UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA
FACOLTÀ DI FARMACIA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE FARMACEUTICHE
SCUOLA DI DOTTORATO IN SCIENZE MOLECOLARI
INDIRIZZO IN SCIENZE FARMACEUTICHE
XX CICLO
SINTESI DI NUOVI INIBITORI DELLA TOPOISOMERASI II E
DELLA PROTEINCHINASI CK2 CON POTENZIALE ATTIVITÀ
ANTITUMORALE
Direttore della Scuola: Ch.mo Prof. Maurizio Casarin
Supervisore: Ch.mo Prof. Adriano Guiotto
Correlatore: Ch.mo Prof. Adriana Chilin
Dottorando: Samuele Zanatta
31 Gennaio 2008
INDICE
1.
RIASSUNTO
Pg. 1
2.
ABSTRACT
Pg. 3
3.
INTRODUZIONE
Pg. 5
3.1
LE TOPOISOMERASI
Pg. 3
3.1.1 INIBITORI DELLE TOPOISOMERASI
Pg. 8
3.1.2 MODELLO
DI
INTERAZIONE
COMPLESSO DNA-ENZIMA
3.1.3
3.2
3.3
DEL
Pg. 9
INIBIZIONE DELLA TOPOISOMERASI
E APOPTOSI
Pg. 11
LA PROTEINCHINASI CK2
Pg. 13
3.2.1 INIBITORI DELLA CK2
Pg. 14
SINTESI
ORGANICA
MICROONDE
ASSISTITA
DA
Pg. 17
3.3.1 AZIONE DELLE MICROONDE
Pg. 18
3.3.2
Pg. 21
MICROONDE SINGLE-MODE E MULTIPLEMODE
4.
OBIETTIVO
Pg. 23
5.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Pg. 27
5.1
SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DELLA
TOPOISOMERASI II
Pg. 27
5.1.1
SINTESI DELLE CATENE LATERALI N-(4AMINOFENIL)-METANSOLFONAMIDICHE
Pg. 28
5.1.2
SINTESI DI N-[4-(BENZOCHINAZOLIN-6ILAMINO)FENIL]-METANSOLFONAMIDI
Pg. 29
SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DELLA
PROTEINCHINASI CK2
Pg. 32
5.2.1 SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DI CK2
CON NUCLEO CHINOLINONICO
Pg. 32
5.2
I
5.2.2 SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DI CK2
CON NUCLEO CUMARINICO
Pg. 35
5.2.2.1 SOSTITUZIONI NELLE POSIZIONI 6 ED 8
DEL NUCLEO CUMARINICO
Pg. 35
5.2.2.2 SOSTITUZIONI NELLA POSIZIONE 7 DEL
NUCLEO CUMARINICO
Pg. 39
5.2.2.3 SOSTITUZIONI NELLA POSIZIONE 4 DEL
NUCLEO CUMARINICO
Pg. 43
Pg. 57
5.3 DATI BIOLOGICI
5.3.1
NUOVI INIBITORI DELLA TOPOISOMERASI
II
Pg. 57
5.3.2
NUOVI
INIBITORI
PROTEINCHINASI CK2
Pg. 58
DELLA
5.3.3 SAGGI IN ASSOCIAZIONE
6.
Pg. 62
PARTE SPERIMENTALE
Pg. 67
6.1
MATERIALI
Pg. 67
6.2
STRUMENTAZIONE
Pg. 67
6.3
METODI
Pg. 68
6.3.1 SINTESI DI NUOVI
TOPOISOMERASI II
INIBITORI
DELLA
Pg. 68
6.3.1.1
SINTESI
DI
N-(4-AMINOFENIL)METANSOLFONAMIDE
Pg. 68
6.3.1.2
SINTESI
DI
N-(4-AMINO-3METOSSIFENIL)-METANSOLFONAMIDE
Pg. 70
6.3.1.3
SINTESI DI N-[4-(BENZO[h]CHINAZOLIN-6ILAMINO)FENIL]METANSOLFONAMIDI
Pg. 72
6.3.1.4
SINTESI DI N-[4-(BENZO[f]CHINAZOLIN-6ILAMINO)FENIL]METANSOLFONAMIDI
Pg. 81
6.3.2 SINTESI
DI
NUOVI
CHINOLINONICI DI CK2
6.3.3
INIBITORI
Pg. 88
6.3.2.1
ALOGENAZIONE
DI
METILCHINOLIN-2-ONE
7-IDROSSI-4-
Pg. 88
6.3.2.2
BROMURAZIONE
DI
7-IDROSSI-4,6DIMETILCHINOLIN-2-ONE
Pg. 102
SINTESI DI NUOVI INIBITORI CUMARINICI Pg. 106
DI CK2
6.3.3.1
SINTESI DI 7-IDROSSI-4-METILCUMARINE
SOSTITUITE IN POSIZIONE 6 ED 8
Pg. 106
6.3.3.2
SINTESI DI BROMO-4-METILCUMARINE
SOSTITUITE IN POSIZIONE 7
Pg. 135
II
6.3.3.3
7.
SINTESI DI BROMO-7-IDROSSICUMARINE
SOSTITUITE IN POSIZIONE 4
Pg. 153
Pg. 217
BIBLIOGRAFIA
INDICE DELLE FIGURE
Figura 1
Struttura dei potenziali inibitori della Topoisomerasi II a
struttura benzochinazolinica.
Pg. 1
Figura 2
Struttura dei composti chinolinonici sintetizzati.
Pg. 2
Figura 3
Struttura dei composti cumarinici sintetizzati.
Pg. 2
Figura 4
Ciclo catalitico della Topoisomerasi II.
Pg. 7
Figura 5
Strutture di alcuni farmaci antitopoisomerasici.
Pg. 9
Figura 6
Complesso covalente Top2-DNA e ingrandimento della
regione d’ interazione.
Pg. 10
Figura 7
Modello di intercalazione della
complesso covalente Top2-DNA.
nel
Pg. 11
Figura 8
Meccanismi di attivazione di apoptosi in seguito a
formazione di complesso covalente tra Topoisomerasi e
DNA.
Pg. 12
Figura 9
Struttura dell’Emodina.
Pg. 15
Figura 10
Struttura della Quercetina e della Fisetina.
Pg. 15
Figura 11
Struttura di TBB (4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazolo).
Pg. 16
Figura 12
Struttura
della
metilcumarina).
Pg. 16
Figura 13
Spettro elettromagnetico.
Pg. 17
Figura 14
Illustrazione schematica del riscaldamento in-situ dovuto
alle microonde.
Pg. 18
DBC
III
m-Amsacrina
(3,8-dibromo-7-idrossi-4-
Figura 15
Andamento
microonde.
dell’onda
elettromagnetica
dovuta
a
Pg. 19
Figura 16
Effetto del riscaldamento MW sulla costante cinetica di
reazione.
Pg. 20
Figura 17
Reattore monomodale self-tuning.
Pg. 21
Figura 18
Schematizzazione del sistema di raffreddamento.
Pg. 22
Figura 19
Struttura di Amsacrina e m-Amsacrina.
Pg. 23
Figura 20
Spettroscopia NMR della miscela di 3,8-dibromo-4clorometil-7-idrossicumarina e 3,8-dibromo-4-bromometil7-idrossicumarina.
Pg. 48
Figura 21
Spettroscopia HMRS in negativo della miscela di 3,8dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina e 3,8-dibromo-4bromometil-7-idrossicumarina.
Pg. 49
Figura 22
Spettro NOESY di 7-idrossi-4-metossicumarina: crosspeak tra i segnali del metossile in 4 e del protone in 3.
Pg. 51
Figura 23
Spettro NOESY di 7-idrossi-4-metossicumarina: crosspeak tra il segnale dell’ossidrile in 7 ed i segnali dei
protoni in 6 ed 8.
Pg. 51
INDICE DEGLI SCHEMI
Schema 1
Sintesi di N-(4-aminofenil)-metansolfonamide.
Pg. 28
Schema 2
Sintesi di N-(4-amino-3-metossifenil)-metansolfonamide.
Pg. 29
Schema 3
Sintesi
di
N-[4-(benzo[h]chinazolin-6-ilamino)fenil]metansolfonamidi.
Pg. 30
Schema 4
Sintesi
di
N-[4-(benzo[f]chinazolin-6-ilamino)fenil]metansolfonamidi.
Pg. 31
Schema 5
Sintesi di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one.
Pg. 32
Schema 6
Sintesi di bromoderivati 4-metil-7idrossichinolinonici.
Pg. 33
IV
Schema 7
Sintesi di iododerivati 4-metil-7idrossichinolinonici.
Pg. 34
Schema 8
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one.
Pg. 34
Schema 9
Sintesi di derivati cumarinici come inibitori CK2.
Pg. 39
Schema 10
Sintesi
di
bromoderivati
metilcumarina.
Pg. 38
Schema 11
Sintesi di bromoderivati 7,8-diidrossicumarinici.
Pg. 39
Schema 12
Sintesi di 7-amino-3,8-dibromo-4-metilcumarina.
Pg. 40
Schema 13
Sintesi di bromocumarine 7-sostituite.
Pg. 41
Schema 14
Sintesi di 3,8-dibromo-4-metil-7-tiocumarina.
Pg. 42
Schema 15
Sintesi di bromoderivati 4,7-diidrossicumarinici.
Pg. 43
Schema 16
Sintesi di bromocumarine non sostituite in posizione 4.
Pg. 44
Schema 17
Sintesi di bromoderivati 4-etil-7-idrossicumarinici.
Pg. 45
Schema 18
Sintesi di bromo-4-bromometilcumarine e bromo-4idrossimetilcumarine.
Pg. 46
Schema 19
Sintesi di bromo-4-clorometilcumarine
idrossimeticumarine.
Pg. 47
Schema 20
Sintesi di bromo-4-metossicumarine.
Pg. 50
Schema 21
Sintesi di bromo-4-trifluorometilcumarine.
Pg. 52
Schema 22
Tentativo di sintesi
trifluorometilcumarina.
Pg. 53
Schema 23
Sintesi di 2-bromoresorcinolo.
Schema 24
Tentativo di sintesi
trifluorometilcumarina.
di
3,8-dibromo-7-idrossi-4-
Pg. 54
Schema 25
Tentativo di sintesi
trifluorometilcumarina.
di
3,8-dibromo-7-idrossi-4-
Pg. 55
di
V
della
6,7-diidrossi-4-
e
bromo-4-
3,8-dibromo-7-idrossi-4-
Pg. 53
INDICE DELLE TABELLE
Tabella 1
Confronto sintesi convenzionale vs. sintesi assistita da
microonde.
Pg. 36
Tabella 2
Citotossicità in
Topoisomerasi II.
della
Pg. 58
Tabella 3
Confronto dell’attività inibitoria su CK2 tra i composti
chinolinonici sintetizzati ed alcuni analoghi cumarinici.
Pg. 59
Tabella 4
Confronto dell’attività inibitoria su CK2 tra composti
bromocumarinici 4-metil sostituiti e 4-metossi sostituiti.
Pg. 60
Tabella 5
Citotossicità in vitro dei nuovi inibitori di CK2.
Pg. 61
vitro
dei
VI
nuovi
inibitori
1.
RIASSUNTO
Nell’ambito della ricerca di nuove molecole da utilizzare in terapia antitumorale,
una particolare importanza riveste la classe degli inibitori delle Topoisomerasi,
enzimi ubiquitari in grado di controllare lo stato topologico del DNA, mediante un
meccanismo di taglio e richiusura della doppia elica. Questi enzimi si classificano
in Topoisomerasi I (tagliano un solo filamento di DNA) e Topoisomerasi II
(tagliano contemporaneamente entrambi i filamenti), svolgono un ruolo
fondamentale per la vita cellulare e sono il bersaglio di molti dei farmaci
antitumorali usati oggi nella pratica clinica. Altro bersaglio attualmente molto
studiato per nuovi farmaci antitumorali è la proteinchinasi CK2, enzima
fosforilante che riveste un ruolo fondamentale nella trasduzione dei segnali di
sopravvivenza cellulare. Da recenti studi si sono evidenziate interazioni tra
Topoisomerasi II e CK2 che si inseriscono nei percorsi apoptotici che portano alla
morte cellulare programmata. E’ stato quindi studiato come gli inibitori delle
Topoisomerasi e di CK2 possano agire in modo sinergico nei confronti della
vitalità delle cellule tumorali, considerando anche che la terapia dei tumori è
solitamente multicomponente.
Il programma di ricerca si è quindi sviluppato secondo due linee principali:
1. Sintesi di nuovi inibitori della Topoisomerasi II (Figura 1) a struttura ibrida,
aventi cioè un nucleo policiclico planare benzochinazolinico derivatizzato con
il residuo metansolfonamidoanilinico proprio dell’Amsacrina, noto inibitore
della Topoisomerasi II.
N
N
N
N
HN
HN
R
R
NHSO2CH3
NHSO2CH3
Figura 1. Struttura dei potenziali inibitori della Topoisomerasi II a struttura benzochinazolinica.
R= H, OCH3.
1
2. Sintesi di nuovi inibitori di proteinchinasi CK2 a struttura chinolinonica
(Figura 2) e cumarinica (Figura 3) progettati sulla base dei requisiti sterici ed
elettronici di noti inibitori competitivi del substrato fosfodonatore (ATP o
GTP).
CH3
R1
R2
N
H
HO
O
R3
R1= H, Br.
R2= H, CH3, Br.
R3= I, Br.
Figura 2. Struttura dei composti chinolinonici sintetizzati.
R2
R3
R1
R4
O
O
R5
R1= H, Br.
R2= H, CH3, CF3, CH2CH3, CH2OH, CH2Cl, CH2Br, OH, OCH3.
R3= H, CH3, OH, NO2, Br.
R4= OH, NH2, OCH3, OCOCH3, SH.
R5= H, CH3, CHO, CH=NOH, CN, OH, NO2, Br.
Figura 3. Struttura dei composti cumarinici sintetizzati.
I composti progettati sono stati preparati utilizzando sia metodi di sintesi
convenzionali sia metodi di sintesi assistita da microonde e tutti i composti sono
stati caratterizzati tramite 1H-NMR, 13C-NMR e HRMS. La purezza dei campioni
inviati ai saggi biologici è stata determinata mediante analisi elementare.
I potenziali agenti antitopoisomerasici sintetizzati sono stati saggiati sulla
Topoisomerasi II. Sulla libreria di potenziali inibitori CK2 sono stati effettuati dei
saggi di inibizione sull’enzima isolato e con i dati ottenuti si sono potute fare delle
considerazioni struttura-attività tra i nuovi composti preparati e quelli riportati in
letteratura. I composti più attivi sui rispettivi enzimi bersaglio sono stati saggiati
su linee di cellule tumorali per valutarne la citotossicità.
2
2.
ABSTRACT
The Topoisomerase inhibitors play an essential role in the research of new
molecules useful in the antitumor therapy. Topoisomerases are enzymes that
regulate the topology of the DNA macromolecule. There are two type of
Topoisomeases: Type I are enzymes that cleave single strand of DNA, type II
cleaves both strands of DNA and they play an essential role on the cell life. The
Topoisomerases are the targets of many antitumor agents currently used in the
clinical practice.
Proteinkinase CK2 is another interesting target for the potential anti-neoplastic
drugs. CK2 is a messenger-indipendent kinase that plays an essential role in cell
growth and proliferation.
Some studies underline the interaction between Topoisomerase II and
proteinkinase CK2 as CK2 is involved in the control of Topo II activity and
programmed cell death (apoptosis). The synergism between Topoisomerase II
inhibitors and CK2 inhibitors was studied considering that usually the treatment
of cancer is a multicomponent therapy.
The research was developed with two goals:
1. The synthesis of new Topoisomerase II inhibitors (Figure 1) represented by
molecular hybrid obtained by functionalization of planar benzoquinazolinic
system substituted by methanesulfonamidoanilinic chain of Amsacrine, known
drug Topo II inhibitors.
N
N
N
N
HN
HN
R
R
NHSO2CH3
NHSO2CH3
Figure 1. Structure of synthesized compounds as Topoisomerase II inhibitors.
R= H, OCH3.
3
2. The synthesis of new quinolinone proteinkinase CK2 inhibitors (Figure 2) and
coumarin proteinkinase CK2 inhibitors (Figure 3).
CH3
R1
R2
N
H
HO
O
R3
R1= H, Br.
R2= H, CH3, Br.
R3= I, Br.
Figure 2. Structure of synthesized quinolinone compounds.
R2
R3
R1
R4
O
O
R5
R1= H, Br.
R2= H, CH3, CF3, CH2CH3, CH2OH, CH2Cl, CH2Br, OH, OCH3.
R3= H, CH3, OH, NO2, Br.
R4= OH, NH2, OCH3, OCOCH3, SH.
R5= H, CH3, CHO, CH=NOH, CN, OH, NO2, Br.
Figure 3. Structure of synthesized coumarin compounds.
The compounds were synthesized by conventional synthesis or by microwave
assisted methods. All the compounds were characterised by 1H-NMR,
13
C-NMR
and HRMS.
The production of high purity compounds was determinated by elementary
analisys.
The potential Topoisomerase II inhibitors were examined on Topoisomerase II
enzyme. From the tests performed on isolated CK2 enzyme a structure-activity
relationship was made comparing the data obtained with new CK2 inhibitors and
those already reported in literature.
The most active compounds were examined for their cytotoxic properties in a
panel of human tumor cell lines.
4
3.
INTRODUZIONE
Per il trattamento dei tumori esistono tre diversi possibili tipi di trattamento:
l’asportazione chirurgica, la radioterapia e la chemioterapia.
La chemioterapia costituisce il principale metodo di trattamento solamente per
alcuni tumori, viene invece sempre più utilizzata in associazione alla chirurgia o
alla radioterapia.
Le scarse differenze biochimiche tra le cellule neoplastiche e quelle sane
rappresentano un limite importante nell’impiego farmacologico di molte molecole
citotossiche.
Poiché numerose sostanze attualmente usate in clinica per la terapia antitumorale
sono molecole che interagiscono con il DNA, risulta sempre molto interessante
approfondire il loro meccanismo di azione per renderle più selettive nei confronti
delle cellule tumorali. Spesso i farmaci non producono un danno alla cellula solo
per interazione con il DNA: la loro azione si esplica impedendo o alterando i
normali processi biologici mediati da enzimi strettamente connessi con il DNA. È
perciò molto importante approfondire le conoscenze sui meccanismi d’azione di
farmaci che agiscono secondo queste modalità, in modo da poter ottenere
molecole sempre più selettive nei confronti delle cellule tumorali.
Tra i diversi farmaci ad azione antitumorale, particolare importanza rivestono gli
inibitori delle Topoisomerasi ed in prospettiva quelli delle CK2 (caseinchinasi).
3.1
LE TOPOISOMERASI
Le Topoisomerasi sono enzimi ubiquitari, in grado di controllare lo stato
topologico del DNA, mediante un meccanismo di taglio e richiusura della doppia
elica1. Tale loro azione li rende indispensabili nei processi di duplicazione,
trascrizione, ricombinazione e riparo, oltre che nella formazione e nella
segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare. Il DNA, infatti, non è
una struttura statica, ma è libero di muoversi nello spazio fluido della cellula,
5
assumendo varie conformazioni topologiche. Inoltre, tutti i processi cellulari che
comportano uno scorrimento di complessi proteici sul DNA alterano la sua
struttura nello spazio torcendolo, srotolandolo o creando delle regioni di
superavvolgimento del tutto simili a quelle che può assumere una corda od un
elastico. Tutte le transizioni conformazionali che il DNA compie in questi
processi sono controllati dalle Topoisomerasi2.
Questi enzimi sono divisi in due classi, a seconda del loro meccanismo d’azione:
9 Topoisomerasi I: sono enzimi monomerici che tagliano un solo filamento di
DNA, senza utilizzo di ATP, rilassando il DNA di un giro alla volta3;
9 Topoisomerasi II: sono enzimi costituiti da due o più subunità e sono in
grado di tagliare entrambi i filamenti di DNA, mediante l’utilizzo di ATP4.
Gli inibitori delle Topoisomerasi II sono in grado di interferire con il ciclo
cellulare in diversi punti5, e per comprendere le basi su cui poggia il meccanismo
di inibizione operato da questi farmaci, è opportuno conoscere il ciclo catalitico di
rottura e rinsaldamento operato dagli enzimi.
L’azione delle Topoisomerasi II si esplica in più passaggi (Figura 4):
1. riconoscimento da parte dell’enzima di specifiche zone del DNA;
2. formazione di un legame covalente tra un residuo tirosinico dell’enzima e un
5’-fosfato del DNA, in presenza di ioni Mg2+, che consente la rottura del
filamento;
3. passaggio attraverso l’apertura di un secondo filamento del DNA;
4. rinsaldamento del filamento interrotto;
5. ripristino della forma attiva dell’enzima.
6
Figura 4. Ciclo catalitico della Topoisomerasi II.
L’energia necessaria a ricostruire la catena polinucleotidica è conservata nel
legame tra l’enzima ed il filamento interrotto. L’ATP, inoltre, viene utilizzata
dall’enzima per indurre grossi cambi conformazionali.
