BD FACSCalibur™ flow cytometer
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)
Un citometro a flusso è essenzialmente costituito di:
•  Sistema fluidico per il trasporto del campione e la
sua focalizzazione idrodinamica
•  Sistema ottico
•  Circuito di rilevazione
•  Elettronica per l’acquisizione, elaborazione e
presentazione dei dati.
The fluidic system
Air filter
Air pump
Flow
chamber
Sheat pressure
regulator
Filter
Sheat
fluid
waste
Sample
pressure
regulator
Sample
Hydrodynamic focusing
Low pressure
High pressure
High sample
flow rate
60µl/min
Low sample
flow rate
12µl/min
Laminar
Flow
Laminar
Flow
Sample core
Sheath
Sample
Sheath
Sheath
Sample
Sheath
LIGHT SCATTER
Rifrazione e Riflessione
proporzionale alla granularità cellulare
e alla complessità.
Rilevate a 90° rispetto la luce incidente
SSC
LASER
Incident
light
source
FSC
Diffrazione
Proporzionale all’area
della cellula.
Rilevata lungo l’asse
della luce incidente 0°.
Discrimination of different cell populations in
blood based on light scattering
granulocytes
human
Side
Scatter
Lysed whole blood
Forward Scatter
lymphocytes
monocytes
Characterization of unstained cells using
light scatter
The fluorescence phenomenon
E’ il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa
di definita lunghezza d’onda (λ) ne emette un’altra a λ maggiore e ad
energia inferiore.
FLUOROCROMI
Molecole
fluorescenti che assorbono energia dal laser e
rilasciano l’energia assorbita per:
-  Vibrazione e dissipazione del calore
-  Emissione di fotoni di una lunghezza d’onda più lunga.
Sono coniugate a ligandi o anticorpi monoclonali specifici per
molecole biologiche con significato antigenico o recettoriale
posizionate sulla membrana cellulare, nel nucleo o nel citosol;
altri “colorano” direttamente altre sostanze (DNA, RNA,
proteine, ioni citoplasmatici).
Anche le cellule non marcate con alcun fluorocromo presentano
una debole fluorescenza di fondo, l’autofluorescenza,
misurabile.
Absorption and emission spectra of a fluorochrome
(Stokes shift)
Ogni fluorocromo presenta una caratteristica banda di λ
per l’eccitazione e per l’emissione
I
fluorocromi
attualmente
citofluorimetria sono:
• 
• 
• 
• 
• 
• 
FITC
PE
Fluorocromi tandem
APC
PI (Propidium Iodide)
PerCP
più
Ciascun fluorocromo è caratterizzato
particolare BRILLANTEZZA.
usati
in
da
una
Absorption and
fluorochromes
emission
spectra
Absorption spectra
1000
PerCP
FITC
PI
RPE
550
600
of
different
Emission spectra
APC
FITC
RPE
PI APC PerCP
800
600
400
200
0
400
450
500
650
700
400
450
Wavelenght (nm)
500
550
600
650
700
Tandem fluorochromes
PerCP-Cy5.5
488
695
PE-Cy5
(Cy-chrome)
488
670
APC-Cy7
(PharRed)
650
767
Composti fluorescenti costruiti unendo fra loro molecole con proprietà
fotofisiche complementari, atte a sfruttare il principio di trasferimento
dell’energia.
Correlation between number of binding sites and
fluorescence intensity
FITC
FITC
FITC
Number of events
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Fluorescence intensity
Emitted fluorescence intensity ∝ binding sites
Staining
of
cells
with
fluorochrome
antibobies specific for surface antigens
anti-A Antibody
Antigen A
fluorochromes
anti-B Antibody
Antigen B
conjugated
Single and three colours staining
Incubation
Incubation
washing
acquisitio
n
washing
acquisitio
n
Indirect staining
Second antibody
Goat Anti-Mouse Ig FITC
First unconjugated
mouse antibody
Acquisition and
Analysis
Incubation
Incubation
washing
washing
Optic system of a flow cytometer
FITC
SSC
PE / PI
PerCP
7-AAD
PE-Cy5
FSC
Optical filters
Longpass
460
500
LP 500
Shortpass
540
460
500
SP 500
540
Bandpass
460
500
BP500/50
540
Optic system of a BD FACSCalibur flow cytometer,
equipped with two lasers
FL1
530/30
I segnali di fluorescenza
emessi dalla cellula vengono
raccolti da lenti poste
ortogonalmente al fascio di
eccitazione, selezionati con
opportuni specchi separatori di
fascio, specchi dicroici e filtri
ottici e portati ciascuno ad un
diverso PMT.
SSC
488/10
FL2 585/42
FL4
90/10 Beam Splitter
661/16
DM 560SP
DM 640LP
670LP
Half Mirror
Fluorescence
Collection Lens
FL3
Beam Combiner
.
Flow
Cell
488/10
Focusing
Lens
FSC Diode
FLUORESCENCE MEASUREMENTS
Generation of an electrical pulse
Voltage
Sensori denominati PMT o detectors trasformano i segnali ottici in
intensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in
maniera lineare o logaritmica.
