Dipartimento Regionale
Interaziendale
Medicina Trasfusionale
Gli Emocomponenti
BUONA PRATICA DI PRODUZIONE
Trait d’union tra donatore e ricevente
Enrico Chiurazzi
Dirig.Biologo
L’acqua è un bene prezioso
NON SPRECARLA !!
Il Sangue è una risorsa
limitata, deperibile,
e al momento insostituibile
Il sangue usato per fini terapeutici è un FARMACO a tutti gli effetti
Come tale ha :
una composizione
indicazioni
controindicazioni
interazioni farmacologiche
reazioni sfavorevoli a breve elungo termine
Deve esistere in campo trasfusionale un preciso programma
di sorveglianza e notifica delle reazioni avverse (emovigilanza)
al fine di meglio connotare il “rischio trasfusionale”
e migliorare indicazioni, qualità e procedure
La mission del
Servizio Trasfusionale
“primum non nocere”
fornire sangue ed emocomponenti
sicuri, puri, efficaci
APPROPRIATI
NON RECARE DANNO AL DONATORE
TUTELARE LA SALUTE DEL PAZIENTE
RISPONDERE AI BISOGNI SANITARI
MINISTERO DELLA SALUTE
Legge 04 maggio 1990
n° 107
R(95) 15
del C.E.
MINISTERO DELLA SALUTE
Decreto 03 marzo 2005
SIMTI
Caratteristiche e modalità per la donazione
produzione e conservazione
degli Emocomponenti
Il percorso del sangue
D
O
N
A
Z
I
O
N
E
struttura
trasfusionale
RACCOLTA
LAVORAZIONE
VALIDAZIONE
PAZIENTI
ASSEGNAZIONE
INDUSTRIA
frazionamento
plasma
Presidi
Biomateriali
Equilibrio Biochimico
Circuiti chiusi
GARANTIRE
la sopravvivenza e la funzionalità
Connettore sterile
IMPEDIRE
la proliferazione
Cappa
sterile (flussobatterica
laminare)
EVITARE
Filtri pre/post storage
che si realizzino modificazioni lesive
Deflussori
Inquinamento batterico:
confronto tra emocomponenti
• Piastrine (pool di 5 unità) Dallo
1: 0,04%
2.282 al 5%
(79.875 unità)
Gram Positivi : reaz. clin. lievi
• Plasma
1: 0,01%
20.721all 1%
Dallo
(35.481 unità)
• Emazie concentrate
Dallo
1: 0,002%
27.721 all 1%
Gram Negativi
:
reaz.
clin.
severe
(138.605 unità)
Incidence of Bacterial Contamination in the Quebec Hemovigilance
Systemfor year 2000. Quebec Health Ministry, Quebec, Canada
Sicurezza
Microbiologica
Cause Endogene
Batteriemia Transitoria
•Infez.gastrointestinali
•Endocarditi
•Osteomieliti
•Proced. odontoiatriche
Cause esogene
Contaminazione della sacca
Mani dell’operatore
Bagnomaria
Zona della Venipuntura
Cause Concomitanti
Bassa temperatura
Ridotta attivita’ battericida
////////
////////
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Sicurezza Microbiologica
 Disinfezione della cute
Accurata igiene dell’operatore
 Sistemi a circuito chiuso
 Connettori sterili
 Conservazione a basse temperature
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////////
/////
Il Sangue Intero
CONTIENE
 globuli rossi
 globuli bianchi
 piastrine
 plasma
 anticoagulante/conservante
Ha un volume standard di 450 ml. +/- 10%
Emoglobina 45 g/unità
Emolisi inferiore a 8 %
////////
////////
/////
ANTICOAGULANTI / CONSERVANTI
 ACD(acido citrico-destrosio)
 CPD(citrato-fosfato-destrosio)
 SAG-M(salina-adenina-glucosio-mannitolo)
 PAS(citrato-acetato-NaCl-magnesio)
Prelievo
• Quantità non inferiore a 450 ml.
• Tempo non superiore a 12 min.
• Sacca triple T&B con CPD
• Agitazione
• Flusso/Tempo
• Etichettatura
Il non rispetto dei requisiti dovrebbe far escludere
l’unità dalla produzione di emocomponenti.
Sangue intero
emazie
plasma
piastrine
Emoderivati
Emazie
filtrate
Emazie
lavate
Cordon
Cell
Piastrine
lavate
Criodepleto
Emazie
congelate
PBSC
Piastrine
filtrate
Crio
precipitato
Emazie
irradiate
stem cells
Colla
di fibrina
Piastrine
irradiate
Growt
factor
Centrifugazione
Alto recupero di cellule
Basi teoriche della separazione
Plasma
1.030
Sangue
intero
Piastrine 1.040
1.055
Densità
Dimensione
Forma
Velocità
Tempo
Temperatura
Linfociti 1.070
Granulociti 1.080
Globuli rossi 1.090
Viscosita’ del mezzo
Accelerazione di gravità
Per separare le singole popolazioni cellulari si
sfrutta il loro diverso gradiente di densità.
