4° CONFRONTO INTERISTITUZIONALE IN
PATOLOGIA MAMMARIA DA SCREENING
L’attività proliferativa nel carcinoma della
mammella: come valutarla?
Dott. Enrico Orvieto
UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova
Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova
Padova 23-24 novembre 2011
Ki-67: Figlio di un Dio minore
www.google.com
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Ki67 immunohistochemistry: a valuable marker in
prognostication but with a risk of misclassification:
proliferation subgroups formed based on Ki67
immunoreactivity and standardized mitotic index
Jalava et al 2006
• Valori ≤15; >16 e ≤30; >30 discriminavano nelle
pazienti endocrino responsive diverse categorie di
rischio.
• Valutazione effettuata su area periferica della
neoplasia, con maggior proliferazione, contando 200
cellule
St. Gallen 2009
357 tumori della mammella studiati con gene expression profiles (50-gene
PAM50)
La distinzione tra Luminal A e B avviene prevalentemente sulla base
dell’espressione di geni coinvolti nella proliferazione
Nei 144 casi identificati come luminal (dalla metodica molecolare) si è
individuato il cut-off del Ki67 (14%) in grado di separare i casi luminal A
dai luminal B
L’espressione IHC di ER, PgR, HER2 e di Ki67 (cut-off 14%), è stata
utilizzata come surrogato alla classificazione molecolare dei Luminal in
una casistica di oltre 4000 casi
St. Gallen 2011
•Un core di 0,6 mm selezionato casualmente nel tessuto neoplastico
•Percentuale di cellule positive sul totale delle cellule neoplastiche
“This study has several limitations. The main weaknesses of
immunohistochemical approaches are limited technical reproducibility,
subjective interpretation, and qualitative readouts .
To facilitate analysis of suffi ciently large cohorts of samples, the
immunostaining panel was trained and validated on tissue microarrays,
whereas clinical implementation would likely occur on whole
sections.”
Cheang et al 2009
Eppure…
• Quantità di dati sul valore prognostico e
predittivo di KI-67
• A dispetto di:
– Uso di diversi materiali (TMA vs core biopsies
vs intere sezioni)
– Differenti protocolli di colorazione
– Differente valutazione dei risultati
• Possiamo migliorare standardizzazione e
riproducibilità?
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Le raccomandazioni internazionali
Viale: SIAPEC Palermo 2011
J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664
Gradiente di Ki-67
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Gradiente & hot spots
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Gradiente & hot spots
?
Viale: SIAPEC Palermo 2011
The approach to scoring hot spots varies across studies;
some investigators have focused in particular on the
analysis of hot spots, others have included hot spots in a
general assessment of Ki67 across the section, and yet
others have recommended avoiding them altogether.
This issue needs clarification, and a working party of the
International Ki67 in Breast Cancer Working Group has
been established to assess which method is more robust.
In the meantime, for the purposes of consistency, when
hot spots are present, an approach that assesses the
whole section and records the overall average score is
recommended.
J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664
Spot 1: 90% Ki67
Spot 2: 30% Ki67
J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664
Valore medio tra spot 1 e 2 = 60% ki67
Spot 1: 180 cell Ki67 +/200 cell tumorali = 90% Ki67
Spot 2: 45 cell Ki67 +/150 cell tumorali = 30% Ki67
Somme delle cell positive per ki67 tra i due spot: 225/350 = 64% ki67
Data handling
A threshold that is appropriate for determination of prognosis may not
pertain to one that is used for eligibility for a neoadjuvant trial or for use
of Ki67 as a pharmacodynamic marker.
Currently, in the absence of harmonized methodology, the International
Ki67 in Breast Cancer Working Group was unable, therefore, to come to
consensus regarding the ideal cut point(s) that might be used in clinical
practice.
Recommendations
Cut points for prognosis, prediction, and monitoring should only be applied
if the results from local practice have been validated against those in
studies that have defined the cutoff for the intended use of the Ki67
result.
