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Capitolo 9. Attivazione dei linfociti T
I linfociti T maturi che non hanno mai incontrato l’antigene si concentrano negli organi linfoidi secondari dove hanno la possibilità di riconoscere antigeni presentati dalle MHC di cellule dentritiche
mature e quindi di attivarsi. Una volta attivate seguono i processi di espansione e la differenziazione
in cellule effettrici o della memoria. Sia i linfociti T naive che le cellule dentritiche mature sono attratti
nelle aree T per azione di chemochine che interagiscono con i recettori CCR7. Una volta avvenuto l’incontro, il riconoscimento dell’antigene presentato dalle MHC e l’interazione tra le proteine B7 espresse
dalla cellula dendritica e il corecettore CD28 determinano l’attivazione dei linfociti T. Una volta attivato
il linfocita inizia a secernere IL-2 (interleuchina 2), una citochina autocrina che avvia l’espansione
clonale. Alcuni linfociti T lasciano gli organi linfoidi ed entrano in circolo, altri rimangono lì per aiutare
i linfociti B a differenziarsi in plasmacellule. Le risposte T terminano principalmente per apoptosi dei
linfociti T attivati dovuta alla eliminazione dell’antigene che li depriva dello stimolo di sopravvivenza.
1.1
Attivazione dei linfociti CD4
L’attivazione presuppone che antigene e linfociti naive si trovino nello stesso tessuto linfoide. L’antigene raggiunge i linfonodi mediante drenaggio linfatico oppure raggiunge la milza attraverso il circolo
ematico. L’antigene si sposta trasportato dalle cellule dendritiche e viene presentato in associazione
alle molecole MHC di classe II per l’attivazione dei CD4.
Per l’attivazione dei linfociti CD4 sono necessari due segnali: riconoscimento dell’antigene associato a MHC e molecole costimolatorie B7-1 e B7-2. Per la proliferazione è necessaria inoltre la
autosecrezione di IL-2; affinchè vi sia secrezione di Il-2 e parallela espressione del suo recettore è prima necessario che il linfocita abbia riconosciuto l’antigene. In questo modo abbiamo proliferazione
delle sole cellule specifiche e necessarie, proliferazione che coinvolge dunque un unico clone cellulare
e definita espansione clonale. Con l’eliminazione degli antigeni la maggior parte dei T attivati muore
riportando il numero di linfociti a condizioni basali.
1.2
Attivazione dei linfociti CD8
Affinchè vi sia attivazione questa volta serve che l’antigene sia presentato da molecole MHC di classe I.
I linfociti T CD8 hanno il compito di eliminare cellule infettate. Le risposte da questo gruppo di linfociti
sono sollecitate da peptidi microbici presenti nel citosol delle cellule infette: questo pone un problema
perchè gli antigeni riconosciuti possono essere prodotti anche all’interno di una cellula che non è una
APC professionale; le cellule dendritiche hanno però la speciale capacità di catturare e ingerire le cellule
infette o tumorali e di presentarne gli antigeni ai CD8 naive in un processo detto cross-presentazione.
L’attivazione dei CD8 è facilitata dall’azione dei CD4: nel caso di una forte risposta innata quest’ultima è superflua ma diventa indispensabile per risposte a infezioni latenti,tumori ecc. I linfociti T helper
producono citochine che stimolano la differenziazione dei CD4, inoltre esprimono la proteina CD40L
che viene riconosciuta dal recettore CD40 sulle APC: questo ne aumenta l’efficacia nello stimolare la
differenziazione dei CD8.
Alla pari dei CD4, anche i CD8 vanno incontro ad espansione clonale tuttavia in modo molto più
massiccio: si passa da un linfocita specifico ogni 106 linfociti a uno ogni dieci. In seguito all’espansione
si ha la differenziazione in cellule effettrici CTL caratterizzate dalla presenza di granuli citoplasmatici
legati alla membrana contenenti proteine citolitiche quali la perforina e granzimi. Inoltre sono in
grado di produrre citochine tra cui IFN-γ e TNF. Due fattori di trascrizione sono richiesti per questa
nuova espressione genica: T-Bet e Eom.
1.3
Molecole costimolatorie
La differenziazione e proliferazione dei linfociti T naive richiedono molecole costimolatorie espresse dalle
APC: in assenza di costimolazione, anche in caso di incontro con l’antigene, i linfociti T muoiono per
apoptosi in quanto incapaci di rispondere. La molecola meglio caratterizzata sui linfociti T è il recettore
di membrana CD28 che lega le glicoproteine costimolatorie B7-1 e B7-2 espresse sulle APC; B7-2 è
espressa costitutivamente mentre B7-1 solo in cellule attivate. Prodotti microbici che legano il TLR
e citochine, soprattutto IFN-γ, aumentano l’espressione delle B7, così come l’interazione CD40L:CD40.
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Le cellule dendritiche sono quelle che presentano la maggior espressione di queste glicoproteine e
quindi rappresentano le cellule più potenti nell’attivare i linfociti T naive. Molti adiuvanti hanno come
funzione lo stimolare l’espressione di molecole costimolatorie sulle APC.