Negli ultimi anni la ricerca sulle Topoisomerasi ha avuto grande sviluppo, grazie
a studi di cristallografia che hanno contribuito in maniera essenziale alla verifica
dei modelli proposti per il loro meccanismo di azione. Tuttavia, a causa delle
elevate dimensioni e della flessibilità degli enzimi di tipo II, è attualmente
disponibile la struttura cristallografica solo di un loro frammento, rappresentante
il sito attivo della proteina.
7
3.1.1
INIBITORI DELLE TOPOISOMERASI
L’azione di inibizione delle Topoisomerasi può svolgersi secondo due
meccanismi6:
1. stabilizzazione del complesso covalente Topoisomerasi/DNA. I farmaci che
agiscono con questa modalità vengono detti “veleni delle Topoisomerasi”, in
quanto trasformano l’enzima in una potente tossina cellulare. In questa classe
si inseriscono acridine, antracicline, ellipticine e chinoloni;
2. inibizione del ciclo catalitico, senza diretto intervento nel complesso
covalente. I farmaci che agiscono con questa modalità vengono detti “inibitori
delle Topoisomerasi”. In questa classe si inseriscono gli antibiotici cumarinici.
La classificazione più comunemente usata, comunque, si basa sull’enzima
bersaglio (Figura 5); pertanto di norma si parla di inibitori delle Topoisomerasi I,
inibitori delle Topoisomerasi II e inibitori delle Girasi (Topoisomerasi batteriche).
Fra gli inibitori della Topoisomerasi II ricordiamo la m-Amsacrina, che è stata qui
presa a modello per la sintesi di nuovi potenziali farmaci. Questa molecola agisce
come intercalante del solco minore del DNA, con cui è in grado di formare un
complesso sufficientemente stabile da resistere fino all’entrata del DNA nella
tasca enzimatica della Topoisomerasi II. Qui, la m-Amsacrina consente il taglio
del DNA, ma non la sua rinsaldatura, interrompendo così il ciclo catalitico.
8
Figura 5. Strutture di alcuni farmaci antitopoisomerasici.
3.1.2
MODELLO DI INTERAZIONE DEL COMPLESSO
DNA-ENZIMA
Da recenti applicazioni di modelling7 è stata proposta un’ipotetica topologia del
complesso covalente Top2-DNA (Figura 6), dove sono chiaramente riconoscibili i
domini contrassegnati con le denominazioni di testa, spalla, braccio e gomito. Due
gruppi di aminoacidi sembrano coinvolti direttamente nell’interazione con la
doppia elica del DNA: da Tyr734 a Thr744 e da Lys775 a Tyr782. In particolare
nella regione tra Tyr734 e Thr744 è localizzato lo strand di DNA tagliato (tra le
posizioni +1 e –1).
9
Shoulder
DNA
Head
Elbow
Ser740
Thr744
Arm
DNA
Figura 6. Complesso covalente Top2-DNA e ingrandimento della regione d’ interazione.
Partendo dalle coordinate del modello del complesso covalente Top2-DNA, uno
studio di docking molecolare ha permesso di stabilire le probabili interazioni tra il
complesso enzima-DNA nel sito di taglio e diversi antitopoisomerasici, tra cui la
m-Amsacrina, presa come riferimento per la sintesi di nuove strutture (Figura 7).
L’asse dell’elica del DNA passa direttamente al centro dell’anello acridinico,
quindi il cromoforo triciclico si trova circondato da basi su entrambi i lati. Come
risultato dell’intercalazione della m-amsa, si nota uno spostamento delle paia di
basi GC e CG di 9° e 15° rispettivamente in modo da compensare l’eccesso di
forze di Van der Waals dovuto proprio all’intercalazione. Oltre alla zona del
triciclo planare, sono state notate due forti interazioni tra la molecola e il target: il
gruppo ossidrilico di Thr744 interagisce con la funzione solfonamidica
dell’anilina, e l’ossigeno carbonilico di Gly747 interagisce con l’NH della stessa
solfonamide.
10
+1
Ser740
Thr744
Gly747
m-AMSA
-1
-2
Figura 7. Modello di intercalazione della m-Amsacrina nel complesso covalente Top2-DNA, in
cui si evidenzia la posizione della molecola rispetto a Ser740, Thr744 e Gly747. L’elica
del DNA è indicata in azzurro, i ponti idrogeno sono indicati in giallo.
3.1.3
INIBIZIONE DELLA TOPOISOMERASI E APOPTOSI
Gli agenti antitopoisomerasici di utilità clinica sono in grado di aumentare la
quantità di enzima covalentemente legato al DNA, facendo quindi diventare
l’enzima un veleno cellulare, in quanto lascia i filamenti di DNA non saldati.
Alcuni farmaci bloccano il rinsaldamento del DNA rotto, come l’Amsacrina e
l’Etoposide, mentre altri aumentano la velocità di rottura del DNA senza inibire il
rinsaldamento.
La formazione del complesso covalente tra enzima e DNA comporta drammatiche
modificazioni dei meccanismi vitali con conseguente morte cellulare. Alcuni
autori6 ritengono che l’inibizione della Topoisomerasi sia un fattore in grado di
innescare morte cellulare programmata (PCD, Programmed Cell Death) o
apoptosi (Figura 8).
11
Figura 8. Meccanismi di attivazione di apoptosi in seguito a formazione di complesso covalente
tra Topoisomerasi e DNA.
Infatti la formazione del complesso enzima-DNA (CCF, Covalent Complex
Formation) interferisce con il metabolismo degli acidi nucleici e porta a lesioni
irreversibili del DNA, che costituiscono un segnale di attivazione per la
produzione di p53: questo gene è un oncosoppressore in grado di bloccare la
crescita nelle cellule in cui si sono verificati danni al DNA, favorendone la
riparazione. Se la correzione del DNA è produttiva il ciclo può riprendere,
altrimenti si avvia il processo di morte programmata o apoptosi.
12
3.2
LA PROTEINCHINASI CK2
La CK2 (caseinchinasi 2) è una Ser-Thr proteina chinasi con centinaia di substrati
endogeni che sono proteine con ruoli fondamentali nell’espressione genica, nella
traduzione del segnale, nella biosintesi e degradazione delle proteine8.
La CK2 possiede una struttura eterotetramerica costituita da due unità secondarie
catalitiche (α e α1) e due unità secondarie regolatrici (β)9. L’unità secondaria non
catalitica ha la funzione di stabilizzare la molecola, proteggere la chinasi da
denaturanti, modulare la specificità del substrato e regolare l’attività dell’enzima.
Le unità secondarie sono coinvolte sia nel formare l’enzima tetramerico CK2 sia
nel legare e regolare altre proteine chinasi.
In genere le proteinchinasi sono enzimi strettamente regolati che diventano attivi
solo in risposta a determinati stimoli, mentre la CK2 è costitutivamente attiva e
viene definita come una chinasi messaggero-indipendente perché l’attività non
dipende da tutte quelle piccole molecole quali nucleotidi ciclici, lipidi e calcio,
che sono generalmente coinvolti nell’attivazione delle chinasi messaggerodipendenti8. Questo, però, non esclude la possibilità che piccole molecole
partecipino ad alcune funzioni di regolazione della CK2. La CK2 ha una
specificità ridotta per il co-substrato, cioè ha la possibilità di usare sia adenosin
trifosfato (ATP) che guanosin trifosfato (GTP) come donatori di γ fosfato che
vengono trasferiti ai residui aminoacidici di serina e treonina di substrati proteici9.
Come tutte le chinasi la CK2 è coinvolta nei meccanismi regolatori che
controllano i vari stadi del ciclo cellulare attraverso la catalisi della fosforilazione
e regolazione delle proteine che hanno funzioni importanti associate alla
progressione del ciclo cellulare. La CK2, infatti, è coinvolta nei meccanismi che
controllano la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule come in quelli che
innescano il processo di apoptosi8.
L’attività di CK2 aumenta nelle cellule mutate, nelle leucemie, in vari tipi di
tumori solidi, come per esempio nella neoplasia alla ghiandola mammaria, alla
prostata, alla testa, al collo, al polmone e al rene, nei tessuti in rapida
proliferazione e durante l’embriogenesi10.
13
Per questa sua elevata presenza nei tumori e per la capacità di indurre neoplasie in
modelli sperimentali in caso di sua sovraespressione si suppone che la sua
caratteristica di essere costitutivamente attiva sia responsabile del suo potenziale
oncogenico11.
Recenti studi12 hanno inoltre dimostrato che alcuni virus sono in grado di
utilizzare CK2 per il proprio ciclo replicativo.
La proteina chinasi CK2 è attualmente oggetto di numerosi studi per
comprenderne i diversi ruoli fisiologici nella cellula ed il meccanismo di azione
con il quale è coinvolta in essi; lo scopo di questi studi è quello di poter poi
sviluppare inibitori specifici per questo enzima da introdurre nella terapia del
cancro e nella terapia antivirale.
Alcuni studi13 hanno confermato che la proteinchinasi CK2 fosforila
selettivamente due residui serinici (Ser 1524 e Ser 1376) della subunità α della
Topoisomerasi II con conseguente attivazione di quest’ultimo enzima
fondamentale nella proliferazione cellulare.
3.2.1
INIBITORI DELLA CK2
Gli inibitori della CK2 possono essere di due tipi:
9 analoghi del substrato fosfoaccettore (proteina-substrato)
9 analoghi del substrato fosfodonatore (ATP o GTP).
Sono noti inibitori di entrambi i tipi, cioè sia sostanze in grado di competere con il
substrato nel sito attivo dell’enzima, sia sostanze capaci di legarsi al sito di
legame per l’ATP.
Tra gli inibitori di tipo competitivo del substrato fosfoaccettore sono risultati
efficaci molti composti polianionici come l’eparina, l’acido poliglutammico ed
alcuni polimeri di acido glutammico e tirosina14.
Gli inibitori competitivi ATP-mimetici sono risultati, da studi in vitro, più efficaci
e maggiormente selettivi. Questi possono essere suddivisi in diverse classi
chimiche:
•
derivati
idrossiantrachinonici
quali
l’Emodina
(1,3,8-triidrossi-6-
metilantrachinone) (Figura 9) che è un inibitore selettivo per CK2; essa si
14
inserisce in una tasca idrofobica più profondamente rispetto all’ATP o GTP,
con solo i due anelli più esterni sovrapposti alla base nucleotidica. Il legame
tra l’Emodina e la CK2 avviene grazie ad interazioni idrofobiche e di Van der
Waals tra gli anelli aromatici ed alcuni aminoacidi non polari presenti nella
tasca e caratteristici della CK2, e grazie a deboli legami polari con gli ossidrili
antrachinonici per la presenza dell’ossidrile in 3 dell’Emodina15.
OH
O
OH
H3C
OH
O
Figura 9. Struttura dell’Emodina.
•
Alcuni flavonoidi (Quercetina e Fisetina, Figura 10) si sono dimostrati efficaci
inibitori della CK2 grazie alla presenza di gruppi ossidrilici che formano
interazioni polari con residui aminoacidici del sito attivo, ma a differenza dei
derivati antrachinonici non sono selettivi per la CK2 probabilmente per la
mancanza di interazioni idrofobiche11.
OH
O
O
OH
HO
OH
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
Quercetina
Fisetina
Figura 10. Struttura della Quercetina e della Fisetina.
•
Derivati benzimidazolici o benzotriazolici alogenati tra cui troviamo il TBB
(4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazolo, Figura 11). Questo composto si adatta
perfettamente alla tasca idrofobica della CK2 (generalmente le tasche presenti
nelle altre proteinchinasi sono più larghe permettendo la libera entrata e uscita
del TBB da questa) grazie alla presenza dei quattro atomi di bromo presenti
15
sull’anello benzenico che formano interazione idrofobiche con la parte apolare
della CK2α. Tra il TBB e la CK2 c’è anche un’interazione polare grazie a
molecole di acqua presenti nella struttura di CK2 che consentono la
formazione di legami con un atomo di azoto del TBB16.
Br
Br
H
N
Br
N
N
Br
Figura 11. Struttura di TBB (4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazolo).
•
Derivati idrossicumarinici tra i quali vi sono gli inibitori più specifici per la
CK2 finora conosciuti. In particolare la DBC (3,8-dibromo-7-idrossi-4metilcumarina, Figura 12) è il lead compound8 di questa classe grazie alla
presenza dei due atomi di bromo in posizione 3 e 8 che formano interazioni
idrofobiche e di Van der Waals con aminoacidi non polari della tasca.
CH3
Br
HO
O
O
Br
Figura 12. Struttura della DBC (3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilcumarina).
16
3.3
SINTESI
ORGANICA
MICROONDE
ASSISTITA
DA
Si presume che tutte le reazioni chimiche condotte con l’ausilio del calore
possano essere accelerate dall’utilizzo delle microonde. Per confermare questo
presupposto fin dalla metà degli anni ’80 è iniziato l’uso delle microonde per
condurre sintesi organiche. Inizialmente vennero usati i forni a microonde
domestici in commercio, che non sempre si dimostrarono adeguati a sostenere le
condizioni di reazione. I continui miglioramenti apportati hanno quindi permesso
la realizzazione degli attuali reattori per uso scientifico.
Le microonde sono onde elettromagnetiche situate tra la radiazione IR e le onde
radio tra 0.3 e 300 GHz (lunghezza d’onda 1mm-1m) (Figura 13). Per evitare
interferenze con i sistemi di telecomunicazione ed i radar, la frequenza degli
apparati a microonde domestici ed industriali è regolata a 2450 MHz (12.2 cm).
Figura 13. Spettro elettromagnetico.
Ad ogni forma di energia è associata una risposta molecolare: le microonde
inducono solo movimenti di rotazione circolare delle molecole, mantenendo intatti
i legami molecolari e la loro lunghezza. Infatti l’energia per rompere un legame è
stimata tra 80 e 120 Kcal/mol, mentre l’energia del fotone delle microonde è di
0.037 Kcal/mole, evidentemente non sufficiente per indurre la rottura di un
legame.
17
La tecnica MW si è dimostrata utilissima nei casi in cui il riscaldamento
tradizionale ha bassa efficienza per effetto di trasmissione inefficiente del calore.
Infatti la sintesi convenzionale avviene attraverso il trasferimento lento e graduale
di calore da una sorgente esterna alla miscela di reazione attraverso il contenitore.
Nel caso di MW il transfer di energia è rapido e senza inerzia, ha potere di
penetrazione dell’ordine della lunghezza usata (quindi 10 cm) ed interessa i
reagenti ed il solvente ma non il recipiente (Figura 14).
Figura 14. Illustrazione schematica del riscaldamento in-situ dovuto alle microonde.
Quindi il riscaldamento è rapido e localizzato dato che non dipende dalla
conducibilità termica del contenitore (trasparente alle microonde).
3.3.1
AZIONE DELLE MICROONDE
Le microonde sono formate da un campo elettrico (E) e da un campo magnetico
(H) (Figura 15), ma solo quello elettrico trasferisce energia scaldando la sostanza,
mentre quello magnetico non interviene nello svolgimento della reazione chimica.
18
Figura 15. Andamento dell’onda elettromagnetica dovuta a microonde.
Le microonde provocano particolari oscillazioni in molecole che possiedono
momento dipolare non nullo: tali movimenti determinano un riscaldamento
elevatissimo e immediato. Tale riscaldamento si esplica attraverso due
meccanismi: la rotazione dipolare e la conduzione ionica. Nel fenomeno di
rotazione
dipolare,
molecole
dipolari
sottoposte
ad
una
radiazione
elettromagnetica tendono ad allinearsi con il campo elettrico quindi assumono
movimenti oscillatori, che producono energia sotto forma di riscaldamento. Tali
movimenti dipendono dalla viscosità del mezzo in cui sono immerse e dalla
frequenza del campo applicato. Se le frequenze sono troppo elevate, le molecole
non hanno tempo sufficiente per rispondere al campo elettrico, non riescono a
ruotare e quindi non c’è transfer di energia né riscaldamento; se le frequenze sono
troppo basse, le molecole ruotano perfettamente in fase con il campo elettrico, ma
l’energia sviluppata è bassa e non si produce calore. Se la frequenza applicata è
dell’ordine delle microonde, le molecole hanno tempo di ruotare senza però essere
completamente in fase con il campo elettrico, quindi tendono a riallinearsi
continuamente con il campo che a sua volta continuamente oscilla. Questa
differenza di fase provoca collisioni e comporta riscaldamento. L’entità del
riscaldamento è funzione della grandezza del momento dipolare e anche della
viscosità, che varia la possibilità di rotazione delle molecole. In un mezzo gassoso
le molecole sono lontane e libere di oscillare in fase, perciò non si avrà
riscaldamento. Nel fenomeno di conduzione, particelle cariche (ioni) in soluzione
si muovono sotto l’influenza del campo elettrico con aumento delle collisioni tra
le molecole, con conversione dell’energia cinetica in riscaldamento. Liquidi
19
contenenti ioni si riscalderanno maggiormente di liquidi deionizzati. Esiste quindi
una correlazione diretta tra momento di dipolo di una molecola e la sua capacità di
assorbire le microonde. Infatti l’aumento di temperatura dipende fortemente dalla
polarità della miscela di reazione. Per questo principio la scelta del solvente
assume notevole importanza: più polare è il solvente, maggiore è l’aumento di
temperatura che ne risulta. In base alle considerazioni fatte sui meccanismi
d’azione delle microonde, questa tecnica può essere applicata anche in assenza di
solvente, nel caso in cui i reagenti abbiano proprietà dielettriche opportune.
Le microonde aumentano velocità e resa di reazione: l’energia trasferita è molto
maggiore rispetto alla quota necessaria per raggiungere l’energia d’attivazione.
Tale trasferimento è inoltre molto rapido per cui si ha un’attivazione maggiore
delle singole molecole. Queste condizioni provocano un aumento della
temperatura istantanea con il potenziale raggiungimento di valori molto maggiori,
mentre nel metodo convenzionale l’aumento riguarda la temperatura complessiva
del sistema (temperatura di bulk, TB). Quindi nell’equazione di Arrhenius, che
descrive la dipendenza della cinetica di reazione dalla temperatura, si può
sostituire il termine TB con la temperatura istantanea (Ti), che raggiunge valori
maggiori (Figura 16). In questo modo viene influenzata la cinetica di reazione e
aumenta la resa dei prodotti ed inoltre le reazioni sono molto pulite perché non
essendoci fenomeni di surriscaldamento sono ridotti i prodotti collaterali.
Frequency of collision with the
correct geometry required for
reaction
k = reaction rate constant = Ae
TB
-Ea/R or
Ti
Bulk
Temperature
Archieved with
Conduction
Istantaneous
Temperature
Archieved with
Microwave
The fraction of molecules with the
minimum energy required for
reaction
Figura 16. Effetto del riscaldamento MW sulla costante cinetica di reazione.
20
3.3.2
MICROONDE SINGLE-MODE E MULTIPLE-MODE
Esistono due tipi di apparati per microonde: multimodali e monomodali. Nel
primo caso rientrano, ad esempio, i forni a microonde domestici o strumenti
industriali dotati di una cavità ampia con una conseguente dispersione di energia e
una distribuzione energetica non uniforme. Nei sistemi monomodali invece si ha
focalizzazione energetica sul campione con conseguente densità e uniformità
energetica maggiori.
Il reattore utilizzato in questo lavoro di tesi è di tipo monomodale self-tuning
(Figura 17), in cui si ha un’automatica regolazione della potenza delle microonde
in base a temperatura e pressione impostate.
Figura 17. Reattore monomodale self-tuning.
Nel sistema è presente un flusso di gas di raffreddamento (Figura 18) attivabile
secondo le esigenze di reazione ed un controllo a feedback della temperatura che
permette di massimizzare l’input delle microonde (Enhanced microwave
synthesis, EMS). In questo modo è possibile fornire energia senza aumentare
proporzionalmente la temperatura di bulk, migliorando la cinetica di reazione e
riducendo i fenomeni di termodegradazione.
21
Figura 18. Schematizzazione del sistema di raffreddamento.
In conclusione, la sintesi assistita da microonde porta a reazioni più veloci, rese
maggiori, minore formazione di coprodotti o prodotti di degradazione ed inoltre
l’impiego di una chimica sostenibile17.
22
4.
OBIETTIVO
L’obiettivo della ricerca è lo studio di come gli inibitori della Topoisomerasi II e
della proteinchinasi CK2 possano agire in modo sinergico nei confronti del
tumore, considerando che la terapia dei tumori è solitamente multicomponente.
Il progetto ha previsto la sintesi di nuovi potenziali inibitori della Topoisomerasi
II con struttura ibrida (Figura 1), che derivano cioè dall’assemblaggio di unità
strutturali di farmaci diversi. Scegliendo come molecola di riferimento
l’Amsacrina, sono stati individuati come farmacofori alcuni policicli planari
potenzialmente idonei ad intercalare nel DNA, aventi nella struttura policiclica
uno o più atomi di azoto, in analogia al nucleo acridinico di base dell’amsacrina, e
questi sistemi aromatici planari sono stati funzionalizzati con elementi di farmaci
antitopoisomerasici
noti,
più
precisamente
con
le
catene
metansolfonamidoaniliche di Amsacrina e m-Amsacrina (Figura 19).
NHSO2CH3
H3CO
HN
HN
N
N
NHSO2CH3
Figura 19. Struttura di Amsacrina e m-Amsacrina.
