Dicembre 2009
Effect of folic acid supplementation
in a young thalassaemia intermedia patient
with folate deficiency and subfertility
Vincenzo De Sanctis, Maurice Katz1, Giovanna La Fauci, Maria Rita Govoni, Amalia Carpino 2
Pediatric and Adolescent Unit 1 – St Anna Hospital, Ferrara – Italy
1
Obstetric and Gynaecology – University College London – London, U.K.
2
Department of Cell Biology – Faculty of Pharmacy – University of Calabria – Arcavacata of Rende – Italy
S u m m a ry
A 18.6-year-old a boy with !-thalassaemia intermedia, was referred for haematologic, endocrine evaluation and potential fertility status. The patient had a spontaneous full pubertal development. Semen analysis was compatible with moderate oligozoospermia (mean 25.2 millions spermatazoa per ejaculate). Zinc in seminal plasma was normal. Serum folate
level on two separate occasions were low. The patient was treated with folic acid (5 mg/daily, orally) for one year. After
treatment the serum folate level returned in normal range and total sperm count increased to 108 millions. In the following 2 years the folic acid supplementation was reduced to 2.5 mg/day. 3 years later, total sperm count was 134.4 millions.
The increased sperm concentration, after folic acid treatment, was not the result of hormonal changes. We report for the
first time that folic acid deficiency may be an additional cause of subfertility in patients with thalassaemia.
Key words: thalassaemia intermedia, spermatogenesis, folate deficiency.
Direttore Scientifico
Vincenzo De Sanctis ( Fe r r a r a )
Comitato di Redazione
Vincenzo Caruso (Catania), Paolo Cianciulli (Roma), Maria Concetta Galati (Catanzaro),
Maria Rita Gamberini ( Fe r r a r a ),Aurelio Maggio ( Pa l e r m o )
Comitato Editoriale
Maria Domenica Cappellini (Milano), Marcello Capra (Palermo), Gemino Fiorelli (Milano), Alfio La Ferla (Catania), Turi Lombardo (Catania),
Carmelo Magnano ( C a t a n i a ),Roberto Malizia (Palermo), Giuseppe Masera (Monza), Lorella Pitrolo( Pa l e r m o ), Luciano Prossomariti ( N a p o l i ),
Michele Rizzo( C a l t a n i s e t t a ),Calogero Vullo( Fe r r a r a )
Segretaria di Redazione
Gianna Vaccari (Ferrara)
International Editorial Board
A. Aisopos (Athens, Greece), M. Angastiniotis (Nicosia, Cyprus), Y. Aydinok( I z m i r, Turkey), D. Canatan (Antalya, Turkey),
S. Fattoum (Tunis, Tunisia), C. Kattamis (Athens, Greece), D. Malyali (Istanbul, Turkey), P. Sobti (Ludhiana, India), T. Spanos (Athens, Greece)
Emothal
Rivista Italiana di Medicina dell’Adolescenza - Volume 7, n. 3, 2009
Thalassaemia intermedia (TI) is a descriptive term
for the different forms of thalassaemia with clinical
manifestations between the two extremes of transfusion-dependent thalassaemia major (TM) and
asymptomatic ß-thalassaemia trait (1).
Three main factors are responsible for clinical
sequelae of TI: ineffective erythropoiesis, chronic
anaemia and iron overload (2).
A possible consequence of increased erythropoiesis
is folic acid deficiency (3, 4). The classical clinical
and laboratory manifestations of folate deficiency
a re: macrocytic magaloblastic anaemia, neural tube
defects and cardiovascular disease (5-8). Recently,
a diminished folate status has been associated to
enhanced neoplastic risk (9) and to a negative
effects on reproduction (10-12). The current paper
reports a moderate oligoazoospermia in a young
adult with TI and folic acid deficiency. Seminal
parameters improved after folic acid supplementation and were not the results of hormonal alterations.
Case history
The patient, a 18.6-year-old Italian boy with ßthalassaemia intermedia, was re f e r red to
Thalassaemia Centre of Pediatric and Adolescent
Unit of St. Anna Hospital of Ferrara (Italy) for
haematologic, endocrine evaluation and potential fertility status.
His height was 163 cm (< 3rd percentile) and
weight 44.5 kg (< 3rd percentile). The patient had
a spontaneous full pubertal development (pubic
hair: Tanner’s stage 5, testicular volume 15 ml).
Varicocele was not clinically evident.
Splenectomy was performed at the age of 2 years
because of splenomegaly and severe anaemia,
over the ensuing years he required periodic
transfusions for asymptomatic anaemia (13).
From the age of 12 years he received irregular
i ron chelation therapy with desferrioxamine
mesylate by subcutaneous infusion, for 8-9
hours per day, in doses of 20 mg/kg/day (2-3
times/week).
Pituitary-gonadal function,
seminal analysis
and assay procedures
Pituitary-gonadal function was evaluated in the
basal state, using commercial kits, by chemilumi-
nescence assay for luteinizing hormone (LH), follicle-stimulating hormone (FSH) and total testosterone (TT) (Advia Centour, Bayer corporation)
and by radioimmunoassay (RIA) for free-testosterone (FT) (DPC, Los Angeles, CA).
Semen samples were collected in a sterile container by masturbation after an abstinence period of a
least 3 days. Samples were analyzed after liquefaction according to WHO criteria (14). The parameters assessed included volume of ejaculate, total
sperm count, motility and morphology. The total
sperm count was obtained by multiplying the
sperm concentration by the volume of ejaculate.
