TRACCIABILITA' DEI PRODOTTI CASEARI CAPRINI: APPLICAZIONE DI ANALISI
MOLECOLARI
TRACEABILITY OF SOURCE MILK IN GOAT CHEESE: USE OF MOLECULAR ANALYSES
G. Ceriotti1, S. Chessa1, G. Bramante2, P. Bolla1, A. Caroli2, E. Pieragostini3
1
Dipartimento VSA - Facoltà di Medicina Veterinaria, Milano, Italia
2
Dipartimento PROGESA - Facoltà di Agraria, Bari, Italia
3
Dipartimento SBA - Facoltà di Medicina Veterinaria, Bari, Italia
Riassunto
L'identificazione o "tracciabilità" del prodotto primario, in particolare della specie e della razza d'origine,
attraverso l'uso di marcatori biologici oggettivi costituisce un importante obiettivo per la valorizzazione dei
prodotti caseari caprini nazionali. Il presente lavoro riporta i risultati di uno studio preliminare sull'applicabilità
di metodologie molecolari per l'analisi di formaggi caprini. Sono stati utilizzati diversi metodi di estrazione del
DNA dagli alimenti e sostanze organiche. Il DNA è stato efficacemente amplificato mediante primer specifici
per l'analisi del polimorfismo genetico ai loci αs1-caseina e k-caseina caprini, e in seguito analizzato con
successo mediante differenti tecniche molecolari (PCR-SSCP, PCR-RFLP, AS-PCR). I risultati ottenuti sono
preliminari ad un più ampio confronto tra formaggi prodotti da diverse razze caprine italiane, ricercando pattern
molecolari di tipicità. L'analisi avrà la finalità sia di mettere in luce eventuali frodi, come la presenza di latte
vaccino e/o ovino nel formaggio, sia di riconoscere particolari alleli lattoproteici o di altri loci polimorfici,
caratterizzanti le razze caprine autoctone di interesse per la salvaguardia delle risorse genetiche animali italiane e
della tipicità dei prodotti caseari nazionali.
Parole chiave: Prodotti caseari, latte caprino, tracciabilità, analisi molecolare, caseine
Abstract
The valorisation of typical goat cheeses meets the needs of preserving the local country culture and tradition as
well of guaranteeing consumer health by the control of all the steps of production (herd, milk quality, cheesemaking technology). In Italy goat cheese is mainly produced and consumed at local level, such as Cacioricotta in
Apulia. The possibility of identifying or tracing the primary product, mainly the origin breed, by the use of
biologic markers, is an important goal for national goat cheeses. In this field great interest is paid to milk protein
genetic polymorphism. In order to perform an investigation on the possibility of tracing the source milk in goat
dairy products, a preliminary study was carried out on the use of molecular techniques for the analysis of goat
cheese. Some methods for the DNA extraction from food and organic substances were employed. Among them,
a commercial kit for organic material was particularly useful, allowing the extraction of a sufficient DNA
amount from goat cheese. The extracted DNA was efficiently amplified for the analysis of the genetic
polymorphism at the αs1-casein and k-casein loci, and successfully submitted to different molecular techniques
(PCR-SSCP, PCR-RFLP, AS-PCR). The obtained results will allow to perform a wider investigation, comparing
different cheeses produced from goat breeds reared in Italy and researching molecular patterns particularly
useful for the characterisation of typical products. The analysis will aim both to detect frauds, as well as the
presence of cattle or sheep milk in the goat cheese, and to identify particular alleles characterising local breeds
interesting for the safeguard of the Italian animal genetic resources and of the national typical products.
Key words: Cheese, goat milk, traceability, molecular analysis, caseins
Introduzione
In ambito caseario l’Italia vanta una gran varietà di prodotti di diversa origine (Insor 1991) che richiedono una
maggior conoscenza e valorizzazione. Tra i fattori di variabilità che possono avere un effetto particolarmente
rilevante sulla tipicità del prodotto caseario, la biodiversità svolge un ruolo di grande interesse (Gandini et al.
1996; Pieragostini et al.2002). Si tratta di una biodiversità in senso lato che riguarda non solo le caratteristiche
biologiche intrinseche al latte trasformato, ma anche le differenze microbiologiche necessarie a conferire
particolarità strutturali e organolettiche al prodotto caseario finito.
La valorizzazione dei formaggi tipici caprini italiani riveste un duplice interesse, innanzitutto per lo stretto
legame con la cultura e le tradizioni del territorio d'origine, in secondo luogo per l'importanza di un'efficace
salvaguardia del consumatore in tutte le fasi della filiera produttiva: allevamento, qualità della materia prima e
tecnologia di produzione. In Italia il formaggio di capra, come ad esempio il Cacioricotta pugliese, viene
principalmente prodotto e consumato nei luoghi dove è realizzato questo tipo di allevamento. Oltre alle razze
caprine locali, vengono sempre più spesso utilizzate razze cosmopolite maggiormente produttive, in particolare
la Camosciata e la Saanen.
