MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Immunofluorescent Antibody Test Kit for the Detection and
Identification of Legionella pneumophila in Clinical Specimens
and Culture.
Fo
For In Vitro Diagnostic Use
re
efe
rR
nc
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/
Léxico/Leksikon/Ordlista ............................................................................. 1
eU
English.......................................................................................................... 3
Français...................................................................................................... 12
se
Español ..................................................................................................... 22
Deutsch ...................................................................................................... 33
On
Italiano........................................................................................................ 43
Portuguese................................................................................................. 54
ly
Dansk ......................................................................................................... 64
Svensk........................................................................................................ 74
References/Bibliographie/Referencias/Literatur/Bibliografia/
Referencer/Referenser ............................................................................... 84
FOR REFERENCE USE ONLY: DO NOT USE in
place of package inserts provided with each test kit.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
ly
On
Code du lot
Fabricant
Manufacturer
Dispositif médi- Para uso diag- In-vitrocal de diagnos- nóstico in vitro Diagnostitic in vitro
kum
For In Vitro
Diagnostic Use
Consulter les
instructions
d’utilisation
Limites de
température
Xn. Nocif
Consult
Instructions for
Use
Temperature
Limitation
Xn. Harmful
ly
Xn. Nocivo
Límites de
temperatura
Consulte las
instrucciones
de uso
Fabricante
Conformità
europea
Italiano
Verwendbar Utilizzare
bis
entro il
Fabbricante
Codice del
lotto
Per uso
diagnostico
in vitro
Limiti di
temperatura
Xn. Gesund- Xn. Nocivo
heitsschädlich
Zulässiger
Temperaturbereich
Dansk
Medicinsk
udstyr til
in vitrodiagnostik
Fabricante
Xn. Nocivo
Limite de
temperatura
Tillverkare
Partinummer
För in vitrodiagnostik
Använd före
Europeisk överensstämmelse
Svenska
Xn. SundXn. Hälshedsskade- ovådligt
lig
Temperatur- Temperaturbebegrænsn- gränsning
ing
Se brugsan- Se bruksanvisvisning
ningen
Producent
Código do lote Lotnummer
Para
utilização no
diagnóstico in
vitro
Utilizar até
Holdbar til
Conformidade Europæisk
com as noroverensmas europeias stemmelse
Português
Gebrauch- Consultare le Consulte as
sanweisung istruzioni per instruções de
beachten
l'uso
utilização
Hersteller
Código de lote Chargenbezeichnung
On
Batch code
Utiliser avant le Fecha de
caducidad
Use by
CE-Konformitätskennzeichnung
Conformité aux Conformidad
normes
europea
européennes
Deutsch
European
Conformity
Español
Français
English
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/Léxico/Leksikon/Ordlista
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
Representante autorizado en la
Comunidad
Europea
Représentant
agréé dans la
Communauté
Européenne
Réactif
colorant
Authorized
Representative
in the
European
Community
Staining
Reagent
Medio de
montaje
Portaobjetos
para microscopia de fluorescencia
Lames de
microscope à
fluorescence
Fluorescence
Microscopy
Slides
ly
On
Milieu de
Montage
se
Mounting
Media
Positive Control Contrôle Positif Control
positivo
Reactivo de
tinción
Español
Français
English
eU
Positivkontrolle
Anfärbereagenz
Bevollmächtigter
in der
Europäischen Union
Deutsch
Reagente
colorante
Mandatario
autorizzato
per l'Unione
Europea
Italiano
Controllo
positivo
Objektträger für
FluoreszenzMikroskopie
Vetrini per
microscopia
in fluorescenza
Eindeckmit- Soluzione di
tel
montaggio
nc
re
efe
rR
Dansk
Repræsentant i det
Europæiske
Fællesskab
Português
Representante autorizado na
Comunidade
Europeia
Lâminas para
Microscopia
de Fluorescência
Meio de
Montagem
Controlo
Positivo
Monteringsmedium
Positiv kontroll
Färgningsreagens
Auktoriserad
representant i
Europeiska
gemenskapen
Svenska
Fluorescens Objektglas för
mikroskofluorescenspislides
mikroskopi
Monteringsmiddel
Positiv
kontrol
Reagente para FarvningColoração
sreagens
Fo
NAME AND INTENDED USE
MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit is intended
for the detection and identification of Legionella pneumophila in clinical
specimens and culture.
SUMMARY AND EXPLANATION
Organisms of the genus Legionella are gram-negative bacteria that are
ubiquitous in the environment, including sites such as fresh water lakes, tap
water, air conditioning systems, and recreational whirlpools.1 Several species of the genus are associated with human disease,2 however, more than
80% of the organisms isolated from patients have been identified as
L. pneumophila.3,4
Fo
L. pneumophila is the etiologic agent of two distinct illnesses: Legionella
pneumonia (Legionnaires’ disease), an acute respiratory infection,5 and
Pontiac Fever, a non-pneumonic, self-limited, respiratory illness.6
nc
re
efe
rR
Infections with L. pneumophila occur as sporadic isolated events, endemic
clusters of cases, and epidemics. Outbreaks have been reported in almost
all parts of North America and most other continents.7 Epidemics have
been reported in hospitals, hotels, office buildings, and industrial plants.
Transmission of the disease appears to be related to exposure to aerosols
such as those created by air conditioners, jet nebulizers, and room humidifiers.1
se
eU
Increased risk of acquiring Legionnaires’ disease is associated with cigarette smoking, alcohol consumption, and the presence of pre-existing disease resulting in reduced immunocompetence.2,7 Mortality rates for
patients with Legionnaires’ disease range from 15% in persons generally
free of underlying disease to 80% in untreated, immunosuppressed
patients.2
ly
On
The actual incidence of infection with L. pneumophila may be underestimated due to the wide range of clinical symptoms, the similarity of the
symptoms to those of other pneumonias, and the lack of widely available
diagnostic tests. It has been estimated that L. pneumophila accounts for
approximately 10% of the cases of atypical pneumonia.2
Clinical laboratory diagnosis to determine appropriate treatment is best
done by direct examination of clinical specimens and by culture and isolation of Legionella from clinical specimens. Retrospective diagnosis of the
disease is accomplished by demonstration of a four-fold increase in antibody titer in paired serum samples.
The MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit is used
to detect and identify L. pneumophila directly in patient specimens or in
culture isolates, confirming a diagnosis of Legionnaires’ disease.8
3
PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
The MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila Staining Reagent contains
a single monoclonal antibody that is labeled with fluorescein isothiocyanate. This antibody reacts with a protein present in the outer membrane of all
known serogroups of L. pneumophila.9
Fo
Smears are prepared on microscope slides as described in the test procedure, either directly from patient specimens or from organisms isolated in
culture. The smears are stained with the MONOFLUO™ Anti-Legionella
pneumophila Staining Reagent. The labeled monoclonal antibody in this
reagent binds immunologically to any L. pneumophila in the smear. A subsequent rinse step removes unbound antibody from the specimen. When
samples are viewed with a fluorescence microscope, L. pneumophila
appear as brightly fluorescing apple-green bacilli or coccobacilli. Other
organisms will appear dark red or dull gold due to a counterstain.
efe
rR
The MONOFLUO™ Mounting Medium included with the kit contains an
Anti-Quencher. This ingredient increases the amount of time slides may be
scanned before fluorescence fades.
PRODUCT DESCRIPTION
Component
Contents
Preparation
re
Use as supplied.
C1 • Positive Control Antigen
Suspension
1 dropper bottle (2.0 ml)
• Killed L. pneumophila
• Buffered Saline
• Sodium Azide**
Shake before use.
R2 • Mounting Medium
1 dropper bottle (4.0 ml)
• Buffered glycerol
• Anti-Quencher
Use as supplied.
R3 • Fluorescence Microscopy
Slides
24 (2 wells each)
• Fluorescence microscopy
slides
Wipe with lint-free
tissue before use.
se
eU
nc
R1 • Anti-Legionella pneumophila • FITC-Labeled Monoclonal
Staining Reagent
Antibody
1 dropper bottle (1.3 ml)
• Counterstain
• Sodium Azide*
• Protein-stabilized buffer
ly
On
*0.01 % sodium azide; **0.1 % sodium azide
Store reagents at 2-8°C. Slides should be stored at 2-28°C. If stored at the
specified temperatures, opened or unopened reagents are stable for the
printed shelf life.
4
PRECAUTIONS FOR USERS
For in vitro diagnostic use.
For professional use only.
1. Do not use the kit after the stated expiration date.
2. Handle all clinical specimens as potentially infectious material, using
appropriate aseptic laboratory technique to process specimens and cultures. Procedures that could create aerosols should be conducted in a
biological safety cabinet. All materials should be sterilized after use or
prior to disposal.
efe
rR
Fo
3. The Staining Reagent and Positive Control Antigen Suspension contain
sodium azide. Sodium azide may react with lead and copper plumbing
to form metal azides that are highly explosive. To prevent azide buildup,
flush plumbing with a large volume of water if reagents are disposed of
in the sink.
C1 • Positive Control Antigen Suspension:
Xn. Harmful
0.1% NaN3
nc
re
R: 21/22
Harmful in contact with skin and if swallowed.
S: 24/25-28-36/37/39
Avoid contact with skin and eyes. After contact with skin,
wash immediately with plenty of water. Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection.
se
eU
4. Some laboratories may have water supplies that contain L. pneumophila.
If fluorescent organisms are observed when performing a negative control
test, it may be necessary to filter sterilize all deionized water and pre-rinse
glassware used in performing this test.
On
5. Clean Coplin dishes thoroughly between uses to prevent carryover of
positive cells.
6. Do not allow Staining Reagent to dry on the slide during the staining procedure.
ly
SPECIMEN SELECTION
Clinical specimens for the test can be either fresh or fresh-frozen. Almost
every type of lower respiratory tract specimen is appropriate for direct
Legionella testing and culture. In addition, extrapulmonary fluids and tissues can be pertinent specimens.10
The sensitivity of direct testing and culture can be maximized by testing
portions of a specimen that appear most significant. In respiratory fluids,
select a sample of specimen that is milky or bloody. In lung tissue, choose
dense areas of gray or reddish consolidation.10
Whenever possible, Legionella should be isolated by culture. A culture isolate may be needed for epidemiological studies, and culture may increase
5
sensitivity in detecting all Legionella species. The greatest recovery rates
are achieved with the use of buffered charcoal yeast extract agar supplemented with 0.1% alpha-ketoglutarate (BCYEa), with or without selective
ingredients. (For further information on culture techniques for
L. pneumophila see reference 10 or 11 or technical material available from
Bio-Rad Laboratories.)
Legionella colonies exhibit a characteristic cut glass appearance when
viewed with a dissecting microscope under low-angle incident light. An
opalescent sheen is often noted. Young colonies are 1-2 mm in diameter,
round with entire edges, and flat to convex.11
Fo
TEST PROCEDURE
Materials Provided
See Reagents Section, page 4.
se
eU
nc
re
efe
rR
Materials Required but not Provided for the testing of Clinical
Specimens:
• Coverslips, 24 x 60 mm, #1
• Lint-free tissue
• Pasteur pipettes
• Serologic pipette, 1 ml
• Sterile wooden applicator sticks
• 10% formalin in normal saline (see note below)
• Deionized water
• Coplin-type staining dishes, approx. 7x8x10 cm
• Moisture chamber (such as a large, covered petri dish with a wet
paper towel in the bottom)
• 37°C incubator
• Bunsen burner
• Biological safety cabinet (recommended)
• Immersion oil suitable for fluorescence microscopy
• Fluorescence microscope with a filter system for fluorescein isothiocyanate (FITC), i.e. a maximum excitation wavelength of 490 nm and
a mean emission wavelength of 520 nm. Variations in the wattage,
intensity, and alignment of the bulb and differences in type of illumination and filters may affect the performance of this test.
ly
On
Additional Materials Required for Testing Organisms Isolated from Culture:
• Bacterial loop
• Glass test tubes
• Test tube rack
• No. 1 McFarland nephelometer density standard (see note below)
• 1% formalin in normal saline (see note below)
Note:
• No. 1 McFarland nephelometer density standard = 0.1 ml 1% barium chloride added to 9.9 ml 1%
sulfuric acid. Store at 2-8°C, protected from light. Shake before use.
• 10% formalin = 3.7% formaldehyde (for direct specimens).
• 1% formalin = 0.37% formaldehyde (for culture confirmation).
• Normal saline = 0.85% NaCl deionized water.
6
SPECIMEN PREPARATION PRIOR TO STAINING
Smear Preparation for Direct Test on Patient Specimens (biological
safety cabinet recommended)
1. Clean and label a two-well MONOFLUO™ Fluorescence Microscopy
Slide. Specimens from more than one patient should not be combined
on the same slide. Each slide should be processed separately during fixation and washing to ensure that organisms present in one specimen are
not transferred to another specimen. A Positive Control smear should be
prepared on a separate slide and processed separately.
Fo
2. Prepare two smears per patient specimen, as described below. (Many
specimens contain very few Legionella cells and cells may be unevenly
dispersed throughout the sample. Therefore, two smears can increase
the sensitivity of direct testing.)
se
eU
nc
re
efe
rR
a. Tissue (fresh or fresh-frozen)
Choose an area of dense gray or reddish consolidation. Use one or
both of the following techniques to prepare two smears:
• Grind the tissue with sterile, deionized water to create an approximate 10% tissue homogenate. Using a sterile wooden applicator
stick, make thin smears covering the wells on the slide.
• Using sterile forceps and scalpel, cut a fresh face of tissue. (If too
wet to give a thin smear, blot on sterile gauze.) With the forceps,
press and squeeze the tissue against the slide to fill the wells. If
culture is to be performed, do so before making smears.
b. Lung Exudates (fresh or fresh-frozen sputum, transtracheal aspirates, bronchial washings, etc.)
Select a viscous portion of the specimen that is milky or bloody in
appearance. With a sterile wooden applicator stick, prepare two thin
smears.
c. Pleural Fluid and Cerebrospinal Fluid
Centrifuge the specimen in a safety cup at about 4,000xg for 30 minutes. Discard all but 0.5 ml of supernatant; resuspend. With a sterile
Pasteur pipette, make two thin smears.
ly
On
3. Air dry the smears,* then heat-fix the samples by rapidly passing the
slide through a flame.
4. Place the slide in a moisture chamber and cover each smear with 10%
formalin in saline. Fix for 10 minutes at room temperature.
5. Drain off the formalin and briefly dip the slide in deionized water.
6. Soak the slide in fresh deionized water for two minutes to remove the
remainder of the formalin.
7. Air dry,* then proceed with the Fluorescence Staining Procedure.
*Note: During smear preparation, a slide warmer at 35-45°C can be used for all steps requiring air drying.
7
Smear Preparation for Culture Confirmation (biological safety cabinet
recommended)
1. Clean and label a MONOFLUO™ Fluorescence Microscopy Slide.
2. Remove a distinct colony of suspect L. pneumophila from the culture
plate with a bacteriological loop. Suspend the bacteria in a test tube
containing a very small amount of 1% formalin in saline to the turbidity
of a McFarland No.1 standard.
3. Using a Pasteur pipette, apply 2-3 drops of the suspension to a well on
the slide, then remove with the same Pasteur pipette. A thin film of
organisms will remain on the well. Repeat steps 1-3 to make a separate
smear of each suspect colony, using individual slides.
Fo
4. Air dry the smears,* then heat-fix by rapidly passing the slide through a
flame. Proceed with the Fluorescence Staining Procedure.
Smear Preparation for Positive Control
rR
efe
1. Clean and label a MONOFLUO™ Fluorescence Microscopy Slide. Note:
The Positive Control smear should be processed separately from patient
test smears.
nc
re
2. Shake the bottle containing the Positive Control Antigen Suspension to
resuspend cells. Add 1-2 drops of the suspension to a well on the slide,
then using a fresh Pasteur pipette remove the liquid from the well and
discard.
eU
3. Air dry,* then heat fix the sample by rapidly passing the slide through a
flame. Proceed with the Fluorescence Staining Procedure.
*Note: During smear preparation, a slide warmer at 35-45°C can be used for all steps requiring air drying.
se
STAINING PROCEDURE
Fluorescence Staining Procedure
On
ly
1. Apply a sufficient amount of the MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila Staining Reagent to cover the specimen (1-2 drops depending
on the type of specimen, keeping within the boundary of the well).
2. Place the slide in a moisture chamber and incubate for 30 minutes at 3537°C. Note: Incubate the Positive Control slide and specimen slide(s) in
separate moisture chamber.
3. Remove excess Staining Reagent by a method such as aspiration.
Briefly dip the slide in deionized water to rinse, followed by two soaks for
2-10 minutes each in fresh deionized water. Note: Clean hands or
change gloves between handling the Positive Control slide and specimen slide(s).
4. Air dry slides.
5. Add 1-2 drops of Mounting Medium to the slide; apply a coverslip.
8
EXAMINATION OF STAINED SLIDES
• Direct test: Scan each smear with a 20-25x objective. If fluorescent
speckles are observed, switch to a 63-100x objective to confirm cellular
morphology. See Limitations of the Procedure Section, page 10.
• Culture confirmation test: Scan each smear with a 63-100x objective.
• Read the slides within several hours of staining. If desired, the slides
may be stored overnight in the dark at 2-8°C, or for longer periods in the
dark at -20°C. Slides stored in the cold must be allowed to reach room
temperature before reading, or condensation will obscure the sample.
Fo
QUALITY CONTROL
Use Positive Control Antigen Suspension to verify the reactivity of the
Staining Reagent each day the test is performed. The test procedure
describes the method of processing the Positive Control.
efe
rR
Use a culture of a known gram-negative organism such as E. coli as a negative control. Prepare a suspension as described for culture confirmation,
and follow the test procedure.
nc
re
EVALUATION OF TEST RESULTS
Stained L. pneumophila will appear as intra- or extracellular fluorescing,
apple-green rods or coccobacilli. Samples are negative when organisms
appear dark red or dull gold.
eU
L. pneumophila are pleomorphic organisms that can range from very short
coccobacillary forms to long, filamentous rods. Antibiotic therapy may
result in organisms with uncharacteristic morphology.
se
The staining characteristics and morphology of positive organisms resemble the L. pneumophila Positive Control.
On
In a culture confirmation test, overcrowding of cells in the smear may significantly reduce staining intensity. If necessary, examine the outer edges of
the well or portions of the smear containing fewer cells.
ly
Culture conditions, especially age of culture, may result in cell-to-cell variation in fluorescence intensity. Some cells may not stain uniformly over their
entire surface. In all cases, however, positively stained cells will fluoresce in
a pattern that reveals definite cellular morphology. Cultures are confirmed
for L. pneumophila based on the distinctive appearance of the colonies, the
morphology of the fluorescent organisms, and the results of a Gram stain.
The recommended method of reporting results is shown in table 2 below.
9
Table 2: Recommended Reporting Criteria
Direct Test Results
Suggested Report
> 5 fluorescing bacteria/2-well slide
1-5 fluorescing bacteria/2-well slide
FA positive
Report the number of stained cells;
request a second specimen if clinically
indicated. Confirm in culture.
FA negative
No detectable fluorescing bacteria
In many specimens such as sputum, organisms are rarely numerous.
Therefore, if care has been taken to avoid carry-over of Legionella cells,
observation of even a single morphologically typical coccobacillus with
bright, cell-wall fluorescence is considered significant.
Fo
nc
re
efe
rR
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
A negative result does not exclude the possibility of infection with
Legionella pneumophila or other Legionella species in the patient. Sample
collection and preparation are critical steps in the testing procedure. Collecting the sample at an improper time during the course of the disease, by
an inappropriate method or with improper handling of the specimen, or
misusing the reagents provided can result in failure to detect Legionella
pneumophila. Diagnosis should be made in conjunction with clinical symptoms.
eU
With a limited number of organisms (Staphylococcus aureus and some Lactobacillus species), fluorescence may occasionally be observed due to
non-immune binding.
se
Use only fresh or frozen specimens. Histopathologically processed specimens and formalin preserved materials are inappropriate specimens for this
test.
On
ly
Certain purulent sputum specimens may exhibit increased background
staining and non-immune binding to cells. Any specimen exhibiting these
characteristics should be confirmed by culture.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila Staining Reagent is specific to L. pneumophila and detects all known serogroups of the organism.
Based on the fluorescence staining data below, the sensitivity and specificity of the MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila Staining Reagent
were 100% on direct specimens and cultures.
Culture Confirmation
A blind study was conducted to evaluate the performance of the MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test on 50 known cul-
10
tures. The reagent correctly identified all 19 cultures of Legionella
pneumophila and was negative on the other 31 organisms.
Very dim fluorescence (1+ fluorescence) due to non-immune binding was
observed on one culture of Staphylococcus aureus and one culture of Lactobacillus brevis. These were scored as negative due to dim staining. These
organisms can also be distinguished by the morphology of the fluorescent
organisms, the morphology of the colonies on the culture plates, and the
results of a Gram stain.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
Direct Specimens
A blind study was conducted to evaluate the performance of the MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test on 54 human, lowerrespiratory tract, fresh-frozen specimens, of which 24 had previously been
identified as positive and 30 as negative for L. pneumophila. During this
study, the MONOFLUO™ Test identified 25 of these specimens as positive
and 29 as negative. One sample, a transtracheal aspirate which was negative by DFA and culture results during original testing in 1980, was clearly
positive with the MONOFLUO™ Test as well as with two polyclonal
reagents. Although repeat culture attempts were unsuccessful, a Gimenez
stain performed in 1980 had shown atypical forms. This specimen was
therefore considered to be a true positive.
ly
On
11
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Kit de détection par anticorps immunofluorescents pour la mise
en évidence et l'identification de Legionella pneumophila dans
des cultures et échantillons cliniques.
rR
Fo
NOM ET INDICATION
Le kit de détection par anticorps immunofluorescents de Legionella de
MONOFLUO™ est destiné à la mise en évidence et à l’identification de
Legionella pneumophila dans des cultures et échantillons cliniques.
eU
nc
re
efe
SOMMAIRE ET EXPLICATION
Les organismes du genre Legionella sont des bactéries à Gram négatif
ubiquitaires dans l’environnement, y compris dans les lacs d’eau douce,
l’eau du robinet, les systèmes de climatisation, et les bassins jacuzzis de
décontraction.1 Bien que plusieurs espèces du genre aient été associées à
des maladies humaines,2 plus de 80% des organismes isolés sur des
patients ont pu être identifiés comme L. pneumophila.3,4
se
L. pneumophila est l’agent étiologique de deux maladies distinctes : la
pneumopathie à Legionella (ou maladie des légionnaires) qui est une infection respiratoire aiguë5, et la fièvre de Pontiac qui est une maladie respiratoire non pneumonique spontanément résolutive.6
ly
On
Les infections à L. pneumophila se produisent sous forme d’événements
sporadiques isolés, de petits groupes de cas endémiques, et d’épidémies.
Des flambées ont été constatées dans pratiquement toutes les régions de
l’Amérique du nord et sur la plupart des continents.7 Des épidémies ont été
signalées aussi bien dans les hôpitaux et les hôtels, que les bureaux et les
usines. La transmission de la maladie semble être liée à une exposition à
des aérosols tels que ceux produits par les systèmes de climatisation, les
agitateurs à nébulisation et les humidificateurs d’atmosphère.1
Les risques d’acquisition de la maladie des légionnaires sont augmentés
par la consommation de cigarettes et d’alcool, et la présence de maladies
préexistantes entraînant un affaiblissement des défenses immunitaires.2,7
Les taux de mortalité pour les patients atteints de la maladie des légionnaires vont de 15% chez les sujets généralement dépourvus de maladies
sous-jacentes, jusqu’à 80% chez les sujets souffrant d’un déficit immunitaire non traité.2
12
Il est possible que la fréquence réelle des infections à L. pneumophila soit
sous-estimée en raison d’une grande diversité des symptômes cliniques,
d’une similitude des symptômes avec ceux d’autres pneumonies, et d’un
manque de disponibilité des tests diagnostiques. On estime qu’environ
10% des cas de pneumonies atypiques sont causées par L. pneumophila.2
Pour déterminer le traitement adapté, il est préférable d’assurer le diagnostic de laboratoire par l’examen direct des échantillons cliniques et la culture
et l’isolement de Legionella sur ces prélèvements. Un diagnostic rétrospectif de la maladie peut être accompli par la mise en évidence d’une augmentation de 4 dilutions du titre d’anticorps dans des échantillons de sérum
appariés.
rR
Fo
Le kit de détection de Legionella par immunofluorescence de MONOFLUO™ sert à détecter et à identifier L. pneumophila directement dans des
échantillons de patients ou des isolements de culture, dans le but de confirmer le diagnostic d’une maladie des légionnaires.8
nc
re
efe
PRINCIPES DE LA METHODE
Le réactif de coloration anti-Legionella pneumophila de MONOFLUO™
contient un seul anticorps monoclonal marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine. Cet anticorps réagit avec une protéine présente dans la membrane externe de tous les groupes sérologiques connus de
L. pneumophila.9
se
eU
Des frottis sont préparés sur lames microscopiques conformément aux
instructions sur la préparation des échantillons, soit directement à partir
d’échantillons de patients, soit à partir d’organismes isolés en culture. Les
frottis sont alors colorés avec le réactif de coloration anti-Legionella pneumophila de MONOFLUO™. L’anticorps monoclonal marqué de ce réactif se
lie immunologiquement à tout L. pneumophila présente dans le frottis. Le
rinçage qui suit permet d’éliminer les anticorps non liés à l’échantillon.
Sous un microscope à fluorescence, L. pneumophila est visible en tant que
bacille ou coccobacille de couleur vert-pomme brillant. En raison d’une
contre-coloration, d’autres organismes sont rendus visibles par une teinte
rouge foncé ou or mat.
ly
On
Le milieu de montage fourni avec le kit MONOFLUO™ contient un stabilisateur qui prolonge la durée d’examen des lames avant que la fluorescence
ne s’estompe.
13
DESCRIPTION DU PRODUIT
Contenu
Préparation
R1 • Réactif de coloration du
Legionella pneumophila
1 flacon compte-gouttes
(1,3 ml)
• Anticorps
monoclonauxmarqués à
l’isothiocyanate de
fluorescéine
• Contre-colorant
• Azide de sodium*
• Tampon protéinique
Prêt à l'emploi.
C1 • Suspension de l'antigène
témoin positif
1 flacon compte-gouttes
(2,0 ml)
• L. pneumophila tuées
• Solution saline
tamponnée
• Azide de sodium**
Secouer avant
l'emploi.
• Glycérol tamponné
• Stabilisateur
Prêt à l’emploi.
Fo
Composant
rR
R2 • Milieu de montage
1 flacon compte-gouttes
(4,0 ml)
efe
R3 • Lames pour microscopie en • Lames pour microscopie
fluorescence
en fluorescence
24 (2 puits chacune)
Nettoyer avec un
chiffon non pelucheux
avant emploi.
*0,01 % Azide de sodium; **0,1 % Azide de sodium
re
eU
nc
Conserver les réactifs entre 2 et 8° C et les lames entre 2 et 28° C. Quand
ils sont stockés à la température recommandée, les réactifs ouverts ou
fermés sont stables jusqu'à la date de péremption.
se
PRECAUTIONS A PRENDRE
Réservé aux usages diagnostiques in vitro.
Exclusivement à usage professionnel.
On
1. Ne pas utiliser le kit au-delà de la date de péremption indiquée sur l’étiquette.
ly
2. Manipuler tous les échantillons cliniques comme s’ils étaient infectieux,
en respectant les techniques de laboratoire aseptiques appropriées pour
le traitement des échantillons et des cultures. Les techniques produisant
des aérosols doivent être pratiquées sous une hotte de protection
biologique. Tout le matériel doit être stérilisé après emploi ou avant
d’être jeté.
3. Le réactif de coloration et la suspension de l’antigène témoin positif
contiennent de l’azide de sodium. Cette substance peut réagir avec les
tuyaux en plomb et en cuivre pour former des azides métalliques fortement explosifs. Si les réactifs sont évacués dans l’évier, rincer les tuyaux
avec une grande quantité d’eau pour éviter l’accumulation d’azide.
14
Fo
C1 • Suspension de l'antigène témoin positif
Xn: Nocif
0.1 % NaN3
R: 21/22
Nocif par contact avec la peau et par ingestion.
S: 24/25-28-36/37/39
Éviter le contact avec la peau et les yeux. Après contact avec la
peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l'eau.
Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un
appareil de protection des yeux/du visage.