L’assenza di molecole costimolatorie sulle APC contribuisce alla tolleranza verso gli antigeni self,
poichè ogni APC presenta antigeni self ai linfociti T è proprio la mancanza di molecole costimolatorie
che assicura che le cellule T non si attivino in associazione alla selezione negativa durante la fase di
maturazione. I linfociti T effettori e della memoria sono meno dipendenti dalla costimolazione di B7 e
sono quindi in grado di rispondere ad APC in tessuti non linfoidi in cui non sono espresse le B7. Il
controllo delle funzioni delle cellule T effettrici è effettuato da linfociti T regolatori deputati a inibire le
funzioni effettrici.
Il meccanismo di azione pro attivatorio dell’interazione CD28:B7 è compreso in modo parziale. I
segnali prodotti aumentano la produzione di citochine, specialmente l’autocrina IL-2, inoltre si ha
l’aumentata espressione della proteina anti apoptotica Bcl-x.
Oltre alle molecole attivatrici CD28 esistono anche molecole costimolatorie inibitrici sempre appartenenti alla famiglia delle CD28, primo esempio la CTLA-4. Questa lega sempre molecole B7 tuttavia funge da regolatore negativo nella attivazione. Altra molecola inibitoria è PD-1 che lega molecole
appartenenti alla famiglia delle B7 chiamate B7-DC e B7-H1 andando a regolare negativamente l’attivazione del linfocita. Ultimo recettore costimolatore è chiamato ICOS e lega il ligando di ICOS con
particolare rilevanza nell’attivare funzioni effettrici quali la produzione di IL-10 e IL-4. L’attivazione di
CD28 è cruciale per dare inizio alla risposta dei linfociti CD4 mentre quella di ICOS per le cellule T
effettrici. Si ipotizza che CTLA-4 inibisca rispote acute negli organi linfoidi mentre PD-1 quelle croniche
e quelle in tessuti non linfoidi.
1.4
Trasduzione del segnale
La trasduzione del segnale in cellule naive attiva geni normalmente silenti i cui prodotti sono responsabili della risposta e delle funzioni del linfocita attivato. Prima abbiamo visto come citochine e molecole
costimolatorie fossero un punto chiave nell’espansione clonale e nella differenziazione: l’attivazione del
TCR è responsabile invece della specificità.
Il TCR non possiede attività enzimatica intrinseca e si trova associato al complesso CD3 e alla catena
ζ formando il complesso del TCR che possiede, nel versante citoplasmatico, strutture dette domini
ITAM: la fosforilazione di questi domini dà inizio alla trasduzione del segnale. Si assiste all’attivazione
di via di trasduzione parallele che confluiscono nell’attivazione di determinati fattori di trascrizione;le
vie sono principalmente tre:
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• la via della calcineurina che attiva NFAT
• la via della PKC che attiva NF-κB
• la via delle MAP chinasi che attivano AP-1
Queste tre vie sono a loro volta attivate mediante specifiche tirosin chinasi che mediano il segnale tra
TCR e gli enzimi sopra citati.
Tirosin chinasi Una volta formato il complesso del TCR quando il recettore si lega all’antigene e
MHC una tirosin chinasi chiamata Lck associata a CD4 e CD8 si sposta vicino alle sequenze ITAM del
complesso CD3 e della catena ζ attivandosi e fosforilando le tirosine in esse contenute. Queste tirosine
fosforlate fungono da ancoraggio per un’altra tirosin chinasi chiamata ZAP -70 che una volta legatasi
viene anche essa fosforilata da Lck attivandosi e andando a fosforilare numerosi substrati che fungono
da proteine adattatrici di altre molecole coinvolte nella trasduzione del segnale. Altro gruppo di chinasi
importanti sono le PI-3 chinasi attivate dalla costimolazione di CD28: questi enzimi catalizzano la
generazione di fosfatidil inositolo tre fosfato (PIP3 ) a partire dal PIP2 di membrana. Le attività delle
chinasi citate sono regolate da specifiche tirosine fosfatasi reclutate dal complesso TCR e chiamate
SHP-1 e SHP-2 che inibiscono la trasduzione del segnale e un’altra è la SHIP.
Formazione della sinapsi immunologica La regione di contatto tra il linfocita T e la sua APC prende
il nome di sinapsi immunologica. Le molecole che vengono subito spostate verso il centro di questa
struttura sono il complesso TCR, i corecettori CD4 o CD8, i recettori per i costimolatori (CD28) e vari
enzimi associati. La segnalazione viene avviata all’interno di questa struttura sovramolecolare.
Reclutamento e attivazione delle proteine adattatrici ZAP-70 si porta a fosforilare parecchie proteine adattatrici in grado di legarsi a molecole segnalatorie. Le proteine adattatrici presentano domini
ricurrenti di tipo SH2 o SH3 che consentono loro di formare cluster di enzimi in tempi rapidi. Un
evento chiave dell’attivazione del linfocita T è la fosforilazione da parte di ZAP-70 della proteina adattatrice LAT, la quale è in grado di legarsi direttamente alla fosfolipasi Cγ1; la fosfolipasi è una molecola
fondamentale che recluta altre proteine tra le quali SLP-76 e Grb-2.