In secondo luogo è stata prevista la sintesi di composti a struttura chinolinonica o
cumarinica (Figura 2 e Figura 3) come nuovi potenziali inibitori della
proteinchinasi CK2 prendendo come riferimento la 3,8-dibromo-7-idrossi-4metilcumarina (DBC) (Figura 12) che è il composto con maggiore attività
inibitoria nei confronti della proteinchinasi CK2 attualmente descritto in
letteratura8.
L’obiettivo perseguito con la sintesi di nuovi composti cumarinici e chinolinonici
ad attività inibitoria nei confronti di CK2 è stato quello di realizzare un
preliminare rapporto struttura attività sullo scaffold benzopiranonico confrontando
23
i dati di cumarine presenti in letteratura8 con i dati dei saggi biologici dei nuovi
composti sintetizzati. L’attenzione si è focalizzata sullo studio delle posizioni 1, 8,
6 ed infine delle posizioni 7 e 4 del nucleo di base.
5
4
6
3
2
7
O
8
1
O
Nello studio della posizione 1 sono stati progettati composti aventi:
•
Una sostituzione bioisostera dell’ossigeno piranonico (accettore di idrogeno)
con un atomo di azoto del nucleo chinolinonico (donatore di idrogeno).
La preparazione di alcuni derivati derivati bioisosteri a struttura chinolinonica è
dovuta all’interesse di valutare come una sostituzione bioisostera NH-O in
posizione 1 nel nucleo cumarinico possa modulare l’attività inibitoria nei
confronti del target enzimatico.
Nello studio della posizione 8 si è progettata la sintesi di composti aventi in tale
posizione:
ƒ
Un gruppo stericamente ingombrante con effetto elettronattrattore (nitro,
formile, ossima, carbonitrile) sull’adiacente posizione 7 in grado di modulare
l’acidità dell’ossidrile fenolico.
ƒ
Un gruppo (ossidrile) in grado di aumentare le possibili interazioni polari nella
tasca dell’enzima mantenendo o meno le posizioni 3 e 6 sostituite con un
atomo di bromo.
Nello studio della posizione 6 si è progettata la sintesi di composti sostituiti con:
9 Un gruppo (ossidrile) in grado di dare interazioni polari nella tasca
dell’enzima mantenendo o meno le posizioni 3 e 8 sostituite con un atomo di
bromo.
9 Un gruppo stericamente ingombrante e con effetto elettronattrattore (nitro) in
grado di aumentare l’acidità dell’ossidrile fenolico mantenendo gli atomi di
bromo in posizione 3 ed 8 come nel lead compound DBC.
24
Nello studio della posizione 7 si è progettata la sintesi di composti aventi:
™ Un gruppo ossidrilico mascherato (metossile, acetossile) non in grado di dare
buone interazioni polari nella tasca dell’enzima.
™ Un gruppo (aminico, tiolico) con diversa acidità dal gruppo fenolico della
DBC.
Nello studio della posizione 4 sono stati progettati composti aventi:
¾ Nessun sostituente in questa posizione per verificare l’importanza del gruppo
metilico presente nella struttura del lead compound.
¾ Un gruppo in grado di dare interazioni polari nella tasca dell’enzima
(ossidrile, idrossimetile).
¾ Un gruppo (trifluorometile) in grado di modulare la solubilità dei derivati
cumarinici preparati ed un ingombro sterico simile al metile.
¾ Un gruppo (etile, metossile, clorometile, bromometile) stericamente più
ingombrante del metile della DBC.
25
26
5.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Nell’ambito della ricerca di nuove molecole da utilizzare in terapia antitumorale,
una particolare importanza riveste la classe degli inibitori delle Topoisomerasi,
enzimi ubiquitari in grado di controllare lo stato topologico del DNA, mediante un
meccanismo di taglio e richiusura della doppia elica. Esse si classificano in
Topoisomerasi I (tagliano un solo filamento di DNA) e Topoisomerasi II (tagliano
contemporaneamente entrambi i filamenti) e svolgono un ruolo fondamentale per
la vita cellulare, sono inoltre il bersaglio di molti dei farmaci antitumorali usati
oggi nella pratica clinica.
Altro bersaglio attualmente molto studiato per nuovi farmaci antitumorali è la
proteinchinasi CK2, enzima fosforilante che riveste un ruolo fondamentale nella
trasduzione dei segnali di sopravvivenza cellulare.
Da recenti studi si sono evidenziate interazioni tra Topoisomerasi II e CK2, che si
inseriscono nei percorsi apoptotici che portano alla morte cellulare programmata.
E’ stato quindi studiato come gli inibitori di Topoisomerasi II e di CK2 possano
agire in modo sinergico nei confronti del tumore, considerando anche che la
terapia farmacologica dei tumori è solitamente multicomponente.
5.1
SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DELLA
TOPOISOMERASI II
Il cammino sintetico progettato per la preparazione dei potenziali inibitori della
Topoisomerasi II prevede la preparazione delle catene sostituenti aromatiche e dei
nuclei benzochinazolinici ed infine la condensazione dei due sintoni
precedentemente preparati.
27
5.1.1
SINTESI
DELLE
CATENE
LATERALI
N-(4-
AMINOFENIL)-METANSOLFONAMIDICHE
La sintesi della catena sostituente priva del metossile è stata effettuata utilizzando
come composto di partenza la N-(4-aminofenil)-acetamide (1) (Schema 1)18. Il
composto 1 è stato trattato con metansolfonilcloruro in presenza di piridina a
freddo, in atmosfera di azoto, ottenendo la N-(4-metansolfonilamidofenil)acetamide (2). L’acetamide 2 è stata idrolizzata con acido cloridrico, ottenendo la
N-(4-aminofenil)-metansolfonamide (3).
NHCOCH3
NHCOCH3
a
NH2
1
NH2
b
NHSO2CH3
NHSO2CH3
2
3
Schema 1. Sintesi di N-(4-aminofenil)-metansolfonamide.
Condizioni di reazione:
a) CH3SO2Cl, piridina, N2, 5°C, 30 minuti, resa 84%.
b) HCl conc., H2O, riflusso, 4 ore, resa 26%.
La sintesi della catena laterale con il metossile in posizione 2 ha come punto di
partenza la 2-metossi-4-nitroanilina (4) (Schema 2)18. Il gruppo aminico
dell’anilina 4 è stato protetto tramite acetilazione e l’acetamide 5 è stata sottoposta
a riduzione del nitrogruppo per idrogenazione catalitica con Pd/C, ottenendo l’N(4-amino-2-metossifenil)-acetamide (6). Il composto 6 è stato trattato con
metansolfonilcloruro e piridina in atmosfera di azoto, ottenendo la N-(2-metossi4-metansolfonilamidofenil)-acetamide (7). Il composto 7 è stato infine
parzialmente idrolizzato in ambiente acido per acido cloridrico, ottenendo la N-(4amino-3-metossifenil)-metansolfonamide (8).
28
NH2
NHCOCH3
H3CO
H3CO
a
NO2
NHCOCH3
b
H3CO
NO2
4
NH2
5
NH2
6
c
NHCOCH3
H3CO
H3CO
d
NHSO2CH3
NHSO2CH3
8
7
Schema 2. Sintesi di N-(4-amino-3-metossifenil)-metansolfonamide.
Condizioni di reazione:
a) Ac2O, AcOH, 80°C, 1 ora, resa 93%.
b) Pd/C, H2, EtOAc, 8 ore, resa 98%.
c) CH3SO2Cl, piridina, N2, 5°C, 30 min., resa 74%.
d) HCl conc., H2O, riflusso, 4 ore, resa 56%.
5.1.2
SINTESI
DI
N-[4-(BENZOCHINAZOLIN-6-
ILAMINO)FENIL]-METANSOLFONAMIDI
I nuclei benzochinazolinici preparati, entrambi a geometria angolare, ma fra loro
diversi per la posizione relativa dei due atomi di azoto dell’anello pirimidinico,
hanno come prodotti di partenza la 4-bromo-1-naftilamina (9) (Schema 3) e la 4bromo-2-nafilamina (15) (Schema 4), i cui gruppi aminici sono stati protetti per
reazione con etile cloroformiato. Sui carbammati ottenuti (10 e 16) per reazione
con
urotropina
in
acido
trifluoroacetico
è
stato
condensato
l’anello
diidropirimidinico, il quale è stato successivamente deidrogenato con potassio
ferricianuro,
ottenendo
bromobenzo[h]chinazolina
le
due
12
e
6-bromobenzochinazoline19
isomere:
6-bromobenzo[f]chinazolina
17.
6-
Nella
preparazione del nucleo 6-bromobenzo[h]chinazolinico 12 si è notato che
l’isolamento
dell’intermedio
naftildiidropirimidinico
11
comporta
una
diminuzione della resa mentre la resa aumenta se la reazione viene condotta in
unica soluzione. Anche il nucleo bromobenzo[f]chinazolinico 17 è stato
29
sintetizzato direttamente con la metodica che prevede un solo step sintetico a
partire dal bromonaftiluretano 16. Sul nucleo triciclico planare sono state infine
condensate le catene metansolfonamidoaniliniche dell’Amsacrina, tramite
reazione di Buchwald-Hartwig assistita da microonde ottenendo i composti 13,
14, 18 e 19 con una notevole riduzione dei tempi ed un aumento della resa di
reazione rispetto ad analoghe sostituzioni nucleofile effettuate tramite reazione di
Buchwald-Hartwig in tecnica classica20.
EtOOC
NH2
EtOOC
NH
a
N
b
Br
10
9
Br
Br
11
c
d
N
N
N
N
N
e
NH
Br
H3CO2SHN
R
12
13= H
14= OCH3
Schema 3. Sintesi di N-[4-(benzo[h]chinazolin-6-ilamino)fenil]-metansolfonamidi.
Condizioni di reazione:
a) Etile cloroformiato, THF anidro, TEA, riflusso, 1 ora, resa
quantitativa.
b) Urotropina, TFA, riflusso, 1 ora, resa 80%.
c) KOH 10 %, EtOH/H2O 1:1, K3Fe(CN)6, riflusso, resa 6%.
d) 1) Urotropina, TFA, riflusso, 1 ora.
2) KOH 10 %, EtOH/H2O 1:1, K3Fe(CN)6, riflusso, resa 23%.
e) p-metansolfonamidoanilina, Pd(Oac)2, BINAP, CsCO3, DMF, MW,
150°C, 10 min., resa: 13 45%, 14 62%.
30
N
NHCOOEt
NH2
a
N
b
Br
Br
15
Br
17
16
N
c
N
NH
H3CO2SHN
R
18 R= H
19 R= OCH3
Schema 4. Sintesi di N-[4-(benzo[f]chinazolin-6-ilamino)fenil]-metansolfonamidi.
Condizioni di reazione:
a) Etile cloroformiato, THF anidro, TEA, T amb., 1 ora, resa quantitativa.
b) 1) Urotropina, TFA, riflusso, 1 ora.
2) KOH 10 %, EtOH/H2O 1:1, K3Fe(CN)6, riflusso, resa 16%.
c) p-metansolfonamidoanilina, Pd(Oac)2, BINAP, CsCO3, DMF, MW,
150°C, 10 min., resa: 18 28%, 19 12%.
31
5.2
SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DELLA
PROTEINCHINASI CK2
5.2.1
SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DI CK2 CON
NUCLEO CHINOLINONICO
Per la preparazione del 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (22)21, è stato utilizzato
come prodotto di partenza la 1,3-fenilendiamina (20) che è stata fatta reagire con
etile acetoacetato, ottenendo il 7-amino-4-metilchinolin-2-one (21), che è stato
sottoposto a reazione di diazotazione con sodio nitrito e successivamente ad
idrolisi in ambiente acido per acido solforico diluito per ottenere il 7-idrossi-4metilchinolin-2-one (22) (Schema 5).
CH3
CH3
a
H2N
NH2
b
H2N
N
H
20
O
HO
21
N
H
O
22
Schema 5. Sintesi di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (22).
Condizioni di reazione:
a) Etile acetoacetato, 150°C, 24 ore, resa 40%.
b) 1) NaNO2, H2SO4 60%, -5°C.
2) H2SO4 30%, 160°C, resa 95%.
La bromurazione (Schema 6) del 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (22) con bromo
elementare o con N-bromosuccinimmide (NBS) in soluzione di acido acetico ha
sempre portato, pur variando i rapporti stechiometrici, ad una miscela di prodotto
di partenza e dei prodotti di monobromurazione, 8-bromo-7-idrossi-4metilchinolin-2-one
(23),
e
di
dibromurazione,
3,8-dibromo-7-idrossi-4-
metilchinolin-2-one (24), impossibili da separare sia per cristallizzazione che per
cromatografia.
Dallo studio delle miscele di reazione ottenute con differenti rapporti
stechiometrici, si è desunto però che l’alogenazione avviene prima in posizione 8.
32
L’utilizzo di NBS in eccesso porta invece al prodotto trialogenato 3,6,8-tribromo7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (25). L’8-bromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one
(23) è stato ottenuto invece operando la bromurazione con bromo elementare in
ammonio idrato al 20% a temperatura ambiente.
CH3
CH3
a
HO
N
H
HO
O
Br 23
22
N
H
O
b
e
c
CH3
Br
CH3
Br
HO
Br
N
H
Br
d
O
HO
Br
25
N
H
O
24
Schema 6. Sintesi di bromoderivati 4-metil-7idrossichinolinonici.
Condizioni di reazione:
a) Br2, NH4OH (20%), T amb., resa 47%.
b) Br2, AcOH, 60°C.
c) NBS, AcOH, T amb., 1 ora, resa 76%.
d) Na2SO3, NaOH, H2O/MeOH (3/1), T amb..
e) Br2, AcOH, 60°C, resa 47%.
Il 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (24) è stato successivamente
ottenuto per bromurazione del composto 23, addizionando goccia a goccia bromo
diluito in acido acetico fino a scomparsa del prodotto di partenza.
E’ stata anche tentata la sintesi del prodotto 24 per monodebromurazione con
sodio solfito dal 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (25), preparato
dal composto 22 per bromurazione esaustiva con NBS, ma senza ottenere il
prodotto desiderato.
Il 7-idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one (26) (Schema 7) è stato sintetizzato dal
composto 22 solubilizzato in ammonio idrato al 20% aggiungendo, goccia a
goccia, lo iodio solubilizzato in una soluzione acquosa di potassio ioduro. Dal 7idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one (26) è stato quindi sintetizzato il 3-bromo-7-
33
idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one (27) per bromurazione in acido acetico
glaciale.
CH3
CH3
CH3
a
HO
N
H
Br
b
O
HO
I
22
N
H
O
HO
N
H
I
26
O
27
Schema 7. Sintesi di iododerivati 4-metil-7idrossichinolinonici.
Condizioni di reazione:
a) I2, NH4OH, T amb., 1 ora, resa 48%.
b) Br2, AcOH, 60°C, resa 48%.
Il 7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one (30) (Schema 8) è stato preparato per
diazotazione ed idrolisi dal 7-amino-4,6-dimetilchinolin-2-one (29), ottenuto a sua
volta per condensazione di 2,4-diaminotoluene (28) ed acetoacetato di etile a
150°C .
CH3
H3C
a
H2N
H3C
H2N
NH2
28
N
H
O
29
b
CH3
CH3
H3C
Br
HO
Br
N
H
c
H3C
HO
O
31
N
H
O
30
Schema 8. Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one (19).
Condizioni di reazione:
a) Etile acetoacetato, 150°C, 48 ore, resa 46%.
b) 1) H2SO4 30%, NaNO2, -5 °C.
2) H2SO4 30%, 160 °C, resa 50%.
c) Br2, AcOH, 60°C, 3 ore, resa 72%.
La bromurazione del composto 30 in soluzione acetica con bromo elementare in
difetto (0.5:1) ed a diverse temperature, porta alla formazione di una miscela di
34
prodotti di monobromurazione e dibromurazione che non è stato possibile
separare. Invece, usando un eccesso di bromo, si è ottenuto il 3,8-dibromo-7idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one (31).
5.2.2
SINTESI DI POTENZIALI INIBITORI DI CK2 CON
NUCLEO CUMARINICO
5.2.2.1 SOSTITUZIONI NELLE POSIZIONI 6 ED 8 DEL NUCLEO
CUMARINICO22
Il prodotto di partenza della sintesi dei composti riportati nello Schema 9 è il 4metilumbelliferone (32) il quale è stato formilato in posizione 8 con urotropina
per ottenere il composto 33. Dal formilderivato 33 è stata ottenuta l’ossima 34 che
successivamente è stata disidratata con anidride acetica e subito sottoposta ad
idrolisi in ambiente acido ottenendo il derivato carbonitrilico 35. Il composto 35 è
stato sottoposto a reazione di bromurazione ma senza ottenere il prodotto
desiderato 36. Questo è stato invece ottenuto seguendo tre diverse strategie
sintetiche: una via ha previsto la bromurazione in posizione 3 del composto 34 per
ottenere l’ossima 37 che è stata sottoposta a disidratazione ottenendo il prodotto
carbonitrilico 36. Una seconda via ha previsto dapprima la sintesi del derivato
cumarinico 38 bromosostituito in posizione 3, successivamente la formilazione in
posizione 8 ed il composto 39 così ottenuto è stato sottoposto sia a reazione con
idrossilamina per ottenere l’ossima 37 dal quale, come scritto precedentemente, si
ottiene il composto 36. Oppure il composto 39 è stato sottoposto direttamente a
reazione con idrossilamina con tecnica assistita da microonde per ottenere la
formazione dell’intermedio 37 e la sua contemporanea disidratazione a composto
36.
E’ stato effettuato un confronto tra sintesi classica e sintesi assistita da microonde
nella reazione di formilazione che ha portato ai prodotti 33 e 39. Dopo un
opportuno studio di ottimizzazione delle condizioni di reazione si è ottenuto con
la metodica assistita dalle microonde un notevole aumento della resa ed una
riduzione dei tempi di reazione (Tabella 1).
35
Composto
33
39
METODO CONVENZIONALE
Condizioni
Tempo Resa
HMTA, AcOH,
2 ore 30%
riflusso
HMTA, AcOH,
2 ore 28%
riflusso
METODO MW
Condizioni
Tempo Resa
HMTA, AcOH,
15 min 75%
120°C
HMTA, AcOH,
15 min 69%
120°C
Tabella 1. Confronto sintesi convenzionale vs. sintesi assistita da microonde per i composti
33 e 39.
I composti 40 e 41, isomeri 3-bromoderivati con un nitrogruppo rispettivamente in
posizione 6 ed 8, sono stati ottenuti sottoponendo a reazione di nitrazione con
acido nitrico in acido solforico il 3-bromoderivato 38 e separati mediante
cromatografia.
Per la sintesi dei due isomeri 44 e 45 si è dapprima sottoposto il composto 32 a
reazione di nitrazione con acido nitrico in acido solforico ed i due isomeri 42 e 43
sono stati separati per cromatografia e sottoposti a bromurazione esaustiva con
NBS in soluzione di acetonitrile a riflusso.
36
CH3
CH3
Br
e
CH3
Br
HO
Br
b
CH3
HO
O
NO2
O
44
d
HO
g
CH3
O
O
NO2
HO
O
32
HO
O
CH3
CH3
O
Br
HO
O
CN
35
d
O
O
36
c
e
CH3
CH3
Br
Br
Br
c
CN
CH3
HO
O
c
O
g
O2N
O
CH=NOH 37
O
42
HO
e
f
HO
O
33
CH3
+
43
O
a
CH3
O
O
CHO
O2N
HO
O
CH=NOH 34
HO
O
O
a
Br
b
HO
O
38
45
CH3
Br
O
O
CHO
HO
CH=NOH
39
f
O
CH3
O
37
CH3
Br
O2N
Br
+
HO
O
O
40
Schema 9. Sintesi di derivati cumarinici come inibitori CK2.
37
HO
O
NO2
O
41
Condizioni di reazione Schema 9:
Urotropina, AcOH, riflusso, 2 ore; resa: 33 30%, 39 28%.
oppure
Urotropina, AcOH, MW, 120°C, 15 min., resa: 33 75%, 39 69%.
b) Idrossilammina cloridrato, MeOH, T amb., 2 ore; resa: 34 55%, 37 98%.
c) 1) Ac2O, riflusso, 50 min;
2) H2SO4 conc., AcOH, riflusso, 2 ore; resa 35 18%, 36 27%.
d) Idrossilammina cloridrato, NMP, MW, 12 min., 140°C, resa 35 81%, 36 68%.
e) Br2, AcOH, 60°C, resa: 37 64%, 38 12%.
f) HNO3 65%, H2SO4 conc., 0°C, resa: 40 40%, 41 40%, 42 41%, 43 42%.
g) NBS, CH3CN, riflusso, 2 ore, 44 95%, 45 87%.
a)
La
3,8-dibromo-6,7-diidrossi-4-metilcumarina
(50)
è
stata
ottenuta
per
bromurazione esaustiva della 6,7-diidrossi-4-metilcumarina (48) (Schema 10)
mentre la 3-bromo-6,7-diidrossi-4-metilcumarina (49) è stata preparata per
bromurazione regioselettiva in posizione 3 del nucleo di partenza 48 per
trattamento con bromo in soluzione acetica a temperatura ambiente. La
diidrossicumarina 48 è stata preparata partendo dall’1,4-benzochinone (46) che
per reazione con anidride acetica in acido solforico ha fornito l’1,2,4triacetossibenzene (47) che è stato successivamente sottoposto a condensazione di
Pechmann con etile acetoacetato.