Normal values for volume, sperm concentration,
sperm motility and morphology are 2-6 ml, ≥ 20
millions/ml, ≥ 40% and ≥ 30%, respectively.
Subfertility was defined as a sperm concentration
between 5 and 20 x 106 spermatozoa/ml. The
cut-off value of 20 millions spermatozoa/ml
semen was deducted from the WHO guidelines
for fertility (15).
Zinc analysis in seminal plasma was performed
by atomic absorption spectropotometry (Pabish
Hitachi, Atomic Absorption Spectrophotometer
Model Z-1800).
Iron overload was assessed by serum ferritin levels determined by immunoradiometric assay
(IRMA) from BIO-RAD (Milan, Italy) with a calibration range of 10-2500 ng/ml).
Serum folate concentrations were measure d
using competitive assay using natural folate
binding protein and electrochemical luminescence on magnetically captured microparticles
streptavidin-coated (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Germany; normal range 4.6-18.7
ng/ml).
According to Oner et al. (15) serum folate level was
classified as adequate (≥ 6 ng/ml), marginal low
(from 3 to 5.9 ng/ml) or deficient (< 3 ng/ml).
Results
The blood consumption, expressed in ml/kg of
packed red cells (13), in the last year was 63
ml/kg. The soluble receptor of transferrin was 6
times higher than the upper normal value and
the serum ferritin level was in the normal range
(245 µg/l; normal range: 21-385 µg/l).
Serum folate level in two separate occasions were
low (Table 1), thyroid function (FT4 and TSH)
was normal, antitransglutaminase antibodies
were negative and IgA was in the normal range.
24
Emothal
V. De Sanctis, M. Katz, G. La Fauci, M.R. Govoni, A. Carpino
Effect of folic acid supplementation in a young thalassaemia intermedia patient with folate deficiency and subfertility
Table 1. Sperm, biochemical and hormonal parameters before and after folic acid treatment.
Pre-treatment
Post-treatment
(months)
(months)
0
4
12
24
36
3.7
4
5
8
4.5
5
4.2
24
20
18.5
32
32
108
100
134.4
Motility (%)
Abnormal forms (% of normal)
48
50
45
42
48
65
62
55
60
57
3.8
--
4.6
4.3
4.6
3.3
--
5.1
3.6
4.2
487
--
519
399
560
19.1
--
20.1
245
--
310
(normal range: 14-39 U/l)
26
--
17
Serum folate (ng/ml)
3.6
--
19.3
(normal range: 4.6-18.7 ng/ml)
3.8
Sperm parameters
Volume of ejaculate (ml)
Spermatozoa concentrations (millions/ml)
Total sperm count (millions)
Biochemestry
LH (mIU/ml)
(normal range: 1.7-8.6 mIU/ml)
At the last observation, 3
years later, the total sperm
count was 134.4 millions.
All other seminal parameters were in the normal
range.
The increased sperm concentration, after folic acid
t reatment, was not the
result of a lower production of prostate or seminal
fluid
production
as
obtained by multiplying
the sperm concentration
by the volume of ejaculate.
FSH (mIU/ml)
(normal range: 1.5-12.4 mIU/ml)
Total testosterone (ng/dl)
(normal range: 280-800 ng/dl)
Free testosterone (pg/ml)
(normal range: 8.7-54.7 pg/ml)
Serum ferritin (µg/l)
(normal range: 21-385 µg/l)
Serum alanine transaminase (U/l)
In the table 1 the baseline characteristics of the
endocrine and semen parameters are depicted.
Semen analysis was compatible with moderate
oligozoospermia (mean 25.2 millions spermatozoa per ejaculate; mean 0-4 months).
Semen volume, motility and morphology were
normal, according WHO criteria (15).
Zinc in seminal plasma was in the normal range
(400 µg/ejaculate; normal values: 312-1100
µg/ejaculate).
Follow-up
The patient was treated with folic acid (5 mg/
daily, orally). After treatment for one year the
serum folate level was in the normal range (19.3
ng/ml) and the total sperm count increased to
108 millions.
In the following two years the folic acid supplementation was reduced to 2.5 mg/day.
Total and free testosterone levels remained substantially stable during the treatment (Table 1).
25
Discussion
In a previous study we
documented that the
-22.3
sperm count was normal in
66% of patients with TM
374
180
and 80% with TI. Sperm
motility was normal in
23
26
81% of patients with TM
17.9
-and 70% of patients with
TI. Sperm morphology was
normal in both group of
patients.
No correlation was observed in our patients
between ferritin concentrations and sperm count,
LH and FSH, but a strong correlation was found
with age, TT and FT (16). In the present report,
oligozoospermia was not secondary to delayed
puberty, hypothalamic-pituitary-gonadal dysfunction, zinc deficiency, iron overload or
overzealous chelation therapy (16). Therefore we
suspected a possible influence of folate deficiency, secondary to increased erythropoiesis, on
sperm parameters.
Folate is important for synthesis of DNA which
plays an important role in germ cell development
and therefore for reproduction (10, 11). It has
also been reported that folic acid inhibits lipid
peroxidation (10).
