5. REAGENTI FORNITI
96 - Ciascun kit contiene materiale sufficiente per 96
determinazioni.
5.1. CONTENUTO DEL TEST IDEIA BORRELIA BURGDORFERI, IgG
Key Code TSMX7841
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
CA 1 855 805 8539
US 1 855 2360 190
ROW +31 20 794 7071
IDEIA Borrelia
burgdorferi IgG
K602911-2..........................96 Tests
IT
2. S OMMARIO
La borreliosi di Lyme è una infezione multisistemica causata
dalla spirocheta B. burgdorferi sensu lato trasmessa da morso di
zecca1,2. La malattia è stata individuata anche in Russia, in Cina e
in Giappone.
Nel primo stadio si manifesta un’eruzione cutanea caratteristica,
detta eritema migrante (EM), a distanza di giorni o settimane
dal morso della zecca. L’infezione può essere accompagnata da
sintomi non specifici quali mal di testa, malessere, febbre, mialgia
e artralgia. Nel secondo stadio, che si manifesta dopo settimane o
mesi, la malattia si presenta generalmente con meningoradicolite
linfocitica con o senza paralisi dei nervi cranici e paresi delle
estremità (sindrome di Bannwarth), miocardite o artrite. Nel
terzo stadio, che interessa la pelle, il sistema nervoso centrale
o le articolazioni, si possono manifestare acrodermatite cronica
atrofica (ACA), encefalomielite progressiva cronica o artrite a
distanza di molti anni dall’infezione.
A causa della presenza estremamente scarsa di B. burgdorferi nelle
lesioni patologiche e nei fluidi corporei, la coltura e le tecniche
PCR più recenti per la ricerca diretta del DNA spirochetale non
hanno avuto successo nella diagnosi di routine della borreliosi di
Lyme. Pertanto, il metodo più idoneo è tuttora la determinazione
degli anticorpi B. burgdorferi-specifici.
IDEIA Borrelia burgdorferi IgG utilizza come antigene per il saggio
il flagello nativo purificato DK1 del ceppo B. afzelii. Il flagello è
altamente immunogenico e induce una immunorisposta precoce,
intensa e persistente4,5. Rispetto all’antigene convenzionale e più
comunemente usato per il saggio, che si basa sull’estratto della
spirocheta dall’intera cellula, l’antigene flagellare nativo purificato
consente sensibilità e specificità diagnostica migliori dei dosaggi
sierologici per la borreliosi di Lyme6,7. Inoltre, non presentando
variazioni di rilievo tra i ceppi di B. burgdorferi il flagello utilizzato
come antigene per il saggio è idoneo in tutte le aree geografiche.
3. PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
IDEIA Borrelia burgdorferi IgG utilizza micropozzetti ricoperti di
flagello di Borrelia nativo purificato. Gli anticorpi presenti nei
campioni di siero umano si legano ai micropozzetti sensibilizzati
durante la prima incubazione. Dopo il lavaggio dei micropozzetti
per eliminare le proteine del siero non legate, si aggiunge nei
micropozzetti un anticorpo coniugato con perossidasi. Il coniugato
si lega specificatamente agli anticorpi di classe IgG umani attaccati
all’antigene del flagello. Dopo aver eliminato l’eccesso di coniugato
mediante lavaggio, per aggiunta di un cromogeno la perossidasi
legata catalizza lo sviluppo di una colorazione blu. L’acido
aggiunto per bloccare la reazione fa virare il colore da blu a giallo.
L’intensità della colorazione corrisponde alla concentrazione
degli anticorpi B. burgdorferi-specifici nel campione. L’intensità
di colorazione viene determinata spettrofotometricamente a
450nm e il valore di assorbanza del campione viene confrontato
con i valori di assorbanza dei controlli.
4. DEFINIZIONI
I seguenti simboli sono stati utilizzati nelle informazioni del
prodotto
Numero catalogo
Dispositivo medico per la diagnostica in vitro
Per uso in laboratorio
Fare riferimento alle Istruzioni per l’uso
Limiti di temperatura (temp. di conservazione)
Data di scadenza
Prodotto da
Pipetta da 8 canali per la dispensazione di 100µL (facoltativo)
10.1.NOTE SULLA PROCEDURA
Copripiastra in plastica
10.1.1
I reagenti standard (diluente per campioni, tampone di
lavaggio concentrato, substrato e soluzione bloccante)
possono essere utilizzati, con una procedura simile,
anche nei saggi IDEIA Borrelia burgdorferi IgM (
K603011-2) e IDEIA Lyme Neuroborreliosis ( K6028112). Questo consente di eseguire l’analisi dei suddetti
saggi in parallelo utilizzando una unica diluizione del
siero del paziente.
