Aumentano i rischi di
diffusione dei patogeni
mediante seme infetto: le
piante orticole da foglia
come esempio
M.L. Gullino, G. Gilardi e A. Garibaldi
Centro di Competenza per l’innovazione in
campo ambientale (AGROINNOVA)
8 marzo 2012, Incontri Fitoiatrici, Torino
Patogeni trasmessi per seme
Molti patogeni si conservano da un ciclo colturale
all’altro per mezzo del seme e vengono definiti
“patogeni portati da seme”. Il seme rappresenta per
questi patogeni un mezzo di diffusione spesso assai
efficiente nell’ambito delle coltivazioni. Basta spesso
un seme infetto ogni 10.000 per osservare gravi
danni alle piante. Inoltre, il seme stesso, in relazione
agli scambi commerciali (e a quelli a scopo di studio e
ricerca) di cui è oggetto, può permettere a specie
patogene, e alle loro eventuali varianti, di
raggiungere aree nuove anche molto lontane da
quelle di origine.
Diffusione di patogeni
mediante seme
Malattie fungine:
Basilico
Cicoria
Endivia
Lattuga
Rucola
coltivata
Rucola
selvatica
Spinacio
Valerianella
Tracheofusariosi
1989
2010
2009
2002
2002
2002
1978*
2003
Verticilliosi
Alterazioni
Phoma spp.
1987
2007
da
2005*
2006*
Alternariosi
2010
Peronospora
2004
1968
1968
1968
1966
2011
1863
Cladosporiosi
Marciumi
da
Phytophthora
1991*
2004
1967
1922
Septoriosi
Antracnosi
2011
1995
1996
1996
1951
1895
1895
1895
2010
* Non segnalato in Italia.
2007*
2010*
1966
Diffusione di patogeni
mediante seme
Basilico
Cicoria
Lattuga
Rucola
coltivata
Rucola
selvatic
a
Spinacio
Valerianella
Batteriosi
causate da:
Erwinia
carotovora
1977
1969
Acidovorax
valerianellae
Pseudomonas
spp.
2003*
1986
1969
Xanthomonas
campestris
pv. vitians
Xanthomonas
campestris
pv. raphani
* Non segnalato in Italia.
1969
1969
1969
2005
Esempi di trasmissione di patogeni
mediante seme
Coltura
Patogeno
Lattuga
Fusarium oxysporum f.sp. lactucae
Verticillium dahliae
Botrytis cinerea
Pseudomonas cichorii
Xanthomonas campestris pv. vitians
Microdochium panattonianum
Rucola
Fusarium oxysporum
Valerianella
Phoma valerianellae
Acidovorax valerianellae
Endivia e cicoria Alternaria cichorii
Spinacio
Percentuale di
semi infetti
0,1 %
66-90%
30%
*
1-18%
*
0,1%
0,6 - 15%.
0,1-0,9%
0,6-13,75%
Microdochium panattonianum
Fusarium oxysporum f.sp. spinaceae
Peronospora farinosa f.sp. spinaciae
razza 1,2,3,4
Cladosporium variabile
*
*
0,3-2,9%
Stemphylium botryosum **
Verticillium dahliae**
1-95%
0,3-84,8%
1,8%
Tracheofusariosi della lattuga
Fusarium oxysporum f.sp lactucae
Fusarium wilt of lettuce
Come si è spostata la
tracheofusariosi della lattuga
Giappone (1967)
California U.S.A. (1993)
Taiwan (1998)
Italia (2002)
Arizona U.S.A. (2003)
Portogallo (2005)
Fusarium wilt of rocket
Alcuni esempi di
patogeni importati
Tracheofusariosi
di
coltivata e selvatica.
rucola
Gli agenti della malattia sono
trasmessi per seme.
TRACHEOFUSARIOSI DELLA RUCOLA
Sintomi su rucola coltivata (Eruca vesicaria) e
selvatica (Diplotaxis sp.).
La malattia è stata osservata a
partire dal 2002 in Lombardia.
In campo i primi sintomo sono
osservabili su Eruca vesicaria a
partire da temperature del terreno
di 15°C.
E’ confermata la trasmissione del
patogeno mediante seme.