Per separare le singole popolazioni cellulari
si sfrutta il loro diverso gradiente di densità.
Plasma 1.030
Sangue intero
1.055
r.p.m.
Piastrine 1.040
Linfociti 1.070
Granulociti 1.080
time
Globuli rossi 1.090
La temperatura ottimale e tra 20 e 24 ° C
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////////
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Concentrato di Emazie
Si ottiene dal sangue intero per
centrifugazione a seguito della
rimozione
dello
strato
leucocitario e piastrinico e del
plasma.
Parametri standard:
-Volume
in rapporto al sistema usato
-Hct
50-70%
-Hb
43g per unità
-Emolisi
< 0,8% della massa eritrocitaria alla scadenza.
-Leucociti
< 1,2 x 109 per unià
L'aggiunta di SAG-MANNITOLO porta la scadenza dell'unità a
42 giorni conservata a +2 +6°..
Lesioni da PRODUZIONE/conservazione
APOPTOSI
AUMENTO DI IONI (pH)
STRESS DA PRELIEVO
CONSUMO DI 2,3-DPG
CENTRIFUGAZIONE
RIDUZIONE DI ATP
Aumentata affinità per
l’ossigeno
Ridotto rilascio di ossigeno
Emoglobinemia
Rilascio di potassio
3
Sett.
1
Sett.
4
Sett.
2
Sett.
 Aumentata distruzione
 Hb libera
 perdita di K
 ATP
 2,3 DPG
 pH
Conservazione :
a 4°C +/- 2°C
in emoteca a temperatura controllata
(a T.A. il minor tempo possibile non deve superare i 10°C )
Dose terapeutica :
5 ml. pro Kg
Aumentano l’Hb di circa 1 g/dL
////////
////////
/////
Il Plasma
costituisce la parte liquida del sangue
è una soluzione salina nella quale sono sospesi gli elemeti cellulari.
il 90% è acqua e costituisce il 55% del volume totale.
contiene principalmente albunina, globuline, fibrinogeno, fattori della coagulazione
proteine, zuccheri, sali, vitamine, ormoni ecc..
//////
//////
//////
///
Il Plasma
Plasma fresco da donazione ordinaria
contiene 240-260 ml di plasma e anticoagulante
si conserva 12 mesi a - 30 °C
è da considerarsi acelluare
Plasma fresco da aferesi
contiene 600ml max di plasma e anticoagulante
si conserva 12 mesi a - 30 °C
è da considerarsi acellulare
Dose terapeutica :
è calcolata in base al peso del paziente e alla gravità del deficit coagulativo
Generalmente 10-20 ml pro Kg
10 ml. producono un aumento del 10-20% dei fattori della coagulazione
Validità una volta scongelato :
al più presto entro 4 ore a TA
entro 8 ore a 4°C
Plasma safe
• Previene la trasmissione dei virus HIV HBV HCV
• Rimuove le cellule ospitanti agenti infettivi
• Migliora l’accuratezza terapeutica
• Riduce le reazioni avverse
• Impedisce la sepsi da contaminazione batterica
Inattivazione Virale
 Solvente detergente
 Blu di metilene
 Psoralene S59
 Riboflavina
 FRALEs S303
 Inactina
Fotodinamica
Fotochimica
Cross-linking
Legami con A.Nucleici
Le Piastrine
Derivano dalla frammentazione dei Megacariociti
Elementi cellulari anucleati di forma discoidale
Diametro 3-4 m Spessore 0.7-1.1 m
Concentrazione nel sangue 150-400 x 109/L
1/3 circolanti
2/3 costituiscono un pool mobilizzabile
dislocato nella milza
Struttura estremamente complessa
Produzione
 Da PRP (0,6/0,8 x 1011)
 Da Buffy Coat (2,5 x 1011)
 Da Aferesi (2/3 x 1011)
 Risospese in soluzione additiva
 Per produz. Gel Piastrinico
Dose terapeutica :