10.1.2
La conferma della performance del test si basa
sull’analisi in duplicato di tutti i campioni. Se si prevede
di analizzare i campioni dei pazienti singolarmente, si
raccomanda agli utenti di eseguire il test solamente
dopo aver acquisito sufficiente esperienza sulle
caratteristiche di performance del saggio. La variazione
intra-saggio (CV%) è circa 50% superiore quando viene
basata su una determinazione singola.
10.1.3
Se non è disponibile un agitatore regolabile a 500rpm,
la velocità di agitazione delle strisce durante le due fasi
di incubazione può essere ridotta a 300rpm senza effetti
negativi sulla performance del test; alternativamente,
è disponibile un protocollo in condizioni statiche. Si
prega di contattare la filiale il distributore per ulteriori
informazioni su un protocollo idoneo alle condizioni
disponibili.
Agitatore per piastre per microtitolazione regolabile ad una
velocità minima di 500rpm con un diametro orbitale di 3-4mm.
Per informazioni sull’idoneità degli agitatori/incubatori contattare
la filiale o il distributore Oxoid di zona
Contaminuti
Lavapiastre automatico (facoltativo) o altra attrezzatura idonea
per il lavaggio di strisce da 8 micropozzetti (Sezione 10.2.3)
Spettrofotometro o lettore di micropiastre con possibilità di lettura
di piastre da 96 pozzetti suddivise in strisce da 8 micropozzetti
ciascuna ad una assorbanza di 450nm con un valore di riferimento
nell’intervallo 620-650nm. (facoltativo, vedi Sezione 10.3, Lettura
dei risultati del test)
1,5mL di controllo positivo per
le IgG: siero umano in soluzione
tampone con agente antimicrobico e
colorante verde scuro
Per questo saggio, sono disponibili note operative per l’uso di
sistemi automatici aperti. Contattare la filiale o il distributore
Oxoid di zona
Il kit IDEIA Borrelia burgdorferi IgG consente di eseguire sino a
10 cicli individuali in 3 mesi, prima della data di scadenza. Per
garantire la performance ottimale del kit è importante che tutti
i reagenti non utilizzati siano conservati seguendo le seguenti
istruzioni:
Micropozzetti -
Aprire la bustina contenente la piastra tagliando lungo la
chiusura. Staccare i micropozzetti nel numero richiesto per il
dosaggio e riporli nel blocco. Degli 8 micropozzetti di una striscia,
due consentono la determinazione in duplicato di un campione e i
rimanenti 6 sono utilizzati per il diluente per campione, il controllo
cut-off per le IgG e il controllo positivo per le IgG. Ciascuna
striscia addizionale consente l’analisi di campioni provenienti da
4 pazienti. Utilizzando tutte le strisce contemporaneamente, si
possono analizzare 45 campioni provenienti da 45 pazienti.
Rimuovere le strisce non necessarie dal blocco della piastra
e riporle immediatamente nella bustina in plastica sigillabile
con l’agente essiccante. Sigillare accuratamente la bustina e
conservare a 2-8°C. I micropozzetti possono essere utilizzati entro
12 settimane dalla prima apertura se vengono seguite le istruzioni
indicate per la conservazione.
5.2.2
Carta assorbente pulita (per asciugare i micropozzetti)
2,5mL di controllo cut-off per le IgG:
siero umano in soluzione tampone
con agente antimicrobico e colorante
verde chiaro.
5.2. PREPARAZIONE, CONSERVAZIONE E RIUTILIZZO DEI
COMPONENTI DEL KIT
5.2.1
Contenitori per reagenti per pipetta da 8 canali (facoltativo)
Nota: per il lavaggio di una striscia da 8 micropozzetti con un
lavapiastre automatico dotato di testa da 8 micropozzetti, è
importante riempire completamente la striscia con micropozzetti
vuoti
25mL di soluzione bloccante: acido
solforico 0,46mol/L
Diluente per campione -
9. R ACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG è previsto esclusivamente per
l’analisi di campioni di siero umano. L’analisi dei campioni sierici
dall’aspetto torbido o viscoso può portare a risultati non affidabili
a causa di errori di pipettatura. I campioni di siero possono essere
conservati per 14 giorni a 2-8°C prima dell’analisi e sino a 6 mesi
a –20°C o ad una temperatura inferiore.