O
CH3
OCOCH3
OCOCH3
a
HO
b
HO
46 O
47
O
48
OCOCH3
c
d
CH3
CH3
HO
HO
O
O
Br
HO
O
HO
Br
O
Br
49
50
Schema 10. Sintesi di bromoderivati della 6,7-diidrossi-4-metilcumarina.
Condizioni di reazione:
a) Ac2O, H2SO4, 45°C, 30 min., resa 29%.
b) Etile acetoacetato, H2SO4 conc., riflusso, 2 ore, resa 40%.
c) Br2, AcOH, T amb., 30 min., resa 92%.
d) Br2, AcOH, 60°C, 30 min., resa 61%.
38
O
Nello Schema 11 è riportata la via sintetica seguita per ottenere la 3-bromo-7,8idrossi-4-metilcumarina (53) e la 3,6-dibromo-7,8-diidrossi-4-metilcumarina (54).
La 7,8-diidrossi-4-metilcumarina (52) è stata preparata per condensazione di
Pechmann di pirogallolo (51) ed etile acetoacetato. Il composto 52 per lenta
aggiunta della quantità stechiometrica di bromo ha fornito il prodotto di
monobromurazione in 3, 3-bromo-7,8-diidrossi-4-metilcumarina (53), mentre per
bromurazione con eccesso di bromo ha fornito il prodotto di dibromurazione, 3,6dibromo-7,8-diidrossi-4-metilcumarina (54).
CH3
Br
HO
CH3
O
OH
b
53
a
HO
OH
OH
HO
O
OH
51
O
CH3
c
52
O
Br
Br
HO
O
O
OH
54
Schema 11. Sintesi di bromoderivati 7,8-diidrossicumarinici.
a) Etile acetoacetato, H2SO4 conc., 0°C, 15 min., resa 59%.
b) Br2 ( rapporto molare 1:1), AcOH, 60°C, 10 min., resa 51%.
c) Br2 ( rapporto molare 2:1), AcOH, 60°C, 1 ora, resa 52%.
5.2.2.2
SOSTITUZIONI
NELLA
POSIZIONE
7
DEL
NUCLEO
CUMARINICO22
La sintesi della 7-amino-3,8-dibromo-4-metilcumarina (60) (Schema 12), analogo
della DBC con la sostituzione del gruppo ossidrilico con un gruppo amminico, è
stata effettuata partendo dal 3-aminofenolo (55). Per protezione del gruppo
aminico con etile cloroformiato è stato ottenuto l’etile (3-idrossifenil)carbammato
(56) che è stato condensato con etile acetoacetato in acido solforico ottenendo
l’etile
(4-metilcumarin-7-il)carbammato
(57).
Il
composto
57
è
stato
successivamente idrolizzato con acido solforico in soluzione di acido acetico a
riflusso ottenendo la 7-amino-4-metilcumarina (58). Il composto 58 è stato infine
39
dibromurato per reazione con bromo elementare in quantità stechiometrica
ottenendo la 7-amino-3,8-dibromo-4-metilcumarina (60). Dal composto 58 sono
stati anche ottenuti per bromurazione con NBS a temperatura ambiente in
acetonitrile il composto 59 e, per bromurazione esaustiva con bromo elementare
in eccesso a 60°C, il composto 61.
CH3
b
a
H2N
OH
EtOOC
N
H
EtOOC
OH
55
N
H
O
56
O
57
c
CH3
CH3
Br
d
H2N
O
O
H2N
O
O
58
59
e
f
CH3
H2N
O
Br
CH3
Br
Br
O
H2N
Br
O
Br
60
61
Schema 12. Sintesi di 7-amino-3,8-dibromo-4-metilcumarina (58).
Condizioni di reazione:
a) Etile cloroformiato, THF, T amb., 1 ora, resa 56%.
b) Etile acetoacetato, H2SO4 70%, T amb., 5 ore, resa 85%.
c) H2SO4, AcOH, riflusso, 5 ore, resa 83%.
d) NBS, CH3CN, T amb., 20 min., resa 66%.
e) Br2, AcOH, 60°C, 1 ora, resa 14%.
f) Br2, AcOH, 60°C, 3 ore, resa 44%.
40
O
Per ottenere il 3,8-dibromo-7-metossi-4-metilcumarina (63), analogo metossilato
in posizione 7 del lead compound cumarinico (DBC), si è tentato (Schema 13)
dapprima di metilare con iodometano l’ossidrile in posizione 7 del 4metilumbelliferone (32) ottenendo il composto 62 e sottoponendo quest’ultimo a
bromurazione con bromo elementare ottenendo però esclusivamente la 3,6dibromo-7-metossi-4-metilcumarina (64) isomero del prodotto desiderato 63.
Questo è stato invece ottenuto per metilazione del gruppo ossidrilico della DBC
(65), ottenuta per reazione di bromurazione del composto 32. Per reazione di
acetilazione del composto 65 si è ottenuto il derivato 7-acetossilato della DBC
(66).
CH3
CH3
Br
Br
b
H3CO
O
64
O
H3CO
O
O
62
CH3
b
a
CH3
Br
63
HO
O
32
O
H3CO
O
O
Br
c
d
CH3
CH3
Br
HO
O
O
Br
Br
e
H3COCO
O
Br
65
Schema 13. Sintesi di bromocumarine 7-sostituite.
Condizioni di reazione:
a) CH3I, acetone, K2CO3, T amb., 3 ore, resa quantitativa.
b) Br2, AcOH, 60°C, 2 ore, resa 76%.
c) Br2, AcOH, 60°C, 3 ore, resa 48%.
e) CH3I, acetone, K2CO3, T amb., resa quantitativa.
f) Ac2O, sodio acetato, riflusso, 1 ora, resa 58%.
41
O
66
Il composto 67 (Schema 14), ottenuto facendo reagire la DBC (65) con
dimetiltiocarbamoil cloruro, è stato sottoposto a riarrangiamento per fusione
ottenendo così l’intermedio 68, il quale è stato sottoposto ad idrolisi in ambiente
acido portando alla formazione della 3,8-dibromo-4-metil-7-tiolcumarina (69).
CH3
CH3
Br
Br
a
HO
O
O
S
(H3C)2NCO
Br
O
O
Br
67
65
b
CH3
CH3
Br
Br
c
O
(H3C)2NCS
O
O
Br
HS
O
Br
68
69
Schema 14. Sintesi di 3,8-dibromo-4-metil-7-tiolcumarina (69).
Condizioni di reazione:
a) Dimetiltiocarbamoil cloruro, K2CO3, acetone, riflusso, 2 ore, resa 80%.
b) Fusione, 10 min., resa quantitativa.
c) H2SO4 conc., AcOH, riflusso, 1 ora, resa 79%.
42
O
5.2.2.3
SOSTITUZIONE
NELLA
POSIZIONE
4
DEL
NUCLEO
CUMARINICO
La 4,7-diidrossicumarina 71 (Schema 15) è stata sintetizzata sottoponendo a
reazione di Pechmann con acido malonico la resorcina22 (70). Il prodotto 71 è
stato sottoposto a reazione di bromurazione con bromo elementare con diversi
rapporti stechiometrici per ottenere i prodotti desiderati: 3-bromo-7-idrossi-4,7diidrossicumarina (72), 3,8-dibromo-7-idrossi-4,7-diidrossicumarina (73), 3,6,8tribromo-7- idrossi-4,7-diidrossicumarina (74); chiaramente la posizione 3 è la
prima ad essere bromurata, successivamente si bromura la posizione 8 e per
bromurazione esaustiva si bromurano le posizioni 3, 6 ed 8.
OH
Br
72
HO
O
b
OH
O
OH
Br
a
HO
OH
70
c
HO
O
71
73
HO
O
O
O
Br
d
OH
Br
Br
74
HO
O
Br
Schema 15. Sintesi di bromoderivati 4,7-diidrossicumarinici.
a) Acido malonico, ZnCl2, POCl3, 75°C, 3 ore, resa 18%.
b) Br2 (rapporto molare 1:1), AcOH, 60°C, 3 ore, resa 43%.
c) Br2 (rapporto molare 2:1), AcOH, 50°C, 2 ore, resa 40%.
d) Br2 (rapporto molare 3:1), AcOH, 60°C, 3 ore, resa 47%.
43
O
Per reazione di bromurazione con bromo elementare dell’umbelliferone (75)
(Schema 16) in soluzione di acido acetico è stata ottenuta la 3-bromo-7idrossicumarina (76) in quanto la posizione maggiormente attivata per la
sostituzione con bromo risulta essere quella vinilica in 3. La 3,6-dibromo-7idrossicumarina (77) e la 3,8-dibromo-7-idrossicumarina (78) sono state ottenute
dalla reazione di bromurazione del composto 76 per lenta aggiunta di bromo
elementare in acetonitrile fino a scomparsa del prodotto di partenza in quanto la
polibromurazione diretta del nucleo di base 75 porta a miscele di reazione con più
prodotti difficilmente separabili per cristallizzazione o cromatografia. Il derivato
esaustivamente bromurato dell’umbelliferone non è stato preparato in quanto
precedentemente già sintetizzato e saggiato su CK2.
Br
a
HO
O
O
HO
O
75
O
76
b
Br
Br
Br
+
HO
O
O
HO
O
O
Br
77
78
Schema 16. Sintesi di bromocumarine non sostituite in posizione 4.
Condizioni di reazione:
a) Br2, AcOH, 60°C, resa 40%.
b) Br2, CH3CN, 60°C, resa: 77 18%, 78 15%.
La 4-etil-7-idrossicumarina (79) (Schema 17) è stata preparata dal resorcinolo
(70) per condensazione di Pechmann con etile propionilacetato. La 3-bromo-4etil-7-idrossicumarina (80) è stata ottenuta per bromurazione della 4-etil-7idrossicumarina (79). I due isomeri 3,6-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina (81) e
3,8-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina (82) sono stati ottenuti per bromurazione del
composto 79 addizionando molto lentamente bromo elementare diluito fino a
scomparsa del prodotto di partenza e separati mediante cromatografia. La lenta
addizione di bromo è necessaria per ridurre la contemporanea formazione del
44
prodotto trisostituito 83. La 3,6,8-tribromo-4-etil-7-idrossicumarina (83) è stata
sintetizzata a partire dal composto 79 mediante bromurazione esaustiva in acido
acetico.
CH2CH3
a
HO
Br
b
OH
HO
O
67
O
HO
O
79
O
80
c
d
CH2CH3
Br
CH2CH3
CH2CH3
Br
CH2CH3
Br
Br
O
HO
Br
+
HO
O
O
HO
O
Br
81
O
O
Br
82
83
Schema 17. Sintesi di bromoderivati 4-etil-7-idrossicumarinici.
Condizioni di reazione:
a) Etile propionilacetato, H2SO4, riflusso, 1 ora, resa 90%.
b) Br2, AcOH, 60°C, 2 ore, resa 58%.
c) Br2, AcOH, 60°C, resa: 81 18%, 82 11%.
d) Br2, AcOH, 60°C, 1 ora, resa 89%.
La 4-bromometil-7-idrossicumarina (84) (Schema 18) è stata preparata dal
resorcinolo (70) per condensazione di Pechmann con 4-bromoacetoacetato di
etile, preparato a sua volta per reazione con bromo a temperatura ambiente
dell’acetoacetato di etile. La 8-bromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (85) è
stata sintetizzata per bromurazione del composto 84, per lenta aggiunta di bromo
diluito in acetonitrile fino a scomparsa del prodotto di partenza, mantenendo la
temperatura a 0-5°C. La 3,6-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (86) e la
3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (87) sono state ottenute per
bromurazione del composto 84 addizionando goccia a goccia bromo elementare
diluito in acetonitrile a temperatura ambiente ed i due isomeri sono stati isolati
mediante
cromatografia
su
colonna.
45
La
3,6,8-tribromo-4-bromometil-7-
idrossicumarina (88) è stata preparata dalla cumarina di partenza 84 per
bromurazione esaustiva con bromo elementare in acido acetico.
CH2Br
CH2Br
a
HO
OH
b
HO
O
O
HO
O
O
Br
70
84
85
c
d
CH2Br
Br
CH2Br
Br
CH2Br
Br
Br
O
HO
Br
+
HO
O
O
HO
O
Br
86
O
O
Br
88
87
e
e
CH2OH
HO
O
Br
CH2OH
Br
Br
O
HO
Br
O
O
Br
89
90
Schema 18. Sintesi di bromo-4-bromometilcumarine e bromo-4-idrossimetilcumarine.
Condizioni di reazione:
a) 4-Bromoacetacetato di etile, H2SO4, T amb., 1 ora, resa 45%.
b) Br2, CH3CN, 0-5°C, resa 24%.
c) Br2, CH3CN, T amb., resa: 86 17% , 87 25%.
d) Br2, AcOH, 50°C, 2 ore, resa 89%.
e) H2O, MW, 150°C, 15 min., resa quantitativa.
La 4-clorometil-7-idrossicumarina (91) è stata preparata dal resorcinolo (70) per
condensazione di Pechmann con il 4-cloroacetacetato di etile (Schema 19). Per
bromurazione del composto 91 con bromo elementare diluito in acetonitrile ed in
bagno di ghiaccio è stata ottenuta la 8-bromo-4-clorometil-7-idrossicumarina (92),
mentre per reazione di bromurazione a temperatura ambiente ed in soluzione
46
cloroformica del composto 91 si è ottenuta la 6,8-dibromo-4-clorometil-7idrossicumarina (94).
CH2OH
CH2Cl
Br
Br
HO
O
HO
O
O
Br
Br
95
96
f
g
CH2Cl
CH2Cl
a
HO
OH
O
b
HO
70
O
O
HO
O
Br
91
c
O
92
e
d
CH2Cl
CH2Cl
Br
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
94
93
g
CH2OH
Br
HO
O
O
Br
97
Schema 19. Sintesi di bromo-4-clorometilcumarine e bromo-4-idrossimeticumarine.
Condizioni di reazione:
a) 4-Cloroacetoacetato di etile, H2SO4, T amb., 1 ora, resa 48%.
b) Br2, CH3CN, 0-5°C, resa 39%.
c) Br2, CHCl3, T amb., resa 65%.
d) Br2, CH3CN, diverse condizioni.
e) Br2, CH3CN, 0-5°C.
f) NBS, CH3CN, riflusso, 2 ore, resa 92%.
g) H2O, MW, 150°C, 15 minuti, resa: 96 quantitativa, 97 quantitativa.
47
Per ottenere il composto 93 dibromurato nelle posizione 3 ed 8 sono state tentate
diverse strategie sintetiche: si sono variate sia le condizioni di reazione
modificando le temperature ed i tempi di aggiunta del bromo diluito, sia i prodotti
di partenza (sono stati impiegati i composti 91 e 92). Si è cercato infatti di favorire
la sostituzione del bromo in posizione 3 rispetto alla sostituzione dello stesso in
posizione 6, ma nella maggior parte delle reazioni eseguite sono state ottenute
miscele di reazione spesso alquanto complesse e le reazioni sono state così
abbandonate. Il composto desiderato 93 si forma addizionando molto lentamente
una soluzione diluita di bromo (una settimana) ma si è osservata la formazione
come sottoprodotto del composto 87 per sostituzione del cloro clorometilenico
con un atomo di bromo ed i due prodotti (1H-NMR ed HRMS sono riportati in
Figura 20 ed 21) sono risultati non separabili né per cromatografia né per
cristallizzazione. La 3,6,8-tribromo-4-clorometil-7-idrossicumarina (95) è stata
preparata bromurando esaustivamente il composto 91 con NBS.
Figura 20.
Spettroscopia 1H-NMR della miscela di 3,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
(93) e 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (87).
48
Mariner Spec /9:9 (T /0.55:0.55) ASC[BP = 410.8, 1176]
410.7720
100
1176.1
412.7720
90
80
366.8232
% Intensity
70
60
50
40
30
364.8386
20
0
350
408.7906
367.0931
367.8140
10
360.8664
370
414.7670
411.7714
414.3585
378.8827
390
410
430
0
450
Mass (m/z)
Figura 21.
Spettroscopia HMRS in negativo della miscela di 3,8-dibromo-4-clorometil-7idrossicumarina (93) e 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (87).
I prodotti 4-idrossimetilici (Schema 18 e Schema 19) 89, 90, 96, 97, sono stati
ottenuti dai rispettivi 4-alometilderivati 87, 88, 92, 94, utilizzando la sintesi
assistita da microonde che ha consentito, confrontando i dati ottenuti con altri
presenti in letteratura23 per composti analoghi, di ridurre notevolmente i tempi di
reazione (da 14 ore a circa 15 minuti) e di semplificare il work-up della reazione
pur mantenendo paragonabili le rese.
Per la preparazione della 7-idrossi-4-metossicumarina (98) (Schema 20) è stato
utilizzato come prodotto di partenza la 4,7-diidrossicumarina (71), che è stata
sottoposta a reazione di metilazione selettiva24 in posizione 4 per riflusso con
metanolo in ambiente acido per acido solforico. La 8-bromo-7-idrossi-4metossicumarina (99) e poi la 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metossicumarina (100)
sono state ottenute dal composto 98 per lenta addizione di una soluzione diluita di
bromo elementare in acido acetico a diverse temperature.
49
OCH3
99
HO
O
O
Br
OH
b
OCH3
OCH3
Br
a
HO
O
O
c
HO
71
O
98
O
100
HO
O
O
Br
d
OCH3
Br
Br
101
HO
O
O
Br
Sintesi di bromo-4-metossicumarine.
Condizioni di reazione:
a) H2SO4, MeOH, riflusso, 3 ore, resa 60%.
b) Br2, AcOH, 60°C, 2 ore, resa 19%.
c) Br2, AcOH, T amb., resa 23%.
d) NBS, CH3CN, T amb., 1 ora, resa 88%.
Schema 20.
La 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-metossicumarina (101) è stata ottenuta per
bromurazione esaustiva del composto 98 con NBS in soluzione di acetonitrile.
La struttura del composto 98 è stata confermata mediante NOESY per verificare
l’esatta posizione del gruppo metossilico che è risultato essere effettivamente in
posizione 4 in quanto si osserva un cross-peak (in rosso) tra il segnale a 3.96 del
gruppo metossilico ed il segnale a 5.67 del protone in posizione 3 (Figura 22) ed
ulteriormente confermato dai cross-peaks tra il segnale del protone ossidrilico a
10.56 ed i segnali dei protoni in posizione 6 a 6.78 (in blu) ed 8 a 6.69 (in verde)
(Figura 23).
50
Figura 22.
Spettro NOESY di 7-idrossi-4-metossicumarina (98): cross-peak tra i segnali del
metossile in 4 e del protone in 3.
Figura 23.
Spettro NOESY di 7-idrossi-4-metossicumarina (98): cross-peak tra il segnale
dell’ossidrile in 7 ed i segnali dei protoni in 6 (blu) ed 8 (verde).
51
Nello Schema 21 è riportata la via di sintesi seguita per ottenere i bromoderivati
della 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (102).
CF3
CF3
Br
d
HO
O
O
HO
Br
O
Br
b
105
103
c
d
CF3
CF3
OH
Br
c
a
HO
O
HO
O
71
O
102
HO
O
Br
f
O
104
e
CF3
Br
CF3
Br
HO
O
Br
O
f
Br
HO
O
O
Br
106
105
Sintesi di bromo-4-trifluorometilcumarine.
Condizioni di reazione:
a) Trifluoroacetoacetato d’etile, TFA, riflusso, 3 ore, resa 56%.
b) Br2, AcOH, T amb., 2 ore, resa 30%.
c) Br2, AcOH, 60°C., resa 55%.
d) Br2, CH3CN, T amb., 1 ora, resa 77%.
e) NBS, CH3CN, riflusso, 2 ore, resa 83%.
f) Na2SO3, NaOH, acqua/MeOH, T amb., 30 min., resa quantitativa.
Schema 21.
Il composto 102 è stato ottenuto per condensazione del resorcinolo (70) con
trifluoroacetoacetato d’etile e successivamente sottoposto a reazione di
bromurazione in acido acetico a temperatura ambiente ottenendo il composto 103
bromurato in posizione 8. Per reazione di bromurazione a temperatura ambiente in
soluzione di acetonitrile si ottiene il composto 6,8-dibromo sostituito (105). La
52
3,6,8-tibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (106) è stata ottenuta per
bromurazione esaustiva del composto 102 con NBS.
La preparazione del composto 104 è stata tentata per lenta bromurazione del
composto 103 ma l’ingresso del bromo in posizione 3 non si è ottenuta pur
variando temperature e solventi di reazione. L’ottenimento del composto 104 è
stato tentato senza successo anche per reazione di eliminazione del bromo in
posizione 6 con sodio solfito.
Per ottenere il composto 104 si è provata anche la condensazione di Pechmann tra
il 2-bromotrifluoroacetoacetato d’etile (108) (Schema 22), preparato per
bromurazione del trifluoroacetacetato d’etile (107), ed il 2-bromoresorcinolo25
(110) ma senza successo. Il composto 110 è stato preparato per debromurazione
selettiva in posizione 4 e 6, utilizzando Na2SO3 in ambiente acquoso alcalino, del
composto 109, che è stato ottenuto per bromurazione esaustiva del resorcinolo
(70) (Schema 23).
