FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE
TEST DEVICE, TOXIN A.
Test rapido immunocromatografico per il
rilevamento della Tossina A del
Clostridium Difficile nelle feci.
Cod. BSD596 Conf. 20 Pz.
I. PRINCIPIO
Il Clostridium difficile è la causa maggiore di diarrea e coliti
pseudomembranose associate all’assunzione di antibiotici (1). Oggi,
è uno dei patogeni più comuni rilevati e causa di infezioni importanti
nosocomiali in ospedali e case di cura (2, 3). L’organismo è stato
isolato da diversi habitat naturali, incluso terra, sabbia, letame di vari
mammiferi (mucche, asini e cavalli), e da cani, gatti, roditori e feci
umane (4). Il C. difficile produce almeno 3 potenziali fattori virulenti,
tra cui la Tossina A e la Tossina B sono pensate essere le più
importanti nelle infezioni associate alla patogenesi del C. difficile (5).
La Tossina A è un’enterotossina, che sembra interferire con il
citoscheletro delle cellule intestinali epiteliali rendendole non
funzionali mentre la Tossina B è una citotossina che induce forti
effetti citopatici nelle linee di colture di cellule dei tessuti (6). Siccome
non tutti i ceppi del Clostridium difficile producono tossine e
approssimativamente il 2% di adulti sani come più del 50% dei
bambini con età inferiore ai 2 anni, possono essere colonizzati dal
Clostridium difficile, il rilevamento delle tossine (Tossine A e B) nei
campioni di feci di pazienti con diarrea è più significativa che la
coltura dei batteri.
Il FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A è
un test rapido immunocromatografico a flusso laterale per il
rilevamento qualitativo della Tossina A del Clostridium difficile nelle
feci umane. Il test utilizza una combinazione d’anticorpi monoclonali
coniugati con un colorante (oro-colloidale) posizionato alla fine della
parte sinistra sulla membrana. Dopo la raccolta in una provetta
contenete la soluzione d’estrazione, il campione di feci viene disciolto
e dispensate alcune gocce d’estratto nel pozzetto (A) del dispositivo
di reazione. Quando il campione fluisce attraverso il dispositivo
assorbente, l’anticorpo-gold coniugato si lega all’antigene della
Tossina A (eventualmente presente nel campione) formando un
complesso antigene-anticorpo. Questo complesso si lega
all’anticorpo policlonale anti-Tossina A nella finestra di reazione
positiva producendo una banda di colore rosa (B). In assenza della
Tossina A, non si forma alcuna banda nella zona di reazione positiva.
Il campione continua a fluire lungo il dispositivo assorbente,
attraversando la zona di reazione positiva e giungendo nella zona del
controllo (C). Il coniugato libero si lega al reagente nella zona del
controllo producendo una banda di colore rosa che dimostra che i
reagenti hanno funzionato correttamente.
II. COMPONENTI DEL FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST
DEVICE, TOXIN A
Ogni Kit contiene il necessario per eseguire 20 test:
- 20 dispositivi FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST
DEVICE TOXIN A,
- 20 pipette monouso,
- 20 provette riempite con 2 ml di soluzione di estrazione,
- 20 applicatori,
- 1 foglietto illustrativo.
III. STOCCAGGIO E STABILITÀ
1. Il FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICLE TEST DEVICE TOXIN A
dovrebbe essere conservato a temperatura ambiente (4° - 30°C)
nelle buste termosaldate.
2. Non congelare il kit.
3. Il FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A
è stabile fino alla data di scadenza scritta nell’etichetta della
confezione.
IV. PRECAUZIONI
1. Questo test è destinato all’uso diagnostico in vitro e solo per uso
professionale.
2. Leggere attentamente il foglietto illustrativo prima di utilizzare
questo test.
3. Non utilizzare dopo la data di scadenza scritta nell’etichetta della
confezione.
4. Non utilizzare il dispositivo conservato in un involucro protettivo
danneggiato.
5. Tutti i reagenti ed i materiali venuti in contatto con campioni
potenzialmente infetti devono essere trattati con disinfettanti
appropriati o autoclavati a +121°C per almeno un’ora.
6. Indossare gli appositi D. P. I. durante l’esecuzione del test.
7. Non mangiare, bere o fumare nell’area dove sono maneggiati i
reagenti del kit ed i campioni.
8. Evitare qualsiasi contatto tra le mani, occhi e naso durante la
raccolta del campione e l’esecuzione del test.
V. ISTRUZIONI PER LA RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI
CAMPIONI
1) Note preliminari
I campioni di feci dovrebbero essere raccolti il più presto possibile
dopo l’insorgenza dei sintomi. Campioni diluiti possono essere
stoccati da +2 a +8°C per 3 giorni senza interferenze con la
performance del test. Per stoccaggi a lungo termine, conservare i
campioni non diluiti a -20°C. Non congelare e scongelare
ripetutamente i campioni, può causare errori nei risultati.