10. P ROCEDURA DEL TEST
PRIMA DI ESEGUIRE IL TEST FARE RIFERIMENTO ALLA SEZIONE
8.2 (PRECAUZIONI TECNICHE).
50mL di tampone di lavaggio
concentrato
25x.
Soluzione
tamponata con detergente e agente
antimicrobico.
12mL
di
substrato:
perossido
stabilizzato
e
3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina
in
una soluzione tampone diluita.
È stato riportato che la TMB
non è cancerogena. Tuttavia, si
raccomanda l’utilizzo di dispositivi
di protezione individuale per evitare
l’esposizione diretta al prodotto
8. PRECAUZIONI
- Per uso diagnostico in vitro. Il personale che esegue
un saggio utilizzando questo prodotto deve essere specializzato
nell’uso del test ed esperto in procedure di laboratorio.
8.1. PRECAUZIONI DI SICUREZZA
10.2.PROCEDURA OPERATIVA
8.1.1
NOTA:
la procedura operativa richiede l’uso di un agitatore
per piastre per microtitolazione. Per informazioni sull’idoneità
degli agitatori contattare la filiale il distributore.
8.1.2
Ciascun siero di donatore utilizzato per la preparazione
dei controlli delle IgG è stato analizzato individualmente
e confermato negativo per l’antigene di superficie del
virus dell’epatite B, per gli anticorpi diretti contro l’HIV e
contro gli agenti virali responsabili dell’epatite C.
La soluzione bloccante contiene acido solforico
(0,46mol/L). Indossare indumenti protettivi e protezioni
oculari per evitare il contatto con gli occhi e con la pelle.
Se vengono utilizzate strisce multiple, si raccomanda di utilizzare
una pipetta a 8 canali per l’aggiunta del coniugato, del substrato e
della soluzione bloccante.
10.2.1 Aggiunta del campione e del controllo
Collocare il numero richiesto di strisce nel portapozzetti.
Aggiungere 100µL di siero diluito negli opportuni micropozzetti.
Aggiungere 100µL di controllo positivo, di controllo cut-off e di
diluente per campioni in micropozzetti differenti. (Includere
almeno 3 micropozzetti con il controllo cut-off, 2 micropozzetti
con il controllo negativo e 1 micropozzetto con il diluente per
campione per ciascun lotto di campioni analizzati).
8.1.3
Non mangiare, bere, conservare né preparare cibi o
applicare cosmetici nell’area di lavoro designata dove
vengono manipolati reagenti e campioni.
8.1.4
Non pipettare i materiali con la bocca.
8.1.5
Durante la manipolazione dei campioni clinici si
raccomanda l’utilizzo di guanti monouso e di lavarsi
sempre le mani dopo aver lavorato con materiale infetto.
8.1.6
Smaltire tutti i campioni clinici in conformità alle
normative locali.
Coprire i micropozzetti ed incubare a temperatura ambiente (2025°C) con agitazione per 60 minuti.
8.1.7
Schede di sicurezza dei materiali sono disponibili su
richiesta per gli operatori specializzati.
10.2.3 Lavaggio dei micropozzetti
8.1.8
Il substrato TMB contiene 1-metil-pirrolidone (NMP)
con una concentrazione di >5% e <10% che è classificato
come tossico per la riproduzione dalle Direttive della
Comunità Economica Europea (CEE). Cat 2. Le frasi di
Rischio (R) e Sicurezza (S) applicabili sono le seguenti.
R61
Può danneggiare i bambini non ancora
nati.
S53
Evitare l’esposizione - procurarsi speciali
istruzioni prima dell’uso
S45 In caso di incidente o malessere, consultare
immediatamente il medico (se possibile,
mostrargli l’etichetta)
8.2. PRECAUZIONI TECNICHE
10.2.2 Incubazione dei campioni
I micropozzetti devono essere lavati con tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro (vedi Sezione 5.2.3).
La tecnica di lavaggio è fondamentale per la performance del test
(sezione 8.2.10) e deve pertanto essere eseguita correttamente,
in modo che i micropozzetti vengano riempiti (con un minimo
di 350µL di soluzione tampone alla concentrazione di lavoro) e
svuotati completamente.
Sono necessari quattro cicli di lavaggio, con tecniche di lavaggio
automatico o manuale, che devono comprendere 2 minuti di
immersione durante il secondo lavaggio o un totale di 2 minuti di
immersione durante il ciclo completo.
