Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 184-187
M. Caffara, D. Florio, A. Gustinelli, M.L. Fioravanti
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale, Università di Bologna,
Tolara di Sopra, 50 – 40064 Ozzano Emilia (BO), Italia.
[email protected]
DIAGNOSTICA MOLECOLARE DELLE MALATTIE DEI PESCI
CON PARTICOLARE RIFERIMENTO ALLE MIXOSPORIDIOSI
MOLECULAR DIAGNOSIS OF FISH DISEASES
WITH PARTICULAR REFERENCE TO MYXOSPORIDIOSIS
Abstract - Developments in molecular biology have led to a rapid growth in new methods for diagnosing
fish diseases. Identification of parasitic infections still, as traditionally, relies on skilled and experienced
microscopists and traditional taxonomy is vital in the study of Parasitology. Nevertheless, novel methods
can make important contributions to the taxonomy, diagnosis and screening for parasitic infections.
Key-words: molecular diagnosis, fish diseases, parasitic diseases, Myxozoa.
In linea generale, prima dell’avvento delle tecniche molecolari, la diagnosi delle
malattie dei pesci si basava principalmente sull’isolamento dell’agente eziologico, e
sua identificazione su base morfologica/fenotipica, oppure mediante esami istologici e
sierologici. L’impiego della diagnostica molecolare ha permesso invece di poter determinare direttamente l’agente eziologico implicato attraverso l’evidenziazione del suo
materiale genetico e di estendere così la diagnosi anche a quegli organismi per i quali
l’isolamento non era possibile o per cui non erano disponibili tecniche diagnostiche
tradizionali affidabili (Cunningham, 2002). Considerando l’elevata specificità di queste
metodiche è inoltre possibile determinare la presenza di polimorfismi o mutazioni relazionando così le caratteristiche genotipiche quelle fenotipiche (Cunningham, 2002). Nel
caso delle malattie parassitarie, l’applicazione delle tecniche parassitologiche tradizionali (Gibson, 1992; Monis, 1999) risulta ancora di fondamentale importanza, anche
se l’impiego della biologia molecolare è in grado di fornire un importante supporto
soprattutto per quanto riguarda gli studi tassonomici ed epidemiologici. A tutt’oggi il
gene che viene più largamente impiegato per la diagnostica delle malattie parassitarie
in acquacoltura è rappresentato dal DNA ribosomale (rDNA). Questo gene è infatti
un ottimo target in quanto presente in multicopia, organizzato in tandem repeat lungo
il genoma ed altamente conservato, permette l’impiego di primers universali per l’amplificazione (Medlin et al., 1988). La sequenza di questo gene mostra inoltre la presenza di zone variabili che possono essere sfruttate per assegnare gli organismi ad un
livello tassonomico specifico (Gasser e Hoste, 1995; Hershkovitz e Lewis, 1996; Kent
et al., 1998; Zhu et al., 1998; Andree et al., 1999a,b). A tal proposito appare interessante sottolineare come, anche se molti gruppi tassonomici sono facilmente identificabili in base a criteri morfologici e morfometrici, per altri l’identificazione su base
morfologica risulti estremamente indaginosa in quanto i caratteri tassonomici di specie
sono difficilmente distinguibili (Cunningham, 2002).
Un esempio dell’importanza di associare le tecniche parassitologiche tradizionali
a quelle molecolari è rappresentato dall’approccio diagnostico alle mixosporidiosi,
malattie parassitarie sostenuti da organismi del phylum Myxozoa.
I Myxozoa sono metazoi endoparassiti obbligati di invertebrati, prevalentemente
Anellidi e Briozoi, e vertebrati, generalmente pesci e più raramente rettili (Eiras, 2005;
Garner et al., 2005), uccelli (Bartholomew et al., 2008, in press), anfibi (Jirku et al.,
2006) e mammiferi (Kent et al., 2001; Prunescu et al., 2007). La classificazione di
questi parassiti è stata ed è tutt’ora molto controversa. Il phylum Myxozoa è rimasto
Diagnostica molecolare delle malattie dei pesci con particolare riferimento alle mixosporidiosi
185
suddiviso in due classi, Myxosporea e Actinosporea, fino ai primi anni ’90, quando
vennero recepite le indicazioni fornite da Wolf e Markiv (1984) riguardo alle fasi di
sviluppo di questi parassiti negli ospiti vertebrati e invertebrati.