Attenzione! Non raccogliere i campioni in contenitori contenenti
sostanze conservanti, terreni di coltura, siero animale o
detergenti perché tali sostanze potrebbero interferire con il test.
2) Procedura
a) Scrivere il nome del paziente o numero di controllo, nella
provetta di plastica contenente la soluzione d’estrazione.
b) Aprire la provetta e, usando l’applicatore, trasferire un campione
di feci (del volume di 1 pisello) nella provetta, in caso di feci solide.
In caso di feci liquide, trasferire 200 µl di liquido nella provetta.
c) Chiudere bene il tappo e mescolare le feci con la soluzione
d’estrazione agitando bene.
d) Lasciare depositare il particolato sul fondo della provetta o
centrifugare a 500-1.000 RPM per 1 minuto.
VI. PROCEDURA
1. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere il test dalla bustina termosaldata.
3. Aprire la provetta contenete l’estratto.
4. Usando la pipetta di plastica, dispensare 6 gocce (200 µl)
d’estratto nel pozzetto (A).
5. Leggere i risultati del test 15 minuti dopo la dispensazione del
campione nel dispositivo.
VII. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Negativo: Appare solo una banda
colorata nella zona del controllo (C). Non
sono visibili bande nella zona del test (B).
Il test non contiene Tossina A del
C.difficile.
Positivo: Oltre alla banda del controllo
(C), si distingue nettamente la banda
nella zona reattiva del test (B).
Il test contiene Tossina A del C.difficile.
Non valido: non appare la banda del controllo. Deterioramento o
procedure improprie sono le principali cause della non comparsa del
controllo. Rivedere la procedura e ripetere il test.
VIII. CARATTERITICHE
a) Sensibilità analitica:
Le prestazioni del test sono state valutate utilizzando una serie di
soluzioni diluite utilizzando l’antigene purificato della Tossina A
disponibile in commercio. Il test è in grado di rilevare una
concentrazione di 4 ng/ml.
b) Sensibilità diagnostica e specificità:
E’ stato condotto uno studio su 63 campioni di feci utilizzando FASTSTEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A in
parallelo con i metodi di citotossicità e colture cellulari.
I risultati sono riassunti nella tabella 1:
FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE
TEST DEVICE TOXIN A
+
Citotossicità
+
13
2
4
44
Tabella 1: Valutazione dei risultati
Tutti i campioni evidenziano risultati coincidenti utilizzando i metodi di
citotossicità e colture cellulari. Dalla tabella sopra riportata, la
sensibilità del metodo FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST
DEVICE TOXIN A è 86,7% (13/15) in raffronto al metodo della
citotossicità e la specificità è del 91,7 % (44/48) in raffronto al metodo
della citotossicità.
c) Cross Reaction:
Il FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICLE TEST DEVICE TOXIN A
evidenzia considerevoli risultati negativi con concentrazioni della
tossina B fino a 500 ng/ml.
IX.LIMITAZIONI
1. Il FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN
A è specifico per il rilevamento dell’antigene della Tossina A nei
campioni di feci.
2. Come per tutti i test di screening, il medico deve confermare la
diagnosi ottenuta usando il test, con altri metodi clinici.
3. Un risultato negativo non esclude un infezione da C. difficile. Può
Ist. BSD596 Rev. 01 del 16/01/2009
essere causato da digestione proteolitica delle tossine dovuta ad
un’impropria conservazione del campione. Se esiste un fondato
sospetto di infezione, dovrebbe essere testato un altro campione di
feci.
4. Un risultato positivo non esclude la presenza di un altro patogeno.
5. La presenza di sangue nelle feci in quantità significativa può
portare a risultati falsi positivi in limitati casi.
6. I colori delle bande presenti nelle zone del test e del controllo
possono cambiare leggermente in base all’aspetto del campione di
feci. Per esempio bande di colore verde scuro (al posto di bande
color rosa) in caso di campioni di feci verdastre o piuttosto scure. I
risultati devono essere interpretati normalmente, cioè 2 bande per un
risultato positivo ed una banda per un risultato negativo.
X. BIBLIOGRAFIA
1. Lierly, D,M, H.C. Krivan, and T.D. Wilkins. 1988. Clostridium
difficile: its disease and toxins. Clin. Microbiol. Rev. 1:1-18.
2. Mulligan, M.E., L.R. Peterson, R.Y.Y. Kwok, C.R. Clabots, and
D.N. Gerding. 1988. Immunoblots and plasmid fingerprints compared
with serotyping and polyscrylamide gel electrophoresis for typing
Clostridium difficle. J. Clin. Microbiol. 26:41-31.