Lavaggio manuale
Per il lavaggio manuale dei micropozzetti, aspirare il contenuto o
svuotare i micropozzetti capovolgendoli e, utilizzando il tampone
di lavaggio preparato di fresco, accertarsi che vengano riempiti e
svuotati completamente. Dopo ogni ciclo di lavaggio, rimuovere
il tampone di lavaggio residuo picchiettando i micropozzetti
capovolti su carta assorbente pulita. Il lavaggio manuale risulta
più efficiente se il tampone di lavaggio viene versato da una
angolazione tale da produrre un vortice nel micropozzetto. Dopo
il lavaggio finale, la piastra deve essere capovolta e picchiettata
su carta assorbente per rimuovere le tracce residue di tampone
di lavaggio.
8.2.1
Fornito concentrato 25x. Preparare il tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro aggiungendo 1 parte di tampone di
lavaggio concentrato a 24 parti di acqua deionizzata o distillata
fresca (alternativamente, aggiungere il contenuto del flacone del
tampone di lavaggio concentrato a 1200mL di acqua deionizzata
o distillata fresca). Il tampone di lavaggio alla concentrazione di
lavoro deve essere conservato a 2-8°C e utilizzato entro 3 mesi.
Conservare la soluzione concentrata non utilizzata a 2-8°C.
I componenti non devono essere utilizzati dopo la data
di scadenza indicata sulle etichette. Non mischiare o
scambiare tra loro reagenti provenienti da lotti differenti,
fatta eccezione per i reagenti standard (diluente per
campioni, soluzione di lavaggio concentrata, substrato e
soluzione bloccante) che possono essere utilizzati anche
nei saggi IDEIA™ Borrelia burgdorferi, IgM ( K603011-2)
e IDEIA™ Lyme Neuroborreliosis ( K602811-2).
8.2.2
I reagenti sono forniti a concentrazioni di lavoro fisse.
Qualsiasi alterazione dei reagenti o la conservazione
non conforme a quanto indicato nella Sezione 5.2 può
influire negativamente sul risultato del test.
Lavaggio automatico
5.2.4
8.2.3
Evitare la contaminazione dei reagenti.
8.2.4
tilizzare pipette monouso o puntali differenti per
U
ogni campione, controllo o reagente per evitare la
contaminazione crociata dei campioni, dei controlli e
dei reagenti, che può portare a risultati incorretti.
I lavapiastre devono essere calibrati correttamente per assicurare
che i micropozzetti siano riempiti e svuotati completamente
dopo ogni lavaggio. Dopo il lavaggio finale, la piastra deve essere
capovolta e picchiettata su carta assorbente per rimuovere le
tracce residue di tampone di lavaggio.
8.2.5
onservare l’acqua deionizzata o distillata per la
C
diluizione dei reagenti concentrati in contenitori puliti
per evitare contaminazione microbica.
Pronto per l’uso. Conservare il diluente per campione non
utilizzato a 2-8°C.
5.2.3
Tampone di lavaggio concentrato -
Controllo cut-off per le IgG -
Pronto per l’uso. Conservare il controllo cut-off per le IgG non
utilizzato a 2-8°C.
5.2.5
Controllo positivo per le IgG -
Pronto per l’uso. Conservare il controllo positivo per le IgG non
utilizzato a 2-8°C.
5.2.6
Numero lotto
Piastra per microtitolazione da 96
pozzetti (12 strisce di 8 micropozzetti)
ricoperta di flagello nativo di
Borrelia. Per la conservazione dei
micropozzetti non utilizzati viene
fornita una bustina in plastica
sigillabile.
13mL di coniugato anti-IgG:
perossidasi-coniugato di coniglio
anti-IgG umane con colorante blu
chiaro.
L’infezione da B. burgdorferi è caratterizzata da vari sintomi clinici
e la sua manifestazione si può suddividere in tre stadi3.
Provette da circa 5mL di capacità
Micropipette di precisione e puntali monouso per la dispensazione
di volumi di 10–1000µL
100mL di diluente per campione:
soluzione tampone con detergente,
agente antimicrobico e colorante
rosso.
1. USO PREVISTO
Il test IDEIA™ Borrelia burgdorferi IgG è un immunodosaggio
enzimatico per la ricerca degli anticorpi di classe IgG anti-Borrelia
burgdorferi sensu lato nel siero umano. Il kit intende essere di
utilità per la diagnosi della borreliosi di Lyme.
Cilindro graduato (2L)
Un libretto di istruzioni per l’uso.