Gli autori dimostrarono infatti che gli appartenenti alle due classi non erano altro
che diversi stadi di sviluppo dello stesso parassita e che il ciclo biologico si realizzava
con una alternanza tra due ospiti: uno invertebrato in cui avviene la riproduzione
sessuata con la formazione di “actinospore” e uno vertebrato (prevalentemente pesci)
in cui avviene quella asessuata che esita nella formazione di “mixospore”. Da allora
questo tipo di alternanza è stata dimostrata in circa 25 specie che parassitano pesci
d’acqua dolce (Kent et al., 2001) e recentemente anche per alcune specie dei pesci
marini (Koie et al., 2004; Bartholomew et al., 2006). Attualmente sono state descritte
circa 2200 specie appartenenti a 65 generi negli ospiti vertebrati (mixospore) e 18
gruppi collettivi in quelli invertebrati (actinospore) (Dykovà e Lom, 2007). L’identificazione di entrambi gli stadi di sviluppo si basa principalmente sulla morfologia delle
spore (Lom e Arthur, 1989; Lom e Dyková, 1992; 2006), specificità d’ospite e, solo
nel caso delle mixospore, tropismo tissutale (Molnàr, 1994, 2002). Nonostante Lom e
Arthur (1989) e Lom et al. (1997) abbiano fornito delle chiavi identificative dettagliate
per meglio uniformare l’identificazione dei due stadi di sviluppo, questi parassiti sono
caratterizzati da una variabilità morfologica e morfometrica intraspecifica che rende
l’identificazione morfologica a livello di specie piuttosto indaginosa se non supportata dalle indagini molecolari. Studi condotti sulla SSU rDNA (18S rDNA) hanno
evidenziato che il phylum Myxozoa è separato dal punto di vista filogenetico in due
clade ben distinti, non in base alla morfologia delle spore, ma a seconda dell’habitat
dei loro ospiti, marino e dulciacquicolo. I subclade invece raggruppano generi diversi
a seconda della localizzazione nell’ospite, indipendentemente dalla morfologia della
spora, distinguendo così specie celozoiche, a tropismi intraluminale e specie istozoiche
a localizzazione tissutale extracellulare o intracellulare. Interessante appare anche il
fatto che, dal punto di vista filogenetico, specie appartenenti allo stesso genere (con
spore identiche morfologicamente) possano essere separate o, per contro, differenti
generi possano raggrupparsi in uno stesso cluster (Lom e Dyková, 2006). Attualmente
le indagini molecolari condotte su questo phylum sono volte principalmente a svelare
il loro complesso ciclo biologico, il range di ospiti e l’alternanza dei due stadi di sviluppo. Quest’ultimo punto risulta particolarmente interessante in quanto la morfologia
delle due forme mixosporea (vertebrato) / actinosporea (invertebrato) è completamente
differente e quindi solo attraverso l’analisi genetica può essere possibile stabilire una
relazione tassonomica.
Ad esempio applicativo verrà di seguito descritto un episodio di mixosporidiosi
muscolare osservata in pesci rossi (Carassius auratus auratus) allevati sul territorio
nazionale con ricostruzione del ciclo biologico dell’agente eziologico attraverso identificazione della fase actinosporea nell’ospite invertebrato.
Macroscopicamente i pesci presentavano due neoformazioni ellissoidali circoscritte
alla zona posteriore della testa. L’esame microscopico del contenuto delle lesioni evidenziava la presenza di spore riferibili morfologicamente a parassiti Myxozoa ed in particolare al genere Myxobolus. Le spore sono state quindi sottoposte ad identificazione
molecolare amplificando il 18S rDNA mediante PCR e successivo sequenziamento.