CF3
O
O
F3C
O
a
F3C
O
Br
b
O
HO
Br
108
107
Schema 22.
O
O
Br
O
104
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (103).
Condizioni di reazione:
a) 1) NaH, THF, 0°C.
2) Br2, CH2Cl2, T amb., 3 ore, resa 94%.
b) 2-Bromoresorcinolo, diverse condizioni.
Br
Br
a
HO
OH
70
b
HO
OH
Br
109
HO
Br
OH
110
Schema 23. Sintesi di 2-bromoresorcinolo.
Condizioni di reazione:
a) Br2, AcOH, 60°C, 4 ore, resa 71%.
b) Na2SO3, NaOH, acqua/MeOH, T amb., 15 min., resa 92%.
Si è tentato di ottenere il composto 104 seguendo la strategia di sintesi riportata
nello Schema 24. La 4-trifluorometil-7-idrossicumarina 102 è stata iodurata in
53
posizione 6 con iodio elementare in soluzione ammoniacale ottenendo il composto
111 il quale è stato sottoposto a reazione di bromurazione per ottenere il composto
112 che non è stato però ottenuto in quanto si ha sostituzione con bromo dello
iodio in 6 ed ingresso di bromo nella posizione 8 prima dell’ingresso del bromo
sulla posizione 3 del nucleo cumarinico.
CF3
CF3
a
HO
O
O
I
HO
O
102
O
111
b
b
CF3
I
HO
O
CF3
Br
Br
O
HO
Br
O
O
Br
112
105
c
CF3
Br
HO
O
O
Br
104
Schema 24.
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (104).
Condizioni di reazione:
a) I2, KI, NH4OH, T amb., 1 ora, resa 43%.
b) Br2, AcOH, T amb., resa 80%.
Per provare a sintetizzare il composto 104 si sono seguite due ulteriori strategie
sintetiche (Schema 25).
54
CF3
HO
O
O
102
a
CF3
CF3
O2N
+
HO
O
O
HO
O
NO2
113
O
114
e
b
e
CF3
CF3
O2N
Br
Br
O
118
HO
Br
O
HO
Br
O
115
HO
O
NO2
CF3
NO2
CF3
H2N
H2N
O
O
O
119
c
d
HO
CF3
O
Br
HO
O
Br
117
CF3
O
116
Br
HO
O
NH2
O
120
CF3
Br
HO
O
Br
Schema 25.
O
104
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (104).
Condizioni di reazione:
a)
HNO3 65%, H2SO4 conc., 0°C, resa: 113 40%, 114 31%.
b) Br2, AcOH, 60°C, 1 ora, resa 94%.
c)
SnCl2, EtOH assoluto, riflusso, 1 ora;
d) Na2S2O4, NH4OH 10%, T amb., 1 ora; oppure H2, Pd/C, EtOH, T
amb., resa quantitativa.
e)
Br2, AcOH, 50°C, 2 ore, resa 62%.
55
Per reazione di nitrazione con acido nitrico in acido solforico della 7-idrossi-4trifluorometilcumarina (102) si sono ottenuti i due nitroderivati isomeri 113 ed
114 nitrati rispettivamente nelle posizioni 6 ed 8 che sono stati separati mediante
cromatografia su colonna. La 7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina (113) è
stata sottoposta a reazione di bromurazione esaustiva con bromo elementare
ottenendo la 3,8-dibromo-7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina (115).
Il composto 115 è stato sottoposto a diversi tentativi di riduzione per ottenere il
composto 116 che hanno però portato, usando come riducente cloruro stannoso,
alla formazione di una miscela complessa di prodotti, ed utilizzando come agenti
riducenti sodio solfito od idrogeno, alla formazione della 6-amino7-idrossi-4trifluorometilcumarina (117). Dalla 7-idrossi-8-nitro-4-trifluorometilcumarina
(114) si è cercato di ottenere, seguendo un diverso percorso sintetico il composto
118 per reazione di bromurazione ma non si è ottenuto il prodotto desiderato bensì
il prodotto 119 bromurato nella posizione 6.
56
5.3
DATI BIOLOGICI
L’attività inibitoria dei composti sintetizzati è stata valutata mediante saggi di
inibizione sui rispettivi target enzimatici. Successivamente, con i composti
rivelatisi più attivi nei confronti dell’enzima bersaglio, si sono effettuati saggi di
citotossicità su alcune linee cellulari tumorali.
5.3.1
NUOVI INIBITORI DELLA TOPOISOMERASI II
L’ effetto dei nuovi potenziali inibitori della Topoisomerasi II con nucleo
benzo[h]chinazolinico (13, 14) e benzo[f]chinazolinico (18, 19) sull’attività di
decatenazione del DNA (plasmide PBR322) ha dimostrato una discreta attività
d’inibizione dell’enzima a concentrazioni comprese tra i 10 µM ed i 50 µM
mentre il composto di riferimento (m-Amsacrina) inibisce l’enzima ad una
concentrazione 8 µM.
I composti sono stati successivamente saggiati su alcune linee cellulari tumorali
(Tabella 2) e l’attività citotossica è stata determinata mediante il test MTT 26, un
test colorimetrico largamente utilizzato in vari protocolli di drug screening per la
determinazione dell’attività biologica di nuove sostanze. I dati ottenuti hanno
evidenziato una discreta citotossicità del composto 13 nei confronti delle diverse
linee cellulari tumorali ed una buona citotossicità dei composti 13, 14, 19 su
cellule leucemiche HL60. Il composto 18 non è stato saggiato per problemi di
solubilità.
57
IC50 (µM) ± S.D.
COMPOSTO
2008
13
MCF7
HL60
LoVo
57.53±5.72 57.66±4.17 33.99±2.36 26.49±2.87 78.34±5.56
>100
14
19
A431
>100
>100
26.92±3.29 57.53±5.72
62.58±5.95 77.74±4.50 62.50±4.15 30.76±4.51 89.31±1.65
Amsacrina
4.31±0.53
5.89±1.20
5.13±0.50
1.05±0.05
4.98±2.56
Ellipticina
1.68±0.68
3.24±1.00
0.94±0.14
2.03±1.04
2.92±1.35
Tabella 2.
5.3.2
Citotossicità in vitro dei nuovi inibitori della Topoisomerasi II.
2008: cellule di adenocarcinoma ovarico.
A431: cellule di carcinoma epiteliale umano.
MCF7: cellule di carcinoma mammario.
HL60: promielociti di leucemia umana.
LoVo: cellule di adenocarcinoma del colon umano.
NUOVI INIBITORI DELLA PROTEINCHINASI CK2
I dati dei saggi di inibizione sull’enzima isolato CK2 (tutti i dati sono riportati alla
fine del capitolo) hanno dimostrato, grazie al confronto con dati presenti in
letteratura8 di alcuni composti cumarinici variamente alogenati, che la sostituzione
bioisostera NH-O in posizione 1 del nucleo cumarinico non porta a sostanziali
variazioni di attività inibitoria nei confronti dell’ enzima e quindi lo scaffold
cumarinico e quello chinolinonico sono pressocché equivalenti (Tabella 3).
58
CUMARINA
CHINOLINONE
IC50 (µM)
CH3
HO
O
CH3
O
0.80
HO
I
I
CH3
N
H
O
O
0.28
HO
I
CH3
O
N
H
O
0.70
HO
Br
CH3
N
H
O
HO
Br
CH3
O
N
H
O
Br
1.90
O
0.20
Br
HO
Br
Tabella 3.
1.60
CH3
Br
HO
O
Br
0.10
(DBC)
Br
Br
0.30
CH3
Br
O
O
CH3
Br
HO
1.30
Br
I
HO
O
CH3
Br
HO
IC50 (µM)
Br
N
H
O
2.20
Confronto dell’attività inibitoria su CK2 tra i composti chinolinonici sintetizzati ed
alcuni analoghi cumarinici.
La sostituzione dell’atomo di bromo in posizione 8 della DBC (IC50 0.1 µM) con
un gruppo formilico, idrossimminico, carbonitrilico, ossidrilico od un nitrogruppo
(composti 36, 37, 39, 53 e 41) o la non sostituzione di questa posizione (composto
38) porta ad una diminuzione dell’attività inibitoria nei confronti di CK2. Anche
la sostituzione nei composti chinolinonici sintetizzati dell’atomo di bromo in
posizione 8 (23, 24) con un atomo di iodio (26, 27) porta ad un aumento di IC50.
I composti con maggiore attività non presentano un sostituente in posizione 6.
Infatti i composti sostituiti in posizione 6 della DBC con un gruppo ossidrilico
(50) o con un nitrogruppo (45) o i derivati con un bromo (25) od un metile (31) in
tale posizione dell’analogo chinolinonico della DBC hanno minore attività
59
inibitoria nei confronti dell’enzima rispetto agli analoghi non sostituiti in
posizione 6. Ciò è confermato anche osservando come abbiano un IC50 maggiore i
composti non sostituiti in posizione 4 da un gruppo metilico e bromurati in
posizione 6 (74, 77, 83, 88, 90, 101) rispetto agli analoghi non bromurati in tale
posizione (73, 76, 82, 87, 89, 100).
Il mascheramento del gruppo ossidrilico della DBC con un gruppo metossilico
(63, IC50> 40.00 µM) od acetossilico (66, IC50= 2.50 µM), o la sostituzione di
questo con un gruppo aminico (60, IC50> 40.00 µM) o tiolico (69, IC50= 2.30 µM)
porta ad una diminuzione di attività inibitoria nei confronti di CK2, dimostrando
quindi come l’ossidrile della DBC sia fondamentale per l’attività inibitoria nei
confronti del target enzimatico.
L’aumento dei valori di IC50 negli analoghi dei composti 36, 37, 39, 53, 41 87, 89,
non bromurati in posizione 3 (rispettivamente i composti 33, 34, 35, 52, 42, 85,
96) dimostrano l’importanza della presenza dell’atomo di bromo in tale posizione.
L’attività dei composti variamente sostituiti nella posizione 4 dimostra che
l’assenza di sostituenti o la sostituzione del metile della DBC con un gruppo
ossidrilico, etilico, alometilico, idrossimetilico o trifluorometilico porta ad una
diminuzione di attività. Invece l’attività inibitoria aumenta sostituendo il metile
della posizione 4 della DBC con un gruppo metossilico (Tabella 4).
60
4-METIL
4-METOSSI
IC50 (µM)
OCH3
CH3
HO
O
O
0.70
HO
O
CH3
OCH3
Br
O
O
Br
0.10
(DBC)
HO
Br
O
Br
OCH3
Br
Br
O
O
1.90
Br
HO
O
O
0.26
Br
Br
Tabella 4.
0.09
O
Br
CH3
HO
0.19
O
Br
Br
HO
IC50 (µM)
Confronto dell’attività inibitoria su CK2 tra composti bromocumarinici 4-metil
sostituiti e 4-metossi sostituiti.
In particolare la 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metossicumarina (100) è attualmente la
cumarina con miglior attività inibitoria nei confronti di CK2.
La DBC (65) ed i bromoderivati sostituiti in posizione 4 con un gruppo
metossilico (99, 100, 101) sono stati saggiati sulla linea cellulare HeLa, una linea
cellulare umana di adenocarcinoma della cervice uterina. Per la valutazione della
vitalità cellulare è stato utilizzato il test dell’MTT utilizzando come riferimento la
TBB (4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolo). I dati sperimentali (Tabella 5) dimostrano
come i composti 100 e 101 abbiano una significativa attività antitumorale nei
confronti delle cellule HeLa anche se i valori di IC50 sono superiori a quelli del
composto di riferimento.
IC50 (µM) ± S.D.
HeLa
DBC (65)
99
100
101
TBB
57.61±2.18
84.58±3.01
29.97±2.17
21.84±2.14
12.25±2.11
Tabella 5.
Citotossicità in vitro dei nuovi inibitori di CK2.
Le cellule sono state incubate per 48 ore ed i valori di IC50
sono stati determinati mediante analisi dei probit (test del χ2).
61
5.3.3
SAGGI IN ASSOCIAZIONE
Per studiare l’esistenza del sinergismo d’azione tra gli inibitori della
Topoisomerasi II e gli inibitori della proteinchinasi CK2 si stanno effettuando al
momento di stesura di questo lavoro dei saggi di citotossicità su cellule tumorali
utilizzando alcune associazioni costituite da inibitori noti della Topoisomerasi II,
quali l’Amsacrina e l’Ellipticina, e da nuovi inibitori della proteinchinasi CK2,
quali i composti 100, e 101.
62
DATI BIOLOGICI SU CK2 DEI COMPOSTI SINTETIZZATI
R4
R6
R3
R7
X
O
R8
COMPOSTO
X
R3
R4
R6
R7
R8
IC50 (µM)
23
NH
H
CH3
H
OH
Br
1.60
24
NH
Br
CH3
H
OH
Br
0.20
25
NH
Br
CH3
Br
OH
Br
2.20
26
NH
H
CH3
H
OH
I
1.30
27
NH
Br
CH3
H
OH
I
0.30
31
NH
Br
CH3
CH3
OH
Br
8.30
33
O
H
CH3
H
OH
CHO
>40.00
34
O
H
CH3
H
OH
CHNOH
20.00
35
O
H
CH3
H
OH
CN
4.20
36
O
Br
CH3
H
OH
CN
1.90
37
O
Br
CH3
H
OH
CHNOH
2.50
38
O
Br
CH3
H
OH
H
28.50
39
O
Br
CH3
H
OH
CHO
3.30
40
O
Br
CH3
NO2
OH
H
3.30
41
O
Br
CH3
H
OH
NO2
4.00
42
O
H
CH3
H
OH
NO2
4.00
43
O
H
CH3
NO2
OH
H
30.00
63
COMPOSTO
X
R3
R4
R6
R7
R8
IC50 (µM)
44
O
Br
CH3
Br
OH
NO2
4.00
45
O
Br
CH3
NO2
OH
Br
4.00
48
O
H
CH3
OH
OH
H
>40.00
49
O
Br
CH3
OH
OH
H
31.00
50
O
Br
CH3
OH
OH
Br
2.00
52
O
H
CH3
H
OH
OH
>40.00
53
O
Br
CH3
H
OH
OH
10.50
54
O
Br
CH3
Br
OH
OH
3.60
58
O
H
CH3
H
NH2
H
>40.00
59
O
Br
CH3
H
NH2
H
>40.00
60
O
Br
CH3
H
NH2
Br
>40.00
61
O
Br
CH3
Br
NH2
Br
>40.00
63
O
Br
CH3
H
OCH3
Br
>40.00
64
O
Br
CH3
Br
OCH3
H
>40.00
66
O
Br
CH3
H
OCOCH3
Br
2.50
69
O
Br
CH3
H
SH
Br
2.30
72
O
Br
OH
H
OH
H
39.00
73
O
Br
OH
H
OH
Br
28.00
74
O
Br
OH
Br
OH
Br
>40.00
76
O
Br
H
H
OH
H
28.50
77
O
Br
H
Br
OH
H
29.30
78
O
Br
H
H
OH
Br
0.28
80
O
Br
CH2CH3
H
OH
H
20.90
81
O
Br
CH2CH3
Br
OH
H
6.30
82
O
Br
CH2CH3
H
OH
Br
0.37
64
COMPOSTO
X
R3
R4
R6
R7
R8
IC50 (µM)
83
O
Br
CH2CH3
Br
OH
Br
1.40
85
O
H
CH2Br
H
OH
Br
3.00
86
O
Br
CH2Br
Br
OH
H
1.30
87
O
Br
CH2Br
H
OH
Br
1.20
88
O
Br
CH2Br
Br
OH
Br
2.00
89
O
Br
CH2OH
H
OH
Br
1.60
90
O
Br
CH2OH
Br
OH
Br
3.90
92
O
H
CH2Cl
H
OH
Br
1.80
94
O
H
CH2Cl
Br
OH
Br
3.30
95
O
Br
CH2Cl
Br
OH
Br
0.36
96
O
H
CH2OH
H
OH
Br
3.00
97
O
H
CH2OH
Br
OH
Br
19.70
99
O
H
OCH3
H
OH
Br
0.19
100
O
Br
OCH3
H
OH
Br
0.09
101
O
Br
OCH3
Br
OH
Br
0.26
103
O
H
CF3
H
OH
Br
0.37
105
O
H
CF3
Br
OH
Br
1.00
106
O
Br
CF3
Br
OH
Br
0.34
111
O
H
CF3
I
OH
H
2.90
113
O
H
CF3
NO2
OH
H
36.40
114
O
H
CF3
H
OH
NO2
26.30
115
O
Br
CF3
NO2
OH
Br
2.76
119
O
H
CF3
Br
OH
NO2
22.70
65
66
6.
PARTE SPERIMENTALE
6.1
MATERIALI
I prodotti ed i reagenti impiegati (Acros ed Aldrich) sono stati utilizzati come tali,
senza purificazioni.
La purezza dei solventi organici (Carlo Erba e Lab Scan) è di grado analitico.
I solventi deuterati utilizzati per NMR (Aldrich) presentano grado di purezza
isotopica minimo 99.5%.
La cromatografia su strato sottile è stata effettuata su lastre al gel di silice 60 F254
(0.2 mm, Merck), eluendo come indicato volta per volta.
La cromatografia su colonna è stata eseguita utilizzando gel di silice 60 (0.0630.100 mm, Merck), eluendo con i solventi di volta in volta indicati.
6.2
STRUMENTAZIONE
I punti di fusione sono stati determinati in capillare aperto, utilizzando un
apparecchio per punto di fusione Gallenkamp MFB-595-010M.
Gli spettri 1H-NMR e 13C-NMR sono stati eseguiti con spettrometro Bruker 300AMX, utilizzando TMS come standard interno (δ = 0) ed i solventi deuterati di
volta in volta indicati; i valori di assorbimento sono espressi in δ e le costanti in
Hz. Gli spettri di massa sono stati realizzati su spettrometro Applied Biosystem
Mariner System 5220 per iniezione diretta del campione.
Le analisi elementari sono state realizzate su analizzatore Perkin Elmer 2400. I
valori delle analisi elementari degli intermedi e dei prodotti finali rientrano entro
lo 0.3% del valore teorico.
Le sintesi tramite microonde sono state effettuate con reattore monomodale selftuning Discover CEM.
67
6.3
METODI
6.3.1
SINTESI
DI
NUOVI
INIBITORI
DELLA
TOPOISOMERASI II
6.3.1.1 SINTESI DI N-(4-AMINOFENIL)-METANSOLFONAMIDE
Sintesi di N-(4-metansolfonilaminofenil)-acetamide
NHCOCH3
NHCOCH3
NH2
NHSO2CH3
Ad una soluzione di N-(4-aminofenil)-acetamide (10.0 g, 66.6 mmoli) in CH2Cl2
(234 ml) in atmosfera di azoto è stata aggiunta piridina (19.3 ml, 238.3 mmoli)
raffreddata a 5°C. Alla soluzione è stato aggiunto metansolfonilcloruro (18.5 ml,
238.3 mmoli), goccia a goccia in 30 minuti, mantenendo la temperatura al di sotto
di 15°C. La miscela è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per
una notte, quindi concentrata a secchezza. Il residuo semisolido ottenuto è stato
ripreso con acqua (120 ml) e lasciato per 30 minuti sotto agitazione. Il solido è
stato raccolto per filtrazione e lavato con acqua (40 ml), ottenendo l’N-(4metansolfonilaminofenil)-acetamide (12.8 g, resa 84%), con p.f. 205°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.90
(s all., 1 H, -NHSO2CH3)
9.48
(s all., 1 H, -NHCOCH3)
7.51
(d, J=8.9, 2 H, 3-H e 5-H)
7.12
(d, J=8.9, 2 H, 2-H e 6-H)
2.91
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
2.01
(s, 3 H, -NHCOCH3)
68
Sintesi di N-(4-aminofenil)-metansolfonamide
NHCOCH3
NH2
NHSO2CH3
NHSO2CH3
Una miscela di N-(4-metansolfonilaminofenil)-acetamide (12.5 g, 54.7 mmoli),
EtOH 96% (50 ml), acqua (14 ml) ed HCl conc. (16 ml) è stata riscaldata a
riflusso per 4 ore, poi portata a temperatura ambiente. La miscela è stata
raffreddata a 10°C, mantenuta sotto agitazione per 45 minuti e filtrata. Il solido
ottenuto è stato lavato con 2-propanolo (15 ml) e ripreso con acqua (80 ml). La
soluzione è stata portata a pH 8 con NH4OH conc., trattata con Na2S2O4 (110 mg)
e mantenuta in agitazione per tutta la notte. Il solido ottenuto per filtrazione è
stato lavato con acqua (30 ml), ottenendo l’N-(4-aminofenil)-metansolfonamide
(2.7 g, resa 26%), con p.f. 125°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.89
(s all., 1 H, -NHSO2CH3)
6.88
(d, J=8.7, 2 H, 2-H e 6-H)
6.51
(d, J=8.7, 2 H, 3-H e 5-H)
5.00
(s all., 2 H, -NH2)
2.79
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
69
6.3.1.2 SINTESI
DI
N-(4-AMINO-3-METOSSIFENIL)-
METANSOLFONAMIDE
Sintesi di N-(2-metossi-4-nitrofenil)-acetamide
NH2
NHCOCH3
H3CO
H3CO
NO2
NO2
Ad una soluzione di 2-metossi-4-nitroanilina (10.0 g, 59.5 mmoli) e AcOH (56
ml) raffreddata a 10°C è stata aggiunta Ac2O (6.2 ml) e la soluzione è stata
termostatata a 80°C per 1 ora (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento
il precipitato formatosi è stato filtrato e lavato con acqua (3 x 60 ml), ottenendo
l’N-(2-metossi-4-nitrofenil)-acetamide (11.6 g, resa 93%), con p.f. 162°C.
