale dell’opera.
Bibliografia
Bajocchi G., Cauzzi D., Finozzi A., Signorini E., Montanari M., Recchia M.,
Tumminello A. (2009). Studi preparatori finalizzati al restauro di due dipinti
su tela dell’Ottocento. In: Atti del IV Congresso Internazionale Colore e
Conservazione. L’Attenzione alle Superfici Pittoriche: Materiali e Metodi per
il Consolidamento e Metodi Scientifici per Valutarne l’Efficacia (Kunzelman
D. coord.), Milano, 21-22 novembre 2008, 87-111.
Caneva G., Nugari M. P., Salvadori O. (2005). La biologia vegetale per i beni
culturali. I. Biodeterioramento e Conservazione. Nardini, Firenze, 396 pp.
Cifierri O. (1999). Microbial degradation of painting. Applied and Environmental
Microbiology, 65 (3), 879-885.
Domsh K. H., Gams W. (1993). Compendium of soil fungi. Vol I. IHW-Verlag,
Eichin, D, 859 pp.
Ellis, M.B. (1971). Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological
Institute, Kew, UK, 680 pp.
Ellis M.B. (1976). More Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological
Institute, Kew, UK, 507 pp.
Gardes M., Bruns T. D. (1993). ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular
Ecology, 2, 113-118
Kaneko S., Yoshitake K., Itakura S., Tanaka H., Akio Enoki A. (2005). Relationship
between production of hydroxyl radicals and degradation of wood, crystalline
cellulose, and a lignin-related compound or accumulation of oxalic acid in
cultures of brown-rot fungi. Journal of Wood Science, 51, 262-269.
Montegut D., Indictor, N., Koestler, R.J. (1991). Fungal deterioration of cellulosic
textiles, a review. International Biodeterioration, 28, 209-226
O’Neill T.B. (1988). Succession and interrelationship of microorganisms on painted
surfaces. International Biodeterioration, 24, 373-379
Rautela G. S., Cowling E. B. (1966). Simple cultural test for relative cellulolytic
activity of fungi. Applied Microbiology, 14, 892–98
Sagar B.R. (1988). Biodeterioration of textile materials and textile preservation. In:
Houghton D.R., Smith R.N., Eggings H.O.W (Eds.), Biodeterioration 7, Elsevier, NY, 683-702.
Szostak-Kotowa, J. (2004). Biodeterioration of textiles. International Biodeterioration
& Biodegradation. 53, 165-170.
Tansey M.A. (1971). Agar-diffusion assay of cellulolytic ability of thermophilic fungi.
Archives of Microbiology, 77, 1-11
Walseth, C. S. (1952). The influence of the fine structure of cellulose on the action of
cellulases. Tappi, 35, 233-238
White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J, (1990). Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications (Innis M.A., Gelfand D.H., Shinsky J.J., White
T.J., eds.), Academic Press, San Diego, USA, 315–322.
Tab.1. Elenco delle specie fungine isolate dalla tela del dipinto del Caliari e rispettiva
attività cellulosolitica su colonna di agar cellulosa acida amorfa.
Attività cellucodice losolitica (mm/
giorno)
Aspergillus sp.
MM249
n.r.
Aspergillus niger van Tieghem 1867
MM245
0,30 (±0,02)
Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud 1910
MM252
n.r.
Cladosporium sp.
MM236
0,07 (±0,02)
Cladosporium sp.
MM238
0,14 (±0,02)
Cladosporium sp.
MM242
n.r.
Cladosporium sp.
MM251
0,14 (±0,07)
Cladosporium cladosporioides* (Fres.) de Vries 1952
MM241
0,39 (±0,09)
Crysosporium merdarium (Link ex Greville) Carmichael 1962 MM244
n.r.
Cylindrocarpon magnusianum (Sacc.) Wollenw. 1926
MM250
n.r.
Epicoccum purpurascens Ehrenb. ex Schlect. 1824
MM237
n.r.
Epicoccum purpurascens Ehrenb. ex Schlect. 1824
MM240
0,42 (±0,03)
Humicola fusca Traaen 1914
MM239
n.r.
Penicillium sp.
MM247
0,33 (±0,02)
Penicillium sp.
MM248
0,49 (±0,02)
Penicillium citrinum* Thom 1910
MM231
0,70 (±0,04)
Penicillium funniculosum (? ) Thom 1910
MM235
0,37 (±0,02)
Penicillium griseofulvum* Dierckx 1901
MM246
0,66 (±0,02)
Penicillium roseopurpureum* Dierckx 1901
MM230
n.r.
Thelebolus microsporus* (Berk. & Br.) Kimbr 1967
MM233
0,09 (±0,04)
Torula sp.*
MM232
n.r.
Taxa fungini isolati dalla tela
* = funghi identificati tramite sequenziamento dell’ITS del DNA risbosomiale.
n.r. = non rilevabile
I valori di attività cellulosolitica rappresentano la media di quattro ripetizioni. In
parentesi è riportato il valore della deviazione standard.