Rat fed with a folic-acid deficient diet show a
reduction in sperm count (17) and in humans a
positive effect on spermatogenesis and sperm
parameters has been reported by Ebish et al. (11)
and Bentivoglio et al. (18).
In conclusion, we report for the first time that
folic acid deficiency may be an additional factor
Emothal
Rivista Italiana di Medicina dell’Adolescenza - Volume 7, n. 3, 2009
responsible for subfertility in patients with thalassaemia. From the above-mentioned pharmacological interventions, folic acid supplementation seems to have a positive effect on sperm
parameters.
These observations stress the attention on the
prevention of folic acid deficiency in patients
with thalassaemia intermedia and stimulate the
need for further researches on fertility disorders
in thalassaemia.
References
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2. El Rassi F, Cappellini MD, Inati A, Taher A. Beta-thalassemia intermedia: an overview. Pediatr Ann 2008;
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Tartara R. Behaviour of blood folate in children with thalassaemia major under transfusion therapy and in thalassaemia trait. Acta Vitaminol Enzymol 1984; 6:183-188.
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8. Blount BC, Mack MM, Wehr CM, MacGregor JT, Hiatt RA,
Wang G, Wickramasinghe SN, Everson RB, Ames BN.
Folate deficiency causes uracil misincorporation into human
DNA and chromosome breakage: Implications for cancer
and neuronal damage. Proc Natl Acad Sci 1997; 94:32903295.
9. F o rges J, Monner-Barbarino P, Alberto JM, GueantRodriguez RM, Daval JL, Gueant JL. Impact of folate and
homocysteine metabolism on human reproductive health.
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10. Ebisch IMW, Thomas CMG, Peters WHM, Braat DDM,
Steegers-Theunissen RPM. The importance of folate, zinc
and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility. Hum Reprod Update 2007; 13:163-174.
11. Ebisch IMW, Pierik FH, De Jong FH, Thomas MG, SteegersTheunissen RPM. Does folic acid and zinc sulphate intervention effect endocrine parameters and sperm characteristics in men? Int J Androl 2006; 29:339-34.
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Lindemans J, Laven JS, Macklon NS, Steegers EA, SteegersTheunissen RP. Low folate in seminal plasma is associated
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mucus interaction. Cambridge University Press. New York
1999.
15. Oner N, Vatansever U, Karasalihoglu S, Ekuklu G, Celtik
C, Biner B. The prevalence of folic acid deficiency among
adolescent girls living in Edirne, Turkey. J Adolesc Health
2006; 38:599-606.
16. Katz M, De Sanctis V, Vullo C, Wonke B, Ughi M, Pinamonti
A, Sprocati M, Gamberini MR, Bagni B. Spermatogenesis in
patients with ß-thalassaemia major and intermedia. In:
Endocrine disorders in thalassaemia. S. Andò, C. Brancati
Eds. Springer-Verlag. Berlin 1995, pp. 19-24.
17. Mayr CA, Ingersoll R, Wallock LM. Folate levels and the
effects of folate deficiency in the reproductive organs of male
rats. FASEB J 1999; 13:A229.
18. Bentivoglio G, Melica F, Cristoforoni P. Folinic acid in the
treatment of human male infertility. Fertil Steril 1993;
60:698-701.
Correspondence to:
Dr. Vincenzo De Sanctis
Pediatric and Adolescent Unit
St Anna Hospital
Corso Giovecca, 203 – 44121 Ferrara (Italy)
e-mail: [email protected]
26
In questo numero di Emothal viene riportata
la terza parte dei posters presentati
al V Congresso Nazionale SO.S.T.E.-S.I.T.E.,
che si è tenuto a Cagliari dal 16 al 18 Ottobre 2008
Cardiovascular diseases in
B-thalassemia intermedia: involevement
of cholesterol and iron metabolism
Cocco P.L.1, Angius F.1, Abete C.1, Mulas C.1,
Demuro G.1, Borgia A.2, Vacquer S.3, Carta M.P.3,
Dessì S.1, Lai M.E.3
University of Studies of Cagliari
Cardiovascular complications represent the primary cause of mortality and one of the main
causes of morbidity both in thalassemia major
(TM) and in beta thalassemia intermedia (!-TI).
In TM, iron overload is considered the main
cause of these complications. However, cardiovascular involvement in !-TI, is quite different.
Patients live longer and are usually transfusionindependent, at least for the first decades of life.
Several factors have been reported to interfere in
the pathophysiology of cardiovascular abnormalities in !-TI patients. However, at present, no single factor emerges as the major responsible for
atherosclerotic risk in these patients. In the present study total and HDL-cholesterol (TC and
HDL-C) and hepcidin levels in serum and cholesterol esters (CE) content in peripheral blood
mononuclear cells (PBMCs) were evaluated in 15
!-TI subjects. Patients were aged 18 to 54 years,
and compared with age-matched healthy controls. In addition, mRNA levels of genes involved
in cholesterol homeostasis and of hepcidin, IL1" and tumor necrosis factor alpha (TNF-") were
also evaluated in PBMCs of these patients. !-TI
had significantly lower serum total and HDL-C as
well as lower serum hepcidin levels (mean
134,34 ± 28.69 ng/ml) compared with controls
(mean 163.68 ± 16.32 ng/ml). Lower levels in
HDL-C in !-TI were associated with higher levels of erythropoietin as well as ferritinemia.
