METODO NAZIONALE STANDARD
CONTA DI COLIFORMI
E DI PRESUNTE
ESCHERICHIA COLI
CON LA TECNICA DEL
NUMERO PIU' PROBABILE (MPN)
D5
Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Specialist and Reference Microbiology Division
CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU'
PROBABILE (MPN)
Revisione no: 2. 4 Data di revisione 03.05.05 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory a nome del Group F, W
& E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC.
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Riferimento no: D 5i2.4
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
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Riferimento suggerito per questo documento:
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CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’
PROBABILE (MPN)
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INDICE (
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ...............................................................................................
2
INDICE (..............................................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA ...........................................................................................................................
4
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4
4
1.0
PRINCIPIO .......................................................................................................................................
6
2.0
DEFINIZIONI
....................................................................................................................................
6
3.0
STRUMENTAZIONE ....................................................................................................................
6
4.0
TERRENI DI COLTURA E REAGENTI ............................................................................................(
6
5.0
METODO ............................................................................................................................................
7
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(
6.0
CALCOLO DEI RISULTATI ................................................................................................................
c
d
d
7.0
REFERTAZIONE DEI RISULTATI .....................................................................................................
8
ALLEGATO: CARTA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DELLA CONTA DI COLIFORMI E
PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’ PROBABILE (MPN) .................
9
TABELLA 1: DETERMINAZIONE DEL NUMERO PIU’ PROBABILE .............................................................
10
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................................
12
8
CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’
PROBABILE (MPN)
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento D 5
controllato
Titolo del documento
Procedura Operativa Standard per la Conta delle colonie di coliformi e di
controllato
presunte Escherichia coli con la tecnica del Numero Più Probabile
(MPN, Most Probable Number)
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Pagina di modifica
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CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’
PROBABILE (MPN)
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PROCEDURA OPERATIVA STANDARD
PER LA CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE
ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA
DEL NUMERO PIU’ PROBABILE (MPN)
INTRODUZIONE
Scopo
(
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Generalità
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CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’
PROBABILE (MPN)
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1.0
PRINCIPIO
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(
2.0
DEFINIZIONI
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(
Coliformi
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Escherichia coli presunte
(
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3.0
STRUMENTAZIONE
l
l
l
l
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4.0
TERRENI DI COLTURA E REAGENTI
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Brodo lauril triptosio modificato (LTMUG - Modified lauryl tryptose broth)
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Concentrazione normale
Concentrazione doppia
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PROBABILE (MPN)
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5.0 METODO
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5.1
Microrganismi di controllo
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CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’
PROBABILE (MPN)
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5.2
Conferma di coliformi
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5.3
Conferma di presunte E. coli
(
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6.0
CALCOLO DEI RISULTATI
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7.0 REFERTAZIONE DEI RISULTATI
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CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO PIU’
PROBABILE (MPN)
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Allegato: Carta di flusso che illustra la procedura della conta dei coliformi e delle
presunte Escherichia coli con la tecnica del numero più probabile (MPN)
Preparare come richiesto diluizioni del campione10-1, 10-2 e 10-3 in Diluente Peptone Salino
Ø
Per la maggior parte dei prodotti utilizzare 3 provette di LTMUG a doppia concentrazione con 10ml della diluizione 10-1 e tre provette di
LTMUG a concentrazione normale con 1 ml delle diluizioni 10-1 e 10-2
Per formaggio e prodotti cogelati utilizzare tre provette di LTMUG a concentrazione normale con 1ml delle diluizioni 10-1, 10-2 e
10-3
Ø
o
o
Inserire in termostatoa 30 C r 1 C per 48 ore r 2 ore
Ø
Eseguire sottocolture dalle provette che presentano produzione di gas (se rilevato) in BGBB ed inserire in termostato a 30oC r
1oC per 24 ore r 2 ore.
Ø
Le provette con produzione di gas in BGBB sono refertate come coliformi.
Ø
Aggiungere 1ml di idrossido di sodio 1M alle provette di LTMUG, , esaminare con luce UV light fper presenza di
fluorescenza blu-bianca e registrare il risultato
Ø
Aggiungere 0.5ml di reattivo di Kovac per l'indolo, miscelare e dopo un minuto ricercare la comparsa di colorazione rossa nella fase alcolica
Ø
Contare le provette fluorescenti ed indolo positive come E. coli. Le provette solo fluorescenti o solo
indolo positive non sono registrate come E. coli.