Un flacone di ciascuno dei seguenti reagenti:
Un immunodosaggio enzimatico per la determinazione degli
anticorpi di classe IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato nel
siero umano.
7. ATTREZZATURA
È necessaria la seguente attrezzatura:
Coniugato anti-IgG 8.2.6
E vitare la contaminazione con ioni metallici ed agenti
ossidanti.
8.2.7
on utilizzare il substrato se presenta una colorazione
N
blu prima dell’aggiunta nei micropozzetti.
Pronto per l’uso. Conservare il substrato non utilizzato a 2-8°C.
8.2.8
Proteggere il substrato dalla luce.
5.2.8
8.2.9
I micropozzetti non possono essere riutilizzati.
8.2.10
L’attrezzatura per il lavaggio, manuale o automatico,
deve essere priva di contaminazione microbica,
calibrata correttamente e conservata conformemente
alle istruzioni del fabbricante.
Pronto per l’uso. Conservare il coniugato anti-IgG non utilizzato
a 2-8°C.
5.2.7
Substrato -
Soluzione bloccante -
Pronta per l’uso. Conservare la soluzione bloccante non utilizzata
a 2-8°C.
6. REAGENTI AGGIUNTIVI
6.1. REAGENTI
Acqua deionizzata e distillata fresca per la preparazione del
tampone di lavaggio alla concentrazione di lavoro.
8.2.11
Non conservare il tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro inutilizzato per un uso
successivo. Quando non utilizzati, i contenitori del
tampone di lavaggio devono essere sciacquati in acqua
deionizzata o distillata e lasciati asciugare.
I lavapiastre automatici devono essere programmati per
completare almeno 4 cicli di lavaggio, comprendendo
l’equivalente di 2 minuti di immersione durante il ciclo completo.
10.2.4 Aggiunta di coniugato anti-IgG
Aggiungere 100µL di coniugato anti-IgG in ciascun micropozzetto.
10.2.5 Incubazione del coniugato
Coprire i micropozzetti ed incubare a temperatura ambiente (2025°C) con agitazione per 60 minuti.
10.2.6 Lavaggio dei micropozzetti
I micropozzetti devono essere lavati come descritto nella Sezione
10.2.3.
10.2.7 Aggiunta e incubazione del substrato
Aggiungere 100µL di substrato in ciascun micropozzetto.
Coprire i micropozzetti ed incubare a temperatura ambiente (2025°C) senza agitazione per 10 minuti.
10.2.8 Blocco della reazione
Aggiungere 100µL di soluzione bloccante in ciascun micropozzetto.
Assicurare la miscelazione omogenea del contenuto dei
micropozzetti. Il prodotto colorato è stabile per 30 minuti. Non
esporre alla luce solare diretta per evitare la fotodecolorazione
del prodotto.
10.3.LETTURA DEI RISULTATI DEL TEST
11.4.1 Interpretazione qualitativa
10.3.1 Lettura fotometrica
Il limite di rilevamento (OD IgG DETECTION) per gli anticorpi IgG antiBorrelia burgdorferi è calcolato come ODCut-Off x 0,5.
I micropozzetti devono essere letti fotometricamente entro
30 minuti dall’aggiunta della soluzione bloccante. Miscelare il
contenuto dei micropozzetti e leggere l’assorbanza di ciascun
micropozzetto su spettrofotometro o lettore per micropiastre
idoneo impostato a 450nm. Prima della lettura, pulire il fondo
dei micropozzetti e verificare l’assenza di materiale estraneo
all’interno. La lettura deve essere azzerata contro l’aria (cioè
senza piastra sul carrello) prima di procedere alla scansione della
piastra.
Alternativamente, se lo spettrofotometro o il lettore di
micropiastre consente la misurazione di una lunghezza d’onda di
riferimento (da 620 a 650nm), si raccomanda la lettura a doppia
lunghezza d’onda per eliminare qualsiasi interferenza potenziale
causata da aberrazioni come sporco o segni sulla superficie ottica
dei micropozzetti
10.4.SOMMARIO DELLA PROCEDURA OPERATIVA DEL SAGGIO
IDEIA BORRELIA BURGDORFERI IgG
Attendere che tutti i reagenti raggiungano la temperatura
ambiente (15–30°C) prima dell’uso
Diluire i campioni di siero 1:200 aggiungendo 10µL di siero a 2mL
di diluente per campioni
100µL di controllo o di campione del test
Coprire e incubare a
20–25°C con agitazione
per 60 minuti
Il livello al di sopra del quale è probabile che la presenza degli
anticorpi sia dovuta a un’infezione attiva equivale all’ODIgG Cut-Off.