La possibilità di legare alcune produzioni di nicchia ad una razza locale, potrebbe costituire da una parte un
importante mezzo per difendere la tipicità dei prodotti, dall'altra un utile strumento per il recupero e la
valorizzazione di razze caprine autoctone.
L'identificazione o "tracciabilità" del prodotto primario, in particolare della specie e razza d'origine, attraverso
l'uso di marcatori biologici oggettivi costituisce quindi un importante obiettivo per la valorizzazione dei prodotti
caseari caprini nazionali. In questo contesto rivestono particolare importanza i polimorfismi genetici caseinici. I
geni che codificano per le caseine sono strettamente associati ed organizzati in un cluster (Ferretti et al., 1990;
Threadgill e Womack, 1990) che comprende l'αs1-caseina (CSN1S1), la β-caseina (CSN2), l'αs2-caseina
(CSN1S2) e la k-caseina (CSN3).
Negli ultimi anni, ha assunto un interesse sempre maggiore il polimorfismo genetico delle caseine caprine
(Martin 1993, Grosclaude et al., 1994), anche a causa delle relazioni con la qualità e le caratteristiche di
composizione del latte. Le ricerche riguardano principalmente la frazione CSN1S1 la quale è caratterizzata da un
elevato polimorfismo qualitativo e quantitativo ed ha una notevole influenza sulle proprietà tecnologiche e
nutrizionali del latte (Pirisi et al., 1994; Remeuf et al., 1995; Lamberet et al., 1996; Martin et al., 1999;
Bevilacqua et al., 2001). Il locus è sotto il controllo di diversi alleli autosomici, come già indicato dai lavori
effettuati sui polimorfismi genetici del latte caprino mediante tecniche elettroforetiche per la separazione delle
proteine (Boulanger et al., 1984; Grosclaude et al., 1987; Mahé e Grosclaude, 1989).
E' stato recentemente possibile identificare un numero elevato di mutazioni che interessano la trascrizione e/o la
traduzione dei geni caseinici mediante analisi del DNA genomico e dell’RNA messaggero (cfr. Rando et al.,
2000, per una rassegna sull’argomento). In particolare, sono state identificate mutazioni responsabili nella capra
della mancata sintesi di frazioni proteiche da parte di ciascuno dei geni codificanti per le frazioni sensibili al
calcio CSN1S1 (Martin et al. 1999), CSN1S2 (Ramunno et al. 2001) e CSN2 (Ramunno et al. 1995), nonché del
livello ridotto di espressione di alcuni alleli di CSN1S1 (Leroux et al. 1992; Jansa Perez et al. 1994) e di CSN1S2
(Ramunno et al., 2002).
Recenti studi sulla CSN3 caprina (Budelli et al., 2000) hanno inoltre confermato l’esistenza di polimorfismo
genetico suggerito da Di Luccia et al. (1990), identificando le mutazioni responsabili dei differenti fenotipi
proteici a livello di DNA (Caroli et al., 2001). Ulteriori polimorfismi genetici al locus CSN3 sono stati descritti
da Yahyaoui et al. (2001).
Allo scopo di condurre un'indagine sulla tracciabilità del latte di origine nei prodotti caseari, è stato effettuato
uno studio preliminare sull'applicabilità di metodologie molecolari per l'analisi di formaggi caprini. In particolare
sono stati presi in considerazione i polimorfismi genetici dei loci caseinici, proprio a causa del notevole
polimorfismo che tali geni presentano e delle importanti ripercussioni sulle caratteristiche qualitative e
tecnologiche del latte.
Materiali e metodi
Il campionamento dei prodotti caseari da analizzare ha compreso sia formaggi derivati esclusivamente da latte
caprino, che quelli ottenuti da latte misto vaccino e caprino. Le razze caprine erano differenti secondo il prodotto
caseario analizzato. L’estrazione del DNA è stata effettuata mediante l'utilizzo di kit commerciale per alimenti
(Invisorb Spin Food Kit 1 Invitek GmbH – Berlin) o per sostanze organiche (Invisorb Spin Stool DNA Kit
Invitek GmbH – Berlin).
Il DNA estratto è stato amplificato con primer specifici per i loci CSN1S1 e CSN3 (tabella 1). L'avvenuta
amplificazione è stata verificata su gel d'agarosio al 2%. Successivamente i prodotti di PCR sono stati analizzati
mediante i metodi riportati in tabella 1, parzialmente modificati secondo le esigenze di laboratorio.
Tabella 1: Metodiche utilizzate per l’analisi dei loci caseinici .