Interestingly, with regression analysis, serum
HDL-C correlated negatively with the CE content
determined by oil red O staining in PBMCs (Oil
red O positivity = 0,92 controls; and 2,00 !-TI).
Significant changes were also found in the
expression of genes involved in the CE cycle,
with higher mRNA levels of acyl-coenzyme A
cholesterol acyltransferase (ACAT-1) and LDL-
receptor, and decreases sterol regulatory element
binding protein-2 (SREBP2), neutral cholesterol
ester hydrolase (nCEH) and ATP binding cassette-A (ABCA1), a metabolic pattern which has
been repeatedly associated with atherosclerosis.
Hepcidin mRNA levels were reduced in !-TI pts
when compared to the age matched controls.
Nevertheless, hepcidin mRNA levels were significantly lower in !-TI pts as compared to TM pts
receiving regular blood transfusions. Among !-TI
pts lower hepcidin mRNA levels were associated
with lower levels of IL-". TNF-" levels did not
differ between patient and controls. Our results
could help explaining the increased incidence of
atherogenic vascular diseases often reported in !TI patients. They also suggest that levels of hepcidin and IL-1-" in PBMCs could possibly be
estimated as a simple and sensitive diagnostic
tools for the detection of iron overload. In addition, the analysis of the expression of genes
involved in the CE and iron cycles may represent
a sensitive index to evaluate potential atherogenicity in !-TI patients.
Studio su alcuni polimorfismi del cluster
!-globinico in pazienti !-talassemici
Cocco E.1, Sannai M., Pirastru M., Multineddu C.,
Mereu P., Mulas G.1, Manca L., Masala B.
1
AS.L. n° 2 Centro Trasfusionale e di Microcitemia
Dipartimento di Scienze Fisiologiche, Biochimiche e Cellulari Università di Sassari
I principali meccanismi molecolari che possono
attenuare la severità clinica dei pazienti talassemici !° omozigoti o composti eterozigoti di tipo
major (TM) originando fenotipi ematologici lievi
non dipendenti da trasfusioni (TI) sono la coesistenza di delezioni o mutazioni gravi a carico dei
geni " e/o di determinanti genetici che incrementano la sintesi di HbF nell’adulto. In entrambi i casi, il risultato è la riduzione dello squilibrio
globinico "/non-".
Recenti osservazioni suggeriscono una possibile
correlazione fra la gravità della !-talassemia associata ad altre variabili genetiche e la presenza di
Emothal
Rivista Italiana di Medicina dell’Adolescenza - Volume 7, n. 3, 2009
elevati livelli di emoglobina fetale (HbF). A
seconda della particolare configurazione di tali
variabili in cis al cluster !-globinico il fenotipo
complessivo (clinico, ematologico, eritrocitario)
del paziente risulta migliorato (1-3). Queste sono
identificabili in motifs e polimorfismi SNPs quali
i nucleotidi nelle posizioni -1450, -1280, -1225
nel promotore del gene G#, la sequenza di polipurine-pirimidine, (TG)n(CG)m, compre s a
nell’IVS II di entrambi i geni fetali G# e A#, il
microsatellite (AT)xTy in 5’ al gene ! e la sequenza (AT)xNz(AT)y nella regione HS2 della Locus
Control Region.
Nella popolazione talassemica della Sardegna,
sebbene la maggioranza degli omozigoti e dei
composti eterozigoti per le mutazioni più comuni (la !°39 e la !°(-A)6) sviluppino TM, alcuni
soggetti manifestano condizioni di TI. In circa il
30% di questi ultimi è stata osservata anche la
presenza di anomalie a carico dei geni " e/o la
presenza del polimorfismo C$T G#-158 che, in
situazioni di stress emopoietico, promuove la
sintesi di globine fetali anche nel soggetto adulto.
Nei restanti casi, così come nei TM, i suddetti
polimorfismi in cis al cluster !-globinico non
sono stati analizzati.
Considerate le premesse, questa indagine si propone di analizzare soggetti sardi affetti da TM e
da TI allo scopo di verificare se un particolare
aplotipo !-globinico possa essere o meno associato ad un quadro clinico lieve. Al momento
sono disponibili i dati preliminari relativi a soggetti affetti da TM ed ai campioni di controllo.
Clinica ed ematologia: i pazienti sono stati classificati sulla base della loro storia clinica, degli
indici eritrocitari e dei livelli percentuali di HbF
e di HbA2. I parametri ematologici sono stati ottenuti mediante protocolli standard. I livelli di
HbF e di HbA2 sono stati calcolati mediante cromatografia liquida a scambio cationico.
Indagini biochimiche: la composizione qualiquantitativa del tetramero HbF è stata studiata
mediante analisi delle globine in cromatografia
liquida ad alta prestazione in fase inversa previo
isolamento della HbF tramite isoelettrofocalizzazione semi-preparativa.
Analisi molecolare: le mutazioni !-talassemiche
più frequenti sono state identificate mediante
Real Time-PCR. Eventuali altre mutazioni ai geni
‚, ai loci " e # e la diagnosi di "-talassemia sono
state eseguite mediante PCR e successivo sequenziamento nucleotidico. Gli aplotipi !-globinici
classificati secondo Orkin sono stati definiti me-
diante digestione con endonucleasi di restrizione
di frammenti amplificati. Le regioni polimorfe sul
cluster !-globinico sono state definite mediante
sequenziamento di frammenti da PCR, spesso
preceduto da clonaggio genico.