1
H-NMR (CDCl3)
8.57
(d, J=9.0, 1 H, 6-H)
7.92
(dd, J=2.4, J=9.0, 1 H, 5-H)
7.75
(d, J=2.4, 1 H, 3-H)
4.00
(s, 3 H, -OCH3)
2.26
(s, 3 H, -NHCOCH3)
70
Sintesi di N-(4-amino-2-metossifenil)-acetamide
NHCOCH3
NHCOCH3
H3CO
H3CO
NO2
NH2
Ad una sospensione di Pd/C (300 mg) in EtOAc (50 ml) saturata con H2 è stata
aggiunta una soluzione di N-(2-metossi-4-nitrofenil)acetamide (11.6 g, 55.1
mmoli) in EtOAc (600 ml). La miscela di reazione è stata mantenuta in agitazione
sotto leggera pressione di H2 per 8 ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Il
catalizzatore è stato eliminato per filtrazione e il filtrato è stato concentrato a
secchezza, ottenendo l’N-(4-amino-2-metossifenil)-acetamide (9.8 g, resa 98%),
con p.f. 127°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.71
(s, 1 H, -NHCOCH3)
7.26
(d, J=8.4, 1 H, 6-H)
6.24
(d, J=2.3, 1 H, 3-H)
6.07
(dd, J=2.3, J=8.4, 1 H, 5-H)
4.93
(s, 2 H, -NH2)
3.69
(s, 3 H, -OCH3)
1.96
(s, 3 H, -NHCOCH3)
71
Sintesi di N-[2-metossi-4-(metansolfonil)-aminofenil]-acetamide
NHCOCH3
NHCOCH3
H3CO
H3CO
NH2
NHSO2CH3
Ad una miscela di N-(4-amino-2-metossifenil)-acetamide (9.7 g, 53.8 mmoli),
CH2Cl2 (180 ml) e piridina (11.3 ml, 138.8 mmoli) raffreddata a 5°C sotto azoto è
stato aggiunto metansolfonilcloruro (10.7 ml, 138.8 mmoli), goccia a goccia in 30
minuti, mantenendo la temperatura al di sotto di 15°C. La miscela è stata
mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 3 ore, quindi concentrata a
secchezza. Il residuo semisolido ottenuto è stato ripreso con acqua (400 ml) e
mantenuto sotto agitazione per 30 minuti. Il solido ottenuto per filtrazione è stato
lavato con acqua (50 ml), ottenendo la N-[2-metossi-4-(metansolfonil)aminofenil]-acetamide (10.3 g, resa 74%), con p.f. 146°C.
1
H-NMR (CDCl3)
8.32
(d, J=8.6, 1 H, 6-H)
7.68
(s all., 1 H, -NHSO2CH3)
6.95
(d, J=2.3, 1 H, 3-H)
6.70
(dd, J=2.3, J=8.6, 1 H, 5-H)
6.40
(s all., 1 H, -NHCOCH3)
3.90
(s, 3 H, -OCH3)
2.97
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
2.21
(s, 3 H, NHCOCH3)
72
Sintesi di N-(4-amino-3-metossifenil)-metansolfonamide
NHCOCH3
NH2
H3CO
H3CO
NHSO2CH3
NHSO2CH3
Una miscela di N-[2-metossi-4-(metansolfonil)-aminofenil]-acetamide (10.3 g,
39.7 mmoli), EtOH 96% (35 ml), acqua (10 ml) e HCl concentrato (12 ml) è stata
riscaldata a riflusso per 4 ore, poi portata a temperatura ambiente durante la notte.
La miscela è stata raffreddata a 10°C, mantenuta sotto agitazione per 45 minuti e
filtrata. Il solido ottenuto è stato filtrato e lavato con 2-propanolo (10 ml) e ripreso
con acqua (100 ml). La soluzione acida ottenuta è stata portata a pH 8 con
NH4OH conc., trattata con Na2S2O4 (78 mg) e mantenuta sotto agitazione per 4
ore, quindi filtrata. Il residuo solido ottenuto è stato lavato con acqua (80 ml),
ottenendo l’N-(4-amino-3-metossifenil)-metansolfonamide (4.8 g, resa 56%),
con p.f. 153°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.97
(s, 1 H, -NHSO2CH3)
6.69
(s, 1 H, 3-H)
6.57
(m, 2 H, 5-H e 6-H)
4.64
(s, 2 H, -NH2)
3.73
(s, 3 H, -OCH3)
2.83
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
73
6.3.1.3 SINTESI
DI
N-[4-(BENZO[h]CHINAZOLIN-6-
ILAMINO)FENIL]METANSOLFONAMIDI
Sintesi di etile (4-bromonaftalen-1-il)carbammato
O
Et
NH2
Br
O
NH
Br
Ad una soluzione di 4-bromo-1-naftilamina (7.1 g, 32.0 mmoli) in THF anidro
(300 ml) e TEA (4.5 ml, 32.0 mmoli) è stato aggiunto etile cloroformiato (12.3
ml, 127.9 mmoli). La miscela è stata lasciata sotto agitazione a riflusso per un’ora
(TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Il cloridrato di TEA formatosi è stato allontanato
per filtrazione ed il filtrato è stato concentrato a secchezza. Il residuo solido così
ottenuto è stato ripreso con EtOAc e filtrato a caldo. Il filtrato è stato concentrato
a
secchezza,
ottenendo
l’etile
(4-bromonaftalen-1-il)carbammato
quantitativa), con p.f. 143°C.
1
H-NMR (CDCl3)
8.28
(dd, J=4.2, J=2.1, 1 H, 5-H o 8-H)
7.88
(dd, J=4.2, J=2.1, 1 H, 5-H o 8-H)
7.77
(s, 2 H, 2-H e 3-H)
7.65-7.55
(m, 2 H, 6-H e 7-H)
6.90
(s all., 1 H, -NH-)
4.28
(q, J=7.1, 2 H, -COOCH2CH3)
1.35
(t, J=7.1, 3 H, -COOCH2CH3)
74
(resa
Sintesi di etile 6-bromo-2H-benzo[h]chinazolin-1-carbossilato
O
O
Et
Et
O
NH
Br
O
N
N
Br
Una soluzione di etile (4-bromonaftalen-1-il)carbammato (4.9 g, 16.7 mmoli) e
urotropina (16.4 g, 116.7 mmoli) in TFA (100 ml) è stata posta a riflusso per
un’ora (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata raffreddata e
versata in una soluzione di HCl 4M (800 ml), ottenendo la precipitazione delle
impurezze allontanate per filtrazione. La soluzione limpida è stata concentrata a
secchezza e il residuo solido costituito dal cloridrato dell’etile 6-bromo-2Hbenzo[h]chinazolin-1-carbossilato è stato utilizzato per la reazione successiva
senza ulteriori purificazioni.
1
H-NMR (D2O)
8.38
(t, J=1.9, 1 H, 4-H)
8.18
(dd, J=8.0, J=1.4, 1 H, 7-H o 10-H)
7.88
(dd, J=8.0, J=1.4, 1 H, 7-H o 10-H)
7.84
(s, 1 H, 5-H)
7.64
(td, J=8.0, J=1.4, 1 H, 8-H o 9-H)
7.56
(td, J=8.0, J=1.4, 1 H, 8-H o 9-H)
6.15
(d, J=13.9, 1 H, 2a-H)
4.43
(d, J=13.9, 1 H, 2b-H)
4.08
(q, J=7.1, 2 H, -COOCH2CH3)
1.03
(t, J=7.1, 3 H, -COOCH2CH3)
75
Sintesi di 6-bromobenzo[h]chinazolina
O
Et
O
N
N
N
Br
N
Br
Il cloridrato dell’etile 6-bromo-2H-benzo[h]chinazolin-1-carbossilato ottenuto
dalla precedente reazione è stato disciolto in una soluzione di KOH 10% in
H2O/EtOH 1:1 (500 ml). Alla miscela (pH ≥ 10) è stato aggiunto K3Fe(CN)6 (40.0
g, 121.5 mmoli) e la miscela è stata posta a riflusso per 4 ore (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata raffreddata, versata in acqua
ed estratta a fondo con toluene. Il residuo solido ottenuto per concentrazione a
secchezza della fase organica è stato ripreso con la minima quantità di EtOH e
versato in H2O, con formazione di un abbondante precipitato. Il precipitato è stato
filtrato e lavato con H2O, ottenendo così la 6-bromobenzo[h]chinazolina (1.0 g,
resa 23% rispetto alla quantità di etile (4-bromonaftalen-1-il)carbammato di
partenza) con p.f. 115°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.58
(s, 1 H, 4-H)
9.52
(s, 1 H, 2-H)
9.26
(d, J=7.7, 1 H, 7-H o 10-H)
8.50
(s, 1 H, 5-H)
8.36
(d, J=7.7, 1 H, 7-H o 10-H)
8.07
(t, J=7.7, 1 H, 8-H o 9-H)
7.97
(t, J=7.7, 1 H, 8-H o 9-H)
76
Sintesi di N-[4-(benzo[h]chinazolin-6-ilamino)fenil]metansolfonamide
N
N
N
N
NH2
NH
Br
NHSO2CH3
H3CO2SHN
METODO A
Una sospensione di 6-bromobenzo[h]chinazolina (0.30 g, 1.0 mmoli) e N-(4aminofenil)metansolfonamide (0.20 g, 1.3 mmoli) in DMF anidra (5 ml) è stata
lasciata a riflusso in atmosfera di azoto per 3 ore (TLC: EtOAc/CE, 70/30) senza
ottenere formazione di alcun prodotto, quindi la reazione è stata abbandonata.
METODO B
Una sospensione di 6-bromobenzo[h]chinazolina (0.30 g, 1.0 mmoli) e N-(4aminofenil)metansolfonamide (0.20 g, 1.3 mmoli) in DMF anidra (5 ml) è stata
irradiata con microonde a 100 W, raggiungendo la temperatura di 150°C in 2
minuti. La potenza di 100 W è stata mantenuta per 10 minuti (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10) senza ottenere formazione di alcun prodotto, quindi la
reazione è stata abbandonata.
METODO C
Ad una sospensione di 6-bromobenzo[h]chinazolina (0.30 g, 1.0 mmoli) e N-(4aminofenil)metansolfonamide (0.20 g, 1.3 mmoli) in DMF anidra (5 ml) sono stati
aggiunti Pd(OAc)2 (10 mg, 0.03 mmoli), BINAP (30 mg, 0.04 mmoli) e Cs2CO3
(0.50 g, 1.5 mmoli). La sospensione è stata irradiata con microonde a 100 W,
raggiungendo la temperatura di 160°C in 2 minuti. La potenza di 100 W è stata
mantenuta per 10 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento, la
miscela di reazione è stata ripresa con EtOH (20 ml) e il precipitato formatosi è
stato allontanato per filtrazione. La soluzione limpida è stata versata in H2O (100
77
ml), con formazione di abbondante precipitato. Il precipitato è stato filtrato e
digerito in toluene (50 ml) a riflusso per 1 ora. La sospensione è stata raffreddata,
il precipitato è stato filtrato e lavato con toluene, ottenendo la N-[4(benzo[h]chinazolin-6-ilamino)fenil]metansolfonamide (0.16 g, resa 45%) con
p.f. 265°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.31
(s, 1 H, 4’-H)
9.24-9.21
(m, 2 H, 2’-H e 7’-H o 10’-H
8.54
(s all., 1 H, -NHSO2CH3)
8.50
(d, J=8.0, 1 H, 7’-H o 10’-H)
7.98-7.87
(m, 2 H, 8’-H e 9’-H)
7.32-7.23
(m, 4 H, 2-H, 3-H, 5-H e 6-H)
2.98
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.57, 152.52, 145.08, 140.49, 139.35, 132.15, 130.09, 129.97, 129.49, 127.81,
124.36, 124.25, 122.72, 122.37, 121.34, 101.86, 38.82.
HRMS (ESI-TOF) per C19H17N4O2S (M+ +1)
(M+) +1
365.1067 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 62.62%, H 4.43%, N 15.37%, S 8.80%
Trovato: C 62.59%, H 4.45%, N 15.32%, S 8.77%
78
365.0962 (trovato)
Sintesi di N-[4-(benzo[h]chinazolin-6-ilamino)-3-metossifenil]metansolfonamide
N
N
N
N
NH2
OCH3
NH
NHSO2CH3
Br
H3CO2SHN
OCH3
Ad una sospensione di 6-bromobenzo[h]chinazolina (0.26 g, 1.0 mmoli) e N-(4amino-3-metossifenil)metansolfonamide (0.32 g, 1.5 mmoli) in DMF anidra (5
ml) sono stati aggiunti Pd(OAc)2 (2 mg, 0.01 mmoli), BINAP (25 mg, 0.04
mmoli) e Cs2CO3 (0.49 g, 1.5 mmoli). La sospensione è stata irradiata con
microonde a 150 W, raggiungendo la temperatura di 160 °C in 2 minuti. La
potenza di 150 W è stata mantenuta per 10 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10).
Dopo raffreddamento la miscela di reazione è stata ripresa con EtOH (20 ml) e il
precipitato formatosi è stato eliminato per filtrazione. La soluzione limpida è stata
versata in H2O (100 ml) e alla soluzione acquosa è stato aggiunto CHCl3, con
formazione di abbondante precipitato. Il precipitato è stato filtrato e digerito in
toluene (50 ml) a riflusso per 1 ora. La sospensione è stata raffreddata, il
precipitato è stato filtrato e lavato con toluene, ottenendo la N-[4(benzo[h]chinazolin-6-ilamino)-3-metossifenil]metansolfonamide (0.24 g, resa
62%), con p.f. 260°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.22-9.17
(m, 3 H, 2’-H, 4’-H e 7’-H o 10’-H)
8.53
(d, J=8.0, 7’-H o 10’-H)
7.97-7.85
(m, 3 H, 8’-H, 9’-H e -NHSO2CH3)
7.25
(d, J=8.5, 1 H, 5-H)
7.03
(d, J=2.1, 1 H, 2-H)
6.89
(dd, J=8.5, J=2.1, 1 H, 6-H)
6.74
(s, 1 H, 5’-H)
79
3.29
(s, 3 H, -OCH3)
3.05
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.22, 153.44, 151.98, 144.60, 141.59, 135.52, 129.88, 128.84, 127.57, 126.39,
125.61, 124.55, 124.38, 122.59, 112.51, 104.94, 100.00, 55.40, 39.02.
HRMS (ESI-TOF) per C20H19N4O3S (M+ +1)
(M+) +1
395.1172 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 60.90%, H 4.60%, N 14.20%, S 8.13%
Trovato: C 60.92%, H 4.57%, N 14.23%, S 8.11%
80
395.1331 (trovato)
6.3.1.4 SINTESI
DI
N-[4-(BENZO[f]CHINAZOLIN-6-
ILAMINO)FENIL]METANSOLFONAMIDI
Sintesi di etile (4-bromonaftalen-2-il)carbammato
H
N
NH2
O
Et
O
Br
Br
Ad una soluzione di 4-bromo-2-naftilammina (5.3 g, 23.8 mmoli) in THF anidro
(200 ml) e TEA (6.6 ml, 47.6 mmoli) è stato aggiunto etile cloroformiato (4.6 ml,
47.6 mmoli). La miscela è stata lasciata sotto agitazione a temperatura ambiente
per un’ora (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Il cloridrato di TEA formatosi è stato
allontanato per filtrazione e il filtrato è stato concentrato a secchezza. Il residuo
solido è stato ripreso con EtOAc e filtrato a caldo. Il filtrato è stato concentrato a
secchezza,
ottenendo
l’etile
(4-bromonaftalen-2-il)carbammato
quantitativa), di consistenza oleosa.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.98
(s, 1 H, -NH-)
8.09
(d, J=1.3, 1 H, 1-H o 3-H)
8.02-7.98
(m, 2 H, 1-H o 3-H e 5-H o 8-H)
7.86-7.83
(m, 1 H, 5-H o 8-H)
7.58-7.50
(m, 2 H, 6-H e 7-H)
4.18
(q, J=7.1, 2 H, -COOCH2CH3)
1.27
(t, J=7.1, 3 H, -COOCH2CH3)
81
(resa
Sintesi di etile 6-bromo-3H-benzo[f]chinazolin-4-carbossilato
N
H
N
O
Et
N
O
O
Et
O
Br
Br
Una soluzione di etile (4-bromonaftalen-2-il)carbammato (7.0 g, 23.8 mmoli) e
urotropina (23.4 g, 166.7 mmoli) in TFA (150 ml) è stata riscaldata a riflusso per
un’ora (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata raffreddata e
versata in una soluzione di HCl 4M (800 ml), ottenendo la precipitazione delle
impurezze allontanate per filtrazione. La soluzione limpida è stata concentrata a
secchezza e il residuo solido costituito dal cloridrato dell’etile 6-bromo-3Hbenzo[f]chinazolin-4-carbossilato è stato utilizzato per la reazione successiva
senza ulteriori purificazioni.
82
Sintesi di 6-bromobenzo[f]chinazolina
N
N
N
O
N
Et
O
Br
Br
Il cloridrato dell’etile 6-bromo-3H-benzo[f]chinazolin-4-carbossilato ottenuto
dalla precedente reazione è stato disciolto in una soluzione di KOH 10% in
H2O/EtOH 1:1 (700 ml). Alla miscela (pH ≥ 10) è stato aggiunto K3Fe(CN)6 (50.0
g, 151.9 mmoli) e la miscela è stata posta a riflusso fino a scomparsa del prodotto
di partenza (4 ore) (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata
raffreddata, versata in acqua, ed estratta a fondo con toluene. Il residuo solido
ottenuto per concentrazione a secchezza della fase organica è stato ripreso con la
minima quantità di EtOH e versato in H2O, con formazione di un abbondante
precipitato. Il precipitato è stato filtrato e lavato con H2O, ottenendo così la 6bromobenzo[f]chinazolina (1.0 g, resa 16% calcolata rispetto alla quantità di
etile (4-bromonaftalen-2-il)carbammato di partenza) con p.f. 147°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.43
(s, 1 H, 1-H)
9.44
(s, 1 H, 3-H)
9.12-9.13
(m, 1 H, 10-H)
8.42-8.39
(m, 1 H, 7-H)
8.34
(s, 1 H, 5-H)
7.98-7.95
(m, 2 H, 8-H e 9-H)
83
Sintesi di N-[4-(benzo[f]chinazolin-6-ilamino)fenil]metansolfonamide
N
N
NH2
N
N
NH
NHSO2CH3
Br
H3CO2SHN
Ad una sospensione di 6-bromobenzo[f]chinazolina (0.26 g, 1.0 mmoli) e N-(4aminofenil)metansolfonamide (0.28 g, 1.5 mmoli) in DMF anidra (5 ml) sono stati
aggiunti Pd(OAc)2 (2 mg, 0.01 mmoli), BINAP (25 mg, 0.04 mmoli) e Cs2CO3
(0.49 g, 1.5 mmoli). La sospensione è stata irradiata con microonde a 150 W,
raggiungendo la temperatura di 150 °C in 2 minuti. La potenza di 150 W è stata
mantenuta per 10 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento, la
miscela di reazione è stata ripresa con EtOH (20 ml) ed il precipitato formatosi è
stato eliminato per filtrazione. La soluzione è stata concentrata a secchezza e il
residuo solido è stato ripreso con acetone (200 ml), eliminando il precipitato
rimasto indisciolto per filtrazione. Il residuo ottenuto per concentrazione a
secchezza della soluzione è stato digerito in toluene (50 ml) a riflusso per 1 ora.
La sospensione è stata raffreddata e il precipitato è stato filtrato e lavato con
toluene,
ottenendo
la
N-[4-(benzo[f]chinazolin-6-
ilamino)fenil]metansolfonamide (0.28 g, resa 28%), con p.f. 295°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.86
(s, 1 H, 1’-H)
8.95
(s, 1 H, 3’-H)
8.93
(d, J=7.8, 1 H, 7’-H o 10’-H)
8,59
(d, J=7.8, 1 H, 7’-H o 10’-H)
7.85-7.76
(m, 2 H, 8’-H e 9’-H)
7.03-6.91
(m, 4 H, 2-H, 3-H, 5-H e 6-H)
6.74
(s, 1 H, 5’-H)
84
2.59
(s, 3 H, NHSO2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.14, 152.60, 152.48, 147.61, 136.97, 134.37, 129.37, 128.74, 127.77, 124.94,
124.27, 123.07, 122.73, 121.56, 116.88, 101.47, 39.05.
