Virus di Epstein-Barr C. Mengoli, 2008 Tassonomia ► Il virus di Epstein-Barr, EBV, è un membro delle Herpesviridae. ► Appartiene alla sottofamiglia Gammaherpesvirinae, genere Lymphocryptovirus. ► L'infezione è comune, diffusa ubiquitariamente e, in età infantile, solitamente subclinica. Infezione acuta e oncogenicità ► La mononucleosi infettiva (M.I.) con anticorpi eterofili è la manifestazione morbosa più comune (interessa soprattutto l’adolescente, il giovane adulto). ► La MI comprende la triade clinica costituita da febbre, linfoadenopatia, angina. ► Inoltre EBV provoca il linfoma di Burkitt africano e il carcinoma nasofaringeo. Flash storico ► Descrizione di Filatov e Pfeiffer alla fine del 19° secolo della "febbre ghiandolare" (Drusenfieber) ► Descrizione di sei casi clinici di M.I. in giovani adulti (Sprunt e Evans, 1921) ► Downey, 1923: descrizione dettagliata dei linfociti atipici nella M.I. Anticorpi eterofili, linfoma e virus ► Paul-Bunnell (1932); Davidsohn (1937): descrizione di agglutinine attive su emazie di pecora previo assorbimento dell'anticorpo eterofilo su cellule renali di cavia o eritrociti di bue. ► Descrizione di un linfoma insolito con predilezione di capo e collo (Burkitt, 1958) ► Epstein, Barr, Achong (1964): descrizione di particelle virali simili-erpetiche in colture di cellule di linfoma di Burkitt. Aspetti virologici icosaedrica, = 180-200 mm, involucro complesso. Nucleocapside = 100 nm, 162 capsomeri allineati regolarmente con il “modulo erpetico" 5:3:2. ► Virione costituito da numerosi polipeptidi distinguibili all'analisi SDS-PAGE. ► Genoma a DNA, lineare, doppio filamento, 172 kbp, 101 3 megadaltons. ► In vivo cresce produttivamente nelle cellule epiteliali orafaringee e nei linfociti B; ambedue i tipi di cellula hanno recettori di superficie per EBV (CD21, recettore per C3d). ► Simmetria Linfoma e Mononucleosi Werner e Gertrude Henle (1966, 1968): ► sviluppano un procedimento di IF indiretta per ricercare anticorpi anti-EBV ► dimostrano alti titoli anticorpali nel siero di pazienti con linfoma di Burkitt e con M.I. Linfotropismo virus cresce in vitro solo nei linfociti B umani e di certi primati ; generalmente non produce effetto citopatico. ► A seguito dell'infezione, cellule che contengono il genoma virale si trasformano o immortalizzano. ► Le cellule trasformate sono positive alla ricerca degli antigeni virali in sede nucleare e alla ricerca del genoma virale mediante ibridazione DNA-DNA. ► Il Eventi precoci linfociti B (e certi linfociti null con recettori per il complemento) sono dotati di recettore per EBV. ► Nel nucleo della cellula infetta compare EBNA prima che inizi la sintesi di proteine virali. ► Nelle cellule trasformate alcune copie del genoma virale possono integrarsi nel DNA cellulare, benchè la maggior parte rimanga in forma libera, circolare, non integrata (episomiale). ►I Integrazione ► L'integrazione viene stimolata da mitogeni B-specifici (LPS). ► La cellula ospite si immortalizza sia che il virus si integrato, sia che sia episomiale, sia che si trovi in ambedue le forme. Linee linfoblastoidi ► Normalmente meno del 10% delle cellule B esposte al virus forma linee continue; la cellula trasformata contiene numerose genocopie virali ; produce e/o secerne Ig. ► Le linee cellulari che contengono genoma di EBV si distinguono in produttrici e non produttici. Le prime contengono VCA (antigene virale capsidico) nel citoplasma, liberano virioni maturi, esprimono EA (early antigens) in presenza di 5'-bromodeossiuridina (BUdR) o 5 -iodo, 2-deossiuridina (IUdR). Latenza ► Per la maggior parte del tempo EBV rimane latente sia in vivo (nel linfociti