Risultati: Non sono state evidenziate forme di
persistenza ereditaria di HbF non-delezionali ed
in tutti i campioni è stata verificata la eventuale
presenza delle mutazioni !-talassemiche più diffuse in Sardegna e nel bacino del Mediterraneo.
Come atteso, il 90% dei pazienti è risultato omozigote per la mutazione !°39. Tale mutazione è
risultata associata a differenti assetti di microsatelliti e SNPs, nessuno dei quali identico a quelli
descritti in letteratura. È interessante il caso di un
politrasfuso che ha il medesimo genotipo !-globinico (!°39/!+-87) e gli stessi assetti polimorfi
precedentemente descritti in due soggetti non
dipendenti da trasfusione.
Ringraziamenti. Fondazione Banco di Sardegna
– contributo anno 2008.
HB Hinwil e !-talassemia:
una rara associazione
Cuccia L., Saieva L., Borsellino Z., Marocco M.R.,
Ruffo G.B., Gagliardotto F., Capra M.
U.O.C. Ematologia-Emoglobinopatie, P.O. G. Di Cristina,
ARNAS Civico Palermo
Riportiamo il caso di una bambina di 10 mesi,
che mostrava valori di Hb 20.4 g/dl, RBC
10.01x1012/L, Ht 61.8%, MCV61.7 fL e una evidente eritrosi dermica e mucosale.
L’anamnesi familiare di trait ! talassemico nella
madre e la presenza di spiccata microcitosi nella
paziente ci ha indotto ad eseguire lo studio dell’emoglobina che ha evidenziato la presenza del
trait beta talassemico anche nella paziente.
L’indagine per l’identificazione del difetto beta
talassemico ha dimostrato sia nella madre che
nella paziente la presenza della mutazione
!° cod 39 allo stato eterozigote. Nella paziente lo
studio del gene beta globinico rivelava anche la
presenza della mutazione !38 (C4) Thr$ Asn
s u l l ’ a l t ro allele, successivamente identificata
anche nel padre, portatore con lieve poliglobulia.
Tale mutazione determina la produzione di una
variante emoglobinica, Hb Hinwil, ad altà affinità
per l’O2.
Non sono stati riportati sinora in letteratura casi
di associazione con la !° talassemia. Al fine di
confermare la diagnosi si è proceduto all’esecuzione delle seguenti metodiche: IEF, HPLC a fase
28
Emothal
Atti Congresso So.STE
inversa, elettroforesi capillare. L’Hb variante era
visibile in HPLC a fase inversa e in elettroforesi
capillare, mentre non è identificabile con le
metodiche elettroforetiche di base né in IEF e
neppure in HPLC a scambio cationico.
Visto il progredire della eritrocitosi fino a valori
di Ht > 70%, e la comparsa di segni clinici correlati alla iperviscosità ematica, sono state valutate
le seguenti opzioni terapeutiche:
1) Salassoterapia: questo trattamento determinerebbe una iniziale riduzione quantitativa dell’Hb impedendo una adeguata ossigenazione e
causando un ulteriore stimolo alla produzione
di eritropoietina;
2) Terapia con idrossiurea: controindicata per
l’età, determinerebbe gli stessi problemi della
salassoterapia;
3) Eritroexchange, risulterebbe molto invasiva ma
determinerebbe un cambio Hb Hinwil$Hb A
(da donatore) riuscendo a normalizzare i parametri ematologici della paziente;
4) BMT, in atto non attuabile per la non disponibilità di un donatore correlato;
5) Terapia antiaggregante per la profilassi del rischio trombotico.
Diagnosis of red-cell membrane protein
abnormalities in italian patients:
role of flow cytometric test and
SDS page electrophoresis
D’Alcamo E., Agrigento V., Maggio A., Vitrano A.,
Rigano P.
A.O.V. Cervello, U.O.C. Ematologia II con Talassemia, Via
Trabucco n° 180, 90146 Palermo (Italy)
High rate of false negatives was shown in the diagnosis of atypical or mild hereditary spherocytosis
(HS) using osmotic fragility, auto haemolysis , acid
glycerol lyses and pink tests. To reduce the false
positive rate in these cases, we carried ahead a
prospective study using flow cytometric analysis
and SDS PAGE technique. Flow cytometric analysis was performed using eosin-5-maleimide
(EMA). This compound binds to red cells, reacting
with lys-430 on first extracellular loop of band 3
protein. Finally, the fluorescence intensity of intact
red cells labelled with the dye EMA is determined.
This pro c e d u re is fast and cheap. Two-hundredsixty-one subjects including normal control, HS
patients, atypical HS patients and different types of
anaemia have been studied. The main aim of the
study was the determination of the cut-off values
in HS patients and in normal controls.
29
All patients affected by HS or Congenital
D y s e r i t h ropoietic Anaemia type 2 (CDAII),
resulted in a greater degree of reduction in the
intensity of the mean channel fluore s c e n c e
(MCF) reading in comparison with other patients
groups and normal controls. Moreover, the SDS
PAGE analysis confirmed the predictive values of
EMA binding test. Finally, statistical analysis suggested that the cut-off between normal individuals and HS patients ,identified from the logistic
regression, was 49 MCF and sensitivity and
specifity of procedure was 89,47% and 96,83%,
respectively.