4. L’eau d’alimentation de certains laboratoires peut contenir Legionella
pneumophila. Si l’on observe des organismes fluorescents pendant le
test du contrôle négatif, il sera peut-être nécessaire de stériliser en filtrant toute l’eau déminéralisée et de pré-rincer les récipients utilisés
dans le déroulement de ce test.
rR
5. Pour éviter tout transfert des cellules positives, nettoyer méticuleusement les bacs de Coplin entre chaque utilisation.
efe
6. Pendant la procédure de coloration, ne pas laisser sécher le réactif de
coloration sur la lame.
eU
nc
re
SELECTION DES ECHANTILLONS
Les échantillons cliniques utilisés dans ce test peuvent être frais ou congelés. Presque tous les échantillons provenant des voies respiratoires
basses pourront convenir à un test direct et à une culture de Legionella. En
outre, les liquides et tissus extrapulmonaires peuvent constituer des échantillons pertinents.10
se
La sensibilité d’un test direct ou d’une culture peut être améliorée en testant des portions d’échantillon qui paraissent plus significatives. Dans les
liquides respiratoires, sélectionner une partie d’échantillon qui soit laiteuse
ou hémorragique. Dans les tissus pulmonaires, choisir des zones denses
de condensation grise ou rougeâtre.10
On
ly
Dans la mesure du possible, Legionella doit être isolée par culture. Un isolat
cultivé pourrait être nécessaire à la conduite d’études épidémiologiques, et
la culture peut augmenter la sensibilité du processus de détection de
toutes les espèces de Legionella. Les meilleurs taux de récupération sont
obtenus à l’aide d’une gélose d’extrait de levure de charbon tamponné
additionné de 0,1% d’alpha-cétoglutarate (BCYEa), avec ou sans ingrédients sélectifs. [Pour plus de renseignements sur les techniques de culture
de L. pneumophila, voir les références bibliographiques 10 ou 11, ou les
documents techniques disponibles auprès de Bio-Rad Laboratories.]
Les colonies de Legionella ont l’aspect caractéristique du verre taillé quand
on les observe sous un rayon de lumière incident à angle plat à l’aide d’un
microscope disséquant. On remarque souvent des reflets opalescents. Les
colonies jeunes font 1-2 mm de diamètre, elles sont rondes avec des bords
entiers, et plates à convexes.11
15
INSTRUCTIONS POUR LE TEST
Matériel nécessaire
Description du produit, page 14.
eU
nc
re
efe
rR
Fo
Matériel necessaire mais non fourni pour les tests des échantillons
cliniques:
• Lamelles, 24 x 60 mm, n° 1
• Chiffon non pelucheux
• Pipettes Pasteur
• Pipette sérologique, 1 ml
• Bâtonnets applicateurs en bois stériles
• Formol à 10% en solution saline normale (voir remarque ci-dessous)
• Eau déminéralisée
• Bacs de coloration de type Coplin, dimensions approx. 7x8x10 cm
• Chambre humidifiée (par exemple, une grande boîte de Petri couverte
contenant une serviette en papier mouillée)
• Incubateur à 37° C
• Bec Bunsen
• Hotte de protection biologique (recommandée)
• Huile à immersion pour microscopie en fluorescence
• Microscope à fluorescence, équipé d’un système de filtres pour l’isothiocyanate de fluorescéine, c’est-à-dire qui dispose d’une longueur d’onde
d’excitation maximum de 490 nm et d’une longueur d’onde d’émission
moyenne de 520 nm. Les variations de puissance, d’intensité et
d’alignement de l’ampoule et les différents types d’illuminateurs et de filtres utilisés peuvent affecter le niveau de performance du test.
se
Autre matériel nécessaire pour tester les organismes isolés de la
culture:
• Anse bactériologique
• Tubes à essai en verre
• Portoir pour tubes à essai
• Echelle de densité McFarland n°1 établie à l’aide d’un néphélomètre
(voir remarque ci-dessous)
• Formol à 1% en solution saline normale (voir remarque ci-dessous)
ly
On
Remarque:
• Echelle de densité McFarland n° 1 établie à l’aide d’un néphélomètre = 0,1 ml de chlorure de
baryum à 1% ajouté à 9,9 ml d’acide sulfurique à 1%. Entreposer à 2-8° C, à l’abri de la lumière.
Secouer avant l’emploi.
• Formol à 10% = 3,7% de formaldéhyde (pour les échantillons directs)
• Formol à 1% = 0,37% de formaldéhyde (pour confirmation des cultures)
• Solution saline normale = Eau déminéralisée avec 0,85% de NaCl
PREPARATION DES ECHANTILLONS AVANT COLORATION
Préparation des frottis pour test direct sur les échantillons de patients
(usage d’une hotte de protection biologique recommandé)
1. Nettoyer et étiqueter une lame MONOFLUO™ à deux puits pour
microscopie en fluorescence. Les échantillons provenant de plusieurs
16
patients ne doivent pas être combinés sur une même lame. Pendant les
étapes de fixation et de lavage, chaque lame doit être traitée séparément afin d’éviter que les organismes d’un échantillon ne soient transférés à un autre échantillon. Un frottis de contrôle positif doit être
préparé à part sur une autre lame et traité séparément.
2. Préparer deux frottis par échantillon de patient, conformément aux
instructions ci-dessous. (De nombreux échantillons ne contiennent que
très peu de Legionella intra-cellulaires et les cellules sont quelquefois
éparpillées de façon inégale dans l’échantillon. Par conséquent, deux
frottis peuvent augmenter la sensibilité du test direct.)
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
a. Tissu (frais ou congelé)
Choisir des zones denses de condensation grise ou rougeâtre.
Préparer deux frottis selon une des techniques ci-dessous, ou les
deux:
• Broyer le tissu avec de l’eau déminéralisée stérile de manière à
créer un homogénat contenant environ 10% de tissu. A l’aide d’un
bâtonnet applicateur en bois stérile, étaler l’échantillon en bandes
fines afin de recouvrir les puits de la lame.
• A l’aide de pinces et d’un scalpel stériles, couper une nouvelle
tranche de tissu. (Si celui-ci est trop liquide pour donner un frottis
mince, le sécher sur de la gaze stérile.) A l’aide des pinces, appuyer
et aplatir le tissu sur la lame de manière à en remplir les puits. Si l’on
doit faire une culture, celle-ci doit être pratiquée avant les frottis.
b. Les exsudats pulmonaires (échantillons d’expectoration frais ou
congelé, aspirations transtrachéales, lavages bronchiques, etc.)
Sélectionner une partie visqueuse de l’échantillon qui soit d’aspect
laiteux ou hémorragique. A l’aide d’un bâtonnet applicateur en bois
stérile, préparer deux frottis minces.
c. Liquide pleural et liquide cérébro-spinal
Centrifuger l’échantillon dans une coupe de sûreté à 4000 x G environ
pendant 30 minutes. Ne garder que 0,5 ml de surnageant; remettre
en suspension. Faire deux frottis minces à l’aide d’une pipette Pasteur stérile.
ly
On
3. Laisser sécher les frottis à l’air*, puis fixer les échantillons à la chaleur en
passant rapidement la lame dans une flamme.
4. Placer la lame dans une chambre humidifiée et recouvrir chaque frottis
avec du formol à 10% en solution saline. Fixer pendant 10 minutes à
température ambiante.
5. Faire couler le formol en excès et tremper brièvement la lame en eau
déminéralisée.
6. Tremper la lame en eau déminéralisée fraîche pendant deux minutes afin
de la débarrasser de tout le formol.
17
7. Laisser sécher à l’air*, puis passer à la procédure de marquage fluorescent.
Préparation d’un frottis pour confirmation de culture (usage d’une hotte
de protection biologique recommandé)
1. Nettoyer et étiqueter une lame MONOFLUO™ pour microscopie en fluorescence.
2. A l’aide d’une anse bactériologique, prélever sur la boîte de culture une
colonie de L. pneumophila suspectée. Suspendre les bactéries dans un
tube à essai contenant une très petite quantité de formol à 1% en solution
saline correspondant à la turbidité du point n° 1 de l’échelle McFarland.
rR
Fo
3. Avec une pipette Pasteur, appliquer 2-3 gouttes de la suspension dans
un puits de la lame, puis les retirer avec la même pipette Pasteur. Une
fine pellicule des germes va subsister dans le puits. Répéter les étapes
1-3 afin d’obtenir, sur des lames individuelles, un frottis séparé de
chaque colonie suspecte.
efe
4. Laisser sécher les frottis à l’air*, puis fixer à la chaleur en passant rapidement la lame dans une flamme. Passer ensuite à la procédure de marquage fluorescent.
Préparation d’un frottis pour le témoin positif
re
nc
1. Nettoyer et étiqueter une lame MONOFLUO™ pour microscopie en fluorescence. Remarque : Le frottis du témoin positif ne doit pas être traité
avec les frottis des échantillons de patient.
se
eU
2. Secouer le flacon contenant la suspension de l’antigène témoin positif
afin d’en remettre en suspension les cellules. Ajouter 1-2 gouttes de la
suspension à un puits de la lame, puis retirer ce liquide du puits à l’aide
d’une pipette Pasteur fraîche, et le jeter.
On
3. Laisser sécher à l’air*, puis fixer l’échantillon à la chaleur en passant rapidement la lame dans une flamme. Passer ensuite à la procédure de
marquage fluorescent.
ly
*Remarque: Pendant la préparation des frottis, il est possible de réchauffer les lames à 35-45° C au lieu de
les sécher à l’air.
PROCEDURE DE COLORATION
Procédure de marquage fluorescent
1. Déposer suffisamment de réactif de coloration Anti-Legionella pneumophila de MONOFLUO™ pour recouvrir l’échantillon (1à 2 gouttes en
fonction du type d’échantillon, en respectant les limites de contenance
du puits).
2. Placer la lame dans une chambre humidifiée et incuber pendant 30 minutes à 35-37° C. Remarque : La lame du témoin positif et la ou les lames
d’échantillons doivent être incubées en chambres humidifiées séparées.
18
3. Eliminer tout excès de réactif de coloration, par exemple en procédant
par aspiration. Plonger brièvement la lame dans l’eau déminéralisée
pour la rincer, pour ensuite lui faire subir 2 trempages de 2-10 minutes
chacun dans de l’eau déminéralisée fraîche. Remarque : Se laver les
mains ou changer de gants entre les manipulations de la lame du témoin
positif et de celle(s) des échantillons.
4. Laisser sécher les lames à l’air.
5. Déposer une à deux gouttes de milieu de montage sur la lame et appliquer une lamelle.
rR
Fo
EXAMEN DES LAMES COLOREES
• Test direct: Examiner chaque frottis avec un grossissement de 20-25. Si
l’on observe des signes de fluorescence mouchetée, utiliser un grossissement de 63-100 pour confirmer les morphologies cellulaires. Voir la
section intitulée Limites de la méthode page 20.
• Test de confirmation de la culture: Examiner chaque frottis avec un grossissement de 63-100.
eU
nc
re
efe
• Examiner les lames au bout de quelques heures. Après lecture, les
lames peuvent être conservées jusqu’au lendemain dans l’obscurité
entre 2 et 8° C, ou pendant plus longtemps dans l’obscurité à -20° C.
Les lames conservées au froid doivent être laissées à la température
ambiante avant de pouvoir être lues pour éviter que la condensation
n’obscurcisse l’échantillon.
se
CONTROLE DE LA QUALITE
A chaque test, utiliser la suspension de l’antigène témoin positif pour vérifier la réactivité du réactif de coloration. La section décrivant la procédure
du test indique la façon de traiter le témoin positif.
ly
On
Pour le témoin négatif, utiliser une culture avec un germe à Gram-négatif
connu tel que E. coli. Préparer une suspension conforme à celle décrite dans
la section relative à la confirmation de culture, et suivre la procédure du test.
EVALUATION DES RESULTATS DES TESTS
Les L. pneumophila colorées se présentent sous forme de bâtonnets ou de
coccobacilles intra- ou extra-cellulaires vert-pomme fluorescents. Les
échantillons négatifs contiennent des germes de couleur rouge foncé ou or
mat. L. pneumophila sont des germes pléiomorphes qui peuvent se
présenter sous des formes coccobacillaires très courtes ou des bâtonnets
filamenteux longs. Un traitement antibiotique peut donner des organismes
de morphologie atypique.
Par leur morphologie et leurs caractéristiques de coloration, les germes
positifs ressemblent au témoin positif de L. pneumophila.
19
Dans un test de confirmation d’une culture, un surpeuplement des cellules
dans le frottis peut réduire de façon significative l’intensité de la coloration.
Au besoin, examiner les bords extérieurs du puits ou certaines parties du
frottis contenant moins de cellules.
Les conditions de culture, particulièrement l’âge d’une culture, peuvent
entraîner des variations d’intensité de la fluorescence entre les cellules.
Certaines cellules ne se colorent pas uniformément sur toute la surface. Par
contre, dans tous les cas, les cellules colorées positivement vont être fluorescentes d’une manière qui révèle la morphologie cellulaire précise. Les
cultures confirmées de L. pneumophila se caractérisent par l’aspect distinct des colonies, la morphologie des germes fluorescents et le résultat
d’une coloration de Gram.
Fo
La méthode recommandée pour rendre compte des résultats est indiquée
au tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Critères recommandés dans les compte rendus
rR
Résultats d’un test direct
Compte rendu suggéré
nc
re
efe
> 5 bactéries fluorescentes/lame Immunofluorescence positive
à 2 puits
1-5 bactéries fluorescentes/lame Indiquer le nombre de cellules colorées; demander
à 2 puits
un second échantillon en cas de besoin clinique.
Confirmer par une culture.
Aucune bactérie fluorescente
Immunofluorescence négative
visible
se
eU
Dans de nombreux échantillons tels que les spécimens d’expectoration, les
germes sont rarement nombreux. Par conséquent, si l’on a pris garde de ne
pas contaminer les lames, on considère que même l’observation d’un seul
coccobacille à la morphologie typique avec une fluorescence de paroi bien
lumineuse, est significative.
On
ly
LIMITES DE LA METHODE
Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité d’une infection à Legionella
pneumophila ou à une autre espèce de Legionella chez un patient. Le
prélèvement et la préparation des échantillons constituent des étapes
importantes dans la procédure du test. Le prélèvement de l’échantillon à un
moment inopportun au cours de la maladie, par une méthode incorrecte ou
avec une mauvaise manipulation de l’échantillon, ou l’utilisation non appropriée des réactifs fournis peuvent compromettre la détection de Legionella
pneumophila. Un diagnostic doit être établi conjointement avec les
symptômes cliniques.
Avec certains germes peu nombreux (Staphylococcus aureus et certaines
espèces de Lactobacillus), on observe quelquefois de la fluorescence en
raison d’une liaison non immunitaire.
20
N’utiliser que des échantillons frais ou congelés. Les échantillons ayant
subi un traitement histopathologique et les produits conservés dans du formol ne conviennent pas à ce test.
Certains échantillons d’expectoration purulente peuvent manifester une
coloration de fond plus marquée et une liaison non immunitaire aux cellules. Tout échantillon manifestant ces caractéristiques doit être confirmé
par culture.
Fo
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE
Le réactif de coloration anti-Legionella pneumophila de MONOFLUO™ est
spécifique de L. pneumophila et détecte tous les groupes sérologiques
connus de cet organisme. Sur la base des données de coloration en fluorescence indiquées ci-dessous, la sensibilité et la spécificité du réactif de
coloration anti-Legionella pneumophila de MONOFLUO™ étaient de 100%
sur des examens directs et des cultures.
re
efe
rR
Confirmation de culture
Une étude en aveugle a été menée pour évaluer les performances du test
par anticorps immunofluorescents de Legionella de MONOFLUO™ sur 50
cultures connues. Le réactif a pu correctement identifier les 19 cultures de
Legionella pneumophila et s’est montré négatif sur les 31 organismes restants.
se
eU
nc
Une fluorescence très faible (fluorescence 1+) due à une liaison non immunitaire a pu être observée sur une culture de Staphylococcus aureus et une culture de Lactobacillus brevis. En raison de la faible coloration, ces résultats
ont été enregistrés comme négatifs. On peut également distinguer ces
organismes par la morphologie des germes fluorescents, la morphologie des
colonies sur les lames de culture, et les résultats d’une coloration de Gram.
ly
On
Echantillons directs
Une étude en aveugle a été menée pour évaluer les performances du test
par anticorps immunofluorescents de Legionella de MONOFLUO™ sur 54
échantillons humains congelés des voies respiratoires basses, parmi
lesquels 24 avaient déjà été identifiés positifs et 30 s’étaient montrés négatifs pour Legionella pneumophila. Au cours de cette étude, le test de
MONOFLUO™ a identifié 25 de ces échantillons comme étant positifs et 29
comme étant négatifs. Un échantillon d’aspirat transtrachéal qui s’était
montré négatif par les résultats en immunofluorescence direct et en culture
lors des tests d’origine en 1980, s’est avéré nettement positif avec le test
de MONOFLUO™, ainsi qu’avec deux réactifs polyclonaux. Bien que des
tentatives de cultures répétées n’aient pas abouti, une coloration Gimenez
pratiquée en 1980 avait mis en évidence des formes atypiques. Cet échantillon a donc été qualifié de vrai positif.
21
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Equipo de prueba de anticuerpos para la detección e
identificación de Legionella pneumophila en muestras clínicas y
cultivos.
rR
Fo
NOMBRE Y USO DESTINADO
El Equipo MONOFLUO™ de prueba de mediante anticuerpos inmunofluorescentes para Legionella está destinado a usarse para la detección e identificación de Legionella pneumophila en muestras clínicas y cultivos.
eU
nc
re
efe
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Los organismos del género Legionella son bacterias Gram-negativas que
se pueden encontrar en cualquier parte del medio ambiente, con especial
preferencia por zonas como lagos, conducciones de agua, sistemas de
acondicionamiento de aire, y piscinas.1 Varias especies del género han
sido asociadas con patologías en el ser humano.2 Más del 80% de los
organismos de Legionella aislados de pacientes han sido identificados
como L. pneumophila.3,4
se
L. pneumophila es el agente etiológico de dos enfermedades diferentes: la
neumonía por Legionella (enfermedad del legionario), que es una infección
respiratoria aguda,5 y la fiebre de Pontiac, una enfermedad respiratoria
autolimitada y no neumónica.6
On
ly
Las infecciones por L. pneumophila aparecen de forma esporádica y aislada, o como un conjunto de casos endémicos, o como epidemias. Se han
registrado brotes ocurridos en casi toda América del Norte y la mayoría de
los demás continentes.7 También se han producido epidemias en hospitales, hoteles, edificios de oficinas y plantas industriales. La transmisión de
la enfermedad parece estar relacionada con la exposición a aerosoles,
como los que crean los aparatos de aire condicionado, nebulizadores de
chorro y los humidificadores ambientales.1
El riesgo de adquirir la enfermedad del legionario aumenta en fumadores,
con el consumo de alcohol y en presencia de enfermedades que reducen la
inmunocompetencia.2,7 Las tasas de mortalidad en los pacientes con
enfermedad del legionario varían entre el 15% para las personas sin
patología subyacente y el 80% en pacientes con inmunosupresión y sin
tratamiento.2
22
La incidencia real de la infección con L. pneumophila puede estar subestimada debido a la amplia gama de síntomas clínicos, la semejanza de los
síntomas a los de otras neumonías, y la falta de pruebas de diagnóstico
fácilmente disponibles. Se ha estimado que L. pneumophila es responsable de aproximadamente el 10% de los casos de neumonía atípica.2
El diagnóstico de laboratorio para determinar el tratamiento apropiado se
hace por examen directo de las muestras clínicas y por cultivo de muestras
clínicas y aislamiento de Legionella. El diagnóstico retrospectivo de la
enfermedad se efectúa demostrando una cuadruplicación del título de anticuerpos en muestras pareadas de suero.
Fo
El Equipo MONOFLUO™ para la detección de Legionella mediante anticuerpos inmunofluorescentes se usa para detectar e identificar la
L. pneumophila directamente en muestras clínicas o en cultivos, permitiendo confirmar el diagnóstico de enfermedad del legionario.8
efe
rR
PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA
El reactivo colorante MONOFLUO™anti-Legionella pneumophila contiene
un anticuerpo monoclonal único marcado con isotiocianato de fluoresceína
(FITC). Este anticuerpo reacciona con una proteína de la membrana
externa de todos los serogrupos conocidos de L. pneumophila.9
se
eU
nc
re
Las extensiones se preparan sobre portaobjetos de acuerdo con lo
descrito en el procedimiento de la prueba, directamente con la muestra del
paciente o con organismos aislados en el cultivo. Las extensiones se tiñen
con el reactivo colorante MONOFLUO™ anti-Legionella pneumophila. El
anticuerpo monoclonal marcado contenido en este reactivo se une inmunológicamente a los organismos de L. pneumophila presentes en la extensión. Los anticuerpos no unidos se eliminan de la muestra mediante
lavado. Cuando las muestras se examinan bajo un microscopio de fluorescencia, se observan los organismos de L. pneumophila como bacilos o
cocobacilos que emiten una fluorescencia brillante de color verde claro.
Los otros microorganismos presentes dan un color rojo oscuro o doradoanaranjado debido a una coloración de contraste.
ly
On
El medio de montaje MONOFLUO™ incluido con el equipo contiene un
agente estabilizador de fluorescencia. Este ingrediente aumenta la
duración de la fluorescencia y deja más tiempo para el examen de los portaobjetos antes de que desaparezca la fluorescencia.
23
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
Contenido
Preparación
R1 • Reactivo colorante
anti- Legionella
pneumophila
1 frasco cuentagotas
(1,3 ml)
• Anticuerpos monoclonales
anti-Legionella, marcados con
FITC
• Coloración de contraste
• Azida de sodio*
• Tampón estabilizado con
proteínas
Listo para usar
C1 • Suspensión de
antígeno de control
positivo
1 frasco cuentagotas
(2,0 ml)
• L. pneumophila muertas
• Solución fisiológica
tamponada
• Azida de sodio**
Agítese antes de usar
R2 • Medio de montaje
1 frasco cuentagotas
(4,0 ml)
• Glicerol tamponado
• Estabilizador de fluorescencia
Listo para usar
• Portaobjetos para microscopía Limpie con un paño
de fluorescencia
sin pelusa antes de
usa
re
efe
R3 • Portaobjetos para
microscopía de
fluorescencia
24 (2 pozos cada uno)
rR
Fo
Componente
nc
*0,01 % Azida de sodio; **0,1 % Azida de sodio
se
eU
Conserve los reactivos a 2-8°C. Los portaobjetos deben mantenerse entre 228°C. Los reactivos cerrados o abiertos, si se almacenan a la temperatura
especificada, se mantienen estables durante la vida útil impresa en la etiqua.
On
PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS
Solamente para uso diagnóstico in vitro
Sólo para uso profesional.
1. No use el equipo después de la fecha de caducidad indicada.
ly
2. Manipule todas las muestras clínicas como si se tratase de material
potencialmente infeccioso, con técnica de laboratorio aséptica y apropiada para procesar muestras y cultivos. Use una cámara de seguridad
biológica para todos aquellos procesos que pudieran crear aerosoles.
Todos los materiales deben desinfectarse después de su uso o antes de
ser eliminados.
3. El reactivo colorante y la suspensión de antígeno de control positivo
contienen azida de sodio. La azida de sodio puede reaccionar con las
tuberías de plomo y de cobre, para formar azidas metálicas que son
sumamente explosivas. Para evitar la acumulación de azidas metálicas
en las tuberás de desagüe, deje correr agua en abundancia si elimina los
reactivos por el desagüe.
24
C1 • Suspensión de antígeno de control positivo
Xn: Nocivo
0.1 % NaN3
R: 21/22
Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.
S: 24/25-28-36/37/39
Evítese el contacto con los ojos y la piel. En caso de contacto
con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua.
Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los
ojos/la cara.
4. Utilizar batas, guantes y gafas o mascarillas de protección adecuadas.
rR
Fo
5. Algunos laboratorios podrían tener L. pneumophila en sus depósitos de
agua. Si se observan organismos fluorescentes cuando se efectúa el
análisis de un control negativo, podría ser necesario esterilizar por filtración toda el agua desionizada y enjuagar el material de vidrio con
agua esterilizada antes de realizar este análisis.
6. Limpie a fondo los frascos Coplin después de usarlos, para evitar el
arrastre de células positivas.
re
efe
7. Evite que el reactivo colorante se seque sobre el portaobjetos durante el
procedimiento de coloración.
se
eU
nc
SELECCIÓN DE MUESTRAS
Las muestras clínicas para el análisis pueden ser frescas o congeladas de
inmediato tras su obtención. Casi todas las muestras provenientes de las
vías respiratorias bajas son apropiadas para el análisis directo y el cultivo
de Legionella. Las secreciones y tejidos extrapulmonares también pueden
ser muestras apropiadas.10
ly
On
La sensibilidad de los análisis tanto directos como de los cultivos puede
aumentarse al máximo si se analizan porciones de la muestra cuyo aspecto
parezca más significativo. Para las secreciones pulmonares, debe seleccionarse la parte de la muestra que tenga aspecto lechoso o sanguinolento. Para las muestras de tejidos pulmonares, se seleccionarán
zonas densas de consolidación gris o rojiza.10
Siempre que sea posible, debe aislarse la Legionella por cultivo. Un cultivo
positivo puede ser necesario para estudios epidemiológicos, y además
puede aumentar la sensibilidad de la detección de todas las especies de
Legionella. Los mejores rendimientos de recuperación se obtienen cuando
se emplea agar tamponado a base de extracto de carbón vegetal y levadura, suplementado con alfa-cetoglutarato al 0,1% (BCYEa), con o sin
ingredientes selectivos. (Para ampliar la información sobre técnicas de cultivo para L. pneumophila, consulte la referencia 10 u 11, o el material técnico disponible en Bio-Rad Laboratories.)
Las colonias de Legionella tienen un aspecto característico de cristal biselado cuando se les observa con un microscopio de disección bajo una luz
25
de ángulo de incidencia agudo. Frecuentemente se observa un brillo opalescente. Las colonias jóvenes tienen un diámetro de 1-2 mm, son redondas y de bordes lisos, y planas o convexas.11
PROCEDIMIENTO DE PRUEBA
Materiales suministrados
Descriptión del producto, página 24.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
Materiales necesarios que no se suministran para el análisis de
muestras clínicas:
• Cubreobjetos, 24 x 60 mm, N° 1
• Paño sin pelusa
• Pipetas Pasteur
• Pipeta serológica, 1 ml
• Aplicadores de madera, estériles
• Formalina al 10% en solución fisiológica normal (ver la nota más
adelante)
• Agua desionizada
• Frascos de coloración tipo Coplin, de aproximadamente 7x8x10 cm
• Cámara húmeda (como una placa de Petri grande y tapada que tenga
al fondo una toallita de papel humedecido)
• Incubador de 37°C
• Mechero Bunsen
• Cámara de seguridad para materiales biológicos (recomendada)
• Aceite de inmersión apropiado para microscopía de fluorescencia
• Microscopio de fluorescencia con un sistema de filtros para el isotiocianato de fluoresceína (FITC), es decir, una longitud de onda de excitación máxima de 490 nm y una longitud de onda de emisión media
de 520 nm. Las variaciones en la potencia, intensidad y alineamiento
del foco luminoso y las diferencias en el tipo de iluminación y los filtros pueden afectar el rendimiento de este análisis.
ly
On
Materiales adicionales necesarios para analizar organismos aislados
en el cultivo:
• Asa bacteriológica
• Tubos de ensayo de vidrio
• Gradilla para tubos de ensayo
• Estándar de densidad para nefelometría, N° 1 de McFarland (vea la
nota más adelante)
• Formalina al 1% en solución fisiológica normal (vea la nota más
adelante)
Nota:
• Estándar de densidad para nefelometría, N° 1 de McFarland = 0,1 ml de cloruro de bario al 1% agregado a 9,9 ml de ácido sulfúrico al 1%. Consérvese a 2-8°C, al abrigo de la luz. Agíte antes de usar.
• Formalina al 10% = formaldehído al 3,7% (para muestras directas)
• Formalina al 1% = formaldehído al 0,37% (para confirmación de cultivo)
• Solución fisiológica normal = NaCl al 0,85% en agua desionizada
26
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS ANTES DE LA TINCIÓN
Preparación de la extensión para el análisis directo a partir de
muestras de pacientes (se recomienda usar cámara de seguridad
biológica)
1. Limpie y marque un portaobjetos MONOFLUO™ para microscopía de
fluorescencia, de dos pocillos. No combine muestras de diferentes
pacientes en un mismo portaobjetos. Procese cada portaobjetos independientemente durante la fijación y el lavado, para evitar el paso de
organismos de una muestra a otra. Prepare una extensión de control
positivo en un portaobjetos separado y procéselo independientemente.
rR
Fo
2. Prepare dos extensiones por cada muestra, como se describe a continuación. (Hay las muestras que contienen muy pocas células de
Legionella y las células pueden estar dispersas a través de la muestra.
Por lo tanto, si se usan dos extensiones, aumenta la sensibilidad del
análisis directo.)
se
eU
nc
re
efe
a. Tejido (fresco, o congelado en fresco)
Elija una zona de consolidación densa, gris o rojiza. Emplee una o las
dos técnicas siguientes, para preparar dos extensiones:
• Triture el tejido en agua desionizada estéril para crear un homogeneizado de tejido, aproximadamente al 10%. Con un aplicador
estéril de madera, prepare una extensión fina que cubra los pocillos del portaobjetos.