Basilico: patogeni importati
Peronospora belbharii
agente della
peronospora
Fusarium oxysporum f.sp.
basilici agente della
tracheofusariosi
Alternariosi del basilico causata
da Alternaria alternata
Sono stati analizzati undici campioni di semi di
basilico della tipologia ‘Genovese gigante’
commerciali.
Il saggio è stato effettuato in vitro su PDA
impiegando 400 semi per lotto, disinfettati in
una soluzione di ipoclorito di sodio (1%) o
utilizzati tal quale.
Tutti i campioni sono risultati contaminati da
funghi del genere Alternaria, risultati patogeni.
Trattamento dei semi
Contaminazione da
Alternaria
Disinfezione (ipoclorito di sodio 1%)
--
Da 0 al 12%
Da 0,25 al 26%
In alcuni casi sono sufficienti percentuali assai
basse di semi infetti per permettere la rapida
diffusione della malattia in aree geografiche
diverse. Ad esempio nel caso della Phoma
valerianellae percentuali dell’1-2% di semi
infetti possono provocare danni elevati. In altri
casi, come in quello delle tracheofusariosi i
danni evidenti si manifestano dopo 2-3 colture
della stessa specie nel terreno che si è
infettato utilizzando semi contaminati
Un nuovo servizio per le imprese
Nel 2011 è stato avviato un nuovo Laboratorio
che si occupa di sanità del materiale di
propagazione.
Le analisi fitosanitarie di funghi fitoparassiti di
materiale di moltiplicazione di piante da frutto
e orticole sono accreditate dalla Regione
Piemonte.
Perché un nuovo laboratorio?
• Per sfruttare l’esperienza maturata negli ultimi
anni con progetti di ricerca europei;
• Per fornire un nuovo servizio alle imprese;
• Per restare aggiornati sui nuovi problemi;
• Per acquisire nuove risorse;
• Per creare opportunità
di lavoro ai giovani;
…
Le attività del Laboratorio
Il laboratorio, che opera in stretta
collaborazione con le imprese, si occupa di
diagnosi e di caratterizzazione dei patogeni
trasmessi per seme nonché della messa a
punto di tecniche di concia dei semi con
metodi chimici, fisici e biologici e di assistenza
tecnica.
Diagnosi
Per quanto riguarda la diagnosi,
il laboratorio è in grado di
utilizzare tecniche tradizionali
e molecolari, arrivando, nel
caso di nuovi patogeni, a
caratterizzarli e a definire
tecniche diagnostiche che ne
consentano non solo il
riconoscimento, ma anche la
quantificazione.
Diagnostica
• Metodi tradizionali
• Metodi molecolari (ibridazioni acidi nucleici, PCR,
real time PCR, DNA array,…)
Non ci sono metodi molecolari recepiti dalla normativa,
ma la letteratura si sta sempre più arricchendo di
applicazioni che, se pur non ancora validate, presto
offriranno possibilità applicative rapide e affidabili.
Future applicazioni prevedono l’uso di biosensori, che
sfruttano reazioni biologiche per individuare
l’organismo target e che sono già utilizzati in
diagnostica clinica.
Metodi diagnostici: saggio biologico per il
riconoscimento di Phoma valerianellae da seme
PDA + S
Contaminazione dei semi da P. valerianellae compresa tra 0,6% e 15%
Codice
Campione
47/co
130/co
310
310
313
313
130CR
130CR
353PS
353PS
cv
Numero di isolati di
P. valerianellae su
1000 semi
Cambrai
Cambrai
Trophy
Trophy
Palace
Palace
Ljublianski
Ljublianski
Juwallon
Juwallon
61
63
150
101
46
40
6
0
18
10
Pre-trattamento
con ipoclorito di
sodio 1%
No
No
No
Si
No
Si
No
Si
No
Si
Metodi diagnostici: primer specifico per il
riconoscimento di P. valerianellae da seme
Una coppia di oligonucleotidi,
entrambi della lunghezza di 18 bp,
è stata disegnata (prodotto di
amplificazione 496-bp): Pv-FOR
(5’-GGCTTTGCCTGCCATCTC-3’)
e
Pv-REV
(5’GACGTCGTCGTCTGGTTG-3’).
Una PCR effettuata sul DNA
estratto da funghi appartenenti al
genere Phoma (P. betae, P.
heteromorphospora, P. exigua) ha
mostrato che la coppia di primer è
altamente specifica quando sono
utilizzate specifiche condizioni di
temperatura (Tm=59°C).