circolanti) sia in vitro (in linee cellulari trasformate). ► La trasmissione parenterale è rara ma riveste importanza nel paziente trapiantato. Epidemiologia ► Negli USA e nel Regno Unito prima dei 5 anni il 50% della popolazione è sieroconvertita. ► Nell'età adulta il 90-95% della popolazione è in possesso di anticorpi. ► Nei pesi tropicali e nei gruppo socio-economici inferiori gli anticorpi compaiono prima. ► Una seconda “ondata” di sieroconversioni si ha nel secondo decennio di vita. Prima infezione ► La malattia clinicamente manifesta compare più frequentemente negli adolescenti e nelle popolazioni dove l'infezione primaria ha luogo tardivamente (fra i 15 e 24 anni). ► L'incidenza è uguale in uomini e donne (2 anni prima in media nella donna, all’età di 14-16 anni). ► Gli adolescenti e gli adulti con infezione primaria sviluppano una M.I. nel 25-70% dei casi. Viral shedding ► Cariche virionali modeste sono documentabili nella faringe dei malati con M.I. (50-100% dei casi). ► EBV viene emesso dall'orofaringe per lunghi periodi (fino a 18 mesi) dopo la prima infezione. ► Il virus può essere isolato dal tampone faringeo o gargarizzato di 12-25% dei sieropositivi sani Immunosoppressi Gli immunosoppressi emettono il virus con frequenza maggiore: pazienti con tumori solidi (27%) pazienti con HIV-1 (50%) trapiantati renali (56-70%) pazienti critici affetti da leucemie o linfomi (7492%). Circolazione ► Il virus è labile nell'ambiente esterno. ► Trattasi di un agente molto diffuso a bassa contagiosità che richiede contatto intimo tra virus shedder asintomatico e individuo suscettibile. ► Le epidemie non esistono. ► I malati con M.I. riportano contatti con altri pazienti affetti dalla stessa malattia solo nel 6% dei casi. ► La morbilità più alta si osserva nei collegi universitari e fra i militari. Clinica ► ► ► ► ► Faringite, febbre, linfadenopatia. Febbre nel 90% dei casi. Malessere e cefalea sono frequenti. La faringotonsillite con impegno bilaterale delle tonsille, iperemia (con o senza essudato); frequenti le petecchie al palato. Eruzione esantematica nel 5% (90-100% se il malato prende ampicillina) Il rash può essere maculopapuloso, petecchiale, scarlattinoso, orticarioide o simile a eritema multiforme ► ► ► Adenopatia comune (80-90% dei casi), solitamente generalizzata, più evidente nel distretto retrocervicale. Splenomegalia nel 50% dei casi. Lieve epatite con epatomegalia (10-15% dei casi), elevazione transaminasemica (80-90%), ittero (5%). Complicanze ► Rare localizzazioni d’organo risultano rappresentate da sindromi neurologiche, pericardite, miocardite, orchite. Quadro ematologico della MI ► Più del 50% dei leucociti sono cellule mononucleate, più del 10% dei linfociti sono atipici cellule di Downey ► Trattasi di linfociti CD8+, soppressori/citotossici, attivati ► Il citoplasma ampio, basofilo, vacuolizzato, con margini talvolta “arrotolati”; il nucleo è ovale, reniforme, lobulato, con cromatina irregolare; talora sono riconoscibili nucleoli ► Nel complesso, il quadro ematologico periferico appare polimorfo ► Il midollo osseo è normale Morte ► Può conseguire a malattia grave (rara), con polmonite, febbre, pancitopenia, proliferazione virale esuberante in individui apparentemente sani in precedenza ► La morte può anche essere causata da complicanze neurologiche, rottura di milza, complicanze ematologiche (trombocitopenia, granulocitopenia), insufficienza epatica (rarissima), miocardite, ostruzione delle vie aeree Sindrome di Duncan ► EBV può svelare una immunodeficienza selettiva familiare legata al cromosoma X, la sindrome di Duncan. ► I maschi affetti possono morire in corso di infezione