• Con una pinza y bisturí estériles, haga un corte en el tejido para
exponer una superficie fresca. (Si la humedad excesiva del tejido
dificulta la obtención de una extensión delgada, séquelo suavemente sobre una gasa estéril.) Con la pinza, presione y aplaste el
tejido contra el portaobjetos para llenar los pocillos. Si se va a
hacer un cultivo, hágalo antes de preparar las extensiones.
b. Exudados de pulmón (esputo fresco o congelado en fresco, aspirados transtraqueales, lavados bronquiales, etc.)
Seleccione una porción viscosa de la muestra que tenga un aspecto
lechoso o sanguinolento. Con un aplicador de madera estéril, prepare
dos extensiones finas.
c. Líquido pleural y líquido cefalorraquídeo
Centrifugue la muestra en un vaso de seguridad a aproximadamente
4.000 x g durante 30 minutos. Deseche el sobrenadante, dejando 0,5
ml de sedimento, y vuelva a suspender. Con una pipeta Pasteur
estéril, prepare dos extensiones finas.
ly
On
3. Seque las preparaciones al aire,* y luego fije las muestras al calor,
pasando el portaobjetos rápidamente a través de la llama.
Nota: Durante la preparación de las extensiones, puede usarse un calentador de portaobjetos a 35-45°C
para todos los pasos que requieran secado al aire.
27
4. Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda y cubra cada extensión
con formalina al 10% en solución fisiológica. Fije durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
5. Deseche la formalina y sumerja el portaobjetos por un momento en agua
desionizada.
6. Remoje el portaobjetos en agua desionizada fresca durante dos minutos
para eliminar el resto de la formalina.
7. Seque al aire,* y luego efectúe la técnica de tinción fluorescente.
Preparación de una extensión para confirmar un cultivo (se recomienda
usar cámara de seguridad biológica)
1. Limpie y marque un portaobjetos MONOFLUO™ para microscopía de
fluorescencia.
Fo
efe
rR
2. Identifique una colonia aislada con aspecto de ser L. pneumophila y
sáquela de la placa de cultivo con un asa bacteriológica. Suspenda las
bacterias en un tubo de ensayo que contenga una pequeóa cantidad de
formalina al 1% en solución fisiológica, hasta lograr una suspensión con
un grado de turbidez equivalente al estándar N°1 de McFarland.
eU
nc
re
3. Con una pipeta Pasteur, coloque 2-3 gotas de la suspensión en un
pocillo del portaobjetos, y luego retírelas con la misma pipeta Pasteur.
Quedará una fina película de organismos sobre el pocillo. Repita los
pasos 1-3 para preparar extensiones independientes de cada colonia
que tenga aspecto sospechoso, usando portaobjetos diferentes para
cada colonia.
se
4. Seque las extensiones al aire,* y luego fije las muestras al calor, pasando
el portaobjetos rápidamente a través de la llama. Siga con el procedimiento de coloración fluorescente.
Preparación de la extensión de control positivo
ly
On
1. Limpie y marque un portaobjetos MONOFLUO™ para microscopía de
fluorescencia. Nota: Procese la extensión de control positivo independientemente de las de los pacientes.
2. Agite el frasco que contiene la suspensión de antígeno de control positivo, para resuspender las células. Coloque 1-2 gotas de la suspensión
en un pocillo del portaobjetos. Luego emplee una pipeta Pasteur nueva
para extraer y desechar el líquido del pocillo.
3. Seque al aire,* y luego fije la muestra al calor, pasando el portaobjetos
rápidamente a través de la llama. Siga con el procedimiento de coloración fluorescente.
*Nota: Durante la preparación de las extensiones, puede usarse un calentador de portaobjetos a 35-45°C
para todos los pasos que requieran secado al aire.
28
PROCEDIMIENTO DE COLORACIÓN
Procedimiento de coloración fluorescente
1. Coloque el reactivo colorante MONOFLUO™ anti-Legionella pneumophila en cantidad suficiente para cubrir la muestra (1-2 gotas, según el
tipo de muestra, y manteniéndose dentro de los bordes del pocillo).
2. Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda e incube durante 30
minutos a 35-37°C. Nota: Incube el portaobjetos de control positivo y
los portaobjetos con las muestras en cámaras húmedas separadas.
Fo
3. Elimine el exceso de reactivo colorante por aspiración o algún otro
método. Sumerja un momento el portaobjetos en agua desionizada,
para enjuagarlo, y luego remójelo en agua desionizada fresca, dos veces
durante 2-10 minutos cada vez. Nota: Después de manipular el portaobjetos con el control positivo y antes de tocar los portaobjetos con
las muestras, lávese las manos o cámbiese los guantes.
rR
4. Seque los portaobjetos al aire.
efe
5. Agregue 1-2 gotas de medio de montaje al portaobjetos. Coloque un
cubreobjetos.
eU
nc
re
EXAMEN DE LOS PORTAOBJETOS TEÑIDOS
• Análisis directo: Inspeccione cada extensión a través de un objetivo
20-25x. Si observa puntos de fluorescencia, confirme la morfología
celular a través de un objetivo 63-100x. Consulte la sección Limitaciones del procedimiento, página 31.
• Análisis de confirmación de cultivo: Inspeccione cada extensión a través
de un objetivo 63-100x.
se
ly
On
• Inspeccione los portaobjetos dentro de unas horas después de la
tinción. Si desea, puede guardar los portaobjetos hasta el día siguiente
preservados de la luz y a 2-8°C, o durante más tiempo a -20°C también
en ausencia de luz. Si guarda los portaobjetos en un ambiente frío,
permita que alcancen la temperatura ambiente antes de leerlos, para
evitar que la condensación empañe la muestra.
CONTROL DE CALIDAD
Emplee la suspensión de antígeno de control positivo para verificar la reactividad del reactivo colorante cada día que se realice el análisis. El método
para procesar el control positivo se describe en el procedimiento de análisis.
Use un cultivo de organismos Gram-negativos conocidos, como Escherichia coli, como control negativo. Prepare una suspensión tal y como se
describe para la confirmación de cultivo, y procésela de acuerdo con el
procedimiento de análisis.
29
EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL ANÁLISIS
Los organismos de L. pneumophila teñidos aparecen como bastoncillos o
cocobacilos intra o extracelulares, con una fluorescencia de color verde
claro. Las muestras negativas presentan organismos de color rojo oscuro o
dorado-anaranjado.
Las L. pneumophila son microorganismos pleomorfos, cuyo aspecto varía
desde formas de cocobacilos muy cortos a bastoncillos largos y filamentosos. El tratamiento antibiótico puede producir organismos de morfología
diferente de la típica.
Las características de coloración y morfología de los organismos positivos
se asemejan a las del control positivo de L. pneumophila.
rR
Fo
La presencia de acumulaciones celulares en el frotis cuando se realiza una
prueba de confirmación en cultivo, puede hacer que se reduzca de forma
significativa la intensidad de tinción. Si fuera necesario, examine muestras
de los bordes externos del pocillo o de las secciones de la extensión que
tengan menos células.
eU
nc
re
efe
Las condiciones de cultivo, especialmente el tiempo transcurrido desde su
siembra, pueden producir una variación en la intensidad de la fluorescencia
en las distintas células. Algunas células no se tiñen de forma homogénea
en toda su superficie. Sin embargo, en todos los casos, las células coloreadas muestran un patrón de fluorescencia que claramente revela la morfología celular. Se confirma que un cultivo es positivo para L. pneumophila
sobre la base del aspecto característico de las colonias, la morfología de
los organismos fluorescentes, y los resultados de la tinción Gram.
Se recomienda informar los resultados de acuerdo con el método indicado
en la Tabla 2, a continuación.
se
Tabla 2: Criterios de informe recomendados
Informe sugerido
> 5 bacterias fluorescentes/
portaobjetos de 2 pocillos
1-5 bacterias fluorescentes/
portaobjetos de 2 pocillos
Anticuerpos fluorescentes (A.F.): positivo
Informe la cantidad de células coloreadas. Pida una
segunda muestra si existen indicaciones clínicas.
Confirme mediante un cultivo.
Anticuerpos fluorescentes(F.A.): negativo
ly
No se detectan bacterias
fluorescentes
On
Resultados de análisis directo
En ciertas muestras, como las de esputo, no suelen observarse muchos
organismos. Por lo tanto, si se han adoptado las debidas precauciones
para evitar el arrastre de células de Legionella, el hallazgo de tan solo un
cocobacilo de morfología típica y fluorescencia brillante en la pared celular
se considera significativo.
30
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Un resultado negativo no excluye la posibilidad de que un paciente esté
infectado con Legionella pneumophila u otra especie de Legionella. La
obtención y la preparación de la muestra son pasos de vital importancia en
el proceso de análisis. Si la muestra se obtiene en un momento poco adecuado respecto al curso de la enfermedad, empleando un método incorrecto, o si la muestra no se maneja conforme a las directrices aconsejadas
o los reactivos proporcionados no se usan correctamente, puede fracasar
la detección de Legionella pneumophila. El diagnóstico debe hacerse conjuntamente con el cuadro clínico.
Ocasionalmente, puede observarse fluorescencia debida a uniones no
inmunológicas con un número limitado de organismos (Staphylococcus
aureus y algunas especies de Legionella).
Fo
rR
Emplee solamente muestras frescas o congeladas inmediatamente tras su
obtención. Las muestras procesadas para histopatología o conservadas
con formalina no son apropiadas para este análisis.
efe
Ciertas muestras de esputo purulento pueden mostrar una mayor coloración de contraste y uniones no inmunológicas con las células. Toda
muestra que tenga estas características debe confirmarse por cultivo.
se
eU
nc
re
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
El reactivo colorante MONOFLUO™ anti-Legionella pneumophila es específico para L. pneumophila y detecta todos los grupos serológicos conocidos del organismo. Sobre la base de los datos de coloración fluorescente
que se presentan a continuación, la sensibilidad y especificidad del reactivo colorante MONOFLUO™ anti-Legionella pneumophila fueron del 100%
para muestras directas y cultivos.
ly
On
Confirmación de cultivo
Se hizo un estudio ciego para evaluar el rendimiento del Equipo MONOFLUO™ para la detección de Legionella mediante anticuerpos inmunofluorescentes, con 50 cultivos conocidos. El reactivo identificó correctamente a
los 19 cultivos de Legionella pneumophila y dio resultados negativos con
los demás 31 organismos.
En un cultivo de Staphylococcus aureus y un cultivo de Lactobacillus
brevis, se observó una fluorescencia muy tenue (fluorescencia 1+) debida a
uniones no inmunológicas. Estos se clasificaron como negativos debido a
la coloración tenue. Estos organismos también pueden diferenciarse por la
morfología de los organismos fluorescentes, la morfología de las colonias
en las placas de cultivo, y los resultados de la tinción Gram.
Muestras directas
Se hizo un estudio ciego para evaluar el rendimiento del Equipo MONOFLUO™ para la detección de Legionella mediante anticuerpos inmunofluorescentes, con 54 muestras procedentes de vías respiratorias inferiores
31
humanas, congeladas en fresco, previamente clasificadas, de las cuales 24
eran positivas y 30 eran negativas para L. pneumophila. Durante este estudio, el análisis MONOFLUO™ identificó 25 muestras positivas y 29 muestras negativas. Hubo una muestra de aspirado transtraqueal que dio
resultados negativos por anticuerpos fluorescentes directos, y por cultivo
durante el análisis original en 1980, pero que dio resultados claramente
positivos con el análisis MONOFLUO™ y con dos reactivos policlonales.
Aunque no se pudo repetir el cultivo, una tinción de Giménez realizada en
1980 había mostrado formas atípicas. Por lo tanto, se consideró que esta
muestra era positiva verdadera.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
ly
On
32
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Immunofluoreszenz-Antikörper-Testsatz zum Nachweis und zur
Identifizierung von Legionella pneumophila in klinischen Proben
und Kulturen.
rR
Fo
NAME UND ZWECKBESTIMMUNG
Der Legionella Immunofluoreszenz-Antikörper-Testsatz von MONOFLUO™
dient zur Erkennung und Bestimmung von Legionella pneumophila in klinischen Proben und Kulturen.
eU
nc
re
efe
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Die Organismen der Legionella-Gattung sind gramnegative Bakterien, die
ubiquitär in der Natur vorkommen, so z.B. auch in Seen, im Leitungswasser, in Klimaanlagen und Jacuzzis.1 Mehrere Arten werden mit
Erkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht,2 während über 80%
der in Patienten isolierten Organismen als L. pneumophila identifiziert wurden.3,4
se
L. pneumophila ist das ätiologische Agens zweier Krankheiten: Legionella
pneumonia (Legionärskrankheit), einer akuten respiratorischen Infektion5
und Pontiac-Fieber, einer nichtpneumonischen, selbstlimitierenden
Erkrankung der Atemwege.6
ly
On
Infektionen mit L. pneumophila treten sporadisch als isolierte Fälle, als
endemische Fallhäufung und als Epidemie auf. Es wurden Ausbrüche in
fast allen Teilen Nordamerikas und auf den meisten anderen Kontinenten
registriert.7 Epidemien traten in Krankenhäusern, Hotels, Bürogebäuden
und Industrieanlagen auf. Die Übertragung der Krankheit scheint durch die
von Klimaanlagen, Düsenzerstäubern und Luftbefeuchtern usw.
geschaffenen Aerosole begüstigt zu werden, wenn der Mensch diesen ausgesetzt ist.1
Das Risiko, an der Legionärskrankheit zu erkranken, ist größer für Personen, die rauchen, Alkohol trinken und bei vorbestehenden Krankheiten,
die die Immunkompetenz schwächen.2,7 Die Sterberate für Patienten mit
Legionärskrankheit reicht von 15% bei Personen ohne anderweitige
Erkrankungen bis zu 80% bei unbehandelten Patienten mit geschwächter
Immunität.2
33
Die tatsächliche Inzidenz von Infektionen mit L. pneumophila wird möglicherweise aufgrund der breitgestreuten klinischen Symptome, der Ähnlichkeit der Symptome mit denen anderer Pneumonien und aufgrund
mangelnder Verfügbarkeit diagnostischer Tests unterschätzt. Man vermutet, daß L. pneumophila die Ursache für ca. 10% der atypischen Pneumonien ist.2
Eine klinische Labordiagnose zur Bestimmung einer geeigneten Behandlung erfolgt am besten mit einer direkten Untersuchung klinischer Proben
und durch Anlegen einer Kultur und Isolierung der Legionellen aus klinischen Proben. Eine retrospektive Diagnose der Krankheit kann mittels Demonstration eines vierfach erhöhten Antikörpertiters in gepaarten
Serumproben erfolgen.
rR
Fo
Der Legionella Immunofluoreszenz-Antikörper-Testsatz von MONOFLUO™
dient zur direkten Erkennung und Bestimmung von L. pneumophila in
Patientenproben oder Kulturisolaten zur Bestätigung der Diagnose einer
Legionärskrankheit.8
nc
re
efe
VERFAHRENSPRINZIPIEN
Das Anti-Legionella pneumophila Färbereagens von MONOFLUO™ enthält
einen einfachen monoklonalen Antikörper, der mit Fluorescein-Isothiocyanat markiert ist. Dieser Antikörper reagiert mit einem in der Außenmembran aller bekannten Serogruppen von L. pneumophila enthaltenen
Protein.9
se
eU
Zunächst werden Ausstriche auf Objektträgern gemäß dem Testverfahren
vorbereitet, entweder direkt aus Patientenproben oder aus Organismen, die
in der Kultur isoliert wurden. Dann werden die Ausstriche mit dem AntiLegionella pneumophila Färbereagens von MONOFLUO™ gefärbt. Der
markierte monoklonale Antikörper in diesem Reagens verbindet sich immunologisch mit allen L. pneumophila in dem Ausstrich.
Bei der
anschließenden Spülung werden die ungebundenen Antikörper aus der
Probe entfernt. Wenn die Proben unter einem Fluoreszenz-Mikroskop
betrachtet werden, erscheinen die L. pneumophila als helle, fluoreszierende, apfelgrüne Bazillen oder Kokkenbazillen. Andere Organismen
erscheinen aufgrund der Gegenfärbung dunkelrot oder matt goldgelb.
ly
On
Das Fixiermedium von MONOFLUO™, das in dem Testsatz inbegriffen ist,
enthält einen Anti-Quencher. Dieser Zusatz verzögert das Verbleichen der
Fluoreszenz und verlängert den Zeitraum zur Betrachtung der Präparate.
34
PRODUKTBESCHREIBUNG
Inhalt
Vorbereitung
R1 • Anti-Legionella
pneumophila
Färbereagens
1 Tropfflasche (1,3 ml)
• FITC-markierte monoklonale Antikörper
• Gegenfärbung
• Natriumazid*
• Protein-stabilisierter
Puffer
Gebrauchsfertig.
C1 • Positive KontrollAntigen Suspension
1 Tropfflasche (2,0 ml)
• Abgetötete
L. pneumophila
• Gepufferte
Kochsalzlösung
• Natriumazid**
Vor Gebrauch schütteln.
• Gepufferter Glycerol
• Anti-Quencher
Gebrauchsfertig.
Fo
Komponente
R2 • Fixiermedium
1 Tropfflasche (4,0 ml)
rR
R3 • FluoreszenzMikroskopie Objektträger
24 (je 2 Vertiefungen)
• FluoreszenzMikroskopie
Objektträger
Vor Gebrauch mit einem
fusselfreien Tuch
abwischen.
efe
*0,01 % Natriumazid; **0,1 % Natriumazid
eU
nc
re
Die Reagenzien bei 2-8°C, die Objektträger bei 2-28°C lagern. Bei der
angegebenen Temperatur gelagert sind angebrochene und noch
ungeöffnete Reagenzien bis zum Ablauf des aufgedruckten Verfalldatums
stabil.
se
VORSICHTSMASSNAHMEN
Nur zur in vitro Diagnostik
Nur für den Laborgebrauch.
On
1. Den Testsatz nicht über das angegebene Haltbarkeitsdatum hinaus verwenden.
ly
2. Die klinischen Proben als möglicherweise infektiöses Material behandeln, und bei der Verarbeitung der Proben und Kulturen die üblichen
sicheren Laborverfahren beachten. Verfahren, bei denen Aerosole
entstehen könnten, sollten auf einer biologischen Sterilbank ausgeführt
werden. Alle Materialien müssen nach Gebrauch oder vor der Entsorgung sterilisiert werden.
3. Das Färbereagens und die positive Kontrollantigen-Suspension
enthalten Natriumazid. Natriumazid kann mit Blei- und Kupferleitungen
reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Wenn das Reagens ins
Abwasser entsorgt wird, mit viel Wasser nachspülen, damit sich kein
Azid ansammeln kann.
35
C1• Positive Kontroll-Antigen Suspension
Xn: Gesundheitsschädlich
0.1% NaN3
R: 21/22
Fo
Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.
S: 24/25-28-36/37/39
Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden. Bei
Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser. Bei
der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und
Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
4. Manche Labore haben u.U. Wasserversorgungen, die L. pneumophila
enthalten. Falls bein negativen Kontrolltest fluoreszente Organismen
beobachtet werden, muß das für den Test benötigte deionisierte Wasser
möglicherweise filtersterilisiert werden, und Glasgefäße müssen damit
vorspült werden.
rR
5. Die Coplin-Schalen zwischen mehreren Verwendungen gründlich reinigen, um eine Übertragung von positiven Zellen zu verhindern.
re
efe
6. Das Färbereagens beim Färben nicht auf dem Objektträger antrocknen
lassen.
eU
nc
PROBENAHME
Die klinischen Proben für den Test können entweder frisch oder frisch
gefroren sein. Für direkte Legionella-Tests und -Kulturen eignen sich beliebige Proben des tiefen Atmungstraktes. Extrapulmonale Flüssigkeiten und
Gewebe können als zweckdienliche Proben dienen.10
se
Die Empfindlichkeit der direkten Tests und Kulturen kann durch Testen jener
Probenteile, die am bedeutensten erscheinen, optimiert werden. Von respiratorischen Flüssigkeiten sollte ein milchige oder blutige Probe gewählt
werden. Bei Lungengewebe eignen sich dichte Zonen mit gräulicher oder
rötlicher Hepatisation.10
On
ly
Legionella sollte weitmöglichst mittels Kulturen isoliert werden. Ein Kulturisolat kann u.U. für epidemiologische Untersuchungen gebraucht werden,
und die Kultur kann möglicherweise auch die Empfindlichkeit steigern und
alle Legionella-Arten entdecken. Die größten Rückgewinnungsraten werden
mit gepuffertem Holzkohlen-Hefeextraktagar mit zugesetztem 0,1%-igem
Alpha-Ketoglutarat (BCYEa) mit oder ohne selektive Zusätze erzielt. (Einzelheiten über die Kulturverfahren für L. pneumophila sind den Quellen 10
oder 11 bzw. dem von Bio-Rad Laboratories erhältlichen technischen Informationsmaterial zu entnehmen.)
Legionella-Kolonien erscheinen unter dem Mikroskop bei schrägem Lichteinfall typischerweise wie geschliffenes Glas, oftmals mit einem opaleszenten Glanz. Junge Kolonien haben einen Durchmesser von 1-2 mm,
sind rund mit ganzen Rändern und flach bis konvex.11
36
TESTVERFAHREN
Gelieferte Materialien
Produktbeschreibung, Seite 35.
nc
re
efe
rR
Fo
Erforderliche doch nicht mitgelieferte Materialien
zum Testen klinischer Proben:
• Deckgläser, 24 x 60 mm, Nr. 1
• Fusselfreien Tuch
• Serologie-Pipette, 1 ml
• Sterile Holzapplikatorstäbchen
• 10% Formalin in normaler Kochsalzlösung (siehe Anmerkung)
• Deionisiertes Wasser
• Coplin-Färbeschalen, ca. 7 x 8 x 10 cm
• Feuchte Kammer (z.B. große Petri-Schale mit Deckel mit einem
feuchten Papierhandtuch im Boden)
• 37°C Inkubator
• Bunsenbrenner
• Biologische Sterilbank (empfohlen)
• Immersionsöl von Fluoreszenzqualität
• Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtersystem für Fluorescein-Isothiocyanat
(FITC), d.h. einer maximalen Exzitationswellenlänge von 490 nm und
einer durchschnittlichen Emissionswellenlänge von 520 nm. Schwankungen in der Leistung, Intensität und Ausrichtung der Lichtquelle und die
unterschiedlichen Illuminatoren und Filter können die Testergebnisse
u.U. beeinflussen.
se
eU
Zusätzlich erforderliche Materialien für die Tests aus Kulturen
isolierter Organismen:
• Bakterienschlinge
• Glasteströhrchen
• Ständer für die Teströhrchen
• Nr. 1 McFarland Nephelometer Dichtestandard (siehe Anmerkung)
• 1% Formalin in normaler Kochsalzlösung (siehe Anmerkung)
On
ly
Anmerkung:
• Nr. 1 McFarland Nephelometer Dichtestandard = 0,1 ml 1% Bariumchlorid in 9,9 ml 1%
Schwefelsäure. Bei 2-8°C lichtgeschützt lagern. Vor Gebrauch schütteln.
• 10% Formalin = 3,7% Formaldehyd (für direkte Proben)
• 1% Formalin = 0,37% Formaldehyd (zur Kulturbestätigung)
• Normale Kochsalzlösung = 0,85% NaCl deionisiertes Wasser
VORBEREITUNG DER PROBEN VOR DER FÄRBUNG
Anfertigen der Ausstriche für den Direkttest aus Patientenproben (vorzugsweise auf einer biologischen Sterilbank).
1. Einen mit zwei Vertiefungen versehen Objektträger für Fluoreszenzmikroskopie von MONOFLUO™ reinigen und beschriften. Keine Proben
von mehreren Patienten auf einem Objektträger kombinieren. Jeder
Objektträger muß separat fixiert und abgespült werden, damit die
Organismen in einer Probe nicht auf andere Proben übertragen werden.
37
Eine positive Kontrolle muß auf einem separaten Objektträger vorbereitet und verarbeitet werden.
2. Pro Patientenprobe zwei Ausstriche wie nachstehend beschrieben vorbereiten. (Viele Proben enthalten nur wenige Legionella-Zellen, und diese
können u.U. ungleich auf die Probe verteilt sein. Es ist daher besser, die
Empfindlichkeit der Direkttests anhand von zwei Ausstrichen zu
erhöhen.)
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
a. Gewebe (frisch oder frisch gefroren)
Einen Bereich mit dichter grauer oder rötlicher Hepatisation wählen.
Für die Ausstriche eines oder beide der folgenden Verfahren verwenden:
• Das Gewebe mit sterilem, deionisierten Wasser mahlen, um ein
ca. 10%-iges Gewebehomogenat zu erstellen. Mit einem sterilen
Holzapplikatorstäbchen dünne Ausstriche auf die Vertiefungen des
Objektträgers auftragen.
• Mit einer sterilen Pinzette und einem sterilen Skalpell eine frische
Gewebescheibe abschneiden. (Wenn zu große Feuchtigkeit einen
dünnen Ausstrich verhindert, auf sterile Gaze tupfen.) Das Gewebe
mit der Pinzette in die Vertiefungen des Objektträgers drücken.
Wenn eine Kultur angelegt werden soll, ist dies vor den
Ausstrichen zu tun.
b. Lungenexsudate (frisch oder frisch gefrorenes Sputum, transtracheale Aspirate, bronchiale Lavage usw.)
Einen viskösen, milchig oder blutig aussehenden Teil der Probe
wählen. Mit einem sterilen Holzapplikatorstäbchen zwei dünne
Ausstriche vorbereiten.
c. Pleuraflüssigkeit und Liquor cerebrospinalis.
Die Probe in einem Sicherheitsröhrchen bei ca. 4000 G 30 Minuten lang
zentrifugieren. Den Überstand bis auf 0.5 ml verwerfen, resuspendieren. Mit einer sterilen Pasteur-Pipette zwei dünne Ausstriche machen.
On
3. Die Ausstriche an der Luft trocknen lassen,* anschließend durch Hitze
fixieren, indem die Objektträger kurz durch eine Flamme geführt werden.
ly
4. Den Objektträger in eine feuchte Kammer legen und die Ausstriche mit
10%-igem Formalin in Kochsalzlösung bedecken. 10 Minuten lang bei
Zimmertemperatur fixieren.
5. Das Formalin ablassen und den Objektträger kurz in deionisiertes
Wasser tauchen.
6. Den Objektträger in frisches deionisiertes Wasser 2 Minuten lang einlegen, um die Formalinrückstände zu beseitigen.
7. An der Luft trocknen lassen,* dann mit der Fluoreszenzfärbung fortfahren.
*Anmerkung: Bei der Ausstrichvorbereitung kann für alle Schritte, die ein Trocknen an der Luft verlangen,
ein Präparatwärmer mit einer Temperatur von 35-45 °C verwendet werden.
38
Abstrichvorbereitung zur Kulturbestätigung (Biologische Sterilbank
empfohlen)
1. Einen Objektträger für Fluoreszenz-Mikroskopie von MONOFLUO™
reinigen und beschriften.
2. Eine distinkte Kolonie von vermutlichen L. pneumophila mit einer Bakterienschlinge von der Kulturplatte entnehmen. Die Bakterien in einem
Teströhrchen mit sehr wenig l%-igem Formalin in Kochsalzlösung suspendieren, um eine Trübheit gemäß McFarland-Norm Nr.1 zu erzielen.
Fo
3. Mit einer Pasteur-Pipette 2-3 Tropfen der Suspension auf eine Vertiefung
des Objektträgers übertragen und dann mit derselben Pasteur-Pipette
wieder entfernen. Ein dünner Film der Organismen verbleibt in der Vertiefung. Schritt 1-3 wiederholen, um für jede vermutliche Kolonie einen
separaten Ausstrich auf einem separaten Objektträger zu machen.
rR
4. Die Ausstriche an der Luft trocknen lassen,* anschließend durch Hitze
fixieren, indem die Objektträger kurz durch eine Flamme geführt werden.
Mit der Fluoreszenzfärbung fortfahren.
Ausstrichvorbereitung für die positive Kontrolle
efe
re
1. Einen Objektträger für Fluoreszenz-Mikroskopie von MONOFLUO™
reinigen und beschriften. Anmerkung: Der positive Kontrollausstrich
sollte separat von den Patiententestausstrichen verarbeitet werden.
eU
nc
2. Die Flasche mit der positiven Kontrollantigen-Suspension schütteln, um
die Zellen zu resuspendieren. 1-2 Tropfen der Suspension in eine der
Vertiefungen auf dem Objektträger geben, dann mit einer frischen Pasteur-Pipette die Flüssigkeit aus der Vertiefung entfernen und verwerfen.
se
3. Die Ausstriche an der Luft trocknen lassen,* anschließend durch Hitze
fixieren, indem die Objektträger kurz durch eine Flamme geführt werden.
Mit der Fluoreszenzfärbung fortfahren.