Via della MAP chinasi La via Ras è iniziata a seguito del legame del TCR e porta all’attivazione di ERK,
membro fondamentale della famiglia delle MAP kinasi che porta alla mobilitazione di diversi fattori di
trascrizione. Ras nella sua forma inattiva è legato ad una molecola di GDP che, quando viene sostituita
da una di GTP, è responsabile dell’attivazione. L’attivazione di Ras coinvolge le proteine LAT e Grb-2,
in quanto la catena di eventi è la seguente:
1. Fosforilazione di LAT da parte di ZAP-70
2. Reclutamento di Grb-2 su LAT
3. Reclutamento del fattore Sos da parte di Grb-2/LAT
4. Scambio di GTP per GDP su Ras grazie alla catalisi di Sos
5. Attivazione delle MAP kinasi
Esistono tre MAP kinasi principali nei linfociti T, delle quali il prototipo è ERK. L’attivazione di ERK lo
porta a traslocare nel nucleo e a fosforilare una proteina detta Elk, la quale stimola la trascrizione di
Fos, un componente del fattore di trascrizione AP-1.
In parallelo all’attivazione lungo la via Ras si ha il reclutamento di una piccola proteina detta Vav,
la quale scambia GTP per GDP su una proteina detta Rac. Rac in forma attiva inizia una cascata
segnalatoria parallela che termina nell’attivazione della MAP kinasi JNK che si porta a fosforilare c-Jun,
il secondo membro del fattore di trascrizione AP-1.
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Segnali calcio e fosfolipasi dipendenti La fosfolipasi Cγ1 è un enzima citosolico reclutato da LAT
fosforilata e fosforilato da ZAP-70 e altre chinasi. La fosfolipasi fosforilata si porta ad idrolizzare il
fosfolipide di membrana PIP2 producendo così IP3 e DAG. Il ruolo fisiologico di IP3 è l’aumento del calcio citoplasmatico per apertura di canali nel reticolo endoplasmatico; questa fuoriuscita dal reticolo
attiva i canali CRAC che facilitano l’arrivo di altro calcio dal reparto extracellulare (difetti nel gene che
codifica Orai, componente del canale CRAC, sono alla base di alcune rare immunodeficienze umane).
Il calcio citoplasmatico agisce da molecola segnalatoria legandosi a varie calmoduline delle quali una
fondamentale è la calcineurina. Il DAG attiva invece l’enzima PKC che è coinvolto nell’attivazione e
nella traslocazione nucleare di NF-κB.
Attivazione dei fattori di trascrizione I fattori di trascrizione che sono attivati nei linfociti T a seguito
del riconoscimento antigenico sembrano critici per quasi tutte le risposte di queste cellule e sono:
NFAT Questo fattore è richiesto per l’espressione di IL-2, IL-4, e TNF. Questo fattore è presente in forma inattiva serina-fosforilata nei linfociti T a riposo. La sua attivazione è legata alla calcineurina,
che defosforila la molecola e ne svela la sequenza di localizzazione nucleare.
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AP-1 Questo fattore in realtà è una famiglia di molecole leganti DNA. La molecola meglio compresa
è quella formata dalle subunità c-Jun e Fos. AP-1 sembra essere un punto di convergenza di
parecchie vie segnalatorie attivate dal riconoscimento antigenico.
NF-κB Questo fattore è essenziale per la sintesi di parecchie citochine. Nei linfociti a riposo la molecola
è presente in complesso con inibitori specifici (IκB) che ne bloccano l’ingresso nel nucleo; i segnali
del TCR causano l’ubiquitinazione degli inibitori, quindi la loro degradazione e quindi il ripristino
della capacità del fattore di entrare nel nucleo.
1.5
Attenuazione della risposta
I meccanismi inibitori sono mediati da varie strategie quali il reclutamento delle fosfatasi SHP-1, l’attivazione dei recettori inibitori di famiglia CD28 e il reclutamento di proteine dette E3 ubiquitin ligasi
che degradano certe molecole.
Recettori inibitori Il prototipo del recettore inibitorio è CTLA-4, di cui però si sa poco del meccanismo di azione. Normalmente questa molecola è sequestrata in vescicole intracellulari che vengono
rapidamente mobilitate con la formazione della sinapsi immunologica. Nella sinapsi CTLA-4 potrebbe
competere con CD28 per legare le molecole B7 o reclutare fosfatasi che bloccano l’attivazione dei domini
ITAM.
L’altro recettore inibitorio di interesse è PD-1, indotto in linfociti B, T e monociti a seguito dell’attivazione. PD-1 ha due ligandi, PD-L1 e PD-L2, omologhi ai B7 ed espressi su cellule dendritiche
attivate, monociti e altre cellule. Il recettore contiene sul lato citoplasmatico dei domini ITIM che
contribuiscono al reclutamento delle fosfatasi SHP-1 e SHP-2 che attenuano il segnale.
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