HRMS (ESI-TOF) per C19H17N4O2S (M+ +1)
(M+) +1
365.1067 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 62.62%, H 4.43%, N 15.37%, S 8.80%
Trovato: C 62.57%, H 4.44%, N 15.38%, S 8.82%
85
365.1105 (trovato)
Sintesi di N-[4-(benzo[f]chinazolin-6-ilamino)-3-metossifenil]metansolfonamide
N
N
NH2
N
OCH3
N
NH
NHSO2CH3
Br
H3CO2SHN
OCH3
Ad una sospensione di 6-bromobenzo[f]chinazolina (0.26 g, 1.0 mmoli) e N-(4amino-3-metossifenil)metansolfonamide (0.32 g, 1.5 mmoli) in DMF anidra (5
ml) sono stati aggiunti Pd(OAc)2 (2 mg, 0.01 mmoli), BINAP (25 mg, 0.04
mmoli) e Cs2CO3 (0.49 g, 1.5 mmoli). La sospensione è stata irradiata con
microonde a 150 W, raggiungendo la temperatura di 160 °C in 2 minuti. La
potenza di 150 W è stata mantenuta per 10 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 9/1).
Dopo raffreddamento, la miscela di reazione è stata ripresa con EtOH (20 ml) e la
soluzione limpida è stata concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato ripreso
con acetone (200 ml), eliminando il precipitato rimasto indisciolto per filtrazione.
Il residuo ottenuto per concentrazione a secchezza della soluzione è stato digerito
prima in toluene/EtOH (95/05, 50 ml) a riflusso per 1 ora e successivamente in
H2O (20 ml) a riflusso per 1 ora. La sospensione è stata raffreddata, il precipitato
è stato filtrato e lavato con H2O, ottenendo la N-[4-(benzo[f]chinazolin-6ilamino)-3-metossifenil]metansolfonamide (0.05 g, resa 12%), con p.f. 266°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.93
(s, 1 H, 1’-H)
8.99-8.95
(m, 2 H, 3’-H e 7’-H o 10’-H)
8.60
(d, J=8.4, 1 H, 7’-H o 10’-H)
8.53
(s all, 1 H, -NHSO2CH3)
7.88-7.79
(m, 2 H, 8’-H e 9’-H)
7.30
(d, J=8.4, 1 H, 5-H)
7.04
(d, J=1.9, 1 H, 2-H)
86
6.93
(dd, J=8.4, J=1.9, 1 H, 6-H)
6.41
(s, 1 H, 5’-H)
3.73
(s, 3 H, OCH3)
3.06
(s, 3 H, -NHSO2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.06, 154.81, 152.71, 152.30, 148.48, 137.35, 129.20, 128.52, 128.37, 127.69,
124.43, 124.14, 123.03, 122.70, 116.37, 111.85, 104.32, 100.50, 55.38.
HRMS (ESI-TOF) per C20H19N4O3S (M+ +1)
(M+) +1
395.1172 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 60.90%, H 4.60%, N 14.20%, S 8.13%
Trovato: C 60.94%, H 4.63%, N 14.18%, S 8.11%
87
395.1161 (trovato)
6.3.2
SINTESI DI NUOVI INIBITORI CHINOLINONICI DI
CK 2
6.3.2.1
ALOGENAZIONE DI 7-IDROSSI-4-METILCHINOLIN-2-ONE
Sintesi di 7-amino-4-metilchinolin-2-one
CH3
H2N
NH2
H2N
N
H
O
Una miscela di 1,3-fenilendiamina (20.0 g, 185.0 mmoli) ed etile acetoacetato
(23.6 ml, 185.0 mmoli) è stata termostatata a 150°C fino a scomparsa del prodotto
di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento la miscela di
reazione è stata ripresa con 40 ml di MeOH e filtrata, ottenendo il 7-amino-4metilchinolin-2-one (15.0 g, resa 46%), con p.f. 279°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.10 (s all., 1 H, -NH-)
7.33
(d, J=8.6, 1 H, 5-H)
6.45
(dd, J=8.6, J=2.2, 1 H, 6-H)
6.36
(d, J=2.2, 1 H, 8-H)
5.94
(s, 1 H, 3-H)
5.71
(s, 2 H, -NH2)
2.27
(s, 3 H, 4-Me)
88
Sintesi di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one
CH3
H2N
N
H
CH3
O
HO
N
H
O
Una miscela di 7-amino-4-metilchinolin-2-one (15.0 g, 86.1 mmoli), H2SO4
concentrato (140 ml), acqua e ghiaccio (280 ml) è stata termostatata a -5°C,
mantenendola sotto costante agitazione. Alla miscela è stata aggiunta lentamente
una soluzione di NaNO2 (8.9 g, 129.1 mmoli) in acqua (7 ml) mantenendo la
temperatura compresa tra 0°C e –5°C. Terminata l’aggiunta la miscela di reazione
è stata mantenuta a temperatura ambiente per 15 minuti e quindi versata in una
soluzione di H2SO4 30% (450 ml) e riscaldata a 160°C, mantenendola a tale
temperatura fino a completa eliminazione dell’azoto. La soluzione è stata quindi
versata in acqua e ghiaccio (600 g), ottenendo un abbondante precipitato (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). Il precipitato è stato filtrato, lavato a fondo con acqua e
cristallizzato da MeOH, ottenendo il 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (7.4 g, resa
50%), con p.f. >300°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.39 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
10.05 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
7.52
(d, J=8.7, 1 H, 5-H)
6.69
(d, J=2.3, 1 H, 8-H)
6.65
(dd, J=8.7, J=2.3, 1 H, 6-H)
6.14
(s, 1 H, 3-H)
2.34
(s, 3 H, 4-Me)
89
Sintesi di 8-bromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one
CH3
CH3
HO
N
H
HO
O
Br
N
H
O
METODO A
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli) ed AcOH
glaciale (20 ml) è stata termostatata a 60°C e quindi aggiunta goccia a goccia di
Br2 (0.015 ml, 0.28 mmoli) diluito in AcOH (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). Dopo 3
ore la miscela di reazione è stata fatta raffreddare fino a temperatura ambiente. La
miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e
concentrata a secchezza ottenendo una miscela di prodotti non separabili.
METODO B
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli) ed AcOH
glaciale (20 ml) è stata termostatata a 60°C e quindi aggiunta goccia a goccia di
Br2 (90 mg,0.03 ml, 0.57 mmoli) diluito in AcOH. (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10).
Dopo 3 ore la miscela di reazione è stata fatta raffreddare fino a temperatura
ambiente. La miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è
stata estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con
Na2SO4 e concentrata a secchezza ottenendo una miscela di prodotti non
separabili.
90
METODO C
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli), AcOH
glaciale (20 ml) ed NBS (50 mg, 0.28 mmoli) è stata mantenuta sotto costante
agitazione a temperatura ambiente per 4 ore (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). La
miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e
concentrata a secchezza ottenendo una miscela di prodotti non separabili.
METODO D
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli), AcOH
glaciale (20 ml) ed NBS (0.10 g, 0.57 mmoli) è stata mantenuta sotto costante
agitazione a temperatura ambiente per 4 ore (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). La
miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e
concentrata a secchezza. La miscela di reazione risulta esser troppo complessa.
METODO E
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli) e NH4OH
20% (40 ml) è stata aggiunta goccia a goccia di Br2 (0.03 ml, 0.57 mmoli) diluito
in acqua ed EtOH. La miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a
temperatura ambiente per 2 ore (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). La miscela di
reazione è stata quindi neutralizzata con H2SO4 diluito ed è stata estratta a fondo
con EtOAc. La fase organica è stata anidrificata con Na2SO4 e concentrata a
secchezza ed il residuo solido è stato cristallizzato da MeOH ottenendo l’ 8bromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (70 mg, resa 47%), con p.f. 239°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.03 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
9.83
(s all., 1 H, -OH o -NH-)
7.59
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.88
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
6.26
(s, 1 H, 3-H)
91
2.38
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
161.64, 156.33, 148.50, 137.55, 125.25, 117.45, 113.79, 110.84, 95.20, 18.56.
HRMS (ESI-TOF) per C10H7BrNO2 (M- –1)
(M-) –1
251.9666 (calcolato)
251.9698 (trovato)
-
253.9646 (calcolato)
253.9692 (trovato)
(M + 2) –1
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 47.27%, H 3.17%, Br 31.45%, N 5.51%
Trovato: C 47.31%, H 3.12%, Br 31.38%, N 5.40%
92
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one dal 7-idrossi4-metilchinolin-2-one
CH3
CH3
Br
HO
N
H
O
HO
Br
N
H
O
METODO A
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli) e AcOH
glaciale (20 ml) è stata termostatata a 60°C e quindi aggiunta goccia a goccia di
Br2 (0.06 ml, 1.14 mmoli) diluito in AcOH (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). Dopo 3
ore la miscela di reazione è stata fatta raffreddare fino a temperatura ambiente. La
miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e
concentrata a secchezza ottenendo una miscela complessa di prodotti.
METODO B
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli) e AcOH
glaciale (20 ml) è stata termostatata a 60°C e quindi aggiunta goccia a goccia
mediante un imbuto da carico di Br2 (0.04 ml, 0.86 mmoli) diluito in una
soluzione di AcOH (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). Dopo 3 ore la miscela di
reazione è stata fatta raffreddare fino a temperatura ambiente. La miscela di
reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta a fondo con
EtOAc.La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e concentrata a
secchezza ottenendo una miscela di prodotti che non sono stati isolati.
93
METODO C
Una miscela di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.57 mmoli), AcOH
glaciale (20 ml) e NBS (0.15 g, 0.86 mmoli) è stata mantenuta sotto costante
agitazione a temperatura ambiente per 4 ore. (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10. La
miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e
concentrata a secchezza ottenendo una miscela di prodotti troppo complessa.
94
Sintesi di 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one
CH3
CH3
Br
HO
N
H
O
Br
HO
Br
N
H
O
Il 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (1.0 g, 5.7 mmoli) è stato sciolto nella minima
quantità di AcOH glaciale (100 ml); alla soluzione è stata aggiunta, a piccole
porzioni, alla temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (1.3 ml, 24.6
mmoli) in AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata per 3 ore a 60°C
(TLC: EtOAc/CE, 70/30). Per raffreddamento si è formato un precipitato che è
stato raccolto per filtrazione e cristallizzato da MeOH, ottenendo il 3,6,8tribromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.60 g, resa 26%), con p.f. 220°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.80 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
10.81 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
8.15
(s, 1 H, 5-H)
2.76
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
157.23, 152.62, 146.22, 135.50, 128.40, 117.09, 114.62, 105.92, 97.72, 19.75.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br3NO2 (M- –1)
(M-) –1
407.7876 (calcolato)
407.7649 (trovato)
(M-+2) –1
409.7856 (calcolato)
409.7622 (trovato)
(M-+4) –1
411.7836 (calcolato)
411.7551 (trovato)
(M-+6) –1
413.7817 (calcolato)
413.7607 (trovato)
95
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one da 3,6,8tribromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one
CH3
Br
CH3
Br
HO
Br
N
H
Br
O
HO
Br
N
H
O
Una sospensione di 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.24
mmoli) in acqua (10 ml) e MeOH (10 ml) è stata aggiunta di una soluzione di
Na2SO3 (31 mg, 0.24 mmoli), NaOH (9 mg, 0.25 mmoli) in acqua (5 ml) e
mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata quindi acidificata con HCl
4M, ottenendo la formazione di un precipitato che è stato separato per filtrazione e
risulta costituito unicamente da prodotto di partenza.
96
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one dal 8-bromo-7-idrossi-4metilchinolin-2-one
CH3
CH3
Br
HO
Br
N
H
O
HO
Br
N
H
O
Una soluzione di 8-bromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (50 mg, 0.19 mmoli) in
AcOH glaciale (40 ml) è stata termostatata a 60°C e quindi aggiunta di Br2 (0.015
ml, 0.29 mmoli) diluito in AcOH a piccole frazioni successive (5 gtt) fino a
scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). La miscela di
reazione, versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta a fondo con
EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 e concentrata a
secchezza ottenendo il 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (30 mg,
resa 47%), con p.f. 258°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.16 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
10.45 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
7.72
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
6.92
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
2.60
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
157.35, 156.57, 147.11, 136.19, 125.93, 115.49, 113.25, 111.46, 95.01, 19.69.
HRMS (ESI-TOF) per C10H6Br2NO2 (M- –1)
(M-) –1
329.8771 (calcolato)
329.8797 (trovato)
(M-+2) –1
331.8751 (calcolato)
331.8769 (trovato)
(M-+4) –1
333.8731 (calcolato)
333.8817 (trovato)
97
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 36.07%, H 2.12%, Br 47.99%, N 4.21%
Trovato: C 36.10%, H 2.10%, Br 47.89%, N 4.22%
98
Sintesi del 7-idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one
CH3
HO
N
H
CH3
O
HO
I
N
H
O
Una soluzione di 7-idrossi-4-metilchinolin-2-one (0.20 g, 1.14 mmoli) in NH4OH
20% (40 ml) è stata aggiunta di I2 (0.14 g, 0.57 mmoli) solubilizzato in una
soluzione acquosa di KI (30 ml). La miscela di reazione è stata mantenuta a
temperatura ambiente per 1 ora (TLC: CHCl3\MeOH, 90\10) ed è stata quindi
acidificata con H2SO4 diluito ottenendo la formazione di un abbondante
precipitato che è stato raccolto per filtrazione, lavato con acqua, e cristallizzato da
MeOH ottenendo il 7-idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one (0.17 g, resa 48%),
con p.f. 205°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.18 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
9.08
(s all., 1 H, -OH o -NH-)
7.60
(d, J=8.7, 1 H, 5-H)
6.84
(d, J=8.7, 1 H, 6-H)
6.26
(s, 1 H, 3-H)
2.39
(s, 1 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
161.49, 159.24, 148.76, 139.70, 126.38, 117.09, 113.51, 110.24, 73.90, 18.51.
HRMS (ESI-TOF) per C10H7INO2 (M- –1)
(M-) –1
299.9527 (calcolato)
99
299.9512 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 39.89%, H 2.68%, I 42.15%, N 4.65%
Trovato: C 40.01%, H 2.59%, I 42.13%, N 4.64%
100
Sintesi di 3-bromo-7-idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one
CH3
CH3
Br
HO
I
N
H
HO
O
I
N
H
O
Una soluzione di 7-idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one (0.10 g, 0.33 mmoli) in
AcOH glaciale (20 ml) è stata termostatata a 60°C e quindi aggiunta goccia a
goccia di Br2 (0.017ml, 0.33 mmoli) diluito in AcOH (TLC: CHCl3\MeOH,
90\10). Dopo 3 ore la miscela di reazione è stata fatta raffreddare fino a
temperatura ambiente. La miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata con
NaHCO3, è stata estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi
anidrificata con Na2SO4 e concentrata a secchezza ed il solido ottenuto è stato
purificato mediante cromatografia su colonna con eluente CHCl3, ottenendo il 3bromo-7-idrossi-8-iodo-4-metilchinolin-2-one (60 mg, resa 48%), con p.f.
254°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.30 (s all., 1 H, -OH o -NH-)
9.59
(s all., 1 H, -OH o -NH-)
7.74
(d, J = 8.9, 1 H, 5-H)
6.87
(d, J = 8.9, 1 H, 6-H)
2.61
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.74, 157.64, 147.71, 138.52, 127.38, 115.13, 113.22, 111.06, 74.14, 19.85.
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 31.61%, H 1.86%, Br 21.03%, I 33.40%, N 3.69%
Trovato: C 31.61%, H 1.79%, Br 21.00%, I 33.42%, N 3.48%
101
6.3.2.2
BROMURAZIONE
DI
7-IDROSSI-4,6-DIMETILCHINOLIN-2-
ONE
Sintesi di 7-amino-4,6-dimetilchinolin-2-one
CH3
H3C
H2N
H3C
NH2
H2N
N
H
O
Una miscela di 2,4-diaminotoluene (20.0 g, 185.0 mmoli) ed etile acetoacetato
(23.6 ml, 185.0 mmoli) è stata termostatata a 150°C fino a scomparsa del prodotto
di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento la miscela è stata
ripresa con 40 ml di MeOH e filtrata, ottenendo il 7-amino-4,6-dimetilchinolin2-one (15.0 g, resa 46%), con p.f. 279°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
7.39
(s all., 1 H, 5-H)
6.54
(s, 1 H, 8-H)
6.14
(q, J=1.1, 1 H, 3-H)
2.41
(d, J=1.1, 3 H, 4-Me)
2.20
(s all., 3 H, 6-Me)
102
Sintesi di 7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one
CH3
CH3
H3C
H2N
H3C
N
H
O
HO
N
H
O
Una miscela di 7-amino-4,6-dimetilchinolin-2-one (15.0 g, 86.1 mmoli), H2SO4
concentrato (140 ml), acqua e ghiaccio (280 ml) è stata raffreddata a -5°C,
mantenendola sotto costante agitazione. Alla miscela è stata aggiunta lentamente
una soluzione di NaNO2 (8.9 g, 129.1 mmoli) in H2O (7 ml) mantenendo la
temperatura compresa tra 0°C e –5°C. Terminata l’aggiunta, la miscela di
reazione è stata mantenuta a temperatura ambiente per 15 minuti e quindi versata
in una soluzione di H2SO4 30% (450 ml) e riscaldata a 160°C. La soluzione acida
è stata mantenuta a tale temperatura fino a completa eliminazione dell’azoto e
quindi versata in acqua e ghiaccio (600 g), ottenendo un abbondante precipitato
(TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Il precipitato è stato filtrato, lavato a fondo con
acqua e cristallizzato da MeOH, ottenendo il 7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one
(7.4 g, resa 50%), con p.f. >300°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
7.48
(s all., 1 H, 5-H)
6.73
(s, 1 H, 8-H)
6.25
(q, J=1.1, 1 H, 3-H)
2.44
(d, J=1.1, 3 H, 4-Me)
2.24
(s all., 3 H, 6-Me)
103
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one
CH3
CH3
H3C
HO
H3C
N
H
O
Br
HO
Br
N
H
O
Il 7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one (2.0 g, 10.6 mmoli) è stato sciolto nella
minima quantità di AcOH glaciale (100 ml); alla soluzione è stata aggiunta, a
piccole porzioni, alla temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (3.4
g, 1.1 ml, 21.0 mmoli) in AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata
per 3 ore a 60°C (TLC: CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato un
precipitato che è stato raccolto per filtrazione e cristallizzato da MeOH, ottenendo
il 3,8-dibromo-7-idrossi-4,6-dimetilchinolin-2-one (1.2 g, resa 32%), con p.f.
271°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.37 (s all., 1 H, -OH)
7.62
(q, J=0.8, 1 H, 5-H)
2.60
(s, 3 H, 4-Me)
2.30
(d, J=0.8, 3 H, 6-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
157.21, 154.64, 146.82, 134.24, 126.06, 121.49, 115.81, 113.27, 96.57, 19.68,
16.91.
HRMS (ESI-TOF) per C11H8Br2NO2 (M- –1)
(M-) –1
343.8927 (calcolato)
343.8733 (trovato)
(M-+2) –1
345.8907 (calcolato)
345.8722 (trovato)
(M-+4) –1
347.8888 (calcolato)
347.8694 (trovato)
104
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 38.07%, H 12.61%, Br 46.05%, N 4.04%
Trovato: C 38.05%, H 12.69%, Br 46.00%, N 3.98%
105
6.3.3
SINTESI DI NUOVI INIBITORI CUMARINICI DI CK2
6.3.3.1 SINTESI DI 7-IDROSSI-4-METILCUMARINE SOSTITUITE IN
POSIZIONE 6 ED 8
Sintesi di 8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
HO
O
HO
O
O
O
CHO
METODO A
Una miscela di 7-idrossi-4-metilcumarina (3.0 g, 17.0 mmoli), urotropina (5.5 g,
39.2 mmoli) ed AcOH (50 ml) è stata riscaldata a riflusso per 2 ore (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento la miscela di reazione è stata
aggiunta di HCl dil. (30 ml) e portata a riflusso per 10 min. La soluzione è stata
ripresa con acqua ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4, concentrata a secchezza, ed il residuo solido ottenuto è
stato purificato mediante cromatografia su colonna con eluente CHCl3, ottenendo
la 8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.70 g, resa 30%), con p.f. 184°C.
METODO B
Una miscela di 7-idrossi-4-metilcumarina (1.0 g, 5.7 mmoli), urotropina (1.8 g,
13.1 mmoli) ed AcOH (50 ml) è stata irradiata a 100W, mantenendo una
temperatura di 120°C e per 15 minuti. Dopo raffreddamento la miscela di reazione
è stata versata in acqua ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4 e concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato trattato
a caldo con MeOH ed il solido indisciolto è stato raccolto per filtrazione,
ottenendo la 8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (1.73 g, resa 75%).
106
1
H-NMR (CDCl3)
12.21 (s, 1 H, -OH)
10.62 (s, 1 H, -CHO)
7.73
(d, J=9.0, 1 H, 5-H)
6.90
(dd, J=9.0, 1 H, 6-H)
6.20
(q, J=1.2, 1 H, 3-H)
2.42
(d, J=1.2, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (CDCl3)
193.37, 165.24, 159.19, 156.13, 152.62, 132.85, 114.27, 112.02, 111.95, 108.65,
18.95.