La comparazione mediante BLAST della sequenza ottenuta ha restituito il 99,4% di
identità con Myxobolus lentisuturalis Dyková, Fiala and Nie, 2002, descritto in Cina
in prussian carp (Carassius gibelio) e mai segnalato in Italia. Nel contempo, al fine di
definire il ciclo biologico del parassita ed identificare l’eventuale l’ospite alternato presente nell’ambiente in studio, si è proceduto a raccogliere dalle vasche di allevamento
organismi bentonici con particolare riferimento ad anellidi. Gli invertebrati venivano
posti singolarmente in piastre da colture cellulari a 6 pozzetti in acqua declorinata
186
M. Caffara, D. Florio, A. Gustinelli, M.L. Fioravanti
(Yokoyama et al., 1991) ed osservati al microscopio invertito ogni 3 giorni per circa
2 mesi, per verificare l’eventuale liberazione di actinospore. Dopo circa 15 giorni in
alcuni pozzetti si è osservata la presenza di actinospore che sono state identificate su
base morfologica come appartenenti al gruppo collettivo Raabeia-type. Parallelamente
gli oligocheti presenti nei pozzetti positivi sono stati sottoposti ad identificazione,
risultando appartenente alla specie Branchiura sowerbyi. La PCR e il sequenziamento
condotto sulle Raabeia-type ha restituito una identità del 100% con M. lentisuturalis,
individuando in B. sowerbyi l’ospite alternato di questa specie di Myxozoa nell’ambiente in studio. Sebbene queste osservazioni vadano supportate da prove d’infezione
sperimentale in laboratorio, i risultati ottenuti hanno permesso di individuare gli ospiti
alternati del parassita nelle nostre realtà di allevamento. Questo aspetto risulta di particolare importanza per l’applicazione di procedure di profilassi e controllo delle mixosporidiosi, verso le quali non sono a tutt’oggi conosciuti mezzi efficaci di terapia.
Bibliografia
ANDREE K.B., EL-MATBOULI M., HOFFMAN R.W., HEDRICK R.P. (1999a) - Comparison
of 18S and ITS-1 rDNA sequences of selected geographic isolates of Myxobolus cerebralis. Int. J.
Parasitol., 29: 771-775.
ANDREE K.B., SZEKELY C., MOLNAR K., GRESOVIAC S.J., HEDRICK R.P. (1999b) - Relationships among members of the genus Myxobolus (Myxozoa: Bivalvidae) based on small subunit
ribosomal DNA sequences. J. Parasitol., 85: 68-74.
BARTHOLOMEW J.L., ATKINSON S.D., HALLETT S.L. (2006) - Involvement of Manayunkia
speciosa (Annelida: Polychaeta: Sabellidae) in the life cycle of Parvicapsula minibicornis, a myxozoan parasite of Pacific salmon. J. Parasitol., 92: 742-748.
CUNNINGHAM C.O. (2002) - Molecular diagnosis of fish and shellfish diseases: present status and
potential use in disease control. Aquaculture, 206: 19–55.
DYKOVÁ I., LOM J. (2007) - Comments on the recent knowledge and some of the topics to be
solved in the research on Myxozoa. Parassitologia. 7th International Symposium on Fish Parasites. Viterbo (Italy). 24th – 28th September 2007, 49 (Suppl. 2): 146 pp.
EIRAS J.C. (2005) – An overview on the myxosporean parasite in amphibians and reptiles. Acta
Parasitol., 50: 267-275.
GARNER M.M., BARTHOLOMEW J.L., WHIPPS C.M., NORDHAUSEN R.W., RAITI P.
(2005) - Renal myxozoanosis in Crowned River turtles Hardella thurjii: description of the putative
agent, Myxidium hardella n. sp. by histopathology, electron microscopy, and DNA sequencing.
Vet. Pathol,. 42: 589-595.
GASSER R.B., HOSTE H. (1995) - Genetic markers for closely-related parasitic nematodes. Mol.
Cell. Probes, 9: 315-320.
GIBSON D.I. (1992) - Helminth parasites of aquatic organisms: taxonomic problems. Bull. Scand.
Soc. Parasitol., 2: 58–67.