On
*Anmerkung: Bei der Ausstrichvorbereitung kann für alle Schritte, die ein Trocknen an der Luft verlangen,
ein Präparatwärmer mit einer Temperatur von 35-45 °C verwendet werden.
ly
DAS FÄRBEVERFAHREN
Das Fluoreszenz-Färbeverfahren
1. Die Probe mit einer ausreichenden Menge Anti-Legionella pneumophila
Färbereagens von MONOFLUO™ bedecken (1-2 Tropfen, je nach Probe,
ohne die Vertiefung zu überfüllen).
2. Den Objektträger in eine feuchte Kammer legen und 30 Minuten bei
35-37 °C inkubieren. Anmerkung: Den Objektträger mit der positiven
Kontrolle und den/die Objektträger mit der Probe in getrennten feuchten
Kammern inkubieren.
3. Überschüssiges Färbereagens entfernen. Dies kann beispielsweise
durch Aspiration erfolgen. Den Objektträger zum Abspülen kurz in deio39
nisiertes Wasser tauchen und dann zweimal 2-10 Minuten jeweils in
frisches deionisiertes Wasser einlegen. Anmerkung: Zwischen dem
Umgang mit den Objektträgern mit der positiven Kontrolle und den
Objektträgern mit den Proben die Hände waschen oder Handschuhe
wechseln.
4. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen.
5. 1-2 Tropfen Fixiermedium auf das Präparat auftragen und ein Deckglas
auflegen.
rR
Fo
UNTERSUCHUNG DER GEFÄRBTEN PRÄPARATE
• Direkttest: Jeden Ausstrich mit 20-25-facher Vergrößerung absuchen.
Falls fluoreszierende Punkte erkennbar sind, auf eine 63-100-fache Vergrößerung umschalten, um die Zellmorphologie zu bestätigen. Die Verfahrensbegrenzungen in der Verfahrensbeschreibung auf Seite 41
beachten.
• Kulturbestätigungstest:
größerung absuchen.
Jeden
Ausstrich
mit
60-100-facher
Ver-
nc
re
efe
• Die Präparate innerhalb einiger Stunden nach Färbung untersuchen. Bei
Bedarf können die Präparate über Nacht im Dunkeln bei 2-8 °C oder
länger im Dunkeln bei -20 °C aufbewahrt werden. Im Kalten gelagerte
Präparate müssen erst Zimmertemperatur erreichen, bevor sie untersucht werden können, da sonst Kondensation die Probe verschleiert.
se
eU
QUALITÄTSKONTROLLE
An jedem Testtag die Reaktivität des Färbereagens mit der positiven Kontrollantigen-Suspension bestätigen. Die Anwendungsweise der positiven
Kontrolle ist in der Verfahrensbeschreibung enthalten.
On
Eine Kultur eines bekannten, gramnegativen Organismus wie z.B. E. coli
kann als negative Kontrolle dienen. Die Suspension wie zur Kulturbestätigung zubereiten und das Testverfahren ausführen.
ly
AUSWERTUNG DER TESTERGEBNISSE
Die gefärbten L. pneumophila erscheinen als intra- oder extrazelluläre, fluoreszierende, apfelgrüne Stäbchen oder Kokkenbazillen. Die Proben sind
negativ, wenn die Organismen dunkelrot oder matt gold erscheinen.
L. pneumophila sind pleomorphe Organismen, deren Formen von sehr
kurzen Kokkenbazillen bis zu filamentösen Stäbchen reichen. Eine antibiotische Therapie kann zu Organismen mit uncharakteristischer Morphologie führen.
Die Färbemerkmale und die Morphologie von positiven Organismen ähneln
der positiven Kontrolle der L. pneumophila.
40
Bei einem Kulturbestätigungstest kann eine Zellüberfüllung im Ausstrich zu
einer drastisch verringerten Färbungsintensität führen. Ggf. die Außenränder der Vertiefungen oder Teile des Ausstrichs mit weniger Zellen untersuchen.
Die Kulturbedingungen, besonders das Alter der Kultur, können zu Unterschieden bei der Fluoreszenzintensität der Zellen führen. Bei manchen
Zellen lassen sich die Oberflächen nicht einheitlich färben. In allen Fällen
werden die positiv gefärbten Zellen jedoch in einem Muster fluoreszieren,
das die bestimmte Zellmorphologie zeigt. Die Kulturen werden nach der
jeweiligen Erscheinung der Kolonien oder aber anhand der Morphologie
des fluoreszierenden Organismus und der Ergebnisse einer Gram-Färbung
auf L. pneumophila bestätigt.
Die empfohlene Angabe der Ergebnisse ist in Tabelle 2 gezeigt.
Fo
Tabelle 2: Empfohlene Berichtskriterien
Empfohlener Bericht
rR
Direkttestergebnisse
FA-positiv
Zahl der gefärbten Zellen eintragen; eine
2. Probe verlangen, falls klinisch
angezeigt. In einer Kultur bestätigen.
FA-negativ
nc
Nicht erkennbare fluoreszierende
Bakterien
re
efe
> 5 fluoreszierende Bakterien/Objektträger
mit 2 Vertiefungen
1-5 fluoreszierende Bakterien/Objektträger
mit 2 Vertiefungen
se
eU
In vielen Proben wie z.B. Sputum sind nur selten zahlreiche Organismen zu
finden. Darum ist es bei vorsichtigem Vorgehen zur Vermeidung einer Übertragung von Legionella-Zellen bereits von Bedeutung, wenn auch nur ein
einziger morphologisch typischer Kokkenbazillus mit heller Zellwandfluoreszenz erkannt wird.
ly
On
BESCHRÄNKUNGEN DES VERFAHRENS
Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer Infektion des Patienten
mit Legionella pneumophila oder einer anderen Legionella-Gattung nicht aus.
Die Probenahme und -vorbereitung sind kritische Schritte für den Test. Die
Probenahme zu einer ungeeigneten Zeit während des Krankheitsverlaufs, die
Verwendung einer ungeeigneten Methode oder der falsche Umgang mit den
Proben sowie der Mißbrauch der mitgelieferten Reagenzien kann dazu
führen, daß Legionella pneumophila nicht erkannt wird. Die Diagnose sollte in
Verbindung mit den klinischen Symptomen erfolgen.
Bei einigen wenigen Organismen (Staphylokokkus aureus und einigen Lactobacillus-Arten) kann gelegentlich eine Fluoreszenz aufgrund nichtimmuner Verbindungen auftreten.
41
Nur frische oder gefrorene Proben verwenden. Histopathologisch verarbeitete Proben und in Formalin konservierte Materialien sind nicht für diesen
Test geeignet.
Bestimmte purulente Sputumproben weisen u.U. eine stärkere Hintergrundfärbung und nichtimmunologische Verbindungen zu Zellen auf. Alle
Proben mit diesen Merkmalen sollten mit einer Kultur bestätigt werden.
Fo
LEISTUNGSMERKMALE
Das Anti-Legionella pneumophila-Färbereagens von MONOFLUO™ ist
speziell für L. pneumophila vorgesehen und erkennt alle bekannten Serogruppen des Organismus. Basierend auf den nachstehenden Fluoreszenzfärbedaten war die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Anti-Legionella
pneumophila -Färbereagens von MONOFLUO™ bei direkten Proben und
Kulturen 100%.
efe
rR
Kulturbestätigung
Um die Leistung des Legionella Immunofluoreszenz-Antikörpertests von
MONOFLUO™ beurteilen zu können, wurde eine Blindstudie an 50
bekannten Kulturen vorgenommen. Das Reagens identifizierte alle 19 Kulturen von Legionella pneumophila richtig und lieferte ein negatives Ergebnis
für die anderen 31 Organismen.
se
eU
nc
re
Eine sehr schwache Fluoreszenz (1+ Fluoreszenz) aufgrund nichtimmunologischer Verbindung wurde in einer Kultur von Staphylokokkus aureus und
einer Kultur von Lactobacillus brevis festgestellt. Diese wurden aufgrund
der schwachen Färbung als negativ gewertet. Diese Organismen können
auch durch die Morphologie der fluoreszierenden Organismen, die Morphologie der Kolonien auf den Kulturplatten und die Ergebnisse einer
Gramfärbung erkannt werden.
ly
On
Direkte Proben
Zur Beurteilung der Leistung des Legionella Immunofluoreszenz-Antikörpertests von MONOFLUO™ wurde eine Blindstudie an 54 frisch
gefrorenen menschlichen Proben aus dem tiefen Atmungstrakt durchgeführt, von denen 24 vorher bereits als positiv und 30 als L. pneumophilanegativ identifiziert worden waren. Während dieser Untersuchung identifizierte der MONOFLUO™ Test 25 dieser Proben als positiv und 29 als negativ. Eine Probe, ein transtracheales Aspirat, das bei den ursprünglichen
Tests im Jahr 1980 mittels DFA (direct fluorescent antibody) und Kultur als
negativ identifiziert worden war, erschien anhand des MONOFLUO™-Tests
und aufgrund zweier Tests mit polyklonalen Reagenzien als eindeutig positiv. Obgleich wiederholte Kulturversuche erfolglos blieben, hatte eine Gimenez-Färbung im Jahre 1980 atypische Formen aufgewiesen. Diese Probe
galt daher als wirklich positiv.
42
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Kit di analisi ad immunofluorescenza per la rilevazione e
l'identificazione di Legionella pneumophila in campioni clinici e
colture.
rR
Fo
USO PREVISTO
Il kit Legionella di analisi ad immunofluorescenza MONOFLUO™ va usato
per la rilevazione e l’identificazione di Legionella pneumophila in campioni
clinici e colture.
eU
nc
re
efe
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
Gli organismi appartenenti al genere Legionella sono batteri gram negativi
onnipresenti nell’ambiente inclusi i laghi d’acqua dolce, l’acqua di rubinetto, i sistemi di condizionamento d’aria e le vasche a getti.1 Parecchie
specie appartenenti a questo genere sono associate a patologie umane;2
tuttavia, più dell’80% degli organismi isolati da pazienti è stato identificato
come L. pneumophila.3,4
se
L. pneumophila è l’agente eziologico di due patologie distinte: la polmonite
da Legionella (malattia dei legionari), un’infezione respiratoria acuta,5 e la
febbre di Pontiac, una malattia respiratoria non polmonitica autolimitata.6
ly
On
Le infezioni da L. pneumophila hanno luogo come eventi sporadici ed isolati, come gruppi di casi endemici ed epidemie. Epidemie improvvise si
sono riscontrate in quasi tutte le zone dell’America Settentrionale e nella
maggior parte dei restanti continenti.7 Epidemie si sono verificate in ospedali, alberghi, edifici commerciali adibiti ad uffici e stabilimenti industriali. La
trasmissione della malattia sembra correlata all’esposizione ad aerosol
come, ad esempio, quelli creati dai condizionatori d’aria, dai nebulizzatori a
getto e dagli umidificatori dell’ambiente.1
Vi è un maggior rischio di contrarre la malattia dei legionari in associazione
al fumo di sigarette, al consumo di bevande alcooliche e alla presenza di
patologie preesistenti che determinano la riduzione dell’immunocompetenza.2,7 I tassi di mortalità per i pazienti affetti dalla malattia dei legionari
vanno dal 15% degli individui generalmente non precedentemente affetti
da altre patologie, all’80% dei pazienti immunosoppressi non trattati.2
La reale incidenza delle infezioni da L. pneumophila può essere sottovalutata a causa della varietà dei sintomi clinici, della somiglianza dei sintomi a
43
quelli di altri tipi di polmonite e della mancanza di opportuni test diagnostici
largamente disponibili. È stato stimato che L. pneumophila è responsabile
di circa il 10% dei casi di polmonite atipica.2
La diagnosi effettuata nell’ambito dei laboratori clinici al fine di determinare
l’opportuno trattamento viene meglio condotta mediante esame diretto di
campioni clinici e mediante coltura ed isolamento degli organismi di
Legionella dai campioni clinici. La diagnosi retrospettiva della malattia viene
ottenuta dimostrando la quadruplicazione del titolo anticorpale in campioni
di siero appaiati.
Il kit di analisi ad immunofluorescenza MONOFLUO™ per Legionella viene
usato per la rilevazione e l’identificazione di L. pneumophila direttamente
nei campioni dei pazienti e negli isolati delle colture a conferma della diagnosi della malattia dei legionari.8
Fo
efe
rR
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il reagente per colorazione anti-Legionella pneumophila MONOFLUO™
contiene un singolo anticorpo monoclonale marcato con isotiocianato di
fluoresceina. Questo anticorpo reagisce con una proteina presente nella
membrana esterna di tutti i sierotipi noti di L. pneumophila.9
se
eU
nc
re
Gli strisci vengono preparati per l’esame al microscopio secondo le modalità descritte nella procedura di analisi, direttamente da campioni dei pazienti o da organismi isolati in coltura. Gli strisci vengono quindi colorati con
il reagente per colorazione anti-Legionella pneumophila MONOFLUO™.
L’anticorpo monoclonale marcato presente nel reagente si lega immunologicamente a tutti gli organismi L. pneumophila presenti nello striscio. Il
successivo lavaggio rimuove l’anticorpo in eccesso dal campione. Quando
esaminati mediante un microscopio a fluorescenza, gli organismi
L. pneumophila appaiono come bacilli o coccobacilli con fluorescenza di
colore verde mela brillante. Gli altri organismi mostrano una colorazione di
contrasto rosso scuro o dorato spento.
On
ly
Il mezzo di montaggio MONOFLUO™ accluso al kit contiene un preservante che aumenta la durata del periodo in cui è possibile esaminare i
vetrini prima che la fluorescenza svanisca.
44
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
Componente
Contenuto
Preparazione
R1 • Reagente per colorazione • Anticorpo
anti-Legionella pneumophila
Monoclonale
1 flacone contagocce
marcato con FITC
(1,3 ml)
• Colore di contrasto
• Azoturo di sodio*
• Tampone
stabilizzato con
proteine
Fornito pronto per l'uso.
Fo
Agitare prima dell'uso.
C1 • Sospensione antigenica di • L. pneumophila
inattivata
controllo positivo
• Soluzione fisiologica
1 flacone contagocce
tamponata
(2,0 ml)
• Azoturo di sodio**
• Glicerolo tamponato Fornito pronto per l'uso.
• Preservante (antiquencher)
efe
rR
R2 • Mezzo di montaggio
1 flacone contagocce
(4,0 ml)
R3 • Vetrini per microscopio a
fluorescenza
24 (2 pozzetti ciascuno)
• Vetrini per
microscopio
a fluorescenza
Passare con un panno privo
di lanugine prima dell'uso.
re
*0,01 % Azoturo di sodio; **0,1 % Azoturo di sodio
nc
eU
Conservare i reagenti alla temperatura di 2-8°C. I vetrini vanno conservati a
2-28°C. Se conservati all temperatura indicata, i reagenti aperti sono stabili
per la durata di immagazzinaggio stampigliata.
se
PRECAUZIONI
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Sólo para uso profesional.
On
1. Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza.
ly
2. Trattare tutti i campioni clinici come potenzialmente infetti, adottando le
opportune tecniche asettiche per il trattamento dei campioni e delle colture. Le procedure che possono creare aerosol vanno eseguite in una
cappa per la sicurezza biologica. Dopo l’uso o prima dell’eliminazione,
tutti i materiali vanno sterilizzati.
3. Il reagente per colorazione e la sospensione antigenica di controllo positivo contengono Azoturo di sodio. Questa sostanza può reagire con le
tubature in rame o piombo dando luogo alla formazione di azidi metallici
altamente esplosivi. Qualora si smaltiscano i reagenti attraverso le tubature di scarico versandoli in un lavandino, accompagnarli con una
grande quantità d’acqua per evitare la formazione di azidi metallici.
45
Fo
C1 • Sospensione antigenica di controllo positivo
Xn: Nocivo
0.1% NaN3
R: 21/22
Nocivo a contatto con la pelle e per ingestione.
S: 24/25-28-36/37/39
Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. In caso di contatto
con la pelle lavarsi immediatamente ed abbondantemente con
acqua. Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli
occhi/la faccia.
4. La fornitura idrica di alcuni laboratori può contenere L. pneumophila. Se,
durante l’esecuzione di un test di controllo negativo, si rilevano degli
organismi fluorescenti, può essere necessario filtrare e sterilizzare
l’acqua deionizzata e presciacquare gli oggetti in vetro usati per
l’esecuzione del test.
rR
5. Le piastre di Coplin vanno pulite a fondo tra un uso e l’altro per evitare la
contaminazione con cellule positive.
efe
6. Durante la procedura di colorazione, non consentire l’essiccamento del
reagente per colorazione sul vetrino.
eU
nc
re
SELEZIONE DEI CAMPIONI
I campioni clinici da analizzare possono essere freschi o congelati di
recente. Quasi tutti i tipi di campione prelevati dal tratto respiratorio inferiore sono adatti per l’analisi diretta e la coltura di Legionella. Inoltre, i fluidi
ed i tessuti extrapolmonari possono anch’essi essere campioni adatti.10
se
La sensibilità del test diretto e della coltura può essere massimizzata analizzando le porzioni di un campione che appaiono maggiormente significative. Nei fluidi respiratori, selezionare un campione di aspetto latteo o
sanguigno. Nei tessuti polmonari, selezionare aree di consolidamento
dense rossastre o grigie.10
On
ly
Quando possibile, gli organismi Legionella vanno isolati per coltura. Un isolato da coltura può essere necessario per studi epidemiologici e la coltura
può aumentare la sensibilità di rilevazione di tutte le specie di Legionella. I
tassi di recupero più elevati vengono ottenuti con l’uso di agar a base di
estratto di lievito con carbone tamponato addizionato dello 0,1% di alfachetoglutarato (BCYEa), in presenza o meno di agenti selettivi (per ulteriori
informazioni sulle tecniche di coltura per L. pneumophila consultare le pubblicazioni di cui ai riferimenti 10 o 11 o il materiale tecnico disponibile
presso la Bio-Rad Laboratories).
Le colonie di Legionella hanno un caratteristico aspetto simile a vetro tagliato quando osservate mediante un microscopio per dissezione sotto una
luce con angolo di incidenza ridotto. Spesso è possibile notare una
lucentezza opalescente. Le giovani colonie hanno un diametro di 1-2 mm,
sono rotonde con margini non spezzati, e sono piatte o convesse.11
46
PROCEDIMENTO DEL TEST
Occorrente fornito
Descrizione del prodotto, pagina 45.
eU
nc
re
efe
rR
Fo
Occorrente non fornito per l’analisi dei campioni clinici
• Vetrini coprioggetto, 24 x 60 mm, n. 1
• Panno privo di lanugine
• Pipette Pasteur
• Pipetta sierologica, 1 ml
• Bastoncini applicatori sterili in legno
• Soluzione fisiologica normale con formalina al 10% (vedere nota sottostante)
• Acqua deionizzata
• Piastre di colorazione di tipo Coplin, circa 7x8x10 cm
• Camera umidificata (ad esempio una piastra di Petri di grandi dimensioni coperta contenente una salvietta di carta assorbente umidificata
sul fondo)
• Incubatore a 37°C
• Bruciatore Bunsen
• Cappa per la sicurezza biologica (consigliata)
• Olio per immersione per microscopia a fluorescenza
• Microscopio a fluorescenza con sistema di filtraggio per la lettura
dell’isotiocianato di fluoresceina (FITC), con una lunghezza d’onda
massima di eccitazione di 490 nm ed una lunghezza d’onda media di
emissione pari a 520 nm. Variazioni di wattaggio, intensità e allineamento del bulbo e differenze nel tipo di illuminatore e di filtri possono
influire sul rendimento del test.
se
Ulteriori materiali necessari per il test degli organismi isolati dalle
colture
• Ansa batterica
• Provette in vetro
• Rastrelliera portaprovette
• Nefelometro McFarland N. 1 con standard di densità (vedere nota
sottostante)
• Soluzione fisiologica normale con formalina all’1% (vedere nota sottostante)
ly
On
Note
• Nefelometro McFarland N. 1 con standard di densità = 0,1 ml di cloruro di bario all’1% aggiunto a
9,9 ml di acido solforico all’1%. Conservare a 2-8°C al riparo dalla luce. Agitare prima dell’uso.
• Formalina al 10% = formaldeide al 3,7% (per i campioni diretti)
• Formalina all’1% = formaldeide allo 0,37% (per la conferma delle colture)
• Soluzione fisiologica normale = acqua deionizzata con lo 0,85% di NaCl
47
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PRIMA DELLA COLORAZIONE
Preparazione dello striscio per l’analisi diretta dei campioni dei
pazienti (si raccomanda l’uso di una cappa per la sicurezza biologica)
1. Pulire ed etichettare un vetrino a due pozzetti MONOFLUO™ per
microscopio a fluorescenza. Campioni provenienti da pazienti diversi
non vanno posti sul medesimo vetrino. Ciascun vetrino va trattato separatamente durante la fissazione ed il lavaggio per far sì che gli organismi
presenti in un campione non vengano trasferiti ad un altro. Uno striscio
di controllo positivo va preparato su un vetrino separato ed analizzato a
parte.
rR
Fo
2. Preparare due strisci per campione di paziente secondo le modalità
descritte più avanti (molti campioni contengono un numero molto limitato di cellule di Legionella ed è possibile che tali cellule siano distribuite
in modo non uniforme nel campione. Due strisci possono pertanto
aumentare la sensibilità dell’analisi diretta).
se
eU
nc
re
efe
a. Tessuto (fresco o congelato di recente)
Selezionare un’area di consolidamento densa grigia o rossastra. Per
la preparazione degli strisci, utilizzare una o entrambe le seguenti tecniche.
• Tritare il tessuto con acqua sterile deionizzata per creare un omogeneizzato di tessuto al 10% circa. Mediante un bastoncino applicatore sterile in legno, preparare degli strisci sottili coprendo i
pozzetti del vetrino.
• Utilizzando una pinza ed un bisturi sterili, tagliare una parte fresca
di tessuto (se eccessivamente umida per dare uno striscio sottile,
tamponarla con della garza sterile). Con le pinze, premere e strisciare il tessuto contro il vetrino per riempire i pozzetti. Se si desidera preparare una coltura, questa operazione va condotta prima
della preparazione degli strisci.
b. Essudati polmonari (escreato fresco o congelato di recente, aspirati
transtracheali, lavaggi bronchiali, ecc.)
Selezionare una porzione viscida del campione con aspetto latteo o
sanguigno. Con un bastoncino applicatore sterile in legno, preparare
due strisci sottili.
c. Fluido pleurico e fluido cerebrospinale
Centrifugare il campione in un contenitore di sicurezza a circa 4.000 x
G per 30 minuti. Eliminare il supernatante in eccesso di 0,5 ml; risospendere. Con una pipetta Pasteur sterile, preparare due strisci sottili.
ly
On
3. Lasciare asciugare gli strisci all’aria*, quindi effettuare la fissazione al
calore dei campioni passando i vetrini rapidamente attraverso una
fiamma viva.
48
4. Collocare il vetrino in una camera umidificata e coprire ciascuno striscio
con formalina al 10% in soluzione fisiologica. Fissare per 10 minuti a
temperatura ambiente.
5. Drenare la formalina e immergere brevemente il vetrino in acqua deionizzata.
6. Lasciare in ammollo il vetrino in acqua deionizzata fresca per due minuti,
per rimuovere la formalina rimanente.
7. Lasciare asciugare all’aria*, quindi passare alla procedura di colorazione
per fluorescenza.
*Nota: durante la preparazione degli strisci, è possibile servirsi di un riscaldatore di vetrini a 35-45°C per
tutti i passaggi che prevedono l’asciugatura all’aria.
Fo
Preparazione dello striscio per la conferma delle colture (si
raccomanda l’uso di una cappa per la sicurezza biologica)
rR
1. Pulire ed etichettare un vetrino MONOFLUO™ per microscopio a fluorescenza.
re
efe
2. Rimuovere una colonia distinta sospetta di L. pneumophila dalla piastra
di coltura con l’ansa batterica. Sospendere i batteri in una provetta contenente una piccolissima quantità di soluzione fisiologica con formalina
all’1% alla torbidezza di uno standard McFarland N.1.
eU
nc
3. Utilizzando una pipetta Pasteur, applicare 2-3 gocce di sospensione ad
un pozzetto del vetrino, quindi rimuoverle con la medesima pipetta Pasteur. Un sottile strato di organismi rimarrà sul pozzetto. Ripetere i passaggi da 1 a 3 per preparare uno striscio separato di ciascuna colonia
sospetta, usando vetrini separati.
se
4. Far asciugare gli strisci all’aria*, quindi fissarli al calore facendo passare
rapidamente i vetrini attraverso una fiamma viva. Passare quindi alla procedura di colorazione per fluorescenza.
On
Preparazione dello striscio di controllo positivo
ly
1. Pulire ed etichettare un vetrino MONOFLUO™ per microscopio a fluorescenza. Nota: lo striscio di controllo positivo va analizzato separatamente dagli strisci ottenuti dai campioni del paziente.
2. Agitare il flacone contenente la sospensione antigenica di controllo positivo per risospendere le cellule. Dosare 1-2 gocce di sospensione in un
pozzetto del vetrino, quindi, mediante una pipetta Pasteur nuova, rimuovere il liquido dal pozzetto ed eliminarlo.
3. Lasciare asciugare all’aria*, quindi fissare al calore il campione facendo
passare rapidamente il vetrino attraverso una fiamma viva. Passare
quindi alla procedura di colorazione per fluorescenza.
*Nota: durante la preparazione degli strisci, è possibile servirsi di un riscaldatore di vetrini a 35-45°C per
tutti i passaggi che prevedono l’asciugatura all’aria.
49
PROCEDURA DI COLORAZIONE
Procedura di colorazione a fluorescenza
1. Dosare una quantità di reagente per colorazione anti-Legionella pneumophila MONOFLUO™ sufficiente per coprire il campione (1-2 gocce, a
seconda del tipo di campione, facendo attenzione a mantenerle
all’interno dei margini del pozzetto).
2. Collocare il vetrino in una camera umidificata ed incubare per 30 minuti a
35-37°C. Nota: il vetrino di controllo positivo e il vetrino o i vetrini dei
campioni vanno incubati in camere umidificate separate.
rR
Fo
3. Rimuovere il reagente per colorazione in eccesso mediante aspirazione
o metodo analogo. Immergere brevemente il vetrino in acqua deionizzata per risciacquarlo, quindi lasciarlo in ammollo due volte per 2-10
minuti in acqua deionizzata fresca. Nota: lavarsi le mani o cambiare i
guanti fra la preparazione del vetrino di controllo positivo e i vetrini contenenti campioni da pazienti.
4. Lasciare asciugare all’aria i vetrini.
efe
5. Dosare 1-2 gocce di mezzo di montaggio sul vetrino; applicarvi un
vetrino coprioggetto.
eU
nc
re
ESAME DEI VETRINI COLORATI
• Analisi diretta: sottoporre ciascun vetrino a scansione mediante un obiettivo da 20-25x. Se si osservano delle tracce fluorescenti, passare ad
un obiettivo da 63-100x per confermare la morfologia cellulare. Vedere la
sezione Limitazioni della procedura, pagina 52.
se
• Test di conferma delle colture. Sottoporre ciascun vetrino a scansione
mediante un obiettivo da 63-100x.
ly
On
• I vetrini vanno letti entro alcune ore dalla colorazione. Se lo si desidera, i
vetrini possono essere conservati durante la notte in ambiente scuro a
2-8°C, o per periodi più lunghi al riparo dalla luce a -20°C. I vetrini conservati al freddo devono essere portati a temperatura ambiente prima
della lettura per evitare l’oscuramento del campione da parte della condensa.
CONTROLLO DI QUALITÀ
Usare la sospensione antigenica di controllo positivo per verificare la reattività del reagente per colorazione ogni volta che si esegue il test. La procedura di analisi descrive i metodi di impiego del controllo positivo.
Usare una coltura di organismi notoriamente gram negativi come E. coli
come controllo negativo. Preparare una sospensione secondo le modalità
descritte per la conferma delle colture, quindi attenersi alle istruzioni relative alla procedura del test.
50
VALUTAZIONE DEI RISULTATI DELL’ANALISI
Gli organismi L. pneumophila colorati appaiono come bacilli o coccobacilli
intra o extracellulari con fluorescenza di color verde mela. I campioni sono
negativi quando gli organismi appaiono di color rosso scuro o dorato
spento.
Gli organismi L. pneumophila sono polimorfi: possono variare da forme
coccobacillari molto corte a forme bacillari lunghe e filamentose. Alcune
terapie antibiotiche possono determinare la comparsa di organismi morfologicamente atipici.
Le caratteristiche di colorazione e la morfologia degli organismi positivi
somigliano a quelle del controllo positivo per L. pneumophila.
rR
Fo
In un’analisi di conferma delle colture, l’eccessiva presenza di cellule in uno
striscio può ridurre notevolmente l’intensità della colorazione. Se necessario, esaminare i bordi esterni del pozzetto o le parti dello striscio contenenti
il minor numero di cellule.
nc
re
efe
Le condizioni delle colture, specialmente l’età della coltura, possono
causare variazioni da cellula a cellula per quanto riguarda l’intensità della
fluorescenza. Alcune cellule possono non venir colorate uniformemente
sull’intera superficie. In tutti i casi, comunque, le cellule con colorazione
positiva emetteranno fluorescenza secundo un pattern che rivela una morfologia cellulare ben definita. Le colture vengono confermate per
L. pneumophila in base all’aspetto distinto delle colonie, alla morfologia
degli organismi fluorescenti ed ai risultati di una colorazione di Gram.
eU
Il metodo consigliato per la lettura dei risultati è mostrato nella seguente
tabella.