Locus
Allele identificabile
Specie
Tecnica
Bibliografia
CSN1S1
F, A/0, B/E
Caprina
PCR-RFLP
Ramunno et al. 2000
CSN1S1
B, C
Bovina
PCR-SSCP
Jann et al. 2002
CSN1S1
0, non 0
Caprina
AS-PCR
Cosenza et al. 2001
A, B
Caprina
PCR-SSCP
Caroli et al. 2001
CSN3
Risultati e discussione
Per quanto riguarda l'estrazione del DNA, è risultato efficace il kit commerciale per sostanze organiche. Tale
metodo ha permesso di ottenere, seguendo le istruzioni fornite dalla ditta produttrice e partendo da circa 300 mg
di prodotto caseario, una media di 150 µg/ml di DNA di buona qualità e purezza, ed è quindi consigliabile sia
per velocità di esecuzione, sia perché evita la manipolazione di sostanze tossiche all'operatore rispetto a
metodiche di estrazione tradizionali.
L'amplificazione del DNA estratto è stata efficace: il prodotto di amplificazione era ben visibile anche su gel
d'agarosio. La figura 1 mostra i pattern elettroforetici su gel d’agarosio di alcune sequenze amplificate per
l’identificazione dell’allele CSN1S1*F (223 pb) e degli alleli A e B al locus CSN3 (400pb).
Figura 1: Tracciati elettroforetici, su gel d'agarosio 2%, di campioni di DNA estratti da diversi formaggi (1 =
capra Saanen; 2 =capra Camosciata + vacca; 3 = capra Jonica; 4 = incroci caprini) amplificati per l'analisi dei
loci CSN1S1 (a) e CSN3 (k). M = marcatore PUC19.
a1
a2
a3
a4
M
k1
k2
k3
k4
Le analisi dei prodotti di PCR mediante le metodiche opportune, atte ad identificare particolari alleli caseinici,
hanno dato risultati soddisfacenti. Come esempio viene riportata, in figura 2, la migrazione elettroforetica
ottenuta mediante tecnica SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) di cinque amplificati derivanti da
diversi tipi di formaggio, per il locus CSN3.
La metodica utilizzata consente la chiara identificazione, sul gel, delle bande relative alla CSN3 caprina. Il
ferogramma n° 3 il quale presenta un pattern distinto dagli altri, corrisponde ad un campione di formaggio
prodotto esclusivamente con il latte della capra Jonica la quale è venuta affermandosi in Puglia nella seconda
metà del XX secolo, a seguito dell'incrocio tra la razza Maltese e la popolazione caprina autoctona (Bramante et
al., 2002). La banda indicata con la freccia bianca nella figura 2 è relativa alla variante CSN3*B, ed è visibile
solo nella razza Jonica, dove tale allele è stato osservato con una frequenza superiore al 10% (Caroli et al. 2001).
La tecnica utilizzata potrebbe quindi permettere di identificare, in formaggi caprini da valorizzare come prodotti
di nicchia, alcune varianti genetiche presenti con una certa frequenza nella razza che potrebbe essere legata al
prodotto tipico, o addirittura evidenziare alleli razza-specifici.
Figura 2: Analisi SSCP del locus k-caseina sul DNA estratto dai
formaggi riportati nella tabella sottostante. La freccia bianca
indica la banda relativa all'allele B della k-caseina caprina.
Numero
Tipo
Origine del latte
1
cagliata
2
fresco
vaccino + capra Camosciata
3
fresco
capra Jonica
4
fresco
incroci caprini
capra Saanen
1
2
3
4
5
Il DNA estratto dai formaggi è stato anche efficacemente amplificato e analizzato per la CSN1S1 bovina (tabella
1). L'alta omologia tra sequenze caseiniche caprine e bovine, infatti, consente che primer disegnati su specifiche
sequenze bovine amplifichino anche il DNA caprino, e viceversa. Lo studio del diverso comportamento
molecolare di amplificati caprini, bovini ed eventualmente ovini, mediante tecnica SSCP, potrebbe rivelarsi di
particolare importanza al fine di mettere in luce eventuali frodi, quali la presenza di latte di altre specie nel
prodotto caseario caprino. Un risultato analogo, basato su metodiche molecolari, è stato ottenuto con successo
per quanto riguarda l'identificazione di DNA bovino miscelato a DNA bufalino (Bardin et al.¸ 1994), sempre
sulla base di differenze a loci caseinici (CSN2, CSN3) tra le due specie.
Gli interessanti risultati ottenuti nella presente indagine consentiranno di effettuare una più ampia ricerca e di
confrontare diversi formaggi caprini italiani, ricercando pattern molecolari di tipicità del prodotto. L'analisi avrà
la finalità sia di mettere in luce eventuali frodi, come la presenza di latte vaccino e/o ovino nel formaggio, sia di
riconoscere particolari alleli lattoproteici o di altri loci polimorfici, caratterizzanti le razze caprine autoctone di
interesse per la salvaguardia delle risorse genetiche animali italiane e della tipicità dei prodotti nazionali.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato condotto nell'ambito del Progetto di Ricerca PRIN 2001: "Valorizzazione dei prodotti tipici
attraverso lo studio dei più significativi parametri di qualità del latte ovino e caprino".
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