In conclusion, these results suggest that flow
cytometric dye EMA binding test is a reliable
method for diagnosis of HS and CDAII.
Liver and heart iron overload
extimated by T2* magnetic resonance
(MRI T2*) in patients with thalassemia
intermedia (TI)
Fasulo M.R.1, Cesaretti C.1, Cappellini M.D.1,
Cassinerio E.1, Proto P.1, Pedrotti P.2, Pedretti
S.2, Dellegrottaglie S.2, Roghi A.2.
1
Hereditary Anemia Center, Department of Internal Medicine,
Policlinico Foundation IRCCS, University of Milan, Italy;
2
Department of Cardiology, Niguarda Hospital, Milan, Italy
Purpose. Cardiac dysfunction is common in
Thalassaemia Syndromes, representing the leading cause of morbidity and mortality. Several
studies have been performed to assess cardiac
iron burden in Thalassaemia Major, whereas few
data are available in TI.
In this study we used MRI T2* for measuring
myocardial and liver iron overload in TI patients,
to allow diagnosis and suggest an early iron
chelation therapy.
Methods. 49 TI patients (29 M 20 F, 40.5 ± 8.3
years) followed in Milan underwent MRI T2*.
Normal heart T2* >20 ms; normal liver T2*
> 6.3 ms. 4 patients were regularly transfused, 23
occasionally, 22 never transfused. All patients
were occasionally chelated.
Results. Cardiac T2* was normal in all patients
(38.7 ± 11.0 ms) and did not correlate with age,
Hb, ferritin, LIC, LVEF or transfusion regimen.
Liver T2* was abnormal in 33 patients (67.4%,
18 M and 15 F): 2 (4.1%, 1 M and 1 F) had
severe (T2* < 1.4 ms), 17 (34.7%, 8 M and 9 F)
moderate (T2* between 1.4 and 2.7 ms) and 14
(28.6%, 9 M and 5 F) mild liver iron overload
(T2* between 2.7 and 6.3 ms). A strong correla-
Emothal
Rivista Italiana di Medicina dell’Adolescenza - Volume 7, n. 3, 2009
tion was established between liver T2* and ferritin concentration (p = 0.0026), AST
(p = 0.046), ALT (p = 0.026).
Conclusions. In this cohort of TI patients we
confirmed by MRI T2* that heart is not iron
overloaded. In TI patients iron overload occurs
mainly because of excess gastrointestinal absorption and ineffective erythropoiesis.
According to this mechanism the iron overload
in TI patients is mainly in the liver. Since iron per
se may be responsible for severe liver diseases it
is important to evaluate liver iron overload with
non invasive technique and start an adeguate
iron chelation therapy even in TI patients not
regularly transfused.
Liver fibrosis in adult thalassemia
intermedia (TI) patients assessed
by transient elastography (TE)
Fasulo M.R.1, Fraquelli M.2, Cesaretti C.1, Roghi
A. 3, Cassinerio E.1, Rigamonti C.4, Cappellini
M.D.1
1
(5.0 < TE ≤ 7.9 KPa), 5 (6%) had F > 2, 2 (2%)
had F > 3, 5 (6%) had F > 4. A significant correlation (p < 0.05) was observed between LSM and
age, transfusion therapy, serum ferritin, AST/ALT,
gamma-glutamyltransferase, bilirubin, albumin
and HCV positivity. Splenectomy and cholecystectomy positively correlated with TE values. TE
values were not significantly influenced by sex,
BMI, Hb, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase, cholinesterase and liver iron concentration (LIC) measured by T2* MRI.
Conclusions. Our study demonstrates that significant fibrosis is frequent in TI patients: 12 (13%)
patients have fibrosis stage > 2. TE is a reliable
non-invasive technique to asses liver fibrosis and
monitor liver fibrosis progression, that could substitutes liver biopsy in patients with thalassemia.
The relationship between LSM and LIC measured
by T2* MRI remains to be established.
Screening per le emogrobinopatie
in Albania
Hereditary Anemia Center, Department of Internal Medicine,
Policlinico Foundation IRCCS, University of Milan, Italy;
2
I Division of Gastroenterology, Policlinico Foundation IRCCS,
University of Milan, Italy;
3
Department of Cardiology, Niguarda Hospital, Milan, Italy;
4
II Division of Gastroenterology, Policlinico Foundation
IRCCS, University of Milan, Italy
1
Purpose. Chronic liver disease is frequent in
patients with beta-thalassemia due to HCV infection and iron overload. Transient elastography
(TE) is a new, non-invasive technique that measures liver stiffness (LSM) and assesses liver damage, especially fibrosis and cirrhosis. As TE use in
patients with beta-thalassemia is still limited, in
this study we evaluated LSM by TE in adult
patients with TI to estimate its possible relationship with demographic parameters, liver function, HCV positivity and iron overload.
Methods. 90 TI patients (43 M, 47 F; aged
40.5 ± 11.1 years) were examined by TE
(FibroScan®). 18 (20%) patients were regularly
transfused, 28 (31%) occasionally transfused, 44
(49%) never transfused. Overall, Hb was 8.9 ± 1.3
g/dl, serum ferritin 730 ± 690 ng/ml. HCV-Ab
positivity was found in 18 (20%) patients; 8
(44%) were viremic. TE cut-off to diagnose different stages of hepatic fibrosis was > 7.9 kPa for F
> 2, > 10.3 for F > 3 and > 11.9 for F > 4.48
patients underwent liver iron determination by
T2* Magnetic Resonance Imaging (MRI).