0,7 x 1011 pro 10 Kg di peso
una unità dovrebbe prtare ad un incremento di circa 30.000
Conservazione :
a T.A. in agitazione costante
Leucodeplezione
Lavaggio
Irradiazione
Inattivazione virale
I Leucociti
Il normale conteggio di Leucociti nel
Sangue varia fra 5000 e 9000 leucociti per
ogni ml (1 ml = mm3)

1 unità di sangue intero (450 ml=450.000
mm3) contiene circa 3 miliardi di Leucociti

Dopo l’eliminazione del buffy-coat una unità
di GRC ne contiene circa 1 miliardo

I leucociti sono i responsabili delle principali reazioni
trasfusionali come pure del maggior degrado degli
Emocomponenti durante la conservazione
I leucociti d’interesse appartengono a due gruppi :
• Cellule con funzione fagocitica
• Cellule con funzione immunitaria
GRANULOCITI e MONOCITI
LINFOCITI B e T
Nel sangue conservato granulociti e linfociti già dopo 24 ore
a T.A. (6/12 ore a 4°C) mostrano gravi alterazioni con rilascio
del contenuto dei lisosomi, dei granuli e di metaboliti (enzimi, istamina ecc..),
di BRM e perdita dell’attività bettericida e funzionale
Perche’ leucoridurre
• Reazione febbrile non emolitica (NHFTR)
• Refrattarietà alla trasfusione di piastrine
• Graft versus host disease (GVHD)
• Immunomodulazione (i politrasfusi risultano
spesso immunodepressi)
• Trasmissione agenti infettivi (principalmente
HTLV-1 e CMV)
Cosa leucoridurre
Giorni di conservazione
Volume
Assetto
CMV
Cosa eliminare ?
RBC
Emazie RBC
Leucociti
Piastrine
Micro-aggregati
Piastrine
Da eliminare:
RC
Micro-aggregati
Micro-aggregati
Leucociti
Leucociti
Piastrine
PL
Quanto leucoridurre?
104
NHFTR
Alloimmunizzazione
HTLV-1
105
106
107
108
109
1010
G, M
M, B
CD4+
< 106
G, M, L
CMV
GVHD
CD4+, CD8+
: Rischio elevato
G: Granulociti
M : Monociti
: Ignoto
L : Linfociti
: Prevenzione
B : Linfociti -B
Quanto riusciamo a leucoridurre?
log
1 log = 90%
2 log = 99%
3 log = 99,9%
4 log = 99,99%
5 log = 99,999%
6 log = 99,9999%
7 log = 99,99999%
8 log = 99,999999%
9 log = 99,9999999%
% leucociti residui
leucociti/unità
10%
1%
0,1%
0,01%
0,001%
0,0001%
0,00001%
0,000001%
0,0000001%
100 milioni
10 milioni
1 milione
100.000
10.000
1.000
100
10
1
Quando… Come… Dove…
Bedside
Laboratorio
Pre Storage
Laboratorio e bedside
• Laboratorio
– Procedura più veloce, flusso di circa 50 ml/min
– Condizioni di temperatura più controllabili
– Controllo di qualità sul prodotto ottenuto
– Eseguibile su richiesta
– Impegna il personale
• Bedside
– Procedura lenta, flusso di circa 5 ml/min
– Può durare più di 1 ora ed in condizioni variabili
– Non consente un controllo in vitro del filtrato
– Assegnabile su richiesta
– Non impegna il personale
– Rischio bradikinina
Pre Storage (filtro in linea)
A. PRE CENTRIFUGAZIONE
• Si filtra il sangue intero
• Si perdono WBC ma anche PLTs
• Si recupera più sangue (50g di B.C.)
• Attesa pre filtrazione (min. 2 ore)
• Tempi lunghi di filtazione (20 min.)
B. POST CENTRIFUGAZIONE
• Attesa pre filtrazione (min. 2 ore)
• Perdita di G.R. (B.C. + Filtro)
• PLTs recuperabili
Si allungano i tempi di produzione
Rischio eliminazione unità non valide
ERITROAFERESI
A. Post raccolta
• Si filtrano G.R.C.