3. Gillingan, P.H., L.R. McCarthy, and V.M. Genta. 1981. Relative
frequency of Clostridium difficile in patients with diarrheal disease. J.
Clin. Microbiol. 14:26-31.
4. George, W.L. 1989. Antimicrobial agent-associated diarrhea and
colitis, p661-678. In S.M. Finegold and W.L. George (ed.), Anaerobic
infections in humans. Academic press, Inc. New York.
5. Sullivan, N.M., Pellet S., and T.D. Wilkins. 1982. Purification and
characterization of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect.
Immun. 35:1032-1040.
6. Lyerly, D.M., D.E. Lockwood, S.H. Richardson, and T.D.
Wilkins. 1982. Biological activities of toxins A and B of Clostridium
difficile. Infect. Immun. 35:1147-1150.
FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE
TEST DEVICE, TOXIN A.
Immunocromatogrphic rapid test for the
detection of Clostridium Difficile Toxin A in
feces.
Cod. BSD596 Conf. 20 Pz.
I. PRINCIPLE
Clostridium difficile is a major cause of antibiotic-associated diarrhea
and pseudomembranous colitis (1). It is now one of the most
commonly detected pathogens and an important cause of nosocomial
infections in hospitals and nursing homes (2, 3). The organism has
been isolated from diverse natural habitats, including soils, hay, sand,
dung from various large mammals(cow, donkey and horses), and
from dog, cat, rodent and human feces (4). C. difficile produces at
least three potential virulence factors from which Toxin A and Toxin B
are thought to be the most important in the pathogenesis of C. difficile
associated diseases (5). Toxin A is an enterotoxin which seems to
interfere with the cytoskeleton of the intestinal epithelial cells
rendering them non functional while Toxin B is a cytotoxin that
induces strong cytopathic effects in tissue cultures cell lines (6). Since
not all strains of Clostridium difficile produce toxins and approx. 2% of
healthy adults as well as up to 50% of children younger than 2 years
can be colonized with Clostridium difficile, the detection of the toxins
(Toxin A and Toxin B) in stool samples of patients with diarrhea is
more significant than culturing bacteria. The FAST-STEP
CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A is a lateral flow,
immunocromatographic rapid test for the qualitative detection of
Clostridium difficile Toxin A in human feces. The method employs a
unique combination of monoclonal dye conjugate and polyclonal solid
phase antibodies to selectively identify Toxin A with a high degree of
sensibility and specificity. After collection in a tube containing the
extraction solution, the feces sample is dissolved and few drops of
this extract are added into each well (A) of the reaction device. As the
test sample flows through the absorbent device, the labelled
antibody-dye conjugate binds to the Toxin A antigen (when present in
the sample) forming an antibody antigen complex. This complex
binds to the polyclonal anti-Toxin A antibody in the positive reaction
zone producing a rose-pink coloured band (B). In the absence of
Toxin A, there is no line in the positive reaction zone. The reaction
mixture continues flowing through the absorbent device, past the
positive reaction zone and control zone. Unbound conjugate binds to
the reagent in the control zone producing a rose-pink coloured band
demonstrating that the reagents are functioning correctly(C).
II. FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE, TOXIN A,
KIT COMPONENTS
Each kit contains everything needed to perform 20 tests.
- 20 FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE
TOXIN A reaction devices,
- 20 plastic droppers,
- 20 plastic tubes filled with 2 ml of extraction solution,
- 20 sample applicators,
- 1 instruction leaflet.
III. STORAGE AND STABILITY
1. All FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN
A kit components should be stored in the sealed pouch at room
temperature (between +4°C and +30°C).
2. Do not freeze the test kit.
3. The FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE
TOXIN A kit is stable until the expiry date stated on the package
label.
IV. PRECAUTIONS
1. This test is designed for in vitro diagnostic use and professional
use only.
2. Read carefully instructions leaflet before using this test.
3. Do not use beyond the expiry date stated on the package label.
4. Do not use a test from a damaged protective wrapper.
5. All reagents and materials coming in contact with potential
infectious specimens must be treated with appropriate disinfectants or
autoclaved at +121°C for at least one hour.
6. Wear protective clothing such as laboratory coats and disposable
gloves while assaying samples.
7. Do not eat, drink or smoke in the area where specimens and kit
reagents are handled.
8. Avoid any contact between hands and eyes or nose during
specimen collection and testing.
V. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
1) Preliminary notes
Stool specimen should be collected as soon as possible after onset of
symptoms. Diluted samples may be stored at +2°C to 8°C for 3 days
without interference with assay performance. For long term storage of
undiluted specimens, storage at -20°C or colder is recommended.
Repeated freezing and thawing of samples is not recommended and
may cause erroneous results.