Ø
Calcolare lal conta per g o ml e refertare
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PIU' PROBABILE
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Riferimento no: D 5i2.4
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
Tabella 1: Determinazione del Numero Più Probabile (MPN)
Numero di resultati positivi
Limiti di confidenza
10-1
MPN
10-2
10-3
diluizione diluizione diluizione per g/ml
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
<3
3
3
6.1
6.2
9.4
3.6
7.2
11
7.4
11
11
15
16
9.2
14
20
15
20
27
21
28
35
29
36
23
38
64
43
75
120
160
93
150
210
290
240
460
1100
>1100
Categoria
3
2
0
3
0
1
2
0
1
3
2
3
3
1
2
0
1
2
0
1
3
0
3
0
1
1
3
1
1
3
0
1
1
2
3
1
1
1
>95%
> 99%
Limite Infer. Limite super. Limite infer. Limite super.
0
9.4
0
14
0.1
9.5
0
14
0.1
10
0
16
1.2
17
0.5
25
1.2
17
0.5
25
3.5
35
1.8
46
0.2
17
0.1
25
1.2
17
0.5
25
4
35
2
46
1.3
20
0.6
27
4
35
2
46
4
35
2
46
5
38
2
52
5
38
2
52
1.5
35
0.7
46
4
35
2
46
5
38
2
52
4
38
2
52
5
38
2
52
9
94
5
142
5
40
2
56
9
94
5
142
9
94
5
142
9
94
5
142
9
94
5
142
5
94
3
142
9
104
5
157
16
181
10
250
9
181
5
250
17
199
11
270
30
360
20
440
30
380
20
520
18
360
12
430
30
380
20
520
30
400
20
560
90
990
50
1520
40
990
30
1520
90
1980
50
2830
200
4000
100
5700
Adattato dade Man JC, 1983. Eur J Appl Biotechnol. 17, 301-305
Categoria
1:
Risultati che hanno la maggior possibilità di essere ottenuti. E’ possibile al massimo solo una probabilità del 5% di ottenere un risultato
che sia meno probabile di quello che ha la minor probabilità di comparire di questa categoria
Categoria
2:
Risultati che hanno minori possibilità di essere ottenuti anche una volta rispetto a quello più basso nella categoria 1, ma al massimo
possibile solo la probabilità dell’1% di ottenere un risultato meno probabile di quello a minor probabilità di comparire in questa categoria
Categoria
3:
Risultati che hanno minori possibilità di essere ottenuti anche una volta rispetto a quello più basso nella categoria 2, ma è possibile
ottenere un risultato inferiore al minore di questa categoria
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Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection
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Categoria
0:
Risultato fra quelli che hanno minor probabilità di essere ottenuto rispetto al risultato minore della categoria 3. Possibilità
inferiore allo 0.1% di ottenere un risultato in questa categoria senza possibilità di errore.
CONTA DI COLIFORMI E DI PRESUNTE ESCHERICHIA COLI CON LA TECNICA DEL NUMERO
PIU' PROBABILE
Revisione no: 2. 4 Data di revisione 03.05.05 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory per conto del Group F
& E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC.
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BIBLIOGRAFIA
1
England and Wales. The Dairy Products (Hygiene) Regulations 1995. Statutory Instrument No.
1086.
2
London: HMSO, 1995
Ministry of Agriculture Fisheries and Food, Department of Health, Scottish Office, Welsh Office.
Dairy
3
Products (Hygiene) Regulations - Guidance Notes 1995. London: HMSO, 1995
BS ISO 11866 : 1997. Milk and milk products - Enumeration of presumptive Escherichia coli. Part
2:
4
Most probable number technique with use of 4-methylumbelliferyl-E-D-glucuronide (MUG)
British Standards Institution. BS 5763 Microbiological examination of food and animal feeding
stuffs,
5
part 3 (ISO 4831: 1991). Enumeration of coliforms - most probable number technique.
London: BSI, 1991
ISO 5541 Part 2. Milk and milk products - enumeration of coliforms. International Organisation for
Standardisation. (In preparation)
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PIU' PROBABILE
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