Gli OD di campioni compresi tra questi due livelli indicano la
presenza di bassi livelli anticorpali, che vanno interpretati con
cautela. Interpretare i risultati come segue:
ODSpecimen <ODIgG DETECTION Negatività per gli anticorpi IgG anti-B. burgdorferi
ODSpecimen >ODIgG DETECTION e <ODIgG Cut-Off Presenza di anticorpi.
Si raccomanda di raccogliere un campione per il follow up dopo
due settimane per confermare lo stato del paziente
ODSpecimen >ODIgG Cut-Off Positività per la produzione attiva di anticorpi IgG anti-B. burgdorferi
11.4.2 Interpretazione semiquantitativa (unità arbitrarie)
Nell’intervallo compreso tra ODIgG Cut-Off e ODIgG Positivo, i valori di
densità ottica corrispondono direttamente al logaritmo di unità
arbitrarie di anticorpo specifico presente nel campione. Questo
viene illustrato nella figura 1 che presenta i risultati ottenuti da
un siero positivo per le IgG anti-B. burgdorferi diluito serialmente
in siero negativo.
Controllo positivo IgG
2.000
1.000
Aggiungere 100µL di coniugato
Coprire e incubare a
20–25°C con agitazione
per 60 minuti
Lavare (4 volte)
Aggiungere 100µL di substrato
Coprire e incubare
a 20-25°C senza
agitazione per 10 minuti
Aggiungere 100µL di soluzione bloccante
Leggere l’assorbanza fotometricamente a 450nm
(valore di rifermento 620-650nm)
Controllo cut-off IgG
0.500
0.000
1
10
100
1000
Log. diluizione
Figura 1 Risultato di una doppia diluizione seriale di un siero
positivo per anticorpi di classe IgG anti-B. burgdorferi in siero
negativo. In aggiunta, vengono riportati i valori OD del controllo
cut-off per le IgG e del controllo positivo per le IgG.
Il livello di anticorpo specifico nel controllo cut-off per le IgG è
stato impostato pari a 1 (UIgG Cut-Off = 1 unità). Il livello di anticorpo
specifico nel controllo positivo per le IgG è stato aggiustato a 8 x
UIgG Cut-Off (UIgG Positive = 8 unità).
Per un campione, le unità arbitrarie di anticorpo specifico
(UCampione) possono essere calcolate utilizzando la formula:
ODCampione - ODIgG Cut-off
UCampione=10 , a = x 0,9*
ODIgG Positivo- ODIgG Cut-off
a
*logUIgG Positivo -logUIgG Cut-off = log8 - log1 = 0,9
11. CONTROLLO DI QUALITÀ E INTERPRETAZIONE DEI
RISULTATI DEL TEST
11.1.DILUENTE PER CAMPIONI
Il valore di densità ottica (OD) del pozzetto contenente il diluente
per campioni deve essere inferiore a 0,100 ma superiore a
0,000 (doppia lunghezza d’onda). Un valore superiore a 0,100
può indicare un lavaggio inadeguato o la contaminazione del
substrato. Se il valore è inferiore a 0,000, riazzerare il lettore di
piastre contro l’aria e ripetere la lettura dei micropozzetti.
Se i requisiti del controllo di qualità non sono soddisfatti i risultati
del test sono considerati non validi e il saggio deve essere ripetuto.
11.2.CONTROLLO CUT-OFF PER LE IgG E CONTROLLO POSITIVO
PER LE IgG
Calcolare i valori medi di densità ottica per i 3 micropozzetti
contenenti il controllo cut-off per le IgG (ODIgG Cut-Off) e per
i 2 micropozzetti contenenti il controllo positivo per le IgG
(ODIgGPositivo). I valori OD individuali non devono differire più del
25% dal valore OD medio. I valori di densità ottica del controllo
cut-off per le IgG che differiscono più del 25% dal valore OD medio
devono essere trascurati dal calcolo e la media ricalcolata.
I Risultati Equivoci
Il limite di rilevamento degli anticorpi IgG equivale a 0,9 unità.
Il livello al di sopra del quale è probabile che la presenza
dell’anticorpo sia dovuta a un’infezione attiva equivale a 1,1
unità. I campioni con meno di 0,9 unità di anticorpi specifici sono
interpretati come negativi per gli anticorpi IgG anti-B. burgdorferi.