Risultati dell’analisi
diretta
Lettura consigliata
On
FA positivo
ly
> di 5 batteri fluorescenti
per vetrino a due
pozzetti
1-5 batteri fluorescenti
per vetrino a due
pozzetti
Nessun batterio
fluorescente rilevabile
se
Tabella 2: criteri di lettura consigliati dei risultati
Riportare il numero di cellule colorate; richiedere un secondo
campione, se clinicamente opportuno. Confermare in coltura.
FA negativo
In molti campioni, come quelli di escreato, raramente gli organismi sono
numerosi. Quindi, se si sono prese le opportune precauzioni atte ad evitare
la contaminazione da cellule di Legionella, la rilevazione anche di un singolo coccobacillo a morfologia tipica con fluorescenza brillante della parete
cellulare è da considerarsi significativa.
51
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione da Legionella
pneumophila o altre specie di Legionella nel paziente. La raccolta e la
preparazione del campione sono estremamente importanti per la procedura di analisi. La raccolta del campione in un momento non adatto
durante il decorso della malattia, l’utilizzazione di un metodo non idoneo
per la sua raccolta, la manipolazione inadeguata del campione o l’uso
improprio dei reagenti forniti possono impedire la rilevazione di Legionella
pneumophila. La diagnosi va effettuata alla luce di un più ampio quadro
clinico.
Con un numero limitato di organismi (Staphylococcus aureus ed alcune
specie di Lactobacillus), la fluorescenza può occasionalmente essere
osservata a causa di un legame non immunologico.
Fo
rR
Usare esclusivamente campioni freschi o congelati di recente. I campioni
sottoposti a trattamento istopatologico ed i materiali conservati con formalina non sono campioni adatti a questa analisi.
efe
Alcuni campioni di escreato purulento possono mostrare un’aumentata colorazione di fondo ed un legame cellulare non immunologico. Qualsiasi
campione che mostri tali caratteristiche va confermato mediante coltura.
se
eU
nc
re
CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO
Il reagente per colorazione anti-Legionella pneumophila MONOFLUO™ è
specifico per L. pneumophila e rileva tutti i sierotipi noti dell’organismo. In
base ai sottostanti dati relativi alla colorazione a fluorescenza, la sensibilità
e la specificità del reagente per colorazione anti-Legionella pneumophila
MONOFLUO™ sono risultate del 100% sia su campioni diretti che su colture.
ly
On
Conferma delle colture
Uno studio alla cieca è stato condotto per valutare il rendimento dell’analisi
ad immunofluorescenza per la rilevazione e l’identificazione di Legionella
pneumophila MONOFLUO™ su 50 colture note. Il reagente ha identificato
correttamente tutte le 19 colture di Legionella pneumophila ed è risultato
negativo su tutti i 31 organismi rimanenti.
Una fluorescenza molto bassa (fluorescenza 1+) dovuta a legami non
immunologici è stata osservata in una coltura di Staphylococcus aureus ed
una coltura di Lactobacillus brevis. Queste colture sono state ritenute negative a causa della limitata fluorescenza. Questi organismi possono anche
essere distinti in base alla morfologia degli organismi fluorescenti, la morfologia delle colonie sulle piastre di coltura e il risultato di una colorazione di
Gram.
Campioni diretti
Uno studio alla cieca è stato condotto per valutare il rendimento dell’analisi
ad immunofluorescenza per la rilevazione e l’identificazione di Legionella
52
pneumophila MONOFLUO™ su 54 campioni umani prelevati dal tratto respiratorio inferiore e congelati di recente, 24 dei quali etano stati precedentemente identificati come positivi e 30 dei quali negativi per L. pneumophila.
Durante questo studio, l’analisi MONOFLUO™ ha identificato 25 di questi
campioni come positivi e 29 come negativi. Un campione di aspirato transtracheale, risultato negativo mediante DFA e colture durante l’analisi originale nel 1980, è risultato chiaramente positivo con l’analisi MONOFLUO™
e con due reagenti policlonali. Sebbene ripetuti tentativi di coltura siano
stati infruttuosi, una colorazione di Gimenez eseguita nel 1980 aveva
messo in evidenza forme atipiche. Questo campione era stato pertanto
considerato un vero campione positivo.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
ly
On
53
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Dispositivo de Teste de Anticorpos Imunofluorescentes para
Detecção e Identificação de Legionella pneumophila em
Amostras Clínicas e em Cultura
rR
Fo
DENOMINAÇÃO E DOMÍNIO DE APLICAÇÃO
O Dispositivo de Teste de Anticorpos Imunofluorescentes de Legionella
MONOFLUO™ é destinado à detecção e identificação de Legionella pneumophila em amostras clínicas e em cultura.
eU
nc
re
efe
RESUMO E EXPLICAÇÃO
Os organismos do gene Legionella são bactérias gram-negativas existentes em todo o ambiente, incluindo locais como lagos de água fresca,
água da torneira, sistemas de ar condicionado e piscinas de água agitada
para fins recreativos.1 Várias espécies do gene estão associadas a doenças
humanas,2 no entanto, mais de 80% dos organismos isolados de doentes
foram identificados como L. pneumophila.3,4
se
L. pneumophila é o agente etiológico de duas doenças distintas: pneumonia Legionella (Doença do legionário), uma infecção respiratória aguda,5 e
febre de Pontiac, uma doença respiratória não pneumónica, auto-limitada.6
ly
On
As infecções com L. pneumophila ocorrem sob a forma de acidentes isolados esporádicos, agregados de casos endémicos e epidemias. Foram
reportados surtos em quase todas as zonas da América do Norte e em
muitos outros continentes.7 Foram descritas epidemias em hospitais,
hotéis, edifícios de escritórios e fábricas industriais. A transmissão da
doença parece estar relacionada com a exposição a aerossóis, tais como
os que se formam em aparelhos de ar condicionado, nebulizadores de
jacto e humidificadores de ambiente.1
O risco de afecção pela doença do legionário aumenta com o fumo de
tabaco, consumo de álcool e a presença de uma doença preexistente da
qual resulte uma redução da imunocompetência.2,7 As taxas de mortalidade nas pessoas afectadas pela doença do legionário situam-se entre
15%, em indivíduos geralmente isentos de qualquer doença subjacente, e
80% nos doentes imunodeprimidos, não tratados.2
A verdadeira incidência da infecção por L. pneumophila pode estar subestimada devido à grande variedade de sintomas clínicos, à semelhança
54
dos sintomas com os de outras pneumonias e à inexistência de testes de
diagnóstico disponíveis em larga escala. Estima-se que a L. pneumophila
seja responsável por aproximadamente 10% dos casos de pneumonia
atípica.2
O diagnóstico de laboratório clínico para determinação do tratamento
apropriado faz-se preferencialmente por análise directa das amostras clínicas e por cultura e isolamento da Legionella em amostras clínicas. O diagnóstico retrospectivo da doença é feito por demonstração de um aumento
quádruplo no título de anticorpos, em amostras de soro emparelhadas.
O Dispositivo de Teste de Anticorpos Imunofluorescentes de Legionella
MONOFLUO™ é utilizado para detectar e identificar a L. pneumophila
directamente nas amostras de doentes ou em isolados em cultura, para
confirmação do diagnóstico da doença do legionário.8
Fo
efe
rR
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O Reagente de Coloração MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila
contém um único anticorpo monoclonal que é marcado com isotiocianato
de fluoresceína. Este anticorpo reage com uma proteína presente na membrana exterior de todos os serogrupos conhecidos de L. pneumophila.9
se
eU
nc
re
Os esfregaços são preparados em lâminas de microscópio, tal como se
descreve no procedimento de teste, quer directamente a partir de amostras de doentes, quer a partir de organismos isolados em cultura. Os esfregaços são corados com o Reagente de Coloração MONOFLUO™ AntiLegionella pneumophila. O anticorpo monoclonal marcado neste reagente
liga-se imunologicamente a qualquer L. pneumophila existente no esfregaço. Uma etapa seguinte de enxaguamento permite eliminar o anticorpo
não ligado da amostra. Quando as amostras são observadas ao microscópio de fluorescência, L. pneumophila aparece sob a forma de bacilos ou
cocobacilos intensamente fluorescentes em verde maçã. Os outros organismos serão visíveis a vermelho escuro ou a dourado baço, devido à contra-coloração.
On
ly
O Meio de Fixação MONOFLUO™ incluído no dispositivo contém um antiextintor. Este elemento permite aumentar o período de tempo em que as
lâminas podem ser observadas antes de a fluorescência desaparecer.
55
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
Componente
Conteúdo
Preparação
R1 • Reagente de Coloração
Anti-Legionella pneumophila
1 conta-gotas (1,3 ml)
• Anticorpo Monoclonal
Marcado com FITC
• Contra-corante
• Azida de Sódio*
• Tampão estabilizado
por proteína
Utilizar como fornecido.
C1 • Suspensão de Antigénio de • L.pneumophila Morta
Controlo Positivo
• Tampão de Solução
1 conta-gotas (2,0 ml)
• Salina
• Azida de Sódio**
Agitar antes de usar
R2 • Meio de Fixação
1 conta-gotas (4,0 ml)
Utilizar como fornecido
Fo
• Tampão de glicerol
• Anti-extintor
R3 • Lâminas de Microscópio de • Lâminas de
Fluorescência
microscópio de
24 (2 poços cada)
fluorescência
rR
Limpar com pano sem
fios antes de usar.
efe
*0,01 % Azida de Sódio; **0,1 % Azida de Sódio
nc
re
Guardar os reagentes a 2-8°C. As lâminas deverão ser conservadas a
2-28°C. Quando conservados às temperaturas especificadas, os reagentes
abertos ou não abertos mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado.
se
eU
PRECAUÇÕES PARA OS UTILIZADORES
Destinado apenas a diagnóstico in vitro.
Apenas para uso profissional.
1. Não utilizar o dispositivo após o termo do prazo de validade.
ly
On
2. Considerar todas as amostras clínicas como material potencialmente
infeccioso, utilizando as técnicas laboratoriais de assepsia apropriadas
para processar as amostras e as culturas. Os procedimentos que possam formar aerossóis deverão ser conduzidos em cabina de segurança
biológica. Todos os materiais devem ser esterilizados depois de utilizados ou antes da sua eliminação.
3. O Reagente de Coloração e a Suspensão de Antigénio de Controlo Positivo contêm azida de sódio. A azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando azidas metálicas que são
altamente explosivas. A fim de evitar a formação de azidas, irrigar a
canalização com água em grande volume, caso os reagentes sejam
eliminados pela canalização de despejo.
4. Alguns laboratórios podem ter fontes de abastecimento de água contendo L. pneumophila. Se se observarem organismos fluorescentes ao
realizar um teste de controlo negativo poderá ser necessário esterilizar
56
toda a água desionizada e enxaguar previamente todos os recipientes
de vidro utilizados na realização deste teste.
5. Limpar cuidadosamente os discos de Coplin antes de qualquer utilização, a fim de evitar a transmissão de células positivas.
6. Não permitir que o Reagente de Coloração seque sobre a lâmina
durante o procedimento de coloração.
SELECÇÃO DE AMOSTRAS
As amostras clínicas a utilizar no teste podem ser frescas ou recém-congeladas. Quase todos os tipos de amostras do tracto respiratório inferior são
apropriadas para a realização do teste de Legionella directo e em cultura.
Além disso, líquidos e tecidos extrapulmonares podem ser igualmente considerados como amostras pertinentes.10
Fo
efe
rR
A sensibilidade dos testes directos e em cultura pode ser maximizada
testando partes de uma amostra que pareçam mais significativas. Nos fluidos respiratórios, seleccionar uma amostra de espécie que seja leitosa ou
contenha sangue. No tecido pulmonar, seleccionar áreas de densa consolidação cinzenta ou avermelhada.10
eU
nc
re
Sempre que possível, a Legionella deve ser isolada por cultura. Um isolado
de cultura poderá ser necessário para estudos epidemiológicos e a cultura
pode aumentar a sensibilidade na detecção de espécies de Legionella. As
maiores taxas de recuperação são atingidas com utilização de tampão de
agar de extracto de levedura de carvão, suplementado com 0,1% alfa-cetoglutarato (BCYEa), com ou sem ingredientes selectivos. (Para mais informações
sobre as técnicas de cultura para L. pneumophila consultar a referência 10 ou
11, ou o material técnico disponível junto de Bio-Rad Laboratories.)
se
As colónias de Legionella exibem uma aparência característica de vidro de
corte quando observadas com um microscópio dissecante, sob luz com
reduzido ângulo de incidência. Observa-se frequentemente uma luminosidade opalescente. As colónias jovens têm 1-2 mm de diâmetro, são
redondas com bordos inteiros e planas a convexas.11
ly
On
PROCEDIMENTO DO TESTE MATERIAIS FORNECIDOS
Ver a secção Reagentes, página 56.
Materiais Necessários Mas Não Fornecidos para teste das Amostras
Clínicas:
• Lamelas de cobertura, 24 x 60 mm, #1
• Pano sem fios
• Pipetas Pasteur
• Pipeta serológica, 1 ml
• Varetas aplicadoras de madeira esterilizadas
• Formalina 10% em solução salina normal (ver nota a seguir)
• Água desionizada
• Discos de coloração tipo Coplin, aprox. 7x8x10 cm
57
• Câmara de humidificação (tal como uma grande placa de Petri
coberta, com uma folha de papel molhado no fundo)
• Incubadora a 37°C
• Bico de Bunsen
• Cabina de segurança biológica (recomendada)
• Óleo de imersão adequado para microscopia de fluorescência
• Microscópio de fluorescência com um sistema de filtro para isotiocianato de fluoresceína (FITC), com um comprimento de onda de excitação máximo de 520 nm. Variações na potência em watts, na
intensidade e no alinhamento da lâmpada, bem como diferenças no
tipo de iluminação e nos filtros, podem afectar o desempenho do teste.
rR
Fo
Outros Materiais Necessários para o teste de Organismos Isolados de
Cultura:
• Ansa bacteriana
• Tubos de ensaio em vidro
• Suporte para tubos de ensaio
• Padrão de densidade de nefelómetro McFarland nº 1 (ver nota a seguir)
• Formalina 1% em solução salina normal (ver nota a seguir)
nc
re
efe
Nota:
• Padrão de densidade de nefelómetro McFarland nº 1 = 0,1 ml de cloreto de bário 1% adicionado
a 9,9 ml de ácido sulfúrico 1%. Guardar à temperatura de 2-8°C, ao abrigo da luz. Agitar antes de
usar.
• Formalina 10% = Formaldeído 3,7% (para amostras directas).
• Formalina 1% = Formaldeído 0,37% (para confirmação em cultura).
• Solução salina normal = Água desionizada e NaCl 0,85%.
eU
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS ANTES DA COLORAÇÃO
Preparação do Esfregaço para Teste Directo em Amostras de Doentes
(cabina de segurança biológica recomendada)
se
1. Limpar e identificar uma Lâmina para Microscópio de Fluorescência
MONOFLUO™ de dois Poços. Não devem ser combinadas amostras de
mais do que um doente numa mesma lâmina. Cada lâmina deve ser
processada separadamente durante os processos de fixação e lavagem, a fim de assegurar que os organismos presentes numa amostra
não são transferidos para outra amostra. Um esfregaço de Controlo
Positivo deverá ser igualmente preparado numa lâmina separada e processado separadamente.
ly
On
2. Preparar dois esfregaços por cada amostra de doente, como se
descreve a seguir. (Muitas amostras contêm muito poucas células de
Legionella e estas células podem estar irregularmente dispersas por
toda a amostra. Por isso, dois esfregaços permitirão aumentar a sensibilidade do teste directo.)
a. Tecido (fresco ou recém-congelado)
Seleccionar uma área de densa consolidação cinzenta ou avermelhada. Utilizar uma ou ambas as seguintes técnicas para preparar os
dois esfregaços:
58
efe
rR
Fo
• Pulverizar o tecido com água desionizada esterilizada para criar
um homogenato de tecido de aproximadamente 10%. Com a
ajuda de uma vareta aplicadora de madeira esterilizada, criar
esfregaços finos para cobrir os poços da lâmina.
• Utilizando pinça e escalpelo esterilizados, cortar um fragmento de
tecido fresco. (Se estiver demasiado molhado para se obter um
esfregaço fino, secar sobre gaze esterilizada.) Com a pinça, pressionar e espremer o tecido contra a lâmina para encher os poços.
Se se pretender efectuar uma cultura, esta operação deverá ser
feita antes de obter os esfregaços.
b. Exsudados Pulmonares (saliva fresca ou recém-congelada, aspirados transtraqueais, lavagens brônquicas, etc.)
Seleccionar uma porção viscosa de uma amostra de aparência
leitosa ou com sangue. Com uma vareta aplicadora de madeira
esterilizada, preparar dois esfregaços finos.
c. Líquido Pleural ou Cefalorraquidiano
Centrifugar a amostra em recipiente seguro a cerca de 4,000xg durante
30 minutos. Rejeitar o restante de 0,5 ml de sobrenadante; ressuspender.
Com uma pipeta Pasteur esterilizada, fazer dois esfregaços finos.
3. Secar os esfregaços ao ar,* em seguida, tratar as amostras termicamente, fazendo passar a lâmina por momentos pela chama.
re
nc
4. Colocar a lâmina numa câmara de homogeneização e cobrir cada esfregaço com formalina 10% em solução salina. Deixar actuar durante 10
minutos à temperatura ambiente.
eU
5. Escorrer a formalina e mergulhar por momentos a lâmina em água
desionizada.
se
6. Imergir a lâmina em água desionizada fresca durante dois minutos para
eliminar a restante formalina.
On
7. Secar ao ar* e, em seguida, continuar com o Procedimento de Coloração por Fluorescência.
ly
*Nota: Durante a preparação dos esfregaços pode-se utilizar um secador de lâminas a 35-45°C para
todas as etapas que requeiram secagem ao ar.
Preparação dos Esfregaços para Confirmação de Cultura (cabina de
segurança biológica recomendada)
1. Limpar e identificar uma Lâmina de Microscópio de Fluorescência
MONOFLUO™.
2. Retirar uma outra colónia de L. pneumophila suspeita, da placa de cultura, por meio de uma ansa bacteriológica. Suspender as bactérias num
tubo de ensaio contendo uma quantidade muito pequena de formalina a
1% em solução salina, à turvação de um padrão McFarland No.1.
3. Utilizando uma pipeta Pasteur, aplicar 2-3 gotas da suspensão num dos
poços da lâmina e, em seguida, retirar com a mesma pipeta Pasteur.
59
Uma fina película de organismos manter-se-á no poço. Repetir os passos 1-3 para fazer um esfregaço separado para cada colónia suspeita,
utilizando lâminas individuais.
4. Secar os esfregaços ao ar* e, em seguida, tratar termicamente fazendo
passar por momentos a lâmina pela chama. Continuar com o Procedimento de Coloração por Fluorescência.
Preparação do Esfregaço para Controlo Positivo
1. Limpar e identificar uma Lâmina de Microscópio de Fluorescência
MONOFLUO™. Nota: O esfregaço de Controlo Positivo deve ser processado separadamente em relação aos esfregaços das amostras de
doentes.
rR
Fo
2. Agitar o frasco contendo a Suspensão de Antigénio de Controlo Positivo
para ressuspender as células. Adicionar 1-2 gotas da suspensão num
poço da lâmina e, depois, utilizando uma nova pipeta Pasteur, retirar o
líquido do poço e rejeitar.
efe
3. Secar ao ar* e depois tratar termicamente fazendo passar a lâmina por
momentos pela chama. Continuar com o Procedimento de Coloração
por Fluorescência.
re
*Nota: Durante a preparação dos esfregaços pode-se utilizar um secador de lâminas a 35-45°C em todas
as etapas que requeiram secagem ao ar.
nc
PROCEDIMENTO DE COLORAÇÃO
Procedimento de Coloração por Fluorescência
eU
se
1. Aplicar uma quantidade suficiente de Reagente de Coloração MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila para cobrir a amostra (1-2 gotas
consoante o tipo de amostra, tendo o cuidado de não exceder os limites
do poço).
ly
On
2. Colocar a lâmina numa câmara de humidificação e incubar durante 30
minutos a 35-37°C. Nota: A lâmina de Controlo Positivo e as lâminas de
amostras devem ser incubadas em câmaras de humidificação separadas.
3. Retirar o Reagente de Coloração excedente por um método como a aspiração. Imergir por momentos a lâmina em água desionizada para enxaguar, seguida de duas imersões, de 2-10 minutos cada, em água
desionizada fresca. Nota: Lavar as mãos ou mudar de luvas entre o
manuseamento da lâmina de Controlo Positivo e as lâminas de amostras.
4. Secar as lâminas ao ar.
5. Adicionar 1-2 gotas do Meio de Fixação à lâmina; aplicar uma lamela de
cobertura.
60
ANÁLISE DAS LÂMINAS CORADAS
• Teste directo: Observar cada esfregaço por meio de uma objectiva 2025x. Se forem observadas manchas fluorescentes, mudar para uma
objectiva 63-100x para confirmar a morfologia celular. Ver a secção Limitações do Procedimento, na página 62.
• Teste de confirmação de cultura: Observar cada esfregaço com uma
objectiva 63-100x.
• Proceder à leitura das lâminas após várias horas de coloração. Se
desejado, as lâminas podem ser guardadas de um dia para o outro a 28°C, ao abrigo da luz, ou por períodos mais longos, a -20°C, ao abrigo
da luz. As lâminas guardadas no frio devem aguardar até atingir a temperatura ambiente antes de se proceder à sua leitura, para evitar que a
condensação obscureça a amostra.
Fo
efe
rR
CONTROLO DE QUALIDADE
Utilizar a Suspensão de Antigénio de Controlo Positivo para verificar a
reactividade do Reagente de Coloração, sempre que o teste seja realizado.
O procedimento de teste descreve o método de processamento do Controlo Positivo.
eU
nc
re
Como controlo negativo, usar uma cultura de um organismo reconhecidamente gram-negativo, tal como E. coli. Preparar uma suspensão, como se
descreve para a confirmação de cultura, e continuar com o procedimento
de teste.
se
AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE
A L. pneumophila em coloração surge sob a forma de bastonetes ou cocobacilos intra ou extracelulares fluorescentes a verde maçã. As amostras
serão consideradas negativas quando forem visíveis organismos de cor
vermelho escuro ou dourado baço.
On
ly
L. pneumophila são organismos pleomórficos que podem variar entre formas cocobacilares muito curtas e longos bastonetes filamentosos. Um
tratamento antibiótico pode resultar em organismos com morfologia não
característica.
As características de coloração e a morfologia dos organismos positivos
são comparáveis ao Controlo Positivo L. pneumophila.
Num teste de confirmação de cultura, a existência de células em excesso
no esfregaço pode reduzir significativamente a intensidade da coloração.
Se necessário, examinar os bordos exteriores do poço ou zonas do esfregaço que contenham menos células.
As condições de cultura, em especial o tempo de cultura, podem resultar
numa variação da intensidade da fluorescência de uma célula para outra.
Algumas células podem não corar uniformemente em toda a sua super61
fície. Em todos os casos, porém, as células de coloração positiva apresentam um padrão de fluorescência que revela uma morfologia celular
definida. As culturas são confirmadas para L. pneumophila com base na
aparência distintiva das colónias, na morfologia dos organismos fluorescentes e nos resultados de uma coloração Gram.
O método recomendado para apresentar os resultados está indicado no
quadro 2 a seguir.
Quadro 2: Critérios de Apresentação Recomendados
Resultados do Teste
Directo
Sugestão de Apresentação
> 5 bactérias fluorescentes/ FA positivo
lâmina de 2 poços
Fo
rR
1-5 bactérias fluorescentes / Indicar o número de células coradas;
lâmina de 2 poços
pedir uma segunda amostra se clinicamente
justificado. Confirmar em cultura.
efe
Sem bactérias fluorescentes FA negativo
detectáveis
eU
nc
re
Em muitas amostras, como a saliva, os organismos raramente são numerosos. Por isso, se se tiver tido o cuidado de evitar o transvasamento de
células Legionella, a observação até de um único cocobacilo de características morfológicas típicas, com fluorescência intensa na parede da célula,
é considerado significativo.
se
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Um resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção com Legionella
pneumophila ou outras espécies de Legionella no doente. A recolha e
preparação das amostras constitui uma etapa da maior importância no procedimento de teste. Recolher uma amostra num momento incorrecto no decurso
da doença, utilizando um método não apropriado ou um manuseamento incorrecto da amostra, ou ainda a utilização incorrecta dos reagentes fornecidos,
pode resultar na incapacidade em detectar Legionella pneumophila. O diagnóstico deverá ser traçado em conjunto com os sintomas clínicos.
ly
On
Com um número limitado de organismos (Staphylococcus aureus e algumas espécies de Lactobacillus), pode observar-se ocasionalmente fluorescência devido a uma ligação não imune.
Utilizar apenas amostras frescas ou congeladas. As amostras histopatologicamente processadas e os materiais conservados em formalina não
são amostras apropriadas para este teste.
Certas amostras de saliva purulenta podem exibir maior coloração de
fundo e uma ligação não imune às células. Qualquer amostra que exiba
estas características deverá ser confirmada por cultura.
62
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
O Reagente de Coloração MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila é
específico da L. pneumophila e permite detectar todos os serogrupos conhecidos do organismo. Com base nos dados de coloração de fluorescência abaixo indicados, a sensibilidade e especificidade do Reagente de
Coloração MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila foi de 100% nas
amostras directas e em cultura.
Confirmação da Cultura
Realizou-se um estudo em anonimato para avaliar o desempenho do Teste
de Anticorpo Imunofluorescente MONOFLUO™ Legionella em 50 culturas
conhecidas. O reagente identificou correctamente todas as 19 culturas de
Legionella pneumophila e revelou ser negativo nos outros 31 organismos.
efe
rR
Fo
Observou-se uma fluorescência muito fraca (fluorescência 1+) devido a
ligação não imune em uma cultura de Staphylococcus aureus e uma cultura
de Lactobacillus brevis. Estas amostras foram classificadas como negativas
devido à coloração fraca. Estes organismos podem ainda ser distinguidos
pela morfologia dos organismos fluorescentes, a morfologia das colónias
nas placas de cultura e os resultados de uma coloração Gram.
se
eU
nc
re
Amostras Directas
Um estudo em anonimato foi conduzido para avaliar o desempenho do Teste
de Anticorpos Imunofluorescentes MONOFLUO™ Legionella em 54 amostras recém-congeladas de tracto respiratório inferior humano, 24 das quais
haviam sido anteriormente identificadas como positivas e 30 como negativas
para L. pneumophila. Durante este estudo, o Teste MONOFLUO™ identificou
25 destas amostras como positivas e 29 como negativas. Uma amostra, um
aspirado transtraqueal que era negativo por DFA e resultados de cultura,
durante o teste original de 1980, revelou ser claramente positivo com o Teste
MONOFLUO™ , bem como com dois reagentes policlonais. Embora as tentativas de repetição da cultura tenham resultado infrutíferas, uma coloração
Gimenez, realizada em 1980, havia revelado formas atípicas. Esta amostra
foi, por isso, considerada como verdadeira positiva.
ly
On
63
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Immunfluorescerende antistoftestsæt til konstatering og
identifikation af Legionella pneumophila i kliniske prøver og
kulturer.
rR
Fo
NAVN OG FORMÅL
MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit er beregnet
til konstatering og identifikation af Legionella pneumophila i kliniske prøver
og kulturer.
eU
nc
re
efe
OVERSIGT OG FORKLARING
Organismer af arten Legionella er Gram-negative bakterier, der findes overalt i omgivelserne, herunder steder som ferskvandssøer, vand fra
vandhanen, luftkonditioneringssystemer og spabade.1 Mange organismer
inden for arten er forbundet med humane sygdomme,2 men mere end 80 %
af de organismer, der er isoleret fra patienter, er blevet identificeret som
L. pneumophila.3,4
se
L. pneumophila er det etiologiske stof for to markante sygdomme:
Legionella pneumonia (Legionærsyge), der er en akut luftvejsinfektion,5 og
Pontiac-feber, der er en selvbegrænsende luftvejslidelse, som ikke sætter
sig på lungerne.6
ly
On
Infektioner med L. pneumophila forekommer som sporadiske og isolerede
tilfælde, endemiske grupperinger af tilfælde og epidemier. Der er rapporteret udbrud næsten overalt i Nordamerika og de fleste andre kontinenter.7
Der er rapporteret epidemier på hospitaler, hoteller, kontorbygninger og
fabrikker. Overførslen af sygdommen lader til at være forbundet med aerosoler, f.eks. dem der genereres af ventilationssystemer, tågekanoner og
luftbefugtere.1
Øget risiko for Legionærsyge er forbundet med cigaretrygning, alkoholforbrug og forekomsten af andre sygdomme, der svækker immunsystemet.2,7
Dødeligheden for patienter med Legionærsyge rækker fra 15 % hos personer, der generelt ikke lider af en underbyggende sygdom, til 80 % hos
ubehandlede patienter med et svækket immunsystem.2
Den konkrete forekomst af en L. pneumophila-infektion kan blive undervurderet på grund af de mange forskellige kliniske symptomer, hvoraf nogle
har ligheder med symptomer på andre typer lungeinfektioner, og mangel64
fuld udbredelse af diagnostiske test på markedet. Det er blevet estimeret,
at L. pneumophila står for ca. 10 % af tilfælde af atypisk lungebetændelse.2
En klinisk diagnosticering med henblik på fastlæggelse af den rette behandling udføres bedst ud fra en direkte undersøgelse af kliniske prøver, dyrkning af kulturer og isolation af Legionella fra de kliniske prøver. Retrospektiv
diagnose af sygdommen opnås ved påvisning af en firedobling af antistoftiteren i serumprøvepar.
MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit anvendes
til at konstatere og identificere L. pneumophila direkte i patientprøver eller
kulturisolater, som kan bekræfte en diagnose på Legionærsyge.8
rR
Fo
PRINCIPPER FOR PROCEDUREN
MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila-farvningsreagense indeholder
et enkelt monoklonalt antistof, der er mærket med fluorescein
isothiocyanat. Dette antistof reagerer med et protein, der findes i ydermembranen på alle kendte serumgrupper i L. pneumophila.9
eU
nc
re
efe
Udstrygningpræparater forberedes på mikroskopplader som beskrevet i
testproceduren, enten direkte fra patientprøver eller fra organismer, der er
isoleret i en kultur. Udstrygningspræparater farves med MONOFLUO™
Anti-Legionella pneumophila-farvningsreagensen. Det mærkede, monoklonale antistof i denne reagense bindes immunologisk til enhver
L. pneumophila-organisme i laget. En efterfølgende skylning fjerner ubundet farvningsreagens fra prøven. Når prøver betragtes med et fluorescensmikroskop, fremstår L. pneumophila som en let fluorescerende, æblegrøn
Bacilli eller Coccobacilli. Andre organismer er mørkerøde eller har en mat
guldfarve på grund af baggrundsfarvningen.
se
MONOFLUO™-monteringsmedier i sættet indeholder en anti-quencher.
Denne ingrediens forlænger det tidsrum, hvor pladerne kan scannes, før
fluorescensen svinder.
ly
On
65
PRODUKTBESKRIVELSE
Indhold
Forberedelse
R1 • Anti-Legionella
pneumophila-farvningsreagens
1 dråbeflaske (1,3 ml)
• FITC-mærket, monoklonalt
antistof
• Baggrundsfarve
• Natriumazid*
• Proteinstabiliseret buffer
Brug som færdigt
præparat.
C1 • Antigenopløsning til positiv
kontrol
1 dråbeflaske (2,0 ml)
• Tilintetgjort L.pneumophila
• Bufret saltvand
• Natriumazid**
Ryst før brug.
R2 • Monteringsmedium
1 dråbeflaske (4,0 ml)
• Bufret glycerol
• Anti-quencher
Brug som færdigt
præparat.
R3 • Plader til
fluorescensmikroskopi
24 (2 brønde hver)
• Plader til
fluorescensmikroskopi
Tør af med en
fnugfri serviet før
brug.
rR
Fo
Komponent
*0,01 % natriumazid; **0,1 % natriumazid
re
efe
Opbevar reagenser ved 2 – 8°C. Pladerne skal gemmes ved 2 – 28°C. Hvis
de åbne eller ikke-åbne reagenser opbevares ved de angivne temperaturer,
er de holdbare inden for den påtrykte periode.
eU
nc
FORHOLDSREGLER FOR BRUGERE
Til in vitro-diagnosticering.
Kun til professionel brug.
1. Undgå at bruge sættet efter den angivne udløbsdato.
se
2. Håndter alle kliniske prøver som potentielt inficeret materiale, og benyt
de rette aseptiske laboratorieteknikker til at behandle prøver og kulturer.
Procedurer, der kan frembringe aerosoler, skal udføres i en biologisk
sikret kammer. Alle materialer skal steriliseres efter brug eller før
bortskaffelse.
On
ly
3. Farvningsreagensen og antistofopløsningen til positiv kontrol indeholder
natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og dermed
danne højeksplosive metalazider. Undgå dannelse af azider ved at skylle
rørene efter med store mængder vand, hvis reagenserne hældes i afløbet.
C1 • Antigenopløsning til positiv kontrol
Xn: Sundhedsskadelig
0.1% NaN3
R: 21/22
Farlig ved hudkontakt og ved indtagelse.
S: 24/25-28-36/37/39
Undgå kontakt med huden og øjnene. Kommer stof på huden
vaskes straks med store mængder vand. Brug særligt arbejdstøj,
egnede beskyttelseshandsker og -briller/ansigtsskærm.
66
4. Nogle laboratorier kan have en vandforsyning, der indeholder
L. pneumophila. Hvis der observeres fluorescerende organismer ved
udførelse af en negativ kontroltest, kan det være nødvendigt at filtersterilisere alt deioniseret vand og forskylle glasudstyr, der anvendes ved
udførelsen af testen.
5. Rengør Coplin-pladerne grundigt fra gang til gang for at forebygge overførsel af positive celler.
6. Lad aldrig farvningsreagens tørre på pladen under farvningsproceduren.
Fo
PRØVETAGNING
Kliniske prøver til testen kan være friske eller nedfrosset i frisk tilstand.
Næsten alle former for prøver fra de nedre åndedrætsorganer egner sig til
direkte Legionella-test og kulturdyrkning. Væsker og væv fra de ydre dele af
lungerne kan desuden være relevante som prøvemateriale.10
efe
rR
Sensitiviteten ved direkte test og kulturdyrkning kan maksimeres ved at benytte de testportioner af en prøve, som forekommer mest signifikante. Vælg en
prøve i væsken fra luftvejene, som er mælkeagtig eller blodig. I lungevæv skal
du vælge kompakte områder med en grålig eller rødlig fortætning.10
eU
nc
re
Når det er muligt, skal Legionella isoleres ved hjælp af kulturdyrkning. Til
epidemiologiske undersøgelser kan et kulturisolat være påkrævet, og kulturdyrkningen kan øge sensitiviteten for konstatering af alle Legionellaprøver. Den højeste gendannelsesgrad opnås ved hjælp af bufret trækulsgærekstraktagar, der er suppleret med 0,1% alfaketoglutarat (BCYEa) med
eller uden selektive ingredienser. (Yderligere oplysninger om kulturdyrkningsteknikker for L. pneumophila finder du i reference 10 eller 11 eller det
tekniske materiale, der kan fås fra Bio-Rad Laboratories).
se
Legionella-kolonier har en karakteristisk lighed med skåret glas, når de
betragtes med en dissektionsmikroskop ved naturligt lys og en lav vinkel.
Der registreres ofte et opaliserende skær. Unge kolonier er 1 – 2 mm i diameter, runde med afsluttede kanter og har en flad eller konveks form.11
ly
On
PROCEDURE
Medfølgende materialer
Se afsnittet Reagenser, side 66.
Krævede materialer, der ikke medfølger til test af kliniske prøver:
• Dækstrimler, 24 X 60 mm, #1.
• Fnugfri serviet
• Pasteur-pipetter
• Serologisk pipette, 1 ml
• Sterile træapplikatorpinde
• 10% formalin i normalt saltvand (se bemærkning nedenfor)
• Deioniseret vand
• Stænkbakker af Coplin-typen, ca. 7x8x10 cm
67
• Fugtkammer (f.eks. en stor, tildækket Petri-plade med en våd
papirserviet i bunden)
• Inkubator til 37°C
• Bunsenbrænder
• Biologisk sikret kabinet (anbefales)
• Immersionsolie, der egner sig til fluorescensmikroskopi
• Fluorescensmikroskopi med et filtersystem til fluorescein isothiocyanat (FITC), dvs. en maksimal spændingsbølgelængde på 490 nm
og en gennemsnitlig emissionsbølgelængde på 520 nm. Variationer i
spændingen, intensiteten og justeringen af pæren og forskelle i belysningstypen og filtrene kan påvirke testens ydeevnen.
efe
rR
Fo
Supplerende materialer, der kræves til test af organismer, der er
isoleret fra kulturer:
• Øjepodenål til bakterieprøver
• Testrør af glas
• Stativ til testrør
• Nr. 1 McFarland-nephelometer med densitetsstandard (se bemærkning nedenfor)
• 1% formalin i normalt saltvand (se bemærkning nedenfor)
nc
re
Bemærk!
• Nr. 1 McFarland-nephelometer med densitetsstandard = 0,1 ml 1% bariumchlorid, som er overført
til 9,9 ml 1% svovlsyre. Opbevar ved 2 – 8°C, beskyttet mod lys. Ryst før brug.
• 10% formalin = 3,7% formaldehyd (til direkte prøver).
• 1% formalin = 0,37% formaldehyd (ved brug af kulturbekræftelsesteknik).
• Normalt saltvand = 0,85 % NaCl deioniseret vand.
eU
FORBEREDELSE AF PRØVER FOR FARVNING
Forberedelse af udstrygningspræparat til direkte test af patientprøver
(et biologisk sikret kammer anbefales)
se
ly
On
1. Rengør og afmærk en MONOFLUO™ Fluorescensmikroskopiplade med
to brønde. Undgå at placere prøver fra mere end en patient på samme
plade. Hver plade skal behandles særskilt under fiksering og vask for at
sikre, at organismer i en prøve ikke overføres til andre prøver. Et
udstrygningspræparat til positiv kontrol skal forberedes på en særskilt
plade og behandles for sig selv.
2. Forbered to udstrygningspræparater pr. patientprøver som beskrevet
nedenfor. (Mange prøver indeholder meget få Legionella-celler, og cellerne kan være ujævnt fordelt i prøven. Forberedelse af to udstrygningspræparater kan derfor øge den direkte tests sensitivitet).
a. Væv (frisk eller nedfrosset i frisk tilstand)
Vælg et kompakt område med en grålig eller rødlig fortætning. Brug
en af eller begge af følgende teknikker til at forberede de to udstrygningspræparater:
• Udjævn vævet med sterilt, deioniseret vand for at sikre en vævshomogenitet på ca. 10 %. Læg et tyndt lag over brøndene på pladen
ved hjælp af en steril træapplikatorpind.
68
• Skær et frisk vævslag af med en steril tang eller skalpel. (Hvis
vævet er for vådt til at give et tyndt lag, kan du tørre det på sterilt
gaze). Brug tangen til at trykke og klemme vævet mod pladen, så
brøndene bliver fyldt. Hvis du skal foretage en kulturdyrkning, skal
du gøre dette, før du påfører udstrygningspræparatet.
b. Lungeexudater (friske eller nedfrosset som friske spytprøver, transtracheale aspirater, bronchiale udskylninger osv.)
Vælg en tyktflydende del af prøven, som er mælkeagtig eller blodig.
Forbered to tynde udstrygninger med en steril træapplikatorpind.
c. Pleural væske og cerebrospinal væske
Centrifuger prøven i et sikkerhedsbæger ved ca. 4.000xg i 30 minutter. Kasser alt materiale, bortset fra 0,5 ml supernatant. Opslæm igen.
Udfør to tynde udstrygninger med en steril Pasteur-pipette.
Fo
3. Lufttør udstrygningerne,* og varmefikser derefter prøverne ved at lade
pladen glide hurtigt gennem en flamme.
rR
4. Placer pladen i et fugtkammer, og dæk laget med 10% formalin i saltvand. Fikser i 10 minutter ved stuetemperatur.
efe
5. Lad formalinen løbe fra, og dyp pladen hurtigt i deioniseret vand.
re
6. Nedsænk pladen i frisk, deioniseret vand i to minutter for at fjerne resten
af formalinet.
nc
7. Lufttør,* og behandl derefter prøven ifølge proceduren for fluorescensfarvning.
eU
*Bemærk! Når du forbereder udstrygningen, kan du anvende en pladeopvarmer ved 35 – 45°C til de trin,
der kræver lufttørring.
se
Forberedelse af udstrygning til kulturbekræftelse (et biologisk sikret
kammer anbefales)
1. Rengør og afmærk en MONOFLUO™ Fluorescensmikroskopiplade.
ly
On
2. Fjern en afgrænset koloni, der mistænkes for at være L. pneumophila,
fra kulturpladen med en bakteriologisk øjepodenål. Opslæm bakterierne
i et testrør, der indeholder en meget lille mængde 1% formalin i saltvand
i forhold til turbiditeten for en Nr. 1 McFarland-standard.
3. Brug en Pasteur-pipette til at placere 2 – 3 dråber af blandingen til en
brønd på pladen. Fjern dråberne med den samme Pasteur-pipette. En
tynd film af organismer forbliver på brønden. Gentag trin 1 – 3 for at
forberede en udstrygning for hver mistænkt koloni.
4. Lufttør udstrygningerne,* og varmefikser derefter ved at lade pladen
glide hurtigt gennem en flamme. Fortsæt med proceduren for fluorescensfarvning.
69
Forberedelse af udstrygningspræparat til positiv kontrol
1. Rengør og afmærk en MONOFLUO™ Fluorescensmikroskopiplade.
Bemærk! Udstrygningspræparatet til positiv kontrol skal behandles særskilt fra udstrygningerne til patienttest.
2. Ryst flasken, som indeholder antigenopløsningen til positiv kontrol for at
opslæmme cellerne. Tilsæt 1 – 2 dråber af blandingen til en brønd på
pladen, og brug derefter en ny Pasteur-pipette til at fjerne væsken fra
brønden. Kasser pipetten.
3. Lufttør,* og varmefikser derefter prøven ved at lade pladen glide hurtigt
gennem en flamme. Fortsæt med proceduren for fluorescensfarvning.
*Bemærk! Når du forbereder udstrygningen, kan du anvende en pladeopvarmer ved 35 – 45°C til de trin,
der kræver lufttørring.
Fo
FARVNINGSPROCEDURE
rR
Procedure for fluorescensfarvning
efe
1. Tilsæt en tilstrækkelig mængde MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila-farvningsreagens til at dække prøven (1 – 2 dråber, afhængigt af
prøvetypen, og således at reagensen forbliver inden for kanten af
brønden).
nc
re
2. Placer pladen i et fugtkammer, og inkuber i 30 minutter ved 35 –37°C.
Bemærk! Inkuber pladen til den positive kontrol og prøvepladerne i særskilte fugtkamre.
se
eU
3. Fjern overskydende farvningsreagens f.eks. ved hjælp af opsugning.
Dyp hurtigt pladen i deioniseret vand for at skylle den. Nedsænk den
derefter to gange á 2 – 10 minutter i frisk deioniseret vand. Bemærk!
Vask hænderne eller skift handsker mellem håndteringen af pladen til
den positive kontrol og prøvepladerne.
On
4. Lufttør pladerne.
5. Tilsæt 1 – 2 dråber monteringsmedium til pladen. Læg en dækstrimmel
over pladen.
ly
UNDERSØGELSE AF FARVEDE PLADER
• Direkte test: Scan alle udstrygninger med et 20 – 25x objektiv. Hvis der
observeres fluorescerende prikker, skal du skifte til et 63 – 100x objekt
for at bekræfte forekomsten af cellulær morfologi. Se afsnittet Begrænsninger for proceduren, side 72.
• Kulturbekræftelsestest: Scan alle udstrygninger med et 63 – 100x objektiv.
• Aflæs pladerne inden for flere timers farvning. Hvis du ønsker det, kan
du opbevare pladerne en enkelt nat et mørkt sted og ved 2 – 8°C eller i
længere perioder på et mørkt sted ved -20°C. Plader, der opbevares
koldt, skal nå stuetemperatur før aflæsningen udføres. Denne procedurer skal forhindre, at kondensdannelse forvrænger prøvens aflæsning.
70
KVALITETSKONTROL
Brug en antigenopløsning til positiv konrol for at bekræfte farvningsreagensens reaktivitet, hver dag testen udføres. Testproceduren beskriver
metoden for behandling af den positive kontrol.
Brug en kultur fra en kendt Gram-negativ organisme som f.eks. E. coli som
negativ kontrol. Forberede en blanding som beskrevet for kulturbekræftelsesteknikken, og følg testproceduren.
EVALUERING AF TESTRESULTATER
Farvet L. pneumophila vises som en intra- eller ekstracellulær, fluorescerende, æblegrøn stav eller som Coccobacilli. Prøven er negativ, når organismerne er mørkerød eller har en mat guldfarve.
rR
Fo
L. pneumophila er pleomorfiske organismer, der kan variere fra korte Coccobacilli-former til lange, trådagtige stave. Antibiotisk behandling kan
resultere i organismer med en ukarakteristisk morfologi.
Karakteristika og morfologi for farvningen af positive organismer svarer til
den positive kontrol for L. pneumophila.
efe
nc
re
I en kulturbekræftelsestest kan overbefolkning af celler i udstrygningen
nedsætte farvningens intensitet i markant grad. Hvis det er nødvendigt, kan
du undersøge yderkanterne af brønden eller de dele af udstrygningen, som
indeholder færre celler.
se
eU
Kulturens betingelser, især kulturens alder, kan resultere i variationer i fluorescensens intensitet fra celle til celle. Nogle celler bliver ikke farvet ens over
hele overfladen. Under alle omstændigheder vil positive, farvede celler lyse i
et mønster, der afslører en afgrænset cellulær morfologi. Kulturer bliver
bekræftet for L. pneumophila ud fra koloniernes karakteristiske udseende, de
fluorescerende organismers morfologi og resultaterne af en Gram-farvning.
Den anbefalede metode til rapportering af resultater er vist i tabel 2 nedenfor.
Foreslået rapport
ly
Direkte
testresultater
On
Tabel 2: Anbefalede rapporteringskriterier
> 5 fluorescerende
bakterier/plade med 2
brønde
FA positiv
1 – 5 fluorescerende
bakterier/plade med 2
brønde
Rapporter antallet af farvede celler. Bed om endnu en prøve,
hvis det er klinisk begrundet. Bekræft resultatet med en
kulturdyrkning.
Der kan ikke påvises
fluorescerende
bakterier
FA negativ
71
I mange prøver som f.eks. spyt, er organismerne sjældent talrige. Hvis der
udvises forsigtighed for at undgå overførsel af Legionella-celler, betragtes
observation af blot en enkelt morfologisk typisk Coccobacillus med en klar
fluorescens i cellevæggen som signifikant.
Fo
BEGRÆNSNINGER FOR PROCEDUREN
Et negativt resultat udelukker ikke muligheden af infektion med Legionella
pneumophila eller andre Legionella-arter hos patienten. Prøvetagningen og
forberedelsen er afgørende dele af testproceduren. Hvis prøven indsamles
på et uegnet tidspunkt i sygdomsforløbet, ved hjælp af en uegnet metode
eller med en forkert håndtering af prøven, eller hvis anvendelsen af
reagenserne er ukorrekt, kan der opstå fejl i konstateringen af Legionella
pneumophila. Diagnosen skal stilles i sammenhæng med de kliniske symptomer.
rR
Med et begrænset antal organismer (Staphylococcus aureus og nogle Lactobacillus-arter), kan der af og til observeres fluorescens på grund af ikkeimmun binding.
efe
Brug kun friske prøver eller friske prøver, der er nedfrosset. Histopatologisk
behandlede prøver og materialer, der er opbevaret i formalin, egner sig ikke
som prøver til denne test.
nc
re
Visse materiefyldt spytprøver kan udvise en øget baggrundsfarvning og
ikke-immun binding til celler. Enhver prøve, der udviser disse karakteristiska, skal bekræftes af kulturdyrkningen.
se
eU
SPECIFIKATIONER FOR YDEEVNE
MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila-farvningsreagensen er specifik for L. pneumophila og kan konstatere alle kendte serogrupper af organismen. Med baggrund i dataene om fluorescensfarvningen nedenfor, var
sensitiviteten og specificiteten af MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila-farvningsreagens 100% på direkte prøver og kulturer.
On
ly
Kulturbekræftelse
Der blev udført en blindundersøgelse for at evaluere ydeevnen for MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit på 50 kendte kulturer. Reagensen identificerede alle 19 kulturer af Legionella pneumophila
korrekt og gav negativt resultat for den andre 31 organismer.
Der blev observeret en meget svag fluorescens (1+ fluorescens) på grund af
ikke-immun binding op en kultur af Staphylococcus aureus og en kultur af
Lactobacillus brevis. De blev angivet som negative på grund af den svage
farvning. Disse organismer kan også registreres ved hjælp af de fluorescerende organismers morfologi, kolonierne morfologi på kulturpladerne og
resultaterne af en Gram-farvning.
72
Direkte prøver
Der blev udført en blindundersøgelse for at evaluere ydeevnen for MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit på 54 friske og
derefter nedfrosne humane prøver fra de nedre åndedrætsorganer, hvoraf
24 tidligere var blevet identificeret som positive og 30 som negative for
L. pneumophila. Under denne undersøgelse identificerede MONOFLUO™testen 25 af disse prøver som positive og 29 som negative. En enkelt prøve
i form af et transtrachealt aspirat, som viste sig negativ ud fra DFA og kulturbekræftelsestesten ved den oprindelige test i 1980, gav et tydeligt positivt resultat med MONOFLUO™-testen og med to polyklonale reagenser.
Selv om gentagne forsøg på kulturbekræftelse ikke lykkedes, blev der
observeret atypiske former ved en Gimenez-farvning, som blev udført i
1980. Resultatet for denne prøve blev derfor betragtet som ægte positivt.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
ly
On
73
MONOFLUO™ Legionella pneumophila
IFA Test Kit • 32514
Immunofluorescerande antikroppstestkit för detektion och
identifiering av Legionella pneumophila i kliniska prov och
odlingar.
rR
Fo
NAMN OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDE
MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit är avsett
för detektion och identifiering av Legionella pneumophila i kliniska prover
och odlingar.
nc
re
efe
ÖVERSIKT
Organismer från genus Legionella är gramnegativa bakterier vanligt förekommande i miljön, inklusive platser som sötvattenssjöar, kranvatten, luftkonditioneringssystem och bubbelpooler.1 Ett flertal species är associerade
med sjukdomar hos människa,2 men mer än 80 % av de organismer som
isolerats från patienter har identifierats som L. pneumophila.3,4
eU
L. pneumophila är etiologiskt agens för två specifika sjukdomar: Legionella
pneumonia (legionärssjuka), en akut luftvägsinfektion,5 och Pontiac-feber,
en icke-pneumonisk, självbegränsad luftvägssjukdom.6
se
Infektioner med L. pneumophila inträffar som sporadiska isolerade utbrott,
endemiska kluster av fall och som epidemier. Utbrott har rapporterats från
nästan alla delar av Nordamerika och de flesta andra kontinenter.7 Epidemier har rapporterats från sjukhus, hotell, kontorshus och på fabriker.
Överföring av sjukdomen tycks vara relaterad till kontakt med aerosoler,
t.ex. sådana som skapas av luftkonditioneringar, jetsprejapparater och luftfuktare.
ly
On
Ökad risk att drabbas av legionärssjuka associeras med cigarrettrökning,
alkoholkonsumtion och närvaro av tidigare existerande sjukdom som lett till
sänkt immunförsvar.2,7 Dödligheten för patienter med legionärssjuka har en
spridning från 15 % för personer som vanligen inte har någon underliggande sjukdom till 80 % för ej behandlade patienter med försämrat immunförsvar.2
Den sanna förekomsten av infektion med L. pneumophila kan vara underskattad på grund av ett brett spektrum av kliniska symptom, liknande
symptom som för andra pneumonier och bristen på lättillgängliga diagnos-
74
tiska test. Enligt samlade bedömningar står L. pneumophila för cirka 10 %
av fallen vad gäller atypisk pneumoni.2
Klinisk laboratoriediagnos för bestämning av lämplig behandling görs bäst
genom direkt undersökning av kliniska prover och genom odling och isolering av Legionella från kliniska prover. Retrospektiv diagnos av sjukdomen
fås genom att serologiskt påvisa en fyrfaldig ökning i antikroppstiter i
parade serumprover.
MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test Kit används
för detektion och identifikation av L. pneumophila direkt i patientprover eller
i odlingsisolat, och därmed bekräfta diagnosen legionärssjuka.8
rR
Fo
TESTPRINCIP
MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila färgningsreagens innehåller en
monoklonal antikropp märkt med fluorescein-isotiocyanat. Denna antikropp
reagerar med ett protein som finns i det yttre membranet hos alla kända
serogrupper av L. pneumophila.9
eU
nc
re
efe
Prov prepareras på mikroskopobjektglas, enligt beskrivning av testprocedur: antingen direkt från patientprover eller från organismer som isolerats i
odling. Preparaten färgas med MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila
färgningsreagens. Den märkta monoklonala antikroppen i reagenset binder
sig immunologiskt till eventuell L. pneumophila i preparatet. Därpå följande
sköljning tar bort obundna antikroppar från provet. När proverna betraktas i
ett fluorescensmikroskop, ser man L. pneumophila som ljust fluorescerande, äppelgröna baciller eller kockobaciller. Andra organismer är
mörkröda eller matt guldgula p.g.a. motfärgning.
se
MONOFLUO™ Mounting Medium som ingår i testet innehåller en ”antiquencher”. Denna ingrediens ökar den tid man har på sig att betrakta
provet innan fluorescensen mattas av.
ly
On
75
PRODUKTBESKRIVNING
Komponent
Innehåll
Beredning
Klar att användas.
C1 • Positiv kontroll antigensuspension
1 droppflaska (2,0 mL)
• Avdödad L.pneumophila
• Buffrad saltlösning
• Natriumazid**
Omskakas före
användning.
R2 • Monteringsmedium
1 droppflaska (4,0 mL)
• Buffrad glycerol
• Anti-quencher
Klar att användas.
R3 • Fluorescensmikroskopiobjektglas
24 (två brunnar vardera)
• Fluorescensmikroskopiobjektglas
Torka med luddfri
servett före
användning.
rR
Fo
R1 • Anti-Legionella pneumophila • FITC-märkt monoklonal
färgreagens
antikropp
1 droppflaska (1,3 mL)
• Bakgrundsfärg
• Natriumazid*
• Proteinstabiliserad buffert
*0,01 % Natriumazid ; **0,1 % Natriumazid
re
efe
Förvara reagens vid 2-8 °C. Objektglas bör förvaras vid 2-28 °C. Om de förvaras vid angivna temperaturer är både öppnade och oöppnade reagenser
stabila till angiven förbrukningstid.
eU
nc
ANVÄNDAR-FÖRESKRIFTER
För in vitro-diagnostisk användning.
Endast för professionellt bruk.
1. Använd inte testet efter sista förbrukningsdatum.
se
2. Hantera alla kliniska prover som potentiellt infekterat material, och
använd lämpliga aseptiska laboratorietekniker för behandling av prover
och odlingar. Förfaranden som kan generera aerosoler bör utföras i ett
biologiskt säkerhetsskåp. Allt material bör steriliseras efter användning
eller innan det kastas.
On
ly
3. Färgningsreagens och positiv kontroll antigensuspension innehåller
natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda
högexplosiva metallazider. För att undvika att azid lagras bör rören spolas länge med vatten om reagens hälls ut i avloppet.
C1 • Positiv kontroll antigen-suspension
Xn: Hälsovådligt
0.1 % NaN3
R: 21/22
Farligt vid hudkontakt och förtäring.
S: 24/25-28-36/37/39: Undvik kontakt med huden och ögonen.
Vid kontakt med huden tvätta genast med mycket vatten.
Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt skyddsglasögon eller ansiktsskydd.
76
4. Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt skyddsglasögon
eller ansiktsskydd.
5. En del laboratorier kan ha vattenreservoarer som innehåller
L. pneumophila. Om fluorescerande organismer observeras vid ett negativt kontrolltest kan det bli nödvändigt att sterilfiltrera allt avjoniserat vatten och skölja glasbehållare i förväg innan detta test utförs.
6. Rengör coplinskålarna ordentligt mellan användningstillfällena så att
inga positiva celler blir kvar.
