Diss. ETH No. 11579
Structure of Serum
Response
Factor
core
bound to DNA
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
of
degree
Doctor of Natural Science
presented by
LUCA PELLEGRINI
Laurea in Chimica
born
July 8th,
1966
Italian citizen
Prof. T. J. Richmond, Examiner
Prof. K. Wuthrich, Co-examiner
Zurich, 1996
Summary:
The human
protein
"immediate-early"
as a
Serum
gene
Response Factor (SRF) regulates transcription of the
family
and of muscle
cell-specific
dimer to DNA promoter sequences that contain the
CC(A/T)6GG,
named CArG box. A
core
and sufficient for the activities of DNA
a
been identified in
58 amino acids DNA
a
large
consensus
decamer
domain of about 90 amino acids is necessary
binding,
dimerization and recruitment of the
accessory factors that cooperate with SRF to activate
domain is there
genes like the actins. It binds
transcription. Within the
binding motif,
number of regulatory
core
called the MADS box, that has
proteins
from the animal and the
plant
kingdoms.
This work describes the
vector, its
subcloning of SRF's
in E. coli and
overexpression
cocrystallization with a DNA
the
X-ray
sequence
core
domain into the
pET3a expression
purification to homogeneity,
containing
structure of the SRF core-DNA
its
CArG box, and determination of
a
complex using the multiple isomorphous
replacement method.
The structure of the SRF core-DNA
family of transcription
binding motif.
dyad axis
In the
factors
complex,
of the DNA. The
of two a-helices that sits
complex
shows that the members of the MADS
recognize their DNA
site via
the two fold axis of the
principal
DNA
binding
a
structurally
protein
dimer coincides with the
element is
an
antiparallel
tails of the SRF
groove,
phosphates
core
depart
and the
edges
an
opposite
place.
allowing
The N-terminal
with the DNA there. The C-terminal part of the
hydrophobic (3-hairpin that,
element from the other monomer,
of the coiled coil
of the bases to take
to
from the coiled coil and penetrate in the A/T rich minor
making important interactions
MADS box is
coiled coil
top of the minor groove and is aligned roughly parallel
on
it. The DNA molecule wraps around the basic N-termini of the helices,
contacts with the
novel DNA
forming
a
in the
protein dimer, pairs
four-stranded
with the
same
{} -sheet that covers the side
the DNA. The C-terminal ends of the SRF
core
fold into
irregular coils
followed
by
two
sheet, excluding it from any
short cc-helices that close off the upper surface of the
contact with the solvent.
Overall, the SRF
core
has
P-
a
compact, slab-like appearance. The DNA double helix is severely bent towards the
major groove
in direction of the
protein
A/T rich part of the CArG box shows
exploits these conformational
a
at both ends of the CArG
very
features of its
narrow
box, while the central,
minor groove. The SRF
recognition site to
core
achieve sequence-
specific binding, with only one base-specific contact in the major groove within the
CArG box.
The three dimensional structure of the SRF core-DNA
of the
complex expands
general principles governing protein-DNA interaction
and
provides
structural basis to understand how different members of the MADS box
recognize DNA sequences that
are
similar but different.
our
knowledge
the necessary
family
can
Zusammenfassung:
Das menschliche Protein "Seram
der
Response Factor" (SRF) reguliert die Transkription
"immediate-early" Genfamilie
Dimer
an
DNA Promoter
und
Sequenzen
muskelzell-spezifischer Gene.
mit dem Konsensus-Dekamer
CArG Box genannt. Eine Kern-Domane
und
geniigend
Faktoren, die
fur
von
Es bindet als
CC(A/T)eGG,
ungefahr 90 Aminosauren
ist
notwendig
DNA-Bindung, Dimerisierung und Rekrutierung zusatzlicher
zusammen
enthalt ein 58 Aminosauren
in einer grossen Zahl
Transkription aktivieren.
mit SRF die
von
langes
Diese Kern-Domane
DNA bindendes Motiv, MADS Box genannt, das
regulatorischen Proteinen
dem Tier- und Pflanzenreich
aus
identifiziert wurde.
Die
vorliegende
Arbeit beschreibt die
Expressions-Vektor pET3a,
die
Subklonierung
Uberexpression in
der SRF Kern-Domane in den
E.coli und die
Cokristallisieren mit einer CArG Box enthaltenden DNA
Aufreinigung,
das
Sequenz und die
Bestimmung der Rdntgenkristallstruktur des SRF Kern-Domane/DNA Komplexes
mittels MIR.
Die Struktur der SRF Kern/DNA
Transkriptionsfaktoren-Familie
Komplexes zeigt,
einem
derjenigen
antiparallelen
der DNA
was
Kontakte mit den
zu
zusammen.