Rilevate infezioni dei
semi dell’ordine dello
0,6%
Tr. ipoclorito di Na
non trattato
Le form ae speciales di Fusarium ox ysporum
Fusarium oxysporum: fungo anamorfo terricolo.
Ceppi patogeni raggruppati in formae speciales sulla base della
loro specificità d’ospite.
Descritte circa 100 formae speciales diverse.
Alcune formae speciales sono state ulteriormente suddivise in
razze sulla base delle cultivar colpite.
Alcuni ortaggi a foglia
Specie
Basilico
Lattuga
Valerianella
Rucola
Catalogna
Indivia
Famiglia
Lamiaceae
Asteracee
Valerianaceae
Brassicaceae
Asteraceae
Asteraceae
Forma specialis
basilici
lactucae
raphani
raphani
Le form ae speciales : le regioni IGS
Formae speciales: saggi di patogenicità su diverse specie
di ospiti
Razze fisiologiche: saggi di patogenicità su diverse
cultivar di una singola specie vegetale
Saggi biologici efficaci ma laboriosi e tempi lunghi
Spaziatori intergenici – IGS (tra due unità ripetute):
1 - Analisi RFLP
2 - Analisi delle sequenze
Inter retrotransposon amplified
polymorphism: IRAP
Razza 1 di F. ox ysporum f.sp. lactucae (FOL)
Ceppi italiani
Ceppi stranieri
- Ceppi italiani identici a FOL proveniente da Taiwan (razza 1)
- Trasmissione del fungi attraverso materiale infetto proveniente
dall’Asia
Fusarium oxysporum f.sp. basilici
Profilo RAPD con il primer OPB-08
5 FOB, FO ff.spp. dianthi,
canariensis, radicis-lycopersici,
gladioli, cyclaminis,
lycopersici,
melonis, lilii, pisi,
tulipae, e isolati
non patogeni
Amplificazione ottenuta
mediante impiego di primer
SCAR specifici per F.
oxysporum f.sp. basilici:
BIK1 e BIK2, BIK3 e BIK4,
BIK1 e BIK4
Identificazione di P seudom onas syringae pv
actinidiae
Le amplificazioni con le coppie di primer PsaF1-PsaR2 e Psa3F-Psa4R hanno
generato due amplificati di 280 bp e 175 bp in 60 dei 92 campioni analizzati.
PSA1F/PSA2R
PSA3F/PSA4R
13 isolati batterici da kiwi. I primi 7
pozzetti sono gli isolati ottenuti da
foglia, gli altri 6 da ramo.
Concia
Per quanto riguarda la concia,
l’esperienza
acquisita
nell’ambito
di
progetti
europei e nazionali che hanno
riguardato la messa a punto di
trattamenti di concia con
mezzi chimici, fisici e/o
biologici su semi di cereali e
orticole
consente
di
sviluppare
rapidamente
metodologie adeguate e
adatte alle diverse situazioni.
Metodi alternativi di concia per il
contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello
In prove condotte in ambiente protetto in vaso e su bancale attraverso
concia umida o secca di seme naturalmente infetto (tasso di infezione:
20%)
sono stati saggiati i seguenti trattamenti, valutando % di
emergenza, incidenza e indice di malattia:
• impiego di acqua calda, vapore aerato, elettroni;
• uso di formulati commerciali a base di 4
subtilis, Pseudomonas
chlororaphis,
Streptomyces griseoviridis);
microorganismi (Bacillus
Fusarium oxysporum e
• applicazione di isolati di microrganismi selezionati per la loro
antagonistica;
• concia con estratto di timo e farina di crucifere;
• impiego di induttori di resistenza.