primaria (nel 40% dei casi), oppure, diversi anni anni dopo l’episodio di M.I., possono presentare: agammaflobulimenia linfoma linfocitico anemia aplastica Complicanze ematologiche ► Anemia emolitica autoimmune da agglutinine fredde (solitamente anti-i). ► Trombocitopenia; raramente grave; possibile genesi autoimmune. Reticoloendotelite ► V’è una reticoloendotelite diffusa. ► I linfonodi sono ingrossati, con un aumento del numero dei follicoli che appaiono ingranditi. ► I centri germinativi sono ingrossati; contengono blasti, istiociti e linfociti. ► La milza é aumentata di volume (di 2 o 3 volte) con edema capsulare e trabecolare. V’è iperplasia della polpa rossa, nella quale sono evidenti cellule blastiche pleiomorfiche; la polpa bianca è relativamente normale; sono frequenti emorragie focali, soprattutto subcapsulari. Fegato e SNC ► Nel fegato sono riconoscibili alterazioni modeste con infiltrati linfo-monocitario negli spazi portali. ► Per quanto riguarda il sistema nervoso centrale, nei casi fatali sono stati notati segni di degenerazione neuronale, manicotti perivasali, emorragie perivascolari, iperplasia astrocitaria; l'infiltrazione mononucleare è scarsa. Patogenesi della MI ► La via di penetrazione del virus è l'orofaringe. ► Le cellule dell'epitelio sono dotate di recettori per EBV (gli stessi che legano C3d). ► Studi di citoibridazione hanno dimostrato EBV DNA entro le cellule epiteliali orofaringee. ► Il virus infetta anche le cellule B linfocitarie orofaringee. ► Nel corso dei 30-50 gg di incubazione il virus si dissemina nel tessuto linforeticolare, sistemicamente. Risposta immune ► La risposta immune contro i B-linfociti trasformati è umorale e cellulare. ► Fra gli anticorpi vi sono quelli diretti contro il virus, anti-EBV anticorpi eterofili. Anticorpi virus-specifici La tecnica è quella dell’immunofluorescenza indiretta (nel caso di EBNA, immunofluorescenza indiretta anti-complemento). Possono essere ricercati anticorpi contro quattro principali sistemi antigene: VCA EA/D (early antigen - diffuse component) EA/R (early antigen - restricted component) EBNA anti-VCA IgM anti-VCA: persistono 4-8 sett., sensibili (100%) e specifici; precoci IgG anti-VCA: persistono a vita (significativi se ad alto titolo, importanza epidemiologica); precoci; gli anticorpi neutralizzanti si correlano con le IgG anti-VCA e sono indicatori di immunità anti-EA Anti-EA/D (IgG): poco sensibili (70%) ma specifici, precoci; persistono 3-6 mesi, sono correlati con malattia severa ► anti-EA/R (IgG): pochissimo sensibili, malattia severa o protratta, persistono da 2 mesi a 2 anni; alti titoli nel linfoma di Burkitt africano; indice di infezione riattivata nell'immunosoppresso ► anti-EBNA ► Anti-EBNA: compaiono tardivamente (solitamente contrassegnano la risoluzione del quadro di M.I.), persistono a vita nel 100% dei casi ► Gli anticorpi diretti contro antigeni solubili (fissazione del complemento) hanno il significato degli anti-EBNA Profilo sierologico delle sindromi associate ad EBV Igantigene non immune IgM-VCA - IgG-VCA IgA-VCA IgG-EA/D IgA-EA/D IgG-EA/R antiEBNA i. primaria i. primaria i. passata riattivazione in corso recente + + +/+ +/- + + +/+/- + + + +/+/? +/+ LB CNF ++ ++ + ++ ++ ++ ++ + Anticorpi eterofili non assorbiti M.I: Malattia da siero Soggetto sano con anticorpi anti-Forssman ++++ +++ + dopo assorbimento con cellule emazie di renali di bue cavia +++ 0 0 0 0 + Anticorpi eterofili ► Presenza transitoria ► Agglutinano le emazie di pecora e di cavallo, emolizzano le emazie di bue. ► La classe immunoglobulinica è prevalentemente IgM ► Anticorpi eterofili con specificità Paul-Bunnell coesistono