Caution! Do not collect specimens in containers having media,
preservatives, animal serum or detergents as any of these may
interfere with the test.
2) Procedure
a) Label the plastic tube containing the extraction solution with
patient’s name or control number.
b) Open the tube and, using the sample applicator, transfer into it a
stool sample, volume of a pea, in case of solid stool or 200 µl in
case of liquid stool.
c) Tighten the cap and mix the stool sample and the diluent by
shaking well until the sample is dissolved.
d) Let the tube stand along enough for the large particles to settle
to the bottom of the tube. Alternatively, centrifuge the tube at 5001,000 RPM for 1 minute.
VI. ASSAY PROCEDURE
1. Bring all the reagents at room temperature.
2. Remove the test device from the pouch by tearing along the split.
3. Open the plastic tube containing the extracted sample.
4. Using the plastic pipette, add 6 drops (200 µl) of the extracted
solution into each of the sample well (A).
5. Read the test results 15 minutes after addition of the sample to the
device.
VII. READING TEST RESULTS
POSSIBLE RESULTS PATTERN
Negative: Only one coloured band
appears in the control window (C). No
band is visible in the test window. The
test does not contain C.difficile Toxin A.
Positive: In addition to the control band
(C), a clearly distinguishable band also
appears in the test window (B). The test
contains C.difficile Toxin A.
Inconclusive: If there is no distinct coloured band visible in both the
test and control window, the test is inconclusive. Repeat the test.
VIII. PERFORMANCE CHARACTERISTIC
a) Analytical Sensitivity:
The performance of the test has been evaluated using a range of
Ist. BSD596 Rev. 01 del 16/01/2009
diluted solutions prepared from a commercially available purified toxin
A antigen. The test is able to detect a concentration of 4 ng/mL.
b) Diagnostic sensitivity and specificity:
A study was performed on 63 feces samples using the FAST-STEP
CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A test in
comparison with the cytoxicity and cellular culture methods.
The results are summarized in the table 1:
FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE
TEST DEVICE TOXIN A
+
Cytoxicity
+
13
2
4
44
Table 1: Evaluation results.
All samples showed identical results using the cytoxicity and the
cellular culture methods. From the above table, the sensitivity of
FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A test
is 86,7 (13/15) compared to the cytoxicity method and the specificity
is 91,7% (44/48) compared to the cytoxicity method.
c) Cross Reaction:
The FAST-STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE TOXIN A
showed consistently negative results up to 500 ng/mL Toxin B.
IX. LIMITATIONS
1. The FAST- STEP CLOSTRIDIUM DIFFICILE TEST DEVICE
TOXIN A is specifically designed to detect Toxin A antigen in the stool
samples.
2. As for any in vitro diagnostic procedure, the physician should
confirm the test results with other clinical methods.
3. A negative result does not generally exclude a C. difficile infection.
It can be caused by proteolytic digestion of the toxins due to improper
specimen storage. If a reasonable suspicion of an infection exists,
another stool specimen should be investigated.
4. A positive result does not exclude the presence of other
pathogens.
5. The presence of blood in the feces samples in significant quantity
may lead to false positive results in limited cases.
6. Test and control lines colours may slightly change depending on
the stool sample aspect. For example dark green lines (instead of
pink lines) have been reported when assaying greenish or darkish
stool samples. The test result should be interpreted as usual, i. e. two
lines for a positive results and one line for a negative result.
X. BIBLIOGRAPHY
1. Lierly, D,M, H.C. Krivan, and T.D. Wilkins. 1988. Clostridium
difficile: its disease and toxins. Clin. Microbiol. Rev. 1:1-18.
2. Mulligan, M.E., L.R. Peterson, R.Y.Y. Kwok, C.R. Clabots, and
D.N. Gerding. 1988. Immunoblots and plasmid fingerprints compared
with serotyping and polyscrylamide gel electrophoresis for typing
Clostridium difficle. J. Clin. Microbiol. 26:41-31.
3. Gillingan, P.H., L.R. McCarthy, and V.M. Genta. 1981. Relative
frequency of Clostridium difficile in patients with diarrheal disease. J.
Clin. Microbiol. 14:26-31.
4. George, W.L. 1989. Antimicrobial agent-associated diarrhea and
colitis, p661-678. In S.M. Finegold and W.L. George (ed.), Anaerobic
infections in humans. Academic press, Inc. New York.
5. Sullivan, N.M., Pellet S., and T.D. Wilkins. 1982. Purification and
characterization of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect.
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6. Lyerly, D.M., D.E. Lockwood, S.H. Richardson, and T.D.
Wilkins. 1982. Biological activities of toxins A and B of Clostridium
difficile. Infect. Immun. 35:1147-1150.
Ist. BSD596 Rev. 01 del 16/01/2009