Results. 43 (48%) patients had normal TE values (TE ≤ 5.0 KPa), 35 (39%) had F > 1
Le emoglobinopatie sono malattie ereditarie prevedibili e prevenibili, attraverso: l’informazione
della popolazione a rischio, la ricerca dei portatori sani, gli screening di massa, la ricerca della
coppia a rischio, la sensibilizzazione dei ginecologi e la diagnosi prenatale.
L’Albania è interessata dal “fenomeno” medico
sociale delle emoglobinopatie, anche se, per le
note vicende politiche-economiche, non è stato
mai affrontato un serio programma di prevenzione delle malattie in questione.
In collaborazione con il personale sanitario Albanese, abbiamo iniziato un programma di prevenzione. La prima fase è consistita nell’informare
la popolazione del rischio e nel censire lo stesso
tramite gli esami di screenig. La popolazione, int e ressata dallo screening, è stata la comunità scolastica del penultimo e ultimo anno delle scuole
medie superiori. I distretti scolastici interessati sono stati quelli delle seguenti città: Valona, Fier e
Lushnje, queste ultime sono le città dell’Albania
maggiormente interessate dal “fenomeno” emoglobinopatie. Gli allievi di ogni singola classe venivano informati sul significato di portatore ed in
seguito, volontariamente, venivano sottoposti ad
Gaudiano C.1, Zuccalà G.1, Baba E.2, Valla A.3,
Duqi L.2
Centro Microcitemico ASL n. 4 - Matera.
Ospedale Regionale di Valona.
3
Ospedale di Fier (Albania).
2
30
Emothal
Atti Congresso So.STE
un prelievo ematico su EDTA (provetta BD
Vacutainer da 3ML). Di ogni allievo si registrava,
su supporto informatico e cartaceo, l’anagrafica.
Sul prelievo ematico, in giornata, si eseguiva l’esame emocromocitmetrico, con contaglobuli K1000
della sysmex , e l’HPLC delle emoglobine con
a t t rezzatura dedicata della Biorad (Variant).
I risultati degli esami eseguiti venivano trasferiti
sul supporto cartaceo e informatico(programma
dedicato alle emoglobinopatie da noi “costruito”). Ad ogni alunno veniva consegnato il referto.
Risultati. Valona 3040 screening. 184 beta thalassemici eterozigoti, pari al 6%, 45 eterozigoti
HbS, pari al 1,5%. Fier 2924 screening. 198 beta
thalassemici eterozigoti, pari al 6,8%, 76 eterozigoti HbS pari al 2,7%. Lusnhje 478 screening.
28 beta thalassemici eterozigoti, pari al 6%, 12
eterozigoti HbS, pari al 2,5%.
Lo screening effettuato e i relativi dati ci permetteranno di affrontare, insieme allo screening per
le mutazioni della beta thalassemia, le successive
fasi della prevenzione: ricerca delle coppie a
rischio e diagnosi prenatale.
Ringraziamenti: Si ringrazia l’associazione
ONLUS “Un Cuore per…” l’Albania, per aver
finanziato totalmente il progetto.
Coeulizione di emoglobine varianti
mediante HPLC: osservazioni
e commenti
Li Muli R., Giambona A., Passarello C.,
Vinciguerra M., Leto F., Fiorentino G., Cassarà F.,
Cannata M., Lo Gioco P., Renda D., Maggio A.
U.O.C. Ematologia II con Talassemia, Ospedale Vincenzo
Cervello 180, CAP 90146, Palermo.
L’identificazione e la classificazione delle varianti
emoglobiniche è uno degli obiettivi primari del
laboratorio di primo livello nello studio delle
Emoglobinopatie. L’iter diagnostico è rappresentato dalle due fondamentali tappe:
1. individuazione e quantizzazione di una variante emoglobinica mediante HPLC (indagine presuntiva);
2. tipizzazione della variante emoglobinica con
l’analisi molecolare. Valutando i tempi di ritenzione e la quantità di variante emoglobinica
eluita in HPLC, anche se si tratta di un test presuntivo, è possibile ottenere informazioni
molto vicine alla realtà per quelle che sono le
varianti più comuni e tra queste l’Hb-D, l’Hb-S
e l’Hb-C eluenti in “windows” specifiche.
L’obiettivo di questo lavoro è la comparazione fra
diverse varianti che “co-eluiscono” nelle stesse
“windows” ed evidenziare le differenze visualizzabili dai cromatogrammi. L’analisi in HPLC è
stata effettuata con la metodica “beta- thal Short
Variant II” della Bio Rad Laboratories, alcune
varianti sono state analizzate anche con la metodica “beta- thal Variant I” della Bio Rad
Laboratories. Sono stati utilizzati Kit di lotti
diversi in modo da escludere che i picchi ottenuti non fossero frutto di artefatti legati alla colonna o al gradiente.
I risultati ottenuti sono riportati in Tabella.
Conclusioni: Anche se l’esame di primo livello
per le varianti rimane un esame presuntivo, da
questo studio emerge che un’attenta osservazione
del cromatogramma può fornire importanti indicazioni circa la natura della emoglobina variante
presente nel campione analizzato. Oltre alla per-
Tabella 1.