I campioni compresi tra 0,9 e 1,1 unità indicano la presenza di
bassi livelli anticorpali, che vanno interpretati con cautela; si
raccomanda di raccogliere un campione per il follow up dopo
due settimane per confermare lo stato del paziente. I campioni
con ,1,1 o più unità di anticorpi specifici sono interpretati come
positivi per gli anticorpi IgG anti-B. Burgdorferi.
La specificità di IDEIA Borrelia burgdorferi, IgG è stata valutata
presso un laboratorio indipendente di diagnostica di routine in
Svezia. Lo studio è stato condotto su un pannello di 200 campioni
sierici provenienti da donatori di sangue presumibilmente sani in
una zona endemica per la borreliosi di Lyme
Specificità
Valore atteso
Valutazione*
98%
98.5%
* I risultati equivoci sono interpretati come negativi.
La sensibilità diagnostica di IDEIA Borrelia burgdorferi, IgG è
stata valutata presso un laboratorio indipendente di diagnostica
di routine in Svezia. Lo studio è stato condotto su tre pannelli
di campioni sierici provenienti da pazienti che presentavano
alcune delle manifestazioni cliniche più comuni di infezione da B.
burgdorferi: 45 campioni sierici da pazienti con eritema migrante,
38 campioni sierici da pazienti con meningoradicolite linfocitica e
20 campioni sierici da pazienti con acrodermatite cronica atrofica.
I risultati sono confrontati con i valori attesi precedentemente
riportati6, 8.
Sensibilità diagnostica
Manifestazione clinica
Valore atteso Valutazione*
Eritema migrante
36%
38%
Meningoradicolite linfocitica 77%
79%
Acrodermatite
100%
100%
cronica atrofica
* I risultati equivoci sono interpretati come negativi.
14.3.CROSS-REATTIVITÀ
I sieri provenienti da pazienti con sifilide e malattie infiammatorie
(positivi per il fattore reumatoide FR), analizzati con IDEIA™
Borrelia burgdorferi IgG, hanno dati i seguenti risultati:
Sieri dei pazienti Numero di sieri Numero di risultati
positivi*
Sifilide
25
0
FR
18
1
* I risultati equivoci sono interpretati come negativi.
15. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1. Burgdorferi W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP.
(1982) Lyme disease - a tick-borne spirochetosis? Science 216: 1317-9.
2. Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG, Burgdorferi
W, et al. (1983) The spirochetal etiology of Lyme disease. N Engl J Med 308:
733-40.
3. Steere AC. (1989)Lyme disease. N Engl J Med 321: 586-96.
4. Craft JE, Duncan KF, Shimamoto GT, Steere AC. (1986) Antigens of
Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a
new immunoglobulin M response and expansion of the immunoglobulin G
response late in the illness. J Clin Invest 78: 934-9.
5. 5.Zöller L, Burkard S, Schäfer H. (1991) Validity of Western immunoblot
band patterns in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 29:
174-82.
Una modifica nel livello dell’anticorpo specifico del paziente può
essere considerata significativa quando le unità arbitrarie in un
campione successivo sono doppie o dimezzate. Queste indicazioni
vanno intese solamente come linee guida.
6. Hansen K, Pii K, Lebech A-M. (1991) Improved immunoglobulin M
serodiagnosis in Lyme borreliosis by using a µ-capture enzyme-linked
immunosorbent assay with biotinylated Borrelia burgdorferi flagella. J Clin
Microbiol 29: 166-73.
11.4.3 Commenti sull’interpretazione dei risultati
Risultati negativi
Se i requisiti del controllo di qualità non sono soddisfatti i risultati
del test sono considerati non validi e il saggio deve essere ripetuto.
Un risultato positivo indica una recente esposizione a B.
burgdorferi.
11.3.CAMPIONI DEI PAZIENTI
Risultati equivoci
Calcolare il valore di densità ottica medio per ciascun campione
dei pazienti (ODCampione). I valori OD individuali non devono
differire più del 25% dalla media. Se questo si verifica, i campioni
devono essere rianalizzati. Tuttavia, se entrambi i micropozzetti
presentano un risultato negativo, una differenza superiore al 25%
può essere accettata senza ripetere l’analisi, in quanto i valori di
densità ottica bassi sono misurati con minore precisione.
I risultati di densità ottica che cadono entro ±20% dal valore di
cut-off per le IgG devono essere considerati equivoci e interpretati
con cautela. In questi casi, si raccomanda di ripetere l’analisi.