• Hb = 47g/dl rispetto a 43
• Attesa pre filtrazione (min. 2 ore)
• Perdita di prodotto = 28 g rispetto a 35
• Standardizzazione ottimale del prodotto
Si ottiene la contemporanea raccolta di 350 ml di plasma
o meglio ancora la raccolta di PLTs
Prevenzione della TA- GvHD
Sindromi da Immunodeficienza
Soggetti gravemente immunocompromessi
Riceventi di trapianto
Trasfusioni intrauterine
Irradiate
U.O. di Medicina Trasfusionale
Gestione dei prodotti biologici
Programmazione e Assegnazione
Lavate
Poliagglutinabilità delle emazie
Anticorpi anti-proteine (anti Ig-A)
Gravi reazioni allergiche post-trasfusionali
Emoglobinuria parossistica
REAZIONI ALLERGICHE
CARATTERIZZATE DA MANIFESTAZIONI
• CUTANEE
• RESPIRATORIE
• GASTROINTESTINALI
• CARDIOCIRCOLATORIE
flushing, prurito, orticaria
tosse, dispnea, broncospasmo
nausea, vomito, crampi, diarrea
aritmie, ipotensione, sincope
• REAZIONI ANAFILATTICHE CONCLAMATE
Tali reazioni da IPERSENSIBILITA’ sono causate da anticorpi diretti contro
proteine plasmatiche presenti negli emocomponenti o da BRM
INCIDENZA
Dati FDA :
di tutte le reazioni trasfusionali (100%)
il 17% sono allergiche (similallergiche e
anafilattiche)
il 5% delle anafilattiche sono fatali
Nella popolazione trasfusionale l’incidenza risulta :
ALLERGICHE
1: 250 (G.R.),
ANAFILATTICHE 1 : 23000 (G.R.)
1: 15 (PLTs)
1 : 600 (PLTs)
La diagnosi differenziale è difficile perché cause concomitanti possono
sovrapporsi con sintomatologia simile
TRALI
INTERLEUCHINE
COMPLEMENTO
broncospasmo, insuff. respirat.
orticaria, dispnea, ipotensione
febbre, reaz.anafilattoidi
FARMACI, MEZZI DI CONTRASTO, LATTICE
Le forme cliniche lievi (grado 1 e 2) rispondono già
al solo trattamento antistaminico parenterale
la trasfusione può anche continuare
Le più gravi (grado 3 e 4) hanno bisogno
di terapie combinate
la trasfusione deve essere sospesa
Le reazioni anafilattiche vere e proprie compaiono quasi esclusivamente
in pazienti con deficit congenito di IgA che sviluppano anticorpi
anti-IgA/IgE e aptoglobina
In Europa 1 su 700 individui
ha carenza congenita di IgA :
il 40% di questi sviluppa anticorpi
Un altro studio riporta che su 51 reazione allergiche studiate
il 75% sono probabilmente riconducibili all’evento trasfusionale
il 25% sono considerate come possibili
6 presentavano un grado 3 (marcatamente severo)
Nessuna di queste era associabile in maniera indiscutibile all’evento trasfusionale
La ricerca dei livelli di IgA e della TRIPTASI (unici due test disponibili
per una diagnosi differenziale) sono risultati in tutti i casi nella norma
Definizione di unità lavata
Sono ottenute a partire da concentrato eritrocitario dopo
centrifugazione (4°C)
allontanamento di tutto il plasma e lavaggio con soluzioni
isotoniche a freddo (4°C)
La ST definisce la tipologia, i liquidi e i cicli di lavaggio
Indicazioni
Le emazie lavate sono indicate in pazienti che presentino anticorpi
Anti-proteine, in particolare anticorpi Anti-IgA e in pazienti che
abbiano sofferto di gravi reazioni allergiche post-trasfusionali.
In pazienti con problemi di iperkaliemia e nell’ emoglobinuria
parossistica notturana
Standard di prodotto
Emoglobina : > 40 g/unità
Ematocrito :
65/70%
Contenuto Proteico:
< 0.3 g/unità
L’emocomponente va conservato a +2/6°C
per il minor tempo possibile
e comunque per non più di 24 ore dal trattamento
(se non vengono utilizzati metodi che garantiscono l’integrità del prodotto)
Devono essere pianificati, eseguiti e documentati
specifici controlli di qualità del campione
Selezione del donatore
prevenire trasmissione passiva di allergeni
•TRATTAMENTO FARMACOLOGICO
•IN TRATTAMENTO ASMATICO
•DURANTE TERAPIE IPOSENSIBILIZZANTI
Una valutazione ALLERGOLOGICA dovrebbe essere inclusa nei criteri di idoneità
TSCD
Utilizzazione del Kit
Procedura operativa
Soluzione
Fisiologica
a 4°C
Saldare
dopo
filtrazione
Lavaggio
GLOBULI
ROSSI
Sacca
di
SCARTO
Ottimizzazione
Contenuto proteico inferiore a 5 mg/unità
Hb superiore a 40 g/unità
Hb libera al di sotto di 0.8 g/dL
N.B. Devono essere utilizzate nel più breve tempo possibile
CRITICITA’
• Costi crescenti per disporre di sangue sicuro.
• Aumento dell’aspettativa di vita e crescente fabbisogno trasfusionale
OBIETTIVI SPECIFICI
• Conseguire la massima riduzione possibile del rischio trasfusionale;
• Perseguire l’appropiatezza
La qualità
La sicurezza
L’efficacia
Comincia da Voi !!
grazie