Ki67
Ki67
Ki67
TV
MIB1 DAKO
20
G
SP6
VENTANA
15
(20)
P
MIB1 DAKO
BONDMAX
9
(20)
A
SP6 NEOMARKER
LEICABOND
15
(20)
H
30-9 VENTANA
30
(20)
Q
NP
B
MIB1 DAKO
BONDMAX
20
I
MIB1 DAKO
10
(20)
R
SP6
5
(20)
C
MIB1 DAKO
25
L
MIB1 DAKO
BONDMAX
20
S
MIB1 DAKO
BONDMAX
10
(15)
D
SP6 NEOMARKER
LEICABOND
10
(20)
M
30-9 VENTANA
10
(35)
T
MIB1 DAKO
BONDMAX
10
E
MIB1 DAKO
BONDMAX
8
(20)
N
30-9 VENTANA
24
U
MIB1 DAKO
10
(20)
F
30-9 VENTANA
25
O
30-9 VENTANA
30
V
25
Valutazione: 10 casi basso LI (rosa)
Ventana + 30-9 = alto LI; score superiore: pregio o difetto?
Necessaria correlazione clinica
MIB1 e SP6 sovrapponibili
Ki67
Z
30-9 VENTANA
40
Confronto tra metodiche di valutazione
dell’attività proliferativa nel carcinoma della
mammella
• Il nostro studio prevedeva di valutare l’attività proliferativa con
metodica immunoistochimica in 50 casi di carcinoma della
mammella
• Cercando di evidenziare il metodo più corretto ed efficace per
valutare l’attività proliferativa mediante l’espressione di ki67
Ki67 colorazioni nella linea cellulare MCF-7 .
A mitosi;
dalla B alla F la fase precoce (G1);
Nella G assente;
da H a L confinate nei nucleoli.
Dalla M alla Q con presenza congiunta nel nucleo e nella matrice nucleare ;
R una cellula in profase caratterizzata da condensazione cromosomica
•Tre regioni del diametro di 3mm ciascuna che sono state
evidenziate con inchiostro permanente
•Queste aree erano selezionate cercando di rappresentare
l’eterogenea espressione dell’attività proliferativa della neoplasia.
Valutazione con reticolo
Reticolo di 10 mm di lato diviso in 100 celle inserito nell’oculare
del microscopio
Per ogni regione vengono contati 3 reticoli
Analizzatore digitale
Valutazione effettuata su ogni regione
L’analizzatore è tarato per valutare un massimo di 350 cellule per area
Valutazione routinaria
Valutazione in percentuale di cellule proliferanti sul totale delle cellule
Vengono valutate approssimativamente 500 cellule per area
Confronto con dato clinico dell’attività proliferativa
Significatività differenze (p)
Valutazione clinica
routinaria
Differenza
complessiva
Valutazione clinica
routinaria
Vs
valutazione
routinaria
Valutazione clinica
routinaria
vs
Valut
Analizzatore digitale
Valutazione clinica
routinaria
Vs
Valut con griglia
0,0137
0,0026
0,4273
0,0402
Percentuali medie
Significatività differenze (p)
Valut
Analizzatore
digitale
Valut.
routinaria
Valut
con
griglia
Differenza
complessiva
Digitale
vs
routine
Digitale
vs
griglia
Griglia
vs
routine
Percentuale totale
23,0
23,2
25,0
0,024
0,739
0,012
0,029
Media percentuali 3 aree
23,9
25,7
24,9
0,082
0,026
0,206
0,325
Percentuali medie
Significatività differenze (p)
Valut
Analizzatore
digitale
Valut.
routinari
a
Valut
con
griglia
Differenza
complessiva
Digitale
vs
routine
Digitale
vs
griglia
Griglia
vs
routine
Grading 1 (% totale)
12,7
10,4
10,8
0,281
0,146
0,220
0,802
Grading 2 (% totale)
15,6
17,8
17,6
0,274
0,904
0,187
0,151
Grading 3 (% totale)
41,9
43,2
47,1
0,017
0,219
0,005
0,091
Grading 1 (media medie)
13,0
11,4
10,8
0,347
0,321
0,166
0,672
Grading 2 (media medie)
16,6
17,9
18,2
0,351
0,278
0,170
0,768
Grading 3 (media medie)
35,4
39,2
37,2
0,037
0,011
0,206
0,172
Il confronto tra la valutazione con
analizzatore di immagini e la
valutazione “manuale” effettuata con il
metodo descritto si è dimostrata
significativamente correlata
Era necessario esaminare l’area con 3 reticoli o si
poteva diminuire il numero di reticoli contati?
stabilito un livello di precisione si è calcolato quante griglie
servono per arrivare alla stima della percentuale giusta
col margine d'errore prefissato.