capacità
Metodi alternativi di concia per
il contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello
Trattamento fisico
Acqua calda
Vapore aerato
Elettroni
Parametri
Efficacia
48 °C
10 min
+
74 °C
90 % U.R. 2
min
+
140 kV
12 kGy
+
Efficacia:
+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram)
++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico
+ effetto non apprezzabile
Metodi alternativi di concia per il
contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello
Microrganismo (formulato)
Dose/10 g seme
Efficacia
100 mg
+
50 mg
+
Fusarium oxysporum 251/2
100 mg
+
Bacillus subtilis (MBI 600)
100 mg
+
Bacillus subtilis (Serenade)
100 mg
+
Pseudomonas chlororaphis
(BA 2552)
300 μl
+
Bacillus subtilis (FZB 24)
Streptomyces griseoviridis
(Mycostop)
Efficacia:
+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram)
++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico
+ effetto non apprezzabile
Metodi
alternativi
di
concia
per
il
contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello
Microrganismo/estratto
Dose/
concentrazione
Efficacia
Pseudomonas spp. (6 ceppi)
1x108 UFC/ml
+
Bacillus spp. (2 ceppi)
1x108 UFC/ml
+
Serratia plymuthica
1x108 UFC/ml
+
Curtobacterium sp.
1x108 UFC/ml
+
Pichia guilliermondii
1x108 UFC/ml
+
Burckholderia sp.
1x108 UFC/ml
+
Trichoderma viride
1x106 UFC/ml
+
Fusarium oxysporum antagonista
1x106 UFC/ml
+
Clonostachys rosea IK726
1x109 UFC/g
++
Tillecur (farina brassicacee)
20 %
+
Olio di timo
0,1 %
+++
Efficacia:+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram); ++ effetto apprezzabile, ma inferiore al
trattamento chimico; + effetto non apprezzabile
Metodi
alternativi
di
concia
per
il
contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello
Induttore di resistenza
(p.a.)
Dose/concentrazione
Efficacia
Chitoplant (chitosano)
0,5%
+
10 mg/l
+
1 mg/l
+
Comcat (steroide vegetale)
0,5 mg/l
+
Bion (acibenzolar S-metile)
0,1 mg/l
+
1%
+
0,1%
+
Acido salicilico
Acido jasmonico
Milsana (estratto di
Reynoutria sachalinensis)
Kendal (8% estratto di
Medicago sativa, 15,5%
K2O)
Efficacia:+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram); ++ effetto apprezzabile,
ma inferiore al trattamento chimico; + effetto non apprezzabile
Efficacia dell’impiego di microrganismi e diversi
fungicidi in trattamenti di concia del seme di
lattuga nei confronti della tracheofusariosi
Trattamento°
Bacillus subtilis (Serenade WP)
Bacillus subtilis (FZB24)
Bacillus subtilis (MB1 600)
Streptomyces griseoviridis (Micostop)
Fusarium oxysporum 251/2
Pseudomonas chlororaphis (Cedomon)
Fusarium oxysporum MSA 35
Mancozeb (Mazeb 80)
Tiram (Pomarsol 50)
Testimone inoculato non trattato
Testimone sano
Dose /g seme
0,01 mg
0,01 mg
0,01 mg
0,002 mg
1x107 CFU*
0,3 mg
1x107 CFU
4,8 mg
1,5 mg
-
Efficacia°°
+
±
±
±
+
±
++
++++
+
±
++++
°(±) efficacia rispetto al testimone 0-20%; (+) efficacia rispetto al testimone 2140%; (++) efficacia rispetto al testimone 41-60%; (+++) efficacia rispetto al
testimone 61-80%; (++++) efficacia rispetto al testimone 81-100%;
Assistenza tecnica
Il laboratorio è, inoltre, in grado di svolgere
assistenza tecnica sviluppando protocolli per
trattamenti di concia di semi e di materiale di
moltiplicazione con mezzi fisici, biologici e
naturali e svolge, infine, attività di formazione,
organizzando corsi di aggiornamento per
tecnici e funzionari dei servizi fitosanitari
Conclusioni
Il nuovo laboratorio è stato progettato e
concepito come Centro per condurre ricerche
avanzate e come servizio alle imprese. Questo
nuovo servizio va ad aggiungersi al Centro di
Saggio per la sperimentazione di agrofarmaci
e al Laboratorio di Diagnostica fitopatologica.
… ad Agroinnova coltiviamo il futuro!
Finanziamento della Regione Piemonte (P.O.R. F.E.S.R. 2007/2013 Polo di Innovazione agroalimentare) - progetto SEVARDIA “Selezione
varietale e diagnostica avanzata per la
produzione di basilico di qualità in Piemonte e
per la valorizzazione del prodotto trasformato
(pesto)”.