HERSHKOVITZ M.A., LEWIS L.A. (1996) - Deep-level diagnostic value of the rDNA-ITS region.
Mol. Biol. Evol,. 13: 1276-1295.
JIRKÙ M., BOLEK M.G., WHIPPS C.M., JANOVY J., KENT M.L., MODRÝ D. (2006) - A
new species of Myxidium (Myxosporea: Myxidiidae), from the western chorus frog, Pseudacris
triseriata triseriata, and Blanchard’s cricket frog, Acris crepitans blanchardi (Hylidae) from eastern
Nebraska USA: morphology, phylogeny and critical comments on amphibian Myxidium taxonomy. J. Parasitol., 92: 611-619.
KENT M.L., ANDREE K.B., BARTHOLOMEW J.L., EL-MATBOULI M., DESSER S.S.,
DEVLIN R.H., FEIST S.W., HEDRICK R.P., HOFFMANN R.W., KHATTRA J., HALLETT
S.L., LESTER R.J.G., LONGSHAW M., PALENZEULA O., SIDDALL M.E., XIAO C. (2001) Recent Advances in Our Knowledge of the Myxozoa. J. Eukaryot. Microbiol., 48: 395–413.
KENT M.L., KHATTRA J., HERVIO D.M.L., DEVLIN R.H. (1998) - Ribosomal DNA sequence
analysis of isolates of the PKX myxosporean and their relationship to members of the genus
Sphaerospora. J. Aquat. Anim. Health, 10: 12-21.
KOIE M., WHIPPS C.M., KENT M.L. (2004) - Ellipsomyxa gobii (Myxozoa: Ceratomyxidae) in the
common goby Pomatoschistus microps (Teleostei: Gobiidae) uses Nereis spp. (Annelida: Polychaeta) as invertebrate hosts. Folia Parasitol., 51: 14-18.
Diagnostica molecolare delle malattie dei pesci con particolare riferimento alle mixosporidiosi
187
LOM J., ARTHUR J.R. (1989) - A guideline for the preparation of species descriptions in Myxosporea. J. Fish Dis., 12: 151–156.
LOM J., DYKOVÁ I. (1992) - Protozoan Parasites of Fishes. Elsevier, New York: 315 pp.
LOM J., DYKOVÁ I. (2006) - Myxozoan genera: definition and note on taxonomy, life-cycle terminology and pathogenic species. Folia Parasitol., 53: 1-36.
LOM J., MCGEORGE J., FEIST S.W., MORRIS D., ADAMS A. (1997) - Guidelines for the
uniform characterisation of the actinosporean stages of parasites of the phylum Myxozoa. Dis.
Aquat. Org., 30: 1–9.
MEDLIN L., ELWOOD H.J., STICKEL S., SOGIN M.L. (1988) - The characterisation of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene, 71: 491-499.
MOLNÁR K. (1994) - Comment on the host, organ and tissue specificity of fish myxosporeans and
on the type of their intrapiscine development. Parasit. Hung., 27: 5-20.
MOLNÁR K. (2002) - Site preference of myxosporean spp. on the fins of some Hungarian fish species Dis. Aquat. Org., 52: 123–128.
MONIS P.T. (1999) - The importance of systematics in parasitological research. Int. J. Parasitol.,
29: 381–388.
PRUNESCU C.C., PRUNESCU P., PUCEK Z., LOM J. (2007) - The first finding of myxosporean
development from plasmodia to spores in terrestrial mammals: Soricimyxum fegati gen. et sp. n.
(Myxozoa) from Sorex araneus (Soricomorpha). Folia Parasitol., 54: 159-164.
YOKOYAMA H, OGAWA K, WAKABAYASHI H (1991) - A new collection method of actinosporeans - a probable infective stage of myxosporeans to fishes - from tubificids and experimental
infection of goldfish with the actinosporean Raabeia sp. Fish Pathol., 26: 133-138.
ZHU X., GASSER R.B., PODOLSKA M., CHILTON N.B. (1998) - Characterisation of anisakid
nematodes with zoonotic potential by nuclear ribosomal DNA sequences. Int. J. Parasitol., 28:
1911-1921.