La valutazione di una singola griglia era sufficiente per
valutare correttamente l’espressione dell’attività
proliferativa dell’intero campo identificato sul vetrino
L’unità “griglia” (100 celle contate) era il
minimo da contare
Il numero medio di cellule contate
nelle griglie del nostro studio variava
da 180 a 570
Per conoscere l’attività proliferativa dell’intera neoplasia
sarebbe necessario suddividere la porzione infiltrante
periferica della neoplasia in campi da 3mm di diametro e
valutare una singola “griglia” per campo
Valutazione estremamente onerosa in termini di tempo-lettura
Selezionato 20 dei 50 casi
Selezione è avvenuta in maniera casuale bilanciando i diversi
casi in funzione del grading
Abbiamo valutato interamente la periferia della neoplasia
costruito un algoritmo che individua, facendo tutte le possibili
combinazioni casuali di aree, quante aree si devono contare per
avere un margine d'errore accettabile.
Obbiettivo è quello di individuare il numero minore di aree,
selezionate, in maniera casuale, che consentano di raggiungere il
valore della conta di tutta l’area di proliferazione
Errore medio
1 area
2 aree
3 aree
4 aree
5 aree
0.30
0.37
0.29
0.18
0.12
Quanti campi, selezionati casualmente, sono necessari per
ottenere il valore corretto dell’attività proliferativa
dell’intera sezione neoplastica?
Considerando una popolazione con differente attività
proliferativa, per ottenere il valore dell’attività proliferativa
più “corretto” è necessario valutare con il metodo descritto
almeno 5 aree.
Un “errore” di valutazione del 10% dell’attività proliferativa può
avere differente impatto clinico alla luce dei cut off che stanno
emergendo dalla letteratura
una variazione dal 40% al 44% del valore dell’attività
proliferativa è dal punto di vista clinico ininfluente
una variazione dal 13% al 14,3% del valore dell’attività
proliferativa può essere discriminante
La valutazione dell’attività proliferativa con
metodica immunoistochimica sembra assumere un
significato clinico rilevante
Cosa valutare?
La massima attività proliferativa della neoplasia?
L’attività proliferativa dell’intera neoplasia?
Quali anticorpi anti ki-67 usare?
Metodi automatici o valutazione “manuale?
Necessaria la standardizzazione della valutazione
Conclusioni
•La valutazione “manuale” se basata su concetti condivisi e con
parametri certi è efficace quanto la valutazione con analizzatori di
immagini computerizzati
•Dal nostro studio emerge che per ottenere una valutazione più
corretta dell’attività proliferativa è necessario valutare almento 5
regioni selezionate casualmente alla periferia della neoplasia
•Che per ogni regione è sufficiente contare le cellule incluse nell’area
di un reticolo, o in alternativa in un’area equivalente (0.0625 mm2 a
400x)
•Che il numero di cellule contate è un parametro meno significativo
rispetto ad un campionamento appropriato della regione proliferante
della neoplasia
Conclusioni
Le considerazioni espresse vanno comunque
validate anche con una riproducibilità
interlaboratorio
In attesa di ulteriori “decisioni” delle linee guida
In attesa della definizione di cut-off correlati a
metodiche standard
Dott.ssa Giovanna Boccuzzo
Dipartimento di Scienze Statistiche dell’Università di Padova
Prof. Massimo Rugge
Dott Marcello Lo Mele
Dott.ssa Rajshree Sangapur
Dott. Luciano Giacomelli
UOC Anatomia Patologica
Azienda Ospedaliera – Università di Padova