7. Se till att färgningsreagenset inte torkar in i objektglaset under färgningsförfarandet.
rR
Fo
PROVURVAL
Kliniska prover för testet kan vara färska eller färskfrysta. Nästan alla slags
prover från nedre luftvägarna är lämpliga för direkttest och odling av
Legionella. Dessutom kan extrapulmonära vätskor och vävnader vara relevanta prover.10
re
efe
Känsligheten hos direkt test och odling kan ökas genom att testa de delar
av ett prov som verkar mest signifikanta. I luftvägsvätskor bör man välja ett
prov som är ”mjölkigt” eller blodigt. För lungvävnader väljs täta ytor med
grå eller rödaktig förtätning.10
se
eU
nc
Där så är möjligt bör Legionella påvisas genom odling. Ett odlingsisolat kan
behövas för epidemiologiska studier, och odling kan öka känsligheten för
detektion av alla Legionella-arter. Bästa odlingsresultat uppnås vid användning av buffrad koljästextraktagar med tillägg av 0,1 % alfa-ketoglutarat
(BCYEa), med eller utan selektiva ingredienser. (För ytterligare information
om odlingstekniker för L. pneumophila, se referens 10 eller 11 eller tekniskt
material från Bio-Rad Laboratories.)
ly
On
Legionella-kolonier har ett karakteristiskt utseende,liknande glasskärvor när
man betraktar dem i ett dissektionsmikroskop med inkommande ljus i låg
vinkel. En opalskimrande lyster kan ofta noteras. Unga kolonier är 1-2 mm i
diameter, runda med jämna kanter och platta till konvexa.11
MONOFLUO™ LEGIONELLA PNEUMOPHILA
IFA-TESTFÖRFARANDE
Bifogad material
Se avsnittet Reagenser, sidan 76.
Nödvändig men ej bifogad material som behövs för testning av kliniska
prover:
• Täckglas, 24 x 60 mm, nr 1
• Luddfri servett
• Pasteur-pipetter
• Serologisk pipett, 1 mL
• Sterila utstrykningspinnar av trä
77
•
•
•
•
•
•
•
•
•
efe
rR
•
•
•
•
Fo
•
10 % formalin i normal saltlösning (se not nedan)
Avjoniserat vatten
Färgningsskål av coplin-typ, cirka 7x8x10 cm
Fuktkammare (t.ex. en stor täckt petriskål med en våt pappershandduk i botten)
37 °C inkubator
Bunsenbrännare
Biologiskt säkerhetsskåp (rekommenderas)
Immersionsolja lämplig för fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskop med ett filtersystem för fluorescein-isotiocyanat (FITC), dvs. en maximal excitationsvåglängd på 490 nm och en
genomsnittlig emissionsvåglängd på 520 nm. Variationer i wattstyrka,
intensitet och vinkling av glödlampan samt skillnader i belysningstyp
och filter kan påverka testets tillförlitlighet.
Ytterligare material som krävs för test av odlingsisolerade organismer
:Platinös
Provrör av glas
Provrörsställ
McFarland-nefelometer täthetsstandard nr.1 (se not nedan).
1 % formalin i normal saltlösning (se not nedan)
eU
nc
re
Obs!
• McFarland-nefelometer täthetsstandard nr 1 = 0,1 ml 1 % bariumklorid blandad med 9,9 ml 1 %-ig
svavelsyra. Förvaras vid 2-8 °C, skyddad från ljus. Omskakas före användning.
• 10 % formalin = 3,7 % formaldehyd (för direktprover).
• 1 % formalin = 0,37 % formaldehyd (för odlingskonfirmation).
• Normal saltlösning = 0,85 % NaCl i avjoniserat vatten.
PROVBEREDNING FÖRE FÄRGNING
se
Preparat för direkt test från patientprover (biologiskt säkerhetsskåp
rekommenderas).
ly
On
1. Rengör och märk upp ett MONOFLUO™-fluorescensmikroskopi-objektglas med två brunnar. Prover från mer än en patient bör ej sättas på
samma objektglas. Varje objektglas bör beredas separat under fixering
och tvättning för att undvika kors-kontamination. Ett positivt utstryk bör
göras på ett separat objektglas och beredas separat.
2. Gör i ordning två utstryk per patientprov, se nedan. (Många prover innehåller endast ett fåtal Legionella-celler och cellerna kan vara ojämnt
fördelade över provet. Därför kan två utstryk öka känsligheten för direkt
testning.)
a. Vävnad (färsk eller färskfryst)
Välj täta ytor med grå eller rödaktig förtätning. Välj en eller båda av
följande tekniker för preparering av två utstryk:
• Mortla ner vävnaden med sterilt, avjoniserat vatten till en cirka
10 %-ig vävnadssuspension. Använd en steril utstrykningspinne
av trä och gör tunna utstryk som täcker brunnarna på objektglaset.
78
• Skär ut en färsk vävnadsyta med hjälp av pincett och skalpell.
(Torka med gasväv om den är för våt för ett tunnt utstryk.) Tryck
och kläm vävnaden med pincetten så att den fyller brunnarna. Om
odling ska göras ska det ske före utstrykning.
b. Lungexsudat (färskt eller färskfruset sputum, transtrakeala aspirat,
bronksköljvätska, etc.)
Välj en trögflytande del av provet som ser mjölkvit eller blodig ut.
Använd en steril utstrykningspinne av trä för att preparera två tunna
utstryk.
c. Pleuravätska och spinalvätska
Centrifugera provet i en säkerhetskopp vid cirka 4 000xg i 30 minuter.
Häll av supernatanten men spara ca 0,5 mL lösning; suspendera
igen. Gör två tunna utstryk med en steril Pasteur-pipett.
Fo
3. Lufttorka utstryken,* värmefixera sedan proverna genom att snabbt föra
objektglaset genom en låga.
rR
4. Placera objektglaset i en fuktkammare och täck varje preparat med
10 % formalin i saltlösning. Fixera i 10 minuter vid rumstemperatur.
efe
5. Låt formalinet rinna av och doppa objektglaset en kort stund i avjoniserat vatten.
re
6. Blötlägg objektglaset i färskt avjoniserat vatten i två minuter så att resterande formalin avlägsnas.
nc
7. Lufttorka* och fortsätt sedan med fluorescensfärgningsförfarandet.
eU
*Obs: Vid utstryk kan en objektglasvärmare som håller 35-45 °C användas för alla steg som kräver
lufttorkning.
se
Preparat för odlingskonfirmation (biologiskt säkerhetsskåp
rekommenderas)
On
1. Rengör och märk upp ett MONOFLUO™-fluorescensmikroskopi-objektglas.
ly
2. Tag en distinkt misstänkt L. pneumophila-koloni från odlingsplattan med
en platinös. Suspendera bakterien i ett provrör med en mycket liten
mängd 1 %-igt formalin i saltlösning till en grumlig suspension, motsvarande McFarland-standard nr 1.
3. Applicera 2-3 droppar av lösningen till en brunn med en Pasteur-pipett
och ta sedan bort den med samma Pasteur-pipett. En tunn hinna av
organismen blir då kvar i brunnen. Upprepa stegen 1-3 för att göra ett
separat utstryk för varje misstänkt koloni på individuella objektglas.
4. Lufttorka utstryken,* värmefixera sedan genom att snabbt föra objektglaset genom en låga. Genomför fluorescensfärgningsförfarandet.
79
Preparat för positiv kontroll
1. Rengör och märk upp ett MONOFLUO™-fluorescensmikroskopi-objektglas. Obs! Utstryk av positiv kontroll bör beredas separat från patientutstryk.
2. Skaka flaskan som innehåller den positiva kontrollantigensuspensionen
så att cellerna resuspenderas. Tillsätt 1-2 droppar av suspensionen i en
brunn och använd sedan en Pasteur-pipett för att ta bort suspensionen.
3. Lufttorka* och värmefixera sedan provet genom att snabbt föra objektglaset genom en låga. Genomför fluorescensfärgningsförfarandet.
*Obs: Vid utstryk kan en objektglasvärmare som håller 35-45 °C användas
för alla steg som kräver lufttorkning.
Fo
FÄRGNINGSFÖRFARANDE
Fluorescensfärgningsförfarande
rR
efe
1. Applicera tillräckligt med MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila
färgningsreagens så att det täcker provet (1-2 droppar beroende på
provtyp, men inte så mycket att det kommer utanför brunnen).
nc
re
2. Placera objektglaset i fuktkammare och inkubera i 30 minuter vid 3537 °C. Obs: Inkubera det positiva kontrollobjektglaset och provobjektglaset/-glasen i olika fuktkammare.
se
eU
3. Ta bort överflödigt färgningsreagens, exempelvis genom aspiration.
Skölj objektglaset genom att snabbt doppa det i avjoniserat vatten.
Fortsätt sedan med två på varandra följande ”bad” (2-10 min.) i avjoniserat vatten. Obs: Tvätta händerna eller byt handskar mellan hantering av
det positiva kontrollobjektglaset och provobjektglaset/-glasen.
4. Lufttorka objektglasen.
On
5. Lägg 1-2 droppar monteringsmedium på objektglaset; lägg på ett täckglas.
ly
UNDERSÖKNING AV FÄRGADE OBJEKTGLAS
• Direkt test: Titta igenom varje preparat med ett 20-25x objektiv. Om fluorescerande fläckar observeras, byt till ett 63-100x objektiv och bekräfta
cellulär morfologi. Se avsnittet Testets begränsningar, sidan 82.
• Odlingskonfirmation: Titta igenom varje preparat med ett 63-100x
objektiv.
• Läs av objektglasen inom några timmar efter färgning. Vid behov kan
objektglasen förvaras mörkt över natten vid 2-8 °C, eller frysas för
långtidsförvaring vid –20 °C. Objektglas som förvarats kallt måste uppnå
rumstemperatur före avläsning annars kan kondensation skymma
provet.
80
KVALITETSKONTROLL
Använd positiv kontrollantigensuspension för att verifiera färgningsreagensens kvalite´ vid varje testtillfälle. Testproceduren beskriver metoden för att
genomföra positiv kontroll.
Använd ett isolat från en känd gramnegativ organism såsom E. coli som
negativ kontroll. Gör i ordning en suspension enligt beskrivningen för
odlingskonfirmation och följ testförfarandet.
UTVÄRDERING AV TESTRESULTAT
Färgad L. pneumophila uppträder som intra- eller extracellulärt fluorescerande, äppelgröna stavar eller kockobaciller. Prover är negativa om
organismerna är mörkröda eller matt guldgula.
rR
Fo
L. pneumophila är pleomorfa organismer som kan variera från mycket korta
kockobaciller till långa, trådlika stavar. Antibiotikaterapi kan resultera i
organismer med okaraktäristisk morfologi.
Färgningsegenskaperna och morfologin för positiva organismer liknar den
positiva kontrollen för L. pneumophila.
efe
re
I ett odlingskonfirmationstest kan för många celler i utstryket signifikant
minska färgningsintensiteten. Undersök vid behov brunnens yttre kanter
eller delar av preparatet som innehåller färre celler.
se
eU
nc
Odlingsförhållanden, särskilt odlingens ålder, kan ge variation på fluorescensintensiteten mellan cellerna. Vissa celler kanske inte blir jämnt färgade över hela ytan. Dock kommer positivt färgade celler att fluorescera i
ett mönster som visar tydlig cellulär morfologi. Odlingskonfirmation av
L. pneumophila baseras på; distinkt förekomst av kolonier, morfologi hos
fluorescerande organismer och resultat av Gramfärgning.
Rekommenderad metod för resultat-rapportering visas i tabell 2 nedan.
Tabell 2: Rekommenderade rapportkriterier
On
Rekommenderad rapport
> fem fluorescerande bakterier/
objektglas med två brunnar
FA-positiv
1-5 fluorescerande bakterier/
objektglas med två brunnar
Rapportera antal färgade celler;
begär ett andra prov om det är
kliniskt indikerat Konfirmera med odling.
Inga fluorescerande
bakterier kan påvisas.
FA-negativ
ly
Resultat av direkttest
I många prover, t.ex. sputum, är antalet organismer sällan stort. Om man
varit noga med att undvika överföring av Legionella-celler, kan därför
observation av även en enstaka morfologiskt typisk kockobacill med ljus
cellväggsfluorescens anses signifikant.
81
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten att patienten har en infektion
med Legionella pneumophila eller annan Legionella-art. Provinsamling och
beredning är viktiga steg i testförfarandet. Insamling av prov vid olämplig
tidpunkt under sjukdomsförloppet, med olämplig metod, olämplig provhantering, eller fel användning av reagens kan leda till utebliven detektion av
Legionella pneumophila. Diagnos bör göras tillsammans med kliniska
symptom.
Med ett begränsat antal organismer (Staphylococcus aureus och vissa
andra Lactobacillus-arter) kan fluorescens ibland observeras på grund av
icke-immunologisk bindning.
Fo
Använd endast färska eller frysta prover. Histopatologiskt behandlade
prover och formalinkonserverade material är inte lämpliga prover för detta
test.
efe
rR
Vissa purulenta sputumprover kan uppvisa ökad bakgrundsfärgning och
icke-immunologisk bindning till celler. Alla prover som uppvisar dessa
egenskaper bör konfirmeras med odling.
eU
nc
re
PRODUKTEGENSKAPER
Färgningsreagens för MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila är specifik för L. pneumophila och detekterar alla kända serogrupper för organismen. Baserat på fluorescensfärgningsdata nedan visade färgningsreagens
för MONOFLUO™ Anti-Legionella pneumophila 100 % känslighet och
specificitet på direktprover och odlingar.
se
Odlingskonfirmation
En blindstudie genomfördes för att utvärdera tillförlitligheten för MONOFLUO™ Legionella Immunofluorescent Antibody Test på 50 kända odlingar.
Reagenset gjorde en korrekt identifiering av alla 19 odlingar av Legionella
pneumophila och var negativt för resterande 31 organismer.
On
ly
Mycket svag fluorescens (1+ fluorescens) på grund av icke-immunologisk
bindning observerades för en odling av Staphylococcus aureus och en
odling av Lactobacillus brevis. Dessa angavs som negativa på grund av
svag färgning. Dessa organismer kan särskiljas genom morfologi av fluorescerande organismer, koloni-morfologi på odlingsplattor och resultat av
Gramfärgning.
Direktprover
En blindstudie genomfördes för att utvärdera tillförlitligheten för MONOFLUO™ Legionella immunofluorescerande antikroppstest på 54 färskfrysta
prover från nedre luftvägarna på människor, av vilka 24 tidigare hade identifierats som positiva och 30 som negativa för L. pneumophila. Under studien identifierade MONOFLUO™-testet 25 av dessa prover som positiva
och 29 som negativa. Ett prov, ett transtrakealt aspirat som var negativt
enligt DFA och odlingsresultat vid ursprunglig testning år 1980, var tydligt
82
positivt med MONOFLUO™-testet liksom med två polyklonala reagens.
Även om upprepade odlingsförsök inte lyckades, hade en Gimenez-färgning utförd år 1980 visat atypiska former. Detta prov ansågs därför vara sant
positivt.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
ly
On
83
ΤM
MONOFLUO
Κιτ ∆οκιµής IFA
Legionella pneumophila
Κιτ ∆οκιµής µε Ανοσοφθορίζοντα Αντισώµατα για την
Ανίχνευση και τον Προσδιορισµό της Legionella
pneumophila σε κλινικά δείγµατα και σε καλλιέργειες.
Για διαγνωστική χρήση In Vitro
32514
ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΑ ΓΙΑ ΧΡΗΣΗ ΩΣ
ΕΝΤΥΠΟ ΑΝΑΦΟΡΑΣ:
ΝΑ ΜΗΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ αντί των
ένθετων που παρέχονται µε έκαστο
κιτ δοκιµής.
Ελληνικά
σελίδα
1-10
Αναθεώρηση: Μάρτιος 2001
1
ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
Το κιτ δοκιµής µε ανοσοφθορίζοντα αντισώµατα Legionella MONOFLUOTM
είναι ειδικά σχεδιασµένο για την ανίχνευση και τον προσδιορισµό της Legionella
pneumophila σε κλινικά δείγµατα και καλλιέργειες.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ
Οι οργανισµοί του γένους Legionella είναι βακτήρια gram-αρνητικά που
απαντώνται στο περιβάλλον, µεταξύ άλλων, σε λίµνες µε γλυκό νερό, στο νερό
της βρύσης, σε συστήµατα κλιµατισµού, σε πισίνες και µπάνια µε υδροµασάζ.1
Αρκετά είδη του γένους συσχετίζονται µε ανθρώπινη ασθένεια,2 ωστόσο,
ποσοστό µεγαλύτερο του 80% των οργανισµών που αποµονώθηκαν από
ασθενείς αναγνωρίστηκαν ως L. pneumophila.3,4
Η L. pneumophila είναι ο αιτιολογικός παράγοντας που ευθύνεται για δύο
διαφορετικές ασθένειες: την πνευµονία Legionella (νόσος των λεγεωνάριων), µια
σοβαρή αναπνευστική λοίµωξη,5 και τον πυρετό Pontiac, µια µη πνευµονική,
αυτοπεριοριζόµενη ασθένεια του αναπνευστικού.6
Οι λοιµώξεις από L. pneumophila εκδηλώνονται ως σποραδικά και
µεµονωµένα περιστατικά, ως ενδηµικά κρούσµατα και ως επιδηµίες. Κρούσµατα
έχουν αναφερθεί σε ολόκληρη σχεδόν τη Βόρειο Αµερική και στις περισσότερες
χώρες του κόσµου.7 Επιδηµίες έχουν αναφερθεί σε νοσοκοµεία, ξενοδοχεία,
γραφειακά συγκροτήµατα και βιοµηχανικές µονάδες. Η µετάδοση της ασθένειας
φαίνεται ότι σχετίζεται µε την έκθεση σε αερολύµατα, όπως τα αερολύµατα
κλιµατιστικών, νεφελοποιητών και υγραντήρων χώρου.1
Ο αυξηµένος κίνδυνος προσβολής από την νόσο των λεγεωνάριων
συσχετίζεται µε το κάπνισµα, την κατανάλωση αλκοόλ και τυχόν προϋπάρχουσα
ασθένεια που έχει προκαλέσει µειωµένη ανοσοϊκανότητα.2,7 Τα ποσοστά
θνησιµότητας των ασθενών που πάσχουν από τη νόσο των λεγεωνάριων
κυµαίνονται από 15% σε άτοµα χωρίς υποκείµενη ασθένεια έως 80% σε
ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς στους οποίους δεν χορηγείται αγωγή.2
Η πραγµατική συχνότητα των λοιµώξεων από L pneumophila ενδέχεται να
έχει υποτιµηθεί λόγω του ευρέως φάσµατος των κλινικών συµπτωµάτων, της
οµοιότητας των συµπτωµάτων µε τα συµπτώµατα άλλων τύπων πνευµονίας, και
την έλλειψη ευρέως διαθέσιµων διαγνωστικών δοκιµών. Εκτιµάται ότι η L.
pneumophila είναι υπεύθυνη για ποσοστό 10% των περιστατικών άτυπης
πνευµονίας.2
Η βέλτιστη κλινική εργαστηριακή διάγνωση για τον προσδιορισµό της
κατάλληλης θεραπείας γίνεται µε την άµεση εξέταση των κλινικών δειγµάτων
καθώς και µε την καλλιέργεια και αποµόνωση της Legionella από κλινικά
δείγµατα. Η αναδροµική διάγνωση της νόσου γίνεται µε την κατάδειξη
τετραπλάσιας αύξησης του τίτλου των αντισωµάτων σε ζεύγη δειγµάτων ορού.
Το κιτ δοκιµής µε ανοσοφθορίζοντα αντισώµατα Legionella MONOFLUOTM
χρησιµοποιείται για την ανίχνευση και τον προσδιορισµό της L. pneumophila
απευθείας σε δείγµατα ασθενών ή σε στελέχη αποµονωµένα από καλλιέργειες.8
2
ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑΣ
Το αντιδραστήριο χρώσης Anti-Legionella pneumophiΙa του κιτ MONOFLUOTM
περιέχει µονοκλωνικό αντίσωµα που έχει επισηµανθεί µε ισοθειοκυανική
φθορισεΐνη.
Το εν λόγω αντίσωµα αντιδρά µε µια πρωτεΐνη που βρίσκεται στην εξωτερική
µεµβράνη όλων των γνωστών οροοµάδων της L. pneumophiΙa.9
Τα επιχρίσµατα ετοιµάζονται στις αντικειµενοφόρους πλάκες του µικροσκοπίου
όπως περιγράφεται στη διαδικασία της δοκιµής, και προέρχονται είτε άµεσα από
δείγµατα ασθενών είτε από οργανισµούς που έχουν αποµονωθεί σε καλλιέργειες. Τα
επιχρίσµατα χρωµατίζονται µε το αντιδραστήριο χρώσης Anti-Legionella
pneumophiΙa του κιτ MONOFLUOTM. Το σηµασµένο µονοκλωνικό αντίσωµα του
αντιδραστηρίου αυτού προσκολλάται σε κάθε L. pneumophiΙa του επιχρίσµατος.
Με την έκπλυση που ακολουθεί, αποµακρύνονται από το δείγµα όλα τα µη
δεσµευµένα αντισώµατα. Όταν τα δείγµατα εξετάζονται µε µικροσκόπιο φθορισµού,
τα βακτήρια L. pneumophiΙa εµφανίζονται ως έντονα φθορίζοντες βάκιλλοι ή
κοκκοβάκιλλοι σε χρώµα πράσινου µήλου. Άλλοι οργανισµοί εµφανίζονται µε
σκούρο ερυθρό ή θαµπό χρυσαφί χρώµα λόγω της παρουσίας αντιχρωστικής.
Το µέσο στερέωσης που περιλαµβάνεται στο κιτ MONOFLUOTM περιέχει µια
ουσία κατά της µείωσης της έντασης του φθορισµού (Anti-Quencher). Το εν λόγω
συστατικό παρατείνει τον χρόνο εξέτασης των αντικειµενοφόρων πλακών µέχρι την
εξασθένιση του φθορισµού.
ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ
Κιτ ∆οκιµής IFA Legionella pneumophila
MONOFLUO T M Αριθµός προϊόντος 32514
Συστατικό
R1 • Αντιδραστήριο
χρώσης AntiLegionella
pneumophiΙa
1 σταγονοµετρική φιάλη
(1,3 ml)
C1 • Εναιώρηµα
αντιγόνου θετικού
µάρτυρα
1 σταγονοµετρική φιάλη
(2,0 ml)
R2 • Μέσο στερέωσης
1 σταγονοµετρική φιάλη
(0,4 ml)
R3 • Φθορίζουσες αντικειµενοφόρες
πλάκες µικροσκoπίου
24 (2 κοιλότητες έκαστη)
Περιεχόµενα
Προετοιµασία
• Μονοκλωνικό αντίσωµα
σηµασµένο µε FITC
• Αντιχρωστική
• Αζίδιο του νατρίου
• Ρυθµιστικό διάλυµα
σταθεροποιηµένο µε
πρωτεΐνη
• Εξουδετερωµένα L.
pneumophila
• Αλατούχο ρυθµιστικό
διάλυµα
• Αζίδιο του νατρίου
Να χρησιµοποιείται ως
έχει
• Ρυθµιστικό διάλυµα
γλυκερόλης
• Anti-Quencher
Να χρησιµοποιείται ως
έχει
• Φθορίζουσες
αντικειµενοφόρες
πλάκες µικροσκoπίου
Πριν από τη χρήση
σκουπίστε µε πανί
που δεν περιέχει ίνες
βαµβακόσπορου
3
Ανακινήστε πριν από
τη χρήση
Φυλάσσετε τα αντιδραστήρια σε θερµοκρασία 2-8°C. Οι αντικειµενοφόρες πλάκες θα
πρέπει να φυλάσσονται σε θερµοκρασία 2-28°C. Όταν φυλάσσονται στις προδιαγεγραµµένες θερµοκρασίες, τα αντιδραστήρια παραµένουν σταθερά καθ' όλη τη
διάρκεια ζωής, είτε το κιτ έχει ανοιχτεί είτε όχι.
ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ
Για διαγνωστική χρήση in vitro.
1. Μην χρησιµοποιείτε το κιτ µετά από το πέρας της αναγραφόµενης
ηµεροµηνίας λήξης.
2. Χειρίζεστε όλα τα κλινικά δείγµατα ως εν δυνάµει µολυσµατικό υλικό και
χρησιµοποιείτε άσηπτη εργαστηριακή τεχνική για την επεξεργασία των
δειγµάτων και των καλλιεργειών. Οι διαδικασίες που ενδέχεται να
προκαλέσουν την δηµιουργία αερολυµάτων πρέπει να πραγµατοποιούνται σε
θάλαµο βιολογικής ασφάλειας. Όλα τα υλικά πρέπει να αποστειρώνονται µετά
από τη χρήση ή πριν από την απόρριψη.
3. Το αντιδραστήριο χρώσης και το εναιώρηµα αντιγόνου-θετικού µάρτυρα
περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε
το µόλυβδο και το χαλκό των υδραυλικών σωληνώσεων και να σχηµατίσει
ιδιαίτερα εκρηκτικά αζίδια µετάλλων. Όταν απορρίπτετε τα αντιδραστήρια
στον νεροχύτη, ξεπλένετε τις σωληνώσεις µε άφθονο νερό ούτως ώστε να
αποτρέπεται η συσσώρευση αζιδίου.
4. ∆εν αποκλείεται η παρουσία L. pneumophila στο δίκτυο υδροδότησης
ορισµένων εργαστηρίων. Εάν κατά τη διενέργεια της δοκιµής αρνητικού
µάρτυρα, παρατηρηθούν φθορίζοντες οργανισµοί, τότε ενδέχεται να απαιτείται
η αποστείρωση του απιονισµένου νερού µέσω διήθησης και η πρόπλυση των
γυάλινων σκευών που χρησιµοποιούνται για τη διενέργεια της δοκιµής.
5. Καθαρίζετε καλά τα τρυβλία Coplin µετά από κάθε χρήση, ώστε να
αποτρέπεται τυχόν µεταφορά θετικών κυττάρων.
6. Μην αφήνετε το αντιδραστήριο χρώσης να στεγνώσει
αντικειµενοφόρο πλάκα κατά τη διαδικασία της χρώσης.
επάνω
στην
ΣΥΛΛΟΓΗ ∆ΕΙΓΜΑΤΟΣ
Τα κλινικά δείγµατα της δοκιµής µπορούν να είναι νωπά ή νωπά
κατεψυγµένα. Όλοι σχεδόν οι τύποι δείγµατος που προέρχονται από το κατώτερο
τµήµα της αναπνευστικής οδού είναι κατάλληλοι για άµεση δοκιµή και
καλλιέργεια της Legionella. Επιπλέον, κατάλληλα δείγµατα µπορούν να είναι και
τα εξωπνευµονικά υγρά και οι ιστοί.10
Η ευαισθησία της άµεσης δοκιµής και της καλλιέργειας µπορεί να
µεγιστοποιηθεί µε τη δοκιµή των τµηµάτων του δείγµατος που φαίνονται
σηµαντικότερα. Όταν πρόκειται για αναπνευστικά υγρά, επιλέξτε ένα γαλακτώδες
ή αιµατώδες δείγµα. Όταν πρόκειται για πνευµονικό ιστό, επιλέξτε τις πυκνές
περιοχές γκρίζων ή ερυθρωπών ινώσεων..10
Η Legionella θα πρέπει να αποµονώνεται µε καλλιέργεια όταν αυτό είναι
εφικτό. Ένα αποµονωθέν µέσω καλλιέργειας
ενδέχεται να χρειαστεί για
4
επιδηµιολογικές µελέτες, και η καλλιέργεια µπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία
κατά την ανίχνευση όλων των ειδών Legionella. Το υψηλότερα ποσοστά
ανάκτησης επιτυγχάνονται µε τη χρήση εκχυλίσµατος ζυµοµυκήτων ξυλάνθρακα
σε ρυθµιστικό διάλυµα µε προσθήκη άγαρ που περιέχει 0,1 % άλφακετογλουταρικό (BCYEa), µε ή χωρίς επιλεκτικά συστατικά. (Για περαιτέρω
πληροφορίες σχετικά µε τεχνικές καλλιέργειας για τη L. pneumophila, ανατρέξτε
στις αναφορές 10 ή 11 ή στο τεχνικό υλικό που διατίθεται στα εργαστήρια της BioRad.)
Από ανατοµικό µικροσκόπιο µε φως χαµηλής γωνίας πρόσπτωσης, οι
αποικίες Legionella έχουν την εµφάνιση σπασµένου γυαλιού. Συχνά παρατηρείται
µια ιριδίζουσα λάµψη. Οι νέες αποικίες έχουν διάµετρο 1-2 mm, είναι στρογγυλές
µε πλήρως σχηµατισµένα άκρα και επίπεδες προς κυρτές.11
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ∆ΟΚΙΜΗΣ IFA
ΓΙΑ ΤΗ LEGIONELLA ΡΝΕUΜΟΡΗILA
MONOFLUO
TM
Παρεχόµενα υλικά
Βλέπε το τµήµα Αντιδραστήρια, σελίδα 3.