“Finestra”
S
D
C
Variante
% finestra “F”
% finestra “A2”
% finestra “S”
Hb S
assente o quasi
3,2-4
38-42 (T.R. = 4.50 min.)
% finestra “D”
% finestra “C”
% finestra “unknown”
Hb G-SanJosè
assente o quasi
2,8-3,1
26-36 (T.R. = 4.61 min.)
1,2-3 (T.R. = 1.45 min.)
Hb Stanleyville II*
1,4
3,2
21,7 (T.R. = 4.36 min.)
0,9 (T.R. = 4.63 min.)
Hb Nyu
assente o quasi
1,5-2
1-2 (T.R. = 4.65 min.)
HbA2 Adria
assente o quasi
1,4-2,8
0,5-0,8 (T.R. = 4.57 min.)
Hb D
assente o quasi
1,4-1,8
Hb Etobicoke
assente o quasi
1,6-2
HbA2 Monreale
assente o quasi
0,7-1
Hb C
assente o quasi
3,2-3,8
Hb O-Arab
assente o quasi
2,4-3
38-40 (T.R. = 4.12 min.)
0,7-1 (T.R. = 4.63 min.)
1,8-2,2 (T.R. = 1.96 min.)
20-22 (T.R. = 4.12 min.)
0,7-0,9 (T.R. = 3.91 min.)
1,4-1,8 (T.R. = 4.59 min.)
38-40 (T.R.= 5.16 min.)
0,5-0,8 (T.R. = 4.00 min.) 38-41 (T.R.= 4.93 min.)
* associata con b Cod 39
T.R. = Tempo di Ritenzione
31
Emothal
Rivista Italiana di Medicina dell’Adolescenza - Volume 7, n. 3, 2009
centuale della specifica emoglobina ed ai tempi
di ritenzione, tipici di una variante, possono
essere presenti altre informazioni che ci vengono
date dalla conformazione del picco principale
eluente e dalla presenza di altri picchi “addizionali” presenti nel cromatogramma che accompagnano sempre quel determinato tipo di emoglobina.
Un esempio può essere dato dalla distinzione tra
l’Hb-S e l’Hb G-San José. Entrambe le emoglobine eluiscono nella “window” caratteristica dell’Hb-S ma l’Hb G- San José è caratterizzata da
una percentuale inferiore e dalla presenza di un
picco anomalo tra 1 e il 3% con un tempo di
ritenzione di 1.45 minuti, definito come picco
“unknown” (Tabella 1).
Caratterizzazione di nuove varianti
dell’emoglobina nella popolazione
italiana: aggiornamenti
Ivaldi G.1, Leone D.1, Forni G.L.2, Mercadanti
M.3, Barberio G.4, Tanca D.5, Sala P.6, Musso M.F.7,
Granata S.8
1
Lab. di Genetica – Settore Microcitemia, Ospedali Galliera
(GE);
2
S.S.D. Microcitemia, Ospedali Galliera (GE);
3
1° Lab. Analisi Chimico Cliniche (PR);
4
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Oderzo (TV);
5
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Lavagna (GE);
6
SOC. Analisi Cliniche di Elezione, A.O. Universitaria S.Maria
della Misericordia (UD);
7
Lab. Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche, A.S.O.
Santa Croce e Carle (CN);
8
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Patologia Clinica, A.O.
Niguarda (MI)
Nel corso degli ultimi due anni in collaborazione
con 7 laboratori del Nord Italia sono state osservate e caratterizzate 14 diverse varianti emoglo-
biniche (Hb) mai descritte nella popolazione italiana. 4 varianti Hb ( Hb Galliera1, Hb Galliera2,
Hb Parma, Hb Tarrant) appartengono alle catene alfa, 10 alle catene beta globiniche (Hb
Maryland, Hb Kanagawa, Hb Fukuoka, Hb Sfax,
Hb Yoshizuka, Hb Randwick, Hb Okayama, Hb
Lavagna, Hb Benin City, Hb Niguarda); in particolare 7 non erano mai state citate in letteratura
(Hb Galliera 1, Hb Galliera 2, Hb Parma, Hb
Sfax, Hb Lavagna, Hb Benin City, Hb Niguarda).
In alcuni casi le varianti si sono presentate associate con altri difetti globinici e genetici.
La crescente osservazione di difetti Hb è principalmente dovuta a due fattori che nel futuro consentiranno il riscontro nella popolazione italiana
ancora di molte altre varianti:
a) l’aumentato utilizzo di sistemi HPLC dedicati
(per i casi studiati sono stati utilizzati strumenti diversi delle ditte BioRad Laboratories,
Menarini e Tosoh) nel dosaggio delle frazioni
Hb, soprattutto per l’Hb A1c,
b) l’immigrazione ancora in atto prevalentemente da Paesi interessati a loro volta da difetti Hb
spesso diversi da quelli caratteristici della
popolazione italiana autoctona.
La caratterizzazione molecolare e funzionale ha
consentito in ogni caso un inquadramento del
fenotipo genetico ed ematologico dei 14 difetti
Hb, rappresentando però difetti rari dell’Hb,
non è immediata una correlazione con il possibile fenotipo clinico. A tal fine potrebbe essere
utile pro p o r re un “re g i s t ro” nazionale per censire questi difetti sul territorio nazionale e fornire
così uno strumento informativo alla consulenza
genetica.
32