Phosphatgruppen
groove" ein,
gehen
bildet. Dieses deckt die der DNA
Symmetrieachse (C2)
des
Das DNA bindende Element besteht
alpha-Helices,
vom
wobei sie dort
entsprechenden Haarnadel des
neues
die iiber der "minor
um
aus
groove"
die N-Termini der Helices,
und den Randern der Basen erlaubt. Die N-
C-terminale Teil der MADS Box ist eine
mit der
fallt die
ihr. Die DNA wickelt sich
terminalen Stiicke des SRF Kerns
reiche "minor
Komplex
"coiled coil" zweier
sitzen, ungefahr parallel
Mitglieder der MADS
ihre DNA Bindestellen tiber ein strukturell
DNA bindendes Motiv erkennen. Im
Proteins mit
dass die
"coiled coil"
aus
und
dringen
in die A/T
wichtige Kontakte zur DNA machen.
hydrophobe beta-Haarnadel,
anderen Monomers ein
gegeniiberliegende
Der
die im Dimer
4-strangiges beta-Blatt
Seite des "coiled coil" ab. Die C-
terminalen Enden des SRF-Kems falten sich
zwei kurzen
verhindern
Kern eine
alpha-Helices.
so
zu
Diese schliessen das obere Ende des beta-Blattes ab und
jeglichen Losungsmittelkontakt.
kompakte scheiben-ahnliche
Enden der CArG Box stark
unregelmassigen "Coils", gefolgt von
zur
Im grossen und ganzen hat der SRF
Form. Die DNA
"major groove"
in
Doppelhelix ist an
Richtung
des Proteins
beiden
gebogen,
wahrend der zentrale A/T reiche Teil der CArG Box eine sehr enge "minor
groove"
besitzt. Der SRF Kern nutzt diese Konformationsbesonderheiten seiner
Erkennungsstelle
Kontakt in der
fur
sequenz-spezifisches
"major groove"
Binden mit
einem
basen-spezifischen
der CArG Box.
Die dreidimensionale Struktur des SRF Kern/DNA
Wissen iiber
allgemeinen Prinzipien,
Sie stellt die
notwendigen
wie verschiedene
nur
Komplexes
welche Protein-DNA
strukturellen
Grundlagen
Mitglieder der MADS
zur
erweitert
Wechselwirkungen lenken.
Verfugung um zu verstehen,
Box Familie ihre ahnlichen aber
unterschiedlichen DNA Bindestellen erkennen konnen.
unser
Riassunto:
La
proteina umana
Serum
geni "immediate-early"
forma di dimero
a
e
Response Factor (SRF) regola la trascrizione
di
geni del tessuto
muscolare
come
le actine. Si
chiamato CArG box. Un dominio di circa 90 amminoacidi
e' necessario
sufficiente per le attivita' di
complessamente del DNA,
recruitamento dei fattori ternari che cooperano
Dentro il "core domain" e' contenuta
il
DNA, chiamata MADS box, che e'
trascrizione del regno animale
Questo lavoro descrive
esepressione pET3a,
ot^ogeneita',
la
sua
la
il
e
una
La
stata
di fattori di trascrizione si
e
SRF per attivare la trascrizione.
identificata in
core
overexpressione in
cocristallizzazione
complesso
dimerizzazione
un
grande numero
legare
di fattori di
vegetale.
del metodo della sostituzione
struttura del
(core domain)
sequenza di 58 amminoacidi capace di
subclonaggio del
sua
con
con una
domain del SRF nel vettore di
E. coli
e
purificazione
un
CArG
SRF core-DNA, per
multipla isomorfa.
SRF core-DNA mostra che i membri della
legano
fino ad
sequenza di DNA contenente
b^x, e la determinazione della struttura a raggi x del complesso
mezzo
lega sotto
sequenze di DNA promotore che contengono il decamero
CC(A/T)6GG,
e
famiglia di
della
al loro sito nel DNA tramite
strutturale. Nel compesso, l'asse binario del dimero
famiglia MADS
un nuovo
motivo
proteico coincide con
l'asse binario
del CArG box del DNA. II principale elemento responsabile per il complessamento del
DNA e'
un
"coiled coil" di due alfa eliche situate sopra il solco minore del DNA
allineate in modo
avvolge attorno
con
i fosfati
"coiled coil"
I
segmenti
e
e
approssimativamente parallelo
ai basici
le basi di
segmenti N-terminali
avere
luogo.
ad
esso.
e
La molecola di DNA si
delle alfa eliche,
permettendo
Le code N-terminali del SRF
core
si
contatti
dipartono dal
penetrano nel solco minore del DNA, ivi facendo importanti interazioni.
C-terminali del MADS box formano
dimero, si allinea con lo
stesso
una
forcina beta idrofobica che, nel
elemento dell'altro monomero, formando
antiparallelo con quattro "strands",
un
foglio beta
che copre il lato del "coiled coil" opposto al DNA.
Le estremita1 C-terminali del SRF
terminare in brevi alfa eliche che
escludendolo da
piegata verso il
ogni
solco
contatto
si
avvolgono
in modo
il solvente. La
in direzione della
specifico,
legarla in
basi
limitate ad una, aH'interno del CArG box.
La struttura tridimensionale del
conoscenza
dei
principi che governano
base strutturale necessaria per
proteine
si
complesso
leghino
a
capire
sequenze simili
ma
severamente
del
di questa sequenza di
per la sequenza di
espande la nostra
proteine e DNA,
membri differenti della
diverse.
foglio beta,
solco minore molto
specifiche
SRF core-DNA
le interazioni fra
come
un
proprie
mentre le interazioni
DNA per
sono
poi
proteina ad entrambe le estremita'
caratteristiche conformazionali
modo
del
per
doppia elica del DNA e'
CArG box, mentre il tratto centrale, ricco in A/T, presenta
stretto. II SRF sfrutta le
irregolare
sigillano la superficie superiore
con
maggiore
core
e
fornisce la
famiglia MADS
di