Il test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG comprende un controllo cutoff contenente una specifica quantità di anticorpi specifici IgG
anti-Borrelia burgdorferi. Livelli di anticorpi trovati al di sopra di
questo controllo cut-off sono fortemente indicativi di un’infezione
attiva da Borrelia burgdorferi. Il kit IDEIA Borrelia burgdorferi IgG
può rilevare la presenza di anticorpi a livelli inferiori a questo
cut-off specifico e questi anticorpi possono essere presenti
come anticorpi latenti, residuo di una passata infezione, o
come livelli anticorpali molto bassi, immediatamente dopo
un’infezione recente. Bassi livelli anticorpali vanno interpretati
con cautela; per accertarsi della loro significatività, si raccomanda
di raccogliere un secondo campione per il follow up dei pazienti
dopo almeno due settimane, allo scopo di identificare variazioni
del livello anticorpale che indicherebbero più accuratamente la
significatività degli anticorpi.
Manifestazione clinica
Sensibilità diagnostica
Eritema migrante
36%
Meningoradicolite linfocitica
77%
Acrodermatite cronica atrofica
100%
14. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE SPECIFICHE
14.1.SPECIFICITÀ
Per i campioni con valori di densità ottica superiori a ODIgG Positivo,
le unità di anticorpo specifico anti-B. burgdorferi devono essere
intese come superiori a 8.
La differenza tra il valore OD del controllo cut-off per le IgG e
quello del controllo positivo per le IgG deve essere almeno pari
a 0,500. Un valore inferiore a 0,500 può essere causato da un
lavaggio inadeguato, da una agitazione inadeguata durante le
fasi di incubazione oppure da una temperatura ambiente bassa,
particolarmente durante l’incubazione con il substrato.
11.4.INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
13. VALORI ATTESI
Il livello del controllo cut-off per le IgG è stato aggiustato per dare
una specificità del 98% per i sieri normali. La risposta anticorpale
al flagello di B. burgdorferi dipende dalla manifestazione clinica
dell’infezione e dalla durata della malattia. In alcune delle
manifestazioni cliniche più comuni di infezione da B. burgdorferi,
la sensibilità diagnostica di un saggio di IgG indiretto con flagello
nativo purificato di B. burgdorferi come antigene del test è stata
riportata come segue6,8.
14.2.SENSIBILITÀ DIAGNOSTICA
2.500
OD 1.500
Lavare (4 volte)
12.4.Qualsiasi alterazione dei reagenti o la conservazione non
conforme a quanto indicato nella Sezione 5.2 può influire
negativamente sul risultato del test.
Un risultato negativo non esclude l’esposizione a B. burgdorferi.
Se si sospetta comunque la borreliosi di Lyme, raccogliere un
campione in tempi successivi.
7. Hansen K, Hindersson P, Pedersen NS. (1988) Measurement of
antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in
Lyme disease.J Clin Microbiol 26: 338-46.
8. 8.Karlsson M. (1990) Western immunoblot and flagellum enzyme-linked
immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol
28: 2148-50.
Risultati positivi
In seguito ad un risultato equivoco, si consiglia di raccogliere un
secondo campione per l’analisi entro 2 settimane. Se entrambi
i campioni (o ulteriori campioni successivi) portano a risultati
equivoci, il paziente deve essere considerato come IgG-negativo.
12. L IMITAZIONI DI PERFORMANCE
12.1.Un risultato negativo non esclude la possibilità di una
infezione da B. burgdorferi nel paziente. La mancata
rilevazione di B. burgdorferi può essere causata da diversi
fattori, quali la raccolta del campione in un momento
inappropriato della malattia (prima della manifestazione di
anticorpi rilevabili) o il campionamento e/o la manipolazione
incorretti del campione. La terapia antibiotica precoce
può sopprimere la risposta anticorpale e pertanto alcuni
individui possono non produrre gli anticorpi ad un livello
rilevabile.
12.2.Un risultato positivo indica una esposizione immunologica
precedente e non conferma una infezione in atto.
12.3.Tutti i risultati positivi devono essere interpretati
congiuntamente alle informazioni cliniche pertinenti del
paziente e ai dati epidemiologici, e non giustificano da soli il
trattamento di un paziente. La possibilità dell’esposizione al
morso di zecca deve essere sempre presa in considerazione.
X7841 Rivisto ottobre 2011
OXOID Limited,
Wade Road, Basingstoke,
Hampshire, RG24 8PW,
Verenigd Koninkrijk
Per informazioni contattare la filiale o il distributore Oxoid di
zona.