Voltage
Time
Voltage
Time
Time
Conversion of electrical pulses in digital values
SSC FSC
Pulse height
I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici, ossia proporzionali in
maniera continua alle dimensioni del parametro misurato.
Un convertitore “spezzetta” i valori continui rendendoli discreti a
seconda del numero di canali a disposizione.
0
pulse
width
FL3 FL2 FL1
Volts
Pulse
area
40
Time (µSec)
Channel
s
Analog to
digital
converter
0
1000
Histogram plot
Numero di Cells
Il diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la misura di un
singolo parametro. Gli eventi che si accumulano nei vari canali vanno a
costruire un diagramma di distribuzione.
0
500
1000
490
500
510
Incremento di intensità
Histogram analysis
La statistica si basa sulla impostazione di cursori che definiscono le aree
di interesse calcolando gli eventi che cadono al loro interno.
Unstained sample
Stained sample
events
events
marker
101
Background
fluorescence
FL-1
101
FL-1
Antibody cells
Antibody +
cells
HISTOGRAM
Dot plot
Il diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta la
correlazione fra due parametri, in cui ogni punto rappresenta un singolo
evento dotato di un particolare valore per ciascuno dei due parametri.
1000
1000
840
600
FL2
FL2
800
400
200
85
0
0
200 400 600 800 1000
FL1
800
600
400
200
0
0
200 400 600 800 1000
245
FL1
638
Dot plot analysis
quadrants
Upper Left
Single positive
CD4 PE
Upper Right Double positive
UL
LL
UR
LR
CD3 FITC
Low Left
Double negative
Low Right
Single positive
UL
CD3-/CD4+
UR
CD3+/CD4+
LL
CD3-/CD4-
LR
CD3+/CD4-
DOT PLOT
Isolation of PBMC by ficoll gradient centrifugation
stratification
Plasma
+
platelets
centrifuge
blood
PBMC
Ficoll
erytrocytes
+
granulocytes
Ficoll
Peripheral Blood Mononuclear Cells = PBMC
SSC
CD4 APC
Immunophenotyping technique for determining % of CD4
and CD8 T cells
CD45 PerCp
CD8 PE
CD3 FITC
CD3 FITC
SPT-specimen processing
50 µL whole blood (EDTA)
20 µL Antibody mix
Tube
with
beads
Vortex
15 Minutes @ Room Temperature, dark
450 µL FACS Lysing buffer (1x)
Vortex
15 Minutes @ Room Temperature, dark
Acquisition and Analysis
SPT-sample analysis
Microfluorosphere
Monocytes
Microfluorosphere
CD4 PE
Side Scatter
Granulocytes
Lymphocytes
CD45 PerCP
CD3 FITC
Total no. of
No. of events in the bright
X microfluorospheres added
CD45 region
= Absolute no. of CD4
Volume of blood added
No. of events in the
microfluorosphere region
ELISpot
PBMC
MoAbAnti-IFN-γ
PBMC
Antigens
Antigen
IFN-γ
Enzymatic reaction
ELISpot
Chromogen
Substrate
insoluble coulored
product
Enzyme conjugated to
the detection antibody
CYTOKINE
Detection
anti-cytokine antibody
Capture
anti-cytokine
antibody
ELISpot
Simultaneous phenotypic (naive/memory phenotype) and
functional (IFN-γ production) characterization of antigen
stimulated CD8 T lymphocytes
IFNγ-positive cells (R1)
CCR7
IFN-gamma
R1
R2
CD8
CCR7
CD45RA
Memory
CD45RA-CCR7+
Naive
CD45RA+CCR7+
Pre-Effector
CD45RA-CCR7-
Effector CTL
CD45RA+CCR7-
CD45RA
IFNγ-negative cells (R2)
Simultaneous phenotypic and functional (IFN-γ production
and cytotoxic potential) characterization of antigen
stimulated T lymphocytes
Lymphocytes (R1)
CD3+ CD8+ Lymphocytes (R1 and R2)
1,11%
0,05%
Side Scatter
CD8 PerCP
IFN-gamma PE
69,27% 29,56 %
Forward Scatter
CD3 APC
Perforin FITC
Class I MHC Tetramer
Analysis of proliferation by CFSE labelling
Analysis of the proliferation of PHA stimulated
CD8 T lymphocytes by CFSE labelling
No CFSE
CFSE Not stimulated
CFSE PHA 0,5 µg/ml
CFSE PHA 1 µg/ml
Analysis of the proliferation of PHA stimulated
CD4 T lymphocytes
Stimulated with PHA
CD4
Not stimulated
CFSE (Fluorescence intensity FL1)
Proliferation (cell division)
Analisi del ciclo cellulare
A
B
Analisi del ciclo cellulare
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio)
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio + Annessina V)
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio + Annessina V)
http://www.bdbiosciences.com/support/training/itf_launch.jsp