con anticorpi anti-Forssman ► Non v'è buona correlazione fra gravità della malattia e titolo eterofili. ► Il significato patogenetico è incerto Autoanticorpi ► Sono anche frequenti auto-anticorpi contro piastrine neutrofili linfociti antigeni nucleari ampicillina. Immunità cellulare ► Si osserva una depressione dell’immunità cellulare, con anergia cutanea, ridotta rispota blastica a mitogeni ed antigeni in vitro. ► La risposta immune cellulare antivirale include cellule T citotossiche specifiche e cellule natural killer. ► Linfociti T citotossici per linee cellulari contenentei EBV sono stati documentati in pazienti con MI. Risoluzione ► Con la guarigione clinica il virus non viene eliminato, ma persiste allo stato latente, potendo riattivarsi soprattutto in corso di immunosoppressione. ► La MI non ricompare, comunque. Patogenicità sperimentale La malattia non è trasmissibile all'animale. Linfomi maligni sono stati peraltro indotti in alcuni primati o in roditori neonati, ovvero immunosoppressi, inoculando linee linfoblastoidi umana contenenti EBV o EBV cell-free. Oncogenicità ► L’infezione latente da EBV è associata alla generazione di linee B-linfocitarie immortalizzate ► Questo dimostra il potere oncogeno del virus Latenza ► Dopo l’infezione primaria, i linfociti B del sangue periferico contengono EBV nella proporzione di un cellula su 105 - 106. ► Quando 106 - 107 linfociti del sangue periferico ottenuti da un soggetto EBVsieropositivo sono messi in coltura in assenza di linfociti T funzionanti, è probabile che emergano linee continue B-linfocitarie contenenti EBV Trasformazione e latenza ► Il 10% delle cellule B primarie poste in coltura in presenza di EBV si infetta e si trasforma in elemento capostipite di linea linfoblastoide ► La replicazione virale in queste cellule trasformate è minimale o non dimostrabile ► La presenza del virus è tuttavia documentata dall’espressione di antigeni caratteristici dell’infezione virale “latente” Marcatori di latenza ► Nei B linfociti B con infezione latente, EBV esprime non soltanto 6 EBNAs e 2 LMPs, ma anche 2 piccoli RNA non poliadenilati (EBERs) e “Bam A rightward transcripts”, or BARTs. ► Questi prodotti genici mantengono l’infezione latente e fanno sì che linfociti B quiescenti entrino nel ciclo mitotico, iniziando una attività proliferativa continua. Espressione di geni di latenza Trasformazione ► L’effetto sulla crescita cellulare è immediato; la maggior parte delle cellule infettate entra nel primo ciclo di sintesi del DNA entro 4872 ore dopo l’infezione ► Il linfocita B con fenotipo resting è la cellula più suscettibile a subire la conversione in elemento linfoblastoide Sindromi neoplastiche associate ad EBV Neoplasie e sindromi linfoproliferative ► ► ► ► ► Linfoma di Burkitt africano: associazione con EBV nel 90% dei casi LB extra-africano: associazione nel 15% dei casi Carcinoma nasofaringeo (squamoso o indifferenziato, Cina meridionale); associazione nel 100% dei casi Altri linfomi B-linfocitari dell'immunodepresso, nell’AIDS in particolare; nell’atassia-teleangectasia Sindromi linfoproliferative policlonali nell'immunosoppresso (soprattutto nel trapiantato renale e midollare): PTLD 1600 TACROLIMUS 160.000 MYCOPHENOLATE PREDNISONE 1400 CYCLOSPORIN Ig monoclonal peaks 120.000 ACUTE GVHD 1200 CHRONIC GVHD BK+HEMATURIA 1000 80.000 800 lymphocytes/ml 40.000 First EBV detection Plasma EBV assay (3500 copies/ml) (0 copies/ml) EBV DNA clearance BMT time 04-Apr 21-Mar 28-Mar 14-Mar 07-Mar 28-Feb 21-Feb 14-Feb 07-Feb 31-Jan 24-Jan 17-Jan 10-Jan 03-Jan 27-Dec 20-Dec 13-Dec 0 06-Dec Genomic copies of EBV in peripheral blood lymphocytes/ml 600 400 200