Απαιτούµενα αλλά µη παρεχόµενα υλικά
Για τη δοκιµή κλινικών δειγµάτων:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Καλυπτρίδες, 24 x 60 mm, #1
Πιπέτες Pasteur
Πιπέτα για ορολογική εξέταση, 1 ml
Αποστειρωµένες ξύλινες µπατονέτες
10% φορµαλίνης σε φυσιολογικό αλατούχο διάλυµα (βλ. σηµείωση
παρακάτω)
Απιονισµένο νερό
Τρυβλία χρώσης τύπου CopIin, 7x8x10 cm περίπου
Θάλαµος υγρής ατµόσφαιρας (όπως ένα µεγάλο καλυµµένο τρυβλίο petri που
φέρει υγρό χαρτί στο κάτω µέρος)
Επωαστήρας 37°C
Λύχνος Bunsen
Θάλαµος βιολογικής ασφάλειας (συνιστάται)
Έλαιο εµβάπτισης κατάλληλο για µικροσκοπία φθορισµού
Μικροσκόπιο φθορισµού µε σύστηµα φίλτρου για την ισοθειοκυανική
φθορισεΐνη (FITC), δηλαδή µέγιστο µήκος κύµατος διέγερσης 490 nm και µέσο
µήκος κύµατος εκποµπής 520 nm. Οι επιδόσεις της δοκιµής ενδέχεται να
επηρεάζονται από µεταβολές της ηλεκτρικής ισχύος, της έντασης και της
ευθυγράµµισης του λαµπτήρα, καθώς και από διαφορές ως προς τον τύπο
φωτισµού και φίλτρων.
Επιπρόσθετα υλικά που απαιτούνται για τη δοκιµή
οργανισµών που αποµονώνονται από την καλλιέργεια:
•
Βακτηριολογικός κρίκος
5
•
•
•
•
Γυάλινοι δοκιµαστικοί σωλήνες
Βάση δοκιµαστικών σωλήνων
Πρότυπο McFarIand αριθ. 1 για τη µέτρηση της πυκνότητας του νεφελώµατος
(βλέπε σηµείωση παρακάτω)
1 % φορµαλίνης σε φυσιολογικό αλατούχο διάλυµα (βλέπε σηµείωση
παρακάτω)
Σηµείωση:
• Πρότυπο McFarIand αριθ. 1 για τη µέτρηση της πυκνότητας του νεφελώµατος = 0,1 mI
διαλύµατος 1 % χλωριούχου βαρίου που προστίθεται σε 9,9 mI διαλύµατος 1 % θειικού οξέος.
Φυλάσσεται σε θερµοκρασία 2 έως 8°C, µακριά από το φως. Ανακινήστε πριν από τη χρήση
Φυσιολογικός ορός = απιονισµένο νερό µε 0,85% NaCI.
• 10% φορµαλίνη = 3,7% φορµαλδεΰδης (για απευθείας δείγµατα).
• 1 % φορµαλίνη = 0,37% φορµαλδεΰδης (για επιβεβαίωση καλλιεργειών).
ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ∆ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗ ΧΡΩΣΗ
Προετοιµασία επιχρίσµατος για άµεση δοκιµή σε δείγµατα ασθενών
(συνιστάται η χρήση θαλάµου βιολογικής ασφάλειας)
1. Καθαρίστε και επισηµάνετε την αντικειµενοφόρο πλάκα µικροσκοπίας
φθορισµού δύο κοιλοτήτων του κιτ MONOFLUOTM. ∆εν πρέπει να
αναµιγνύονται
στην
ίδια
αντικειµενοφόρο
πλάκα
δείγµατα
από
περισσότερους ασθενείς. Κατά την καθήλωση και την έκπλυση, συνιστάται ο
ξεχωριστός χειρισµός κάθε αντικειµενοφόρου πλάκας, ώστε να διασφαλίζεται
ότι οι οργανισµοί που υπάρχουν σε ένα δείγµα δεν µεταφέρονται σε άλλα
δείγµατα. Προετοιµάστε ένα επίχρισµα θετικού µάρτυρα σε χωριστή
αντικειµενοφόρο πλάκα και χειριστείτε την χωριστά.
2. Ετοιµάστε δύο επιχρίσµατα ανά δείγµα ασθενή, όπως περιγράφεται
παρακάτω. (Πολλά δείγµατα περιέχουν ελάχιστα κύτταρα Legionella καθώς
και κύτταρα που είναι ενδεχοµένως ανοµοιόµορφα κατανεµηµένα στο δείγµα.
Ως εκ τούτου, δύο επιχρίσµατα µπορούν να ενισχύσουν την ευαισθησία της
άµεσης δοκιµής.)
α. Ιστός (νωπός ή νωπός κατεψυγµένος)
Επιλέξτε µια περιοχή πυκνής γκρίζας ή ερυθρωπής ίνωσης. Εφαρµόστε
τη µία ή και τις δύο ακόλουθες τεχνικές για την προετοιµασία των
επιχρισµάτων:
• Αναµίξτε τον ιστό µε αποστειρωµένο και απιονισµένο νερό ώστε να
σχηµατιστεί οµογενοποιηµένο µίγµα ιστών 10%. Χρησιµοποιήστε
ξύλινη αποστειρωµένη µπατονέτα και καλύψτε τις κοιλότητες της
αντικειµενοφόρου πλάκας µε λεπτές στρώσεις επιχρίσµατος.
• Κόψτε µια νωπή επιφάνεια ιστού χρησιµοποιώντας λαβίδα ή νυστέρι.
(Εάν ο ιστός είναι πολύ υγρός και δεν επιτρέπει την επίχριση κατά
λεπτά στρώµατα, σκουπίστε τον µε µια αποστειρωµένη γάζα.) Ωθήστε
6
και πιέστε τον ιστό στην αντικειµενοφόρο πλάκα µε τη βοήθεια
λαβίδας, ώστε να γεµίσουν οι κοιλότητες. Εάν προβλέπεται να γίνει
καλλιέργεια, διενεργήστε την προτού προβείτε σε επίχριση.
β. Εξιδρώµατα πνεύµονα (νωπά
ή
νωπά
κατεψυγµένα
πτύελα,
διατραχειακές αναρροφήσεις, βρογχικές πλύσεις, κ.λπ.)
Επιλέξτε ένα ιξώδες τµήµα του δείγµατος που είναι γαλακτώδες ή
αιµατώδες. Ετοιµάστε δύο λεπτές στρώσεις µε τη βοήθεια µιας ξύλινης
αποστειρωµένης µπατονέτας.
γ. Πλευριτικό και εγκεφαλονωτιαίο υγρό
Φυγοκεντρίστε το δείγµα σε δοχείο ασφαλείας επί 30 λεπτά σε 4.000xg
περίπου. Απορρίψτε όλο το δείγµα εκτός από 0,5 ml του υπερκείµενου
υγρού και, στη συνέχεια, δηµιουργήστε νέο εναιώρηµα. Χρησιµοποιήστε
αποστειρωµένη πιπέτα Pasteur για να κάνετε δύο λεπτές στρώσεις.
3.
Αφήστε τα επιχρίσµατα να στεγνώσουν µε τον αέρα * και, στη συνέχεια,
σταθεροποιήστε τα µε θέρµανση περνώντας γρήγορα την αντικειµενοφόρο
πλάκα µέσα από φλόγα.
4.
Τοποθετήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα σε θάλαµο υγρής ατµόσφαιρας και
καλύψτε κάθε επίχρισµα µε φορµαλίνη 10% σε αλατούχο διάλυµα.
Σταθεροποιήστε επί 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου.
5.
Σκουπίστε τη φορµαλίνη και βυθίστε για λίγο την αντικειµενοφόρο πλάκα σε
απιονισµένο νερό.
6.
Τοποθετήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα σε φρέσκο απιονισµένο νερό επί
δύο λεπτά για να αποµακρύνετε τυχόν υπολείµµατα φορµαλίνης.
7.
Αφήστε να στεγνώσει µε τον αέρα* και, στη συνέχεια, προβείτε στη διαδικασία
χρώσης φθορισµού.
* Σηµείωση: Κατά την προετοιµασία των επιχρισµάτων, η διάταξη θέρµανσης της αντικειµενοφόρου
πλάκας σε θερµοκρασία 35-45°C µπορεί να χρησιµοποιείται σε όλα τα στάδια όπου απαιτείται στέγνωµα
στον αέρα.
Προετοιµασία επιχρισµάτων για την επιβεβαίωση της καλλιέργειας
(συνιστάται η χρήση θαλάµου βιολογικής ασφάλειας)
1.
Καθαρίστε και επισηµάνετε µια αντικειµενοφόρο πλάκα µικροσκοπίας
φθορισµού του κιτ MONOFLUOTM .
2.
Αποµακρύνετε µια ευδιάκριτη αποικία ύποπτης L. pneumophila από την
πλακέτα καλλιέργειας µε έναν βακτηριολογικό κρίκο. Εναιωρήστε τα βακτήρια
σε δοκιµαστικό σωλήνα που περιέχει πολύ µικρή ποσότητα αλατούχου
διαλύµατος που περιέχει 1 % φορµαλίνη για να αποκτήσετε θολερότητα
ισοδύναµη µε το πρότυπο McFarland αριθ.1.
7
3.
Χρησιµοποιώντας µια πιπέτα Pasteur, απλώστε 2-3 σταγόνες εναιωρήµατος
σε µια κοιλότητα της αντικειµενοφόρου πλάκας και, στη συνέχεια, αφαιρέστε
τις σταγόνες µε την ίδια πιπέτα Pasteur. Στην κοιλότητα θα παραµείνει ένα
λεπτό στρώµα οργανισµών. Επαναλάβετε τα βήµατα 1-3 για να
προετοιµάσετε χωριστό επίχρισµα για κάθε ύποπτη αποικία,
χρησιµοποιώντας διαφορετικές αντικειµενοφόρες πλάκες.
4.
Αφήστε τα επιχρίσµατα να στεγνώσουν µε τον αέρα * και, στη συνέχεια,
σταθεροποιήστε τα µε θέρµανση περνώντας γρήγορα την αντικειµενοφόρο
πλάκα µέσα από φλόγα. Προβείτε στη διαδικασία χρώσης φθορισµού.
Προετοιµασία επιχρίσµατος για θετικό µάρτυρα
1.
Καθαρίστε και επισηµάνετε µια αντικειµενοφόρο πλάκα µικροσκοπίας
φθορισµού του κιτ MONOFLUOTM. Σηµείωση: Η επεξεργασία του
επιχρίσµατος για τον θετικό µάρτυρα πρέπει να πραγµατοποιείται χωριστά
από τα επιχρίσµατα που χρησιµοποιούνται για τις δοκιµές των ασθενών.
2.
Ανακινήστε τη φιάλη που περιέχει το αντιγόνο-θετικό µάρτυρα για υποβάλετε
τα κύτταρα σε εναιώρηση. Προσθέστε 1-2 σταγόνες εναιωρήµατος σε µια
κοιλότητα της αντικειµενοφόρου πλάκας και, στη συνέχεια, αποµακρύνετε το
υγρό από την κοιλότητα µε µια πιπέτα Pasteur και απορρίψτε.
3.
Αφήστε τα επιχρίσµατα να στεγνώσουν µε τον αέρα * και, στη συνέχεια,
σταθεροποιήστε τα µε θέρµανση περνώντας γρήγορα την αντικειµενοφόρο
πλάκα µέσα από φλόγα. Προβείτε στη διαδικασία χρώσης φθορισµού.
* Σηµείωση: Κατά την προετοιµασία των επιχρισµάτων, η διάταξη θέρµανσης της αντικειµενοφόρου
πλάκας σε θερµοκρασία 35-45°C µπορεί να χρησιµοποιείται σε όλα τα στάδια όπου απαιτείται στέγνωµα
στον αέρα.
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ΧΡΩΣΗΣ
∆ιαδικασία χρώσης φθορισµού
1.
Επιστρώστε επαρκή ποσότητα αντιδραστηρίου χρώσης Anti-Legionella
pneumophila του κιτ MONOFLUOTM ώστε να καλυφθεί το δείγµα (1-2
σταγόνες, ανάλογα µε τον τύπο του δείγµατος, και εντός των ορίων της
κοιλότητας).
2.
Τοποθετήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα σε θάλαµο υγρής ατµόσφαιρας και
επωάστε επί 30 λεπτά σε θερµοκρασία 35 έως 37°C. Σηµείωση: Επωάστε την
αντικειµενοφόρο πλάκα του θετικού µάρτυρα και την αντικειµενοφόρο πλάκα
(ή πλάκες) του δείγµατος σε χωριστό θάλαµο υγρής ατµόσφαιρας.
3.
Αποµακρύνετε το πλεονάζον αντιδραστήριο χρώσης µε αναρρόφηση ή µε
παρεµφερή µέθοδο. Βυθίστε για λίγο την αντικειµενοφόρο πλάκα σε
απιονισµένο νερό για να ξεπλυθεί. Επαναλάβετε τη διαδικασία άλλες δύο
φορές σε προσφάτως απιονισµένο νερό, για 2-10 λεπτά κάθε φορά.
8
Σηµείωση: Μετά από κάθε χειρισµό της αντικειµενοφόρου πλάκας (ή πλακών)
θετικού µάρτυρα, πλένετε τα χέρια σας ή αλλάζετε γάντια.
4.
Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να στεγνώσουν µε τον αέρα.
5.
Προσθέστε 1-2 σταγόνες του µέσου στερέωσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα
και τοποθετήστε καλυπτρίδα.
ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΩΝ ΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΩΣΗ
ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟΦΟΡΩΝ ΠΛΑΚΩΝ
• Άµεση δοκιµή: Παρατηρήστε κάθε επίχρισµα χωριστά µε αντικειµενικό
φακό µεγέθυνσης 20-25x. Εάν παρατηρηθούν φθορίζοντα στίγµατα,
χρησιµοποιήστε φακό µεγέθυνσης 63-100x για να προσδιορίσετε τη
µορφολογία των κυττάρων. Βλέπε το τµήµα Περιορισµοί της ∆ιαδικασίας,
σελίδα 9.
• ∆οκιµή επιβεβαίωσης της καλλιέργειας: Παρατηρήστε κάθε επίχρισµα
χωριστά µε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 63-100x.
• Προβείτε σε αναγνώσεις των αντικειµενοφόρων πλακών εντός αρκετών
ωρών από τη χρώση. Εάν θέλετε, µπορείτε να φυλάτε τις
αντικειµενοφόρους πλάκες κατά τη διάρκεια της νύχτας σε σκοτεινό µέρος
και σε θερµοκρασία 2-8°C, ή για µεγαλύτερα διαστήµατα σε σκοτεινό µέρος
και σε θερµοκρασία -20°C. Οι αντικειµενοφόρες πλάκες που φυλάσσονται
σε χαµηλές θερµοκρασίες πρέπει να σταθεροποιηθούν σε θερµοκρασία
δωµατίου πριν από την ανάγνωση, διαφορετικά το δείγµα θα επισκιαστεί
λόγω της συµπύκνωσης.
ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ
Χρησιµοποιείτε εναιώρηµα αντιγόνου θετικού µάρτυρα για να επιβεβαιώνετε
την δραστικότητα του αντιδραστηρίου χρώσης σε καθηµερινή βάση ενώ
διενεργείτε τη δοκιµή. Η διαδικασία της δοκιµής περιγράφεται στη µέθοδο
επεξεργασίας του θετικού µάρτυρα.
Χρησιµοποιείτε καλλιέργεια γνωστού οργανισµού gram-αρνητικού ως
αρνητικό µάρτυρα, όπως το Ε. coli. Για την επιβεβαίωση της καλλιέργειας,
παρασκευάστε εναιώρηµα όπως περιγράφεται και ακολουθήστε τη διαδικασία
της δοκιµής.
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ∆ΟΚΙΜΗΣ
Η L. pneumophila που έχει υποβληθεί σε χρώση θα έχει την εµφάνιση ενδο- ή
εξωκυτταρικών φθορίζοντων ραβδίων σε χρώµα πράσινου µήλου ή τη µορφή
κοκκοβάκιλλων. Όταν οι οργανισµοί έχουν σκούρο ερυθρό ή θαµπό χρυσαφί
χρώµα, τότε τα δείγµατα είναι αρνητικά.
9
Τα βακτήρια L. pneumophila είναι πλειόµορφοι οργανισµοί και µπορεί να
έχουν τη µορφή πολύ κοντών κοκκοβάκιλλων έως και µακριών νηµατωδών
ραβδίων. Η αντιβιοτική θεραπεία µπορεί να οδηγήσει σε οργανισµούς µε µη
χαρακτηριστική µορφολογία.
Η µορφολογία και τα χαρακτηριστικά των θετικών οργανισµών ως προς τη
χρώση οµοιάζουν µε τον θετικό µάρτυρα της L. pneumophila.
Σε µια δοκιµή επιβεβαίωσης της καλλιέργειας, η πολύ µεγάλη παρουσία
κυττάρων στο επίχρισµα µπορεί να µειώσει σηµαντικά την ένταση της χρώσης.
Εφόσον απαιτείται, εξετάστε τα εξωτερικά χείλη της κοιλότητας ή τα τµήµατα του
επιχρίσµατος που περιέχουν λιγότερα κύτταρα.
Οι συνθήκες καλλιέργειας, και ειδικά η ηλικία της καλλιέργειας, µπορεί να
οδηγήσουν σε διαφοροποίηση των κυττάρων ως προς την ένταση του
φθορισµού. Είναι πιθανό να µην είναι οµοιόµορφα χρωµατισµένη ολόκληρη η
επιφάνεια ορισµένων κυττάρων. Σε κάθε περίπτωση πάντως τα θετικά
χρωµατισµένα κύτταρα φθορίζουν µε τρόπο που υποδεικνύει συγκεκριµένη
κυτταρική µορφολογία. Η παρουσία L. pneumophiIa στις καλλιέργειες
επιβεβαιώνεται βάσει της διακριτής εµφάνισης των αποικιών, της µορφολογίας
των φθορίζοντων οργανισµών και των αποτελεσµάτων της χρώσης Gram.
Η συνιστώµενη µέθοδος για την αναφορά των αποτελεσµάτων παρουσιάζεται
στον πίνακα 2 που ακολουθεί.
Πίνακας 2: Συνιστώµενα κριτήρια για την αναφορά των αποτελεσµάτων
Αποτελέσµατα
δοκιµής
άµεσης
Προτεινόµενη αναφορά
FA θετικό
>5 φθορίζοντα
βακτήρια/αντικειµενοφόρος πλάκα 2
κοιλοτήτων
>1-5 φθορίζοντα βακτήρια/ αντικειµενοφόρος πλάκα 2 κοιλοτήτων
∆εν
ανιχνεύτηκαν
φθορίζοντα
Αναφέρατε τον αριθµό των χρωµατισµένων κυττάρων. Ζητήστε
δεύτερο δείγµα εάν απαιτείται
κλινικά. Επιβεβαιώστε µε την
καλλιέργεια.
FA αρνητικό
βακτήρια
Σε πολλά δείγµατα, όπως τα δείγµατα πτυέλων, σπάνια υπάρχουν
πολυάριθµοι οργανισµοί. Συνεπώς, εάν έχει ληφθεί µέριµνα για την αποφυγή
µεταφοράς κυττάρων Legionella, η παρατήρηση ακόµη και ενός µόνο τυπικής
µορφολογίας κοκκοβάκιλλου µε φωτεινό φθορίζον κυτταρικό τοίχωµα θεωρείται
σηµαντική.
10
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑΣ
Ένα αρνητικό αποτέλεσµα δεν αποκλείει την πιθανότητα µόλυνσης του
ασθενούς από Legionella pneumophiIa ή άλλα είδη Legionella. Η συλλογή και η
προετοιµασία του δείγµατος αποτελούν κρίσιµα στάδια της διαδικασίας δοκιµής.
Η άκαιρη συλλογή δείγµατος κατά τη διάρκεια της ασθένειας, η συλλογή
δείγµατος µε ακατάλληλη µέθοδο, ο µη ενδεδειγµένος χειρισµός του δείγµατος ή
ο κακός χειρισµός των παρεχόµενων αντιδραστηρίων µπορεί να οδηγήσουν
στην αστοχία ανίχνευσης της Legionella pneumophila. Η διάγνωση θα πρέπει να
γίνεται σε συνδυασµό µε τα κλινικά συµπτώµατα.
Στην περίπτωση περιορισµένου αριθµού οργανισµών (StaphyIococcus
aureus και ορισµένα είδη Lactobacillus), ο φθορισµός µπορεί ενίοτε να
παρατηρείται λόγω µη ανοσοδέσµευσης.
Χρησιµοποιείτε µόνο νωπά ή κατεψυγµένα δείγµατα. Τα δείγµατα που έχουν
υποβληθεί σε ιστοπαθολογική επεξεργασία και τα υλικά που συντηρούνται µε
φορµαλίνη είναι ακατάλληλα για την παρούσα δοκιµή.
Ορισµένα δείγµατα πυωδών πτυέλων ενδέχεται να παρουσιάζουν αυξηµένη
χρώση υπόβαθρου και µη ανοσοδέσµευση στα κύτταρα. Τα δείγµατα που
παρουσιάζουν αυτά τα χαρακτηριστικά πρέπει να επαληθεύονται µε καλλιέργεια.
ΕΠΙ∆ΟΣΕΙΣ
Το αντιδραστήριο χρώσης Anti-Legionella pneumophila του κιτ
MONOFLUOTM είναι ειδικό για τη L. pneumophila και ανιχνεύει όλες τις γνωστές
οροοµάδες του οργανισµού. Βάσει των στοιχείων που αναφέρονται παρακάτω
σχετικά µε τη φθορίζουσα χρώση, η ευαισθησία και η ειδικότητα του
αντιδραστηρίου χρώσης Anti-Legionella pneumophila του κιτ MONOFLUOTM που
προκύπτει είναι της τάξεως του 100% σε άµεσα δείγµατα και καλλιέργειες.
Επιβεβαίωση της καλλιέργειας
Για την αξιολόγηση της επίδοσης της δοκιµής αντισωµάτων ανοσοφθορισµού
TM
Legionella MONOFLUO
διενεργήθηκε τυφλή δοκιµή σε 50 γνωστές
καλλιέργειες. Το αντιδραστήριο ταυτοποίησε ορθά και τις 19 καλλιέργειες της
Legionella pneumophila ενώ ήταν αρνητικό στους υπόλοιπους 31 οργανισµούς.
Πολύ αχνός φθορισµός: (1 + φθορισµός) λόγω µη ανοσοδέσµευσης
παρατηρήθηκε σε µία καλλιέργεια Staphylococcus aureus και σε µία καλλιέργεια
Lactobacillus breνis. Τα αποτελέσµατα αυτά καταχωρήθηκαν ως αρνητικά λόγω
αχνής χρώσης. Οι εν λόγω οργανισµοί διακρίνονται επίσης από τη µορφολογία
των φθοριζόντων οργανισµών, από τη µορφολογία των αποικιών στις πλακέτες
της καλλιέργειας και από τα αποτελέσµατα της χρώσης Gram.
Άµεσα δείγµατα
Για την αξιολόγηση της επίδοσης της δοκιµής αντισωµάτων ανοσοφθορισµού
Legionella MONOFLUOTM διενεργήθηκε τυφλή δοκιµή σε 54 ανθρώπινα δείγµατα,
11
νωπά-κατεψυγµένα δείγµατα και δείγµατα της κατώτερης αναπνευστικής οδού,
24 εκ των οποίων είχαν προηγουµένως ταυτοποιηθεί ως θετικά και 30 ως
αρνητικά για τη L. pneumophila. Κατά τη διάρκεια της µελέτης, 25 εξ αυτών των
δειγµάτων ταυτοποιήθηκαν ως θετικά και 29 ως αρνητικά µε τη δοκιµή
MONOFLUOTM. Ένα δείγµα ενδοτραχειακής αναρρόφησης, το οποίο προέκυψε
αρνητικό βάσει της εξέτασης DFA και των αποτελεσµάτων της καλλιέργειας κατά
την αρχική δοκιµή το 1980, αποδείχτηκε σαφώς θετικό µε τη δοκιµή
ΜΟΝΟFLUΟΤΜ καθώς και µε δύο πολυκλωνικά αντιδραστήρια. Παρά την αποτυχία
επανειληµµένων αποπειρών καλλιέργειας, µια χρώση Gimenez που διενεργήθηκε
το 1980 έδειξε άτυπες µορφές. Ως εκ τούτου, το εν λόγω δείγµα θεωρήθηκε
αληθώς θετικό.
12
REFERENCES / BIBLIOGRAPHIE / REFERENCIAS /
LITERATUR / BIBLIOGRAFIA / REFERENCER / REFERENSER
1. Broome CV: Epidemiologic assessment of methods of transmission of
legionellosis. Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 255:52-57,1983.
2. Meyer RD: Legionella infections: a review of five years of research.
Reviews of Infectious Diseases 5:258-278, 1983.
3. Wilkinson H: Status of serologic tests for Legionella antigen and antibody at Centers for Disease Control. Zbl. Bakt. I. Hyg. Abt. Orig. A
255:3-7,1983.
4. Winn WC, Myerowitz RL: The pathology of Legionella pneumonias.
Human Pathology 12:401-422,1981.
rR
Fo
5. Fraser DW, Tsai TR, Orenstien W, et al: Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297:11891197,1977.
efe
6. Fraser DW: Legionella pneumophila (Legionnaire’s Disease), p. 18041812. In G.L. Mandell, R.G. Douglas, J.E. Bennett (ed.), Principles and
practices of infectious diseases. John Wiley and Sons, New
York,1979.
nc
re
7. Broome CV: Pneumonia due to Legionella species, p. 16-35. Seminars
in infectious disease, Vol. V, 1983.
eU
8. Edelstein PH, Beer KB, Sturge JC, Watson AJ, Goldstein LC: Clinical
utility of a monoclonal direct fluorescent reagent specific for Legionella
pneumophila. Comparative study with other reagents. J. Clin. Microbiol. 22:416-418, 1985.
se
9. Gosting LH, Cabrian K, Sturge JC, Goldstein LC: Monoclonal antibody
to a species-specific antigen of Legionella pneumophila. J. Clin. Microbiol. 20:1031-1035, 1984.
On
ly
10.Edelstein PH: Legionnaires’ disease laboratory manual. National
Technical Information Service, Publication #PB84-156827, U.S. Dept. of
Commerce, Springfield, Virginia,1984.
11.Edelstein PH: Culture diagnosis of Legionella infections.
Hyg. I. Abt. Orig. A 255:96-101, 1984.
84
Zbl. Bakt.
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
ly
On
504127 back cover.fm Page 0 Friday, September 12, 2003 11:54 AM
Bio-Rad
Laboratories
For Customer Orders and Technical Service Call:
1-800-2-BIO-RAD
se
eU
nc
re
efe
rR
Fo
Website: www.bio-rad.com
Bio-Rad Laboratories Main Office:
4000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547
Ph. (510) 724-7000, Fx. (510) 741-5824
Also in:
Australia - Regents Park, Ph. 61-2-9914-2800,
Fx. 61-2-9914-2888
Austria - Vienna, Ph. 43-1-877-8901, Fx. 43-1-876-5629
Belgium - Nazareth, Ph. 32-9-385-5511, Fx. 32-9-385-6554
Canada - Montreal, Ph.1-514-334-4372,Fx. 1-514-334-4415
China - Beijing, Ph. 86-10-6205-1850, Fx. 86-10-6205-1876
Denmark - Copenhagen, Ph. 45-39-17-99-47,
Fx. 45-39-27-16-98
Finland - Espoo, Ph. 358-9-804-22-00, Fx. 358-9-804-11-10
France - Marnes-la-Coquette , Ph. 33-1-4795-6000
Fx. 33-1-4741-9133
Germany - Munich, Ph. 49-89-318840, Fx. 49-89-318-84100
Hong Kong - Kowloon, Ph. 852-2789-3300,
Fx. 852-2789-1257
India - New Delhi, Ph. 91-11-460-3676, Fx. 91-11-461-0765
Israel - Rishon Le Zion, Ph. 972-3-9514127,
Fx. 972-3-9514129
Italy - Milan, Ph. 39-02-216091, Fx. 39-02-21609-399
Japan - Tokyo, Ph.81-3-5811-6290, Fx. 81-3-5811-6282
Korea - Seoul, Ph. 82-2-3473-4460, Fx. 82-2-3472-7003
Florida - Miami, Ph. 305-894-5950, Fx. 305-894-5960
Mexico - Mexico D.F., Ph. 525-514-2210, Fx. 525-514-2209
The Netherlands - Veenendaal, Ph. 31-318-540666,
Fx. 31-318-542216
New Zealand - Auckland, Ph. 64-9-415-2280,
Fx. 64-9-415-2284
Russia - Moscow, Ph. 7-501-721-14-00, Fx. 7-095-979-98-56
Singapore, Ph. 65-272-9877, Fx. 65-273-4835
Spain - Madrid, Ph. 34-91-590-5200, Fx. 34-91-590-5211
Sweden - Sundbyberg, Ph. 46-8-627-50-00,
Fx. 46-8-627-54-00
Switzerland - Glattbrugg, Ph. 41-61-717-95-55,
Fx. 41-61-717-95-50
United Kingdom - Hemel Hempstead, Ph. 44-181-328-2000,
Fx. 44-181-328-2550
ly
On
Revised September 2003
504127