HRMS (ESI-TOF) per C11H9O4 (M+ +1)
(M+) +1
205.0495 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 64.71%, H 3.95%
Trovato: C 64.75%, H 3.93%
107
205.0489 (trovato)
Sintesi di 7-idrossi-8-idrossimminometil-4-metilcumarina
CH3
CH3
HO
O
O
HO
O
CH
CHO
O
NOH
Ad una soluzione di 8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.40 g, 2.0 mmoli) in
MeOH (30 ml), sono state aggiunte 3 gocce di piridina ed una soluzione di
idrossilamina cloridrato (0.20 g, 2.4 mmoli) in MeOH (15 ml). La miscela di
reazione è stata mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 2 ore (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10) e successivamente concentrata a secchezza. Il residuo
solido è stato ripreso con acqua ed il solido indisciolto è stato raccolto per
filtrazione, ottenendo la 7-idrossi-8-idrossimminometil-4-metilcumarina (0.24
g, resa 55%), con p.f. 260°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.94 (s, 1 H, -CHNOH)
11.17 (s, 1 H, -OH)
8.56
(s, 1 H, -CHNOH)
7.68
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
6.95
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
6.24
(q, J=1.1, 1 H, 3-H)
2.40
(d, J=1.1, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.70, 159.20, 153.68, 151.77, 144.02, 127.25, 112.83, 112.05, 110.69, 104.97,
18.25.
HRMS (ESI-TOF) per C11H10NO4 (M+ +1)
(M+) +1
220.0604 (calcolato)
108
220.0591 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 60.27%, H 4.14%, N 6.39%
Trovato: C 60.30%, H 4.16%, N 6.37%
109
Sintesi di 8-ciano-7-idrossi-4-metilcumarina
CH3
HO
O
CH
CH3
HO
O
NOH
O
O
CN
Una miscela contenente 7-idrossi-8-idrossimminometil-4-metilcumarina (0.70 g,
3.2 mmoli) ed Ac2O (50 ml) è stata lasciata a riflusso per 50 minuti (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata diluita con acqua,
neutralizzata con NaHCO3 ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4, concentrata a secchezza ed il residuo solido è stato
ripreso con una miscela di AcOH (30 ml) ed H2SO4 conc. (2 ml). La soluzione
risultante è stata posta a riflusso per 2ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela
di reazione è stata ripresa con acqua, neutralizzata con NaHCO3 ed estratta a
fondo con EtOAc. La fase organica è stata anidrificata con Na2SO4 e concentrata a
secchezza. Il solido ottenuto è stato solubilizzato nella minima quantità a caldo di
EtOAc e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta di CE, ottenendo
la 8-ciano-7-idrossi-4-metilcumarina (80 mg, resa 35%), con p.f.>300°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.86
(d, J=9.0, 1 H, 5-H)
6.97
(d, J=9.0, 1 H, 6-H)
6.26
(q, J=1.4, 1 H, 3-H)
2.37
(d, J=1.4, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
163.60, 158.60, 155.53, 153.29, 131.20, 112.60, 112.25, 111.94, 111.07, 88.01,
18.07.
110
HRMS (ESI-TOF) per C11H8NO3 (M+ +1)
(M+) +1
202.0558 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 65.67%, H 3.51%, N 6.96%
Trovato: C 65.64%, H 3.52%, N 6.97%
111
202.0499 (trovato)
Sintesi di 8-ciano-7-idrossi-4-metilcumarina
CH3
HO
O
CH3
HO
O
CHO
O
O
CN
La miscela di 8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.30 g, 1.5 mmoli),
idrossilamina cloridrato (0.15 g, 1.8 mmoli) e NMP (2.5 ml) è stata irradiata con
una potenza di 100W, raggiungendo una temperatura di 140°C per 12 min (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata ripresa con acqua ed estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata lavata con acqua, anidrificata con
Na2SO4 e concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato purificato mediante
cromatografia Flash Column con eluente EtOAc, ottenendo la 8-ciano-7-idrossi4-metilcumarina (0.24 g, resa 81%).
112
Sintesi di 3-bromo-7-idrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
O
HO
O
O
La 7-idrossi-4-metilcumarina (2.0 g, 10.3 mmoli) è stata sciolta nella minima
quantità di AcOH glaciale (80 ml); alla soluzione è stata aggiunta, a piccole
porzioni, alla temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (0.26 ml, 5.1
mmoli) in AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata per 3 ore a 60°C
(TLC: CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato un precipitato che è
stato raccolto per filtrazione e purificato mediante cristallizzazioni successive da
MeOH, ottenendo la 3-bromo-7-idrossi-4-metilcumarina (0.30 g, resa 12%),
con p.f. 190°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.80 (s all., 1 H, -OH)
7.82
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.97
(dd, J=8.8, J=2.2, 1 H, 6-H)
6.86
(d, J=2.2, 1 H, 8-H)
2.67
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
161.32, 156.39, 153.03, 151.89, 127.18, 113.41, 111.67, 107.37, 101.93, 19.39.
HRMS (ESI-TOF) per C10H6BrO3 (M- –1)
(M-) –1
252.9500 (calcolato)
252.9466 (trovato)
(M- +2) –1
254.9480 (calcolato)
254.9442 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 47.09%, H 2.77%, Br 31.33%
Trovato: C 47.11%, H 2.79%, Br 31.28%
113
Sintesi di 3-bromo-8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
Br
HO
O
O
HO
O
O
CHO
METODO A
Una miscela di 3-bromo-7-idrossi-4-metilcumarina (3.0 g, 11.8 mmoli),
urotropina (3.8 g, 27.1 mmoli) ed AcOH (50 ml) è stata riscaldata a riflusso per 2
ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento la miscela di reazione è
stata aggiunta di HCl dil. (30 ml) e portata a riflusso per 10 min. La soluzione è
stata ripresa con acqua ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4, concentrata a secchezza, ed il residuo solido ottenuto è
stato purificato mediante cromatografia su colonna con eluente CHCl3, ottenendo
la 3-bromo-8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.95 g, resa 28%), con p.f.
214°C.
METODO B
Una miscela di 3-bromo-7-idrossi-4-metilcumarina (1.0 g, 3.9 mmoli), urotropina
(1.26 g, 9.0 mmoli) ed AcOH (40 ml) è stata irradiata a 100W, mantenendo una
temperatura di 120°C e per 15 minuti. Dopo raffreddamento la miscela di reazione
è stata versata in acqua ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4 e concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato trattato
a caldo con MeOH ed il solido indisciolto è stato raccolto per filtrazione,
ottenendo la 3-bromo-8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.76 g, resa 69%).
1
H-NMR (CDCl3)
11.92 (s, 1 H, -OH)
10.45 (s, 1 H, 8-CHO)
8.50
(d, J=9.2, 1 H, 5-H)
2.59
(d, J=9.2, 1 H, 6-H)
114
2.59
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (CDCl3)
193.11, 159.82, 158.78, 151.25, 149.62, 127.33, 112.40, 111.84, 108.21, 104.23,
19.34.
HRMS (ESI-TOF) per C11H6O4Br (M- –1)
(M-) –1
280.9449 (calcolato)
280.9399 (trovato)
(M-+2) –1
282.9507 (calcolato)
282.9523 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 46.67%, H 2.49%, Br 28.23%
Trovato: C 46.69%, H 2.46%, Br 28.28%
115
Sintesi di 3-bromo-7-idrossi-8-idrossimminometil-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
Br
HO
O
O
HO
O
CH
CHO
O
NOH
Ad una soluzione di 3-bromo-8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.40 g, 1.4
mmoli) in MeOH (30 ml), sono state aggiunte 3 gocce di piridina ed una
soluzione di idrossilamina cloridrato (0.12 g, 1.7 mmoli) in MeOH (15 ml). La
miscela di reazione è stata mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 2
ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10) e successivamente concentrata a secchezza. Il
residuo solido è stato ripreso con acqua ed il solido indisciolto è stato raccolto per
filtrazione,
ottenendo
la
3-bromo-7-idrossi-8-idrossimminometil-4-
metilcumarina (0.41 g, resa 98%), con p.f. 263°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.97 (s, 1 H, -CHNOH)
11.25 (s, 1 H, -OH)
8.52
(s, 1 H, -CHNOH)
7.79
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.99
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
2.57
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.83, 155.75, 152.06, 150.13, 143.62, 127.88, 113.50, 112.01, 108.13, 105.04,
19.47.
HRMS (ESI-TOF) per C11H7NBrO4 (M- –1)
(M- +1)
295.9558 (calcolato)
295.9537 (trovato)
(M- + 2) –1
297.9616 (calcolato)
297.9657 (trovato)
116
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 44.32%, H 2.71%, Br 26.81%, N 4.70%
Trovato: C 44.29%, H 2.73%, Br 26.77%, N 4.65%
117
Sintesi di 3-bromo-8-ciano7-idrossi -4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
CH
Br
HO
O
NOH
O
O
CN
Una miscela contenente 3-bromo-7-idrossi-8-idrossimminometil-4-metilcumarina
(0.80 g, 2.7 mmoli) ed Ac2O (50 ml) è stata lasciata a riflusso per 50 minuti (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata diluita con acqua,
neutralizzata con NaHCO3 ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4, concentrata a secchezza ed il residuo solido è stato
ripreso con una miscela di AcOH (30 ml) ed H2SO4 conc. (2 ml). La soluzione
risultante è stata posta a riflusso per 2 ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La
miscela di reazione è stata ripresa con acqua, neutralizzata con NaHCO3 ed
estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata anidrificata con Na2SO4 e
concentrata a secchezza. Il solido ottenuto è stato solubilizzato nella minima
quantità a caldo di EtOAc e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta
di CE, ottenendo la 3-bromo-8-ciano-7-idrossi-4-metilcumarina (0.20 g, resa
27%), con p.f.>300°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.91
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
6.95
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
2.54
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
165.26 154.60, 151.63, 131.38, 113.71, 112.94, 110.78, 107.38, 87.76, 85.78,
19.38.
118
HRMS (ESI-TOF) per C11H5BrNO3 (M- –1)
(M-) –1
277.9458 (calcolato)
277.9485 (trovato)
-
279.9511 (calcolato)
279.9480 (trovato)
(M +2) –1
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 47.17%, H 2.16%, Br 28.53%, N 5.00%
Trovato: C 47.15%, H 2.18%, Br 28.60%, N 5.02%
119
Sintesi di 3-bromo-8-ciano-7-idrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
Br
HO
O
CHO
O
O
CN
La miscela di 3-bromo-8-formil-7-idrossi-4-metilcumarina (0.12 g, 0.42 mmoli),
idrossilamina cloridrato (0.04 g, 0.50 mmoli) e NMP (2.5 ml) è stata irradiata con
una potenza di 100W, raggiungendo una temperatura di 140°C per 12 min (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata ripresa con acqua ed estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata lavata con acqua, anidrificata con
Na2SO4 e concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato purificato mediante
cromatografia Flash Column con eluente EtOAc, ottenendo la 3-bromo-8-ciano7-idrossi-4-metilcumarina (0.08 g, resa 68%).
120
Sintesi di 3-bromo-7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina e 3-bromo-7-idrossi-4-metil8-nitrocumarina
CH3
CH3
Br
O2N
CH3
Br
Br
+
HO
O
O
HO
O
O
HO
O
O
NO2
Una soluzione di 3-bromo-7-idrossi-4-metilcumarina (0.4 g, 1.6 mmoli) in H2SO4
conc. (20 ml) è stata termostata a 0°C ed aggiunta, goccia a goccia, di una
soluzione di HNO3 65% (1.0 ml) in 1 ml di H2SO4 conc. mantenendo la
temperatura della miscela di reazione a 0°C. Al termine dell’aggiunta la miscela
di reazione è stata versata in acqua (80 ml) ed il precipitato formatosi è stato
separato per filtrazione e purificato mediante cromatografia su colonna con
CHCl3,
eluente
isolando
dapprima
la
3-bromo-7-idrossi-4-metil-6-
nitrocumarina che è stata cristallizzata da MeOH (0.19 g, resa 40%), con p.f.
234°C, e successivamente, con eluente MeOH, la 3-bromo-7-idrossi-4-metil-8nitrocumarina che è stata solubilizzata a caldo in MeOH e fatta precipitare in
forma cristallina per lenta aggiunta di CE (0.19 g, resa 40%), con p.f. 245°C.
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3-bromo-7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina
10.80 (s all., 1 H, -OH)
8.47
(s, 1 H, 5-H)
7.08
(s, 1 H, 8-H)
2.67
(s, 3 H, 4-Me)
HRMS (ESI-TOF) per C10H5BrNO5 (M- –1) 3-bromo-7-idrossi-4-metil-6nitrocumarina
(M-) –1
297.9357 (calcolato)
297.9340 (trovato)
-
299.9337 (calcolato)
299.9331 (trovato)
(M +2) –1
121
ANALISI ELEMENTARE di 3-bromo-7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina
Teorico: C 40.03%, H 2.02%, Br 26.63%, N 4.67%
Trovato: C 40.06%, H 1.98%, Br 26.67%, N 4.63%
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3-bromo-7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina
7.37
(d, J=9.5, 1 H, 5-H)
6.31
(d, J=9.5, 1 H, 6-H)
2.45
(s, 3 H, 4-Me)
HRMS (ESI-TOF) per C10H5BrNO5 (M- –1) di 3-bromo-7-idrossi-4-metil-8nitrocumarina
(M-) –1
297.9357 (calcolato)
297.9348 (trovato)
(M-+2) –1
299.9337 (calcolato)
299.9332 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE di 3-bromo-7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina
Teorico: C 40.03%, H 2.02%, Br 26.63%, N 4.67%
Trovato: C 40.00%, H 1.96%, Br 26.71%, N 4.70%
122
Sintesi di 7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina e 7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina
CH3
CH3
CH3
O2N
+
HO
O
O
HO
O
O
HO
O
O
NO2
Una soluzione di 7-idrossi-4-metilcumarina (5.0 g, 28.4 mmoli) in H2SO4 conc.
(80 ml) è stata termostata a 0°C ed aggiunta, goccia a goccia, di una soluzione di
HNO3 65% (1.8 ml) in 2 ml di H2SO4 conc. mantenendo la temperatura della
miscela di reazione a 0°C.
Al termine dell’aggiunta la miscela di reazione è stata versata in 150 ml di acqua e
ghiaccio ed il precipitato formatosi è stato separato per filtrazione e purificato
mediante cromatografia su colonna con eluente CHCl3, isolando dapprima la 7idrossi-4-metil-6-nitrocumarina (2.7 g, resa 42%), con p.f. 262°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.95 (s all., 1 H, -OH)
8.25
(s, 1 H, 5-H)
6.95
(s, 1 H, 8-H)
6.31
(q, J=1.1, 1 H, 3-H)
2.39
(d, J=1.1, 1 H, 4-Me)
e successivamente la 7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina (2.6 g, resa 41%), con
p.f. 255°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
12.14 (s all., 1 H, -OH)
7.77
(d, J=9.0, 1 H, 5-H)
7.03
(d, J=9.0, 1 H, 6-H)
6.28
(q, J=1.3, 1 H, 3-H)
2.40
(d, J=1.3, 3 H, 4-Me)
123
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina
CH3
CH3
O2N
HO
O2N
O
O
Br
HO
O
O
Br
Una soluzione di 7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina (0.30 g, 1.4 mmoli) in CH3CN
è stata addizionata di NBS (0.71 g, 4.0 mmoli) e posta a riflusso per 30 minuti
(TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). La miscela di reazione è stata concentrata a
secchezza ed il residuo solido è stato cristallizzato da MeOH, ottenendo la 3,8dibromo-7-idrossi-4-metil-6-nitrocumarina (0.45 g, resa 87%), con p.f. 252°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.41
(s, 1 H, 5-H)
2.60
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
155.08, 152.57, 152.12, 150.72, 134.60, 121.97, 112.35, 110.56, 101.26, 19.39.
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br2NO5 (M- –1)
(M-) –1
375.8462 (calcolato)
375.8518 (trovato)
(M-+2) –1
377.8442 (calcolato)
377.8500 (trovato)
(M-+4) –1
379.8423 (calcolato)
379.8451 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 31.69%, H 1.33%, Br 42.17%, N 3.70%
Trovato: C 31.73%, H 1.29%, Br 41.98%, N 3.64%
124
Sintesi di 3,6-dibromo-7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
O
Br
HO
NO2
O
O
NO2
Una soluzione di 7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina (0.30 g, 1.4 mmoli) in CH3CN
è stata addizionata di NBS (0.71 g, 4.0 mmoli) e posta a riflusso per 30 minuti
(TLC: CHCl3\MeOH, 95\5). La miscela di reazione è stata concentrata a
secchezza ed il residuo solido è stato cristallizzato da MeOH, ottenendo la 3,6dibromo-7-idrossi-4-metil-8-nitrocumarina (0.49 g, resa 95%), con p.f. 251°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.42
(s, 1 H, 5-H)
2.60
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.52, 156.24, 155.78, 152.42, 133.75, 124.17, 115.51, 113.55, 102.13, 20.83.
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br2NO5 (M- –1)
(M-) –1
375.8462 (calcolato)
375.8476 (trovato)
(M-+2) –1
377.8442 (calcolato)
377.8469 (trovato)
(M-+4) –1
379.8423 (calcolato)
379.8441 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 31.69%, H 1.33%, Br 42.17%, N 3.70%
Trovato: C 31.72%, H 1.32%, Br 42.21%, N 3.59%
125
Sintesi di bromoderivati della 6,7-diidrossi-4-metilcumarina
Sintesi di 1,2,4-triacetossibenzene
O
OCOCH3
OCOCH3
O
OCOCH3
Ad una miscela di Ac2O (45.0 ml, 475.3 mmoli) e H2SO4 (2 ml) è stato aggiunto
1,4-benzochinone (15.0 g, 138.7 mmoli) e la miscela di reazione è stata lasciata in
agitazione per 30 minuti alla temperatura di 45°C (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). La
miscela di reazione è stata versata in 600 ml di acqua e ghiaccio ed il precipitato è
stato separato per filtrazione, ottenendo il 1,2,4-triacetossibenzene (10.3 g, resa
29%), con p.f. 97°C.
1
H-NMR (CDCl3)
7.19
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
7.05
(d, J=2.5, 1 H, 3-H)
7.01
(dd, J=8.9, J=2.5, 1 H, 5-H)
2.29
(s, 9 H, -Me)
126
Sintesi della 6,7-diidrossi-4-metilcumarina
OCOCH3
CH3
OCOCH3
HO
HO
O
O
OCOCH3
Una soluzione di 1,2,4-triacetossibenzene (3.0 g, 11.9 mmoli) in etile acetoacetato
(1.8 ml, 14.3 mmoli) è stata aggiunta di 8 ml di H2SO4 conc.. La miscela di
reazione è stata posta a riflusso per 90 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo
raffreddamento la miscela di reazione è stata versata in acqua (300 ml) ed estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata anidrificata con Na2SO4 e concentrata
a secchezza. Il residuo solido ottenuto è stato solubilizzato nella minima quantità
a caldo di MeOH e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta di
acqua, ottenendo la 6,7-diidrossi-4-metilcumarina (0.92 g, resa 40%), con p.f.
292°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.98
(s all., 1 H, 6-OH o 7-OH)
9.13
(s all., 1 H, 6-OH o 7-OH)
7.02
(s, 1 H, 5-H)
6.73
(s, 1 H, 8-H)
6.08
(q, J=1.2, 1 H, 3-H)
2.32
(d, J=1.2, 3 H, 4-Me)
127
Sintesi della 3-bromo-6,7-diidrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
HO
HO
HO
O
O
HO
Br
O
O
Ad una soluzione di 6,7-diidrossi-4-metilcumarina (0.10 g, 0.52 mmoli) in acido
acetico glaciale (15 ml) è stata aggiunta, a piccole porzioni, a temperatura di
ambiente, una soluzione contenente bromo (0.03 ml, 0.52 mmoli) in AcOH
glaciale. La miscela di reazione è stata mantenuta per 30 minuti a temperatura
ambiente (TLC: CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato nella miscela
di reazione un precipitato che è stato dapprima separato per filtrazione e lavato
abbondantemente con acqua e successivamente solubilizzato nella minima
quantità a caldo di MeOH e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta
di acqua, ottenendo la 3-bromo-6,7-diidrossi-4-metilcumarina (0.13 g, resa
92%), con p.f. 245°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.03 (s all., 2 H, 6-OH o 7-OH)
7.09
(s, 1 H, 5-H)
6.77
(s, 1 H, 8-H)
2.50
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.72, 151.67, 150.49, 146.07, 143.27, 111.21, 109.90, 107.56, 102.42, 19.40.
HRMS (ESI-TOF) per C10H6BrO4 (M- –1)
(M-) –1
268.9540 (calcolato)
268.9555 (trovato)
(M-+2) –1
270.9501 (calcolato)
270.9436 (trovato)
128
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 44.31%, H 2.60%, Br 29.48%
Trovato: C 44.28%, H 2.70%, Br 29.54%
129
Sintesi della 3,8-dibromo-6,7-diidrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
HO
HO
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 6,7-diidrossi-4-metilcumarina (0.20 g, 1.0 mmoli) in acido
acetico glaciale (25 ml) è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla temperatura di
60°C, una soluzione contenente bromo (0.15 ml, 3.0 mmoli) in AcOH glaciale. La
miscela di reazione è stata termostatata per 30 minuti a 60°C (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). Per raffreddamento si è formato nella miscela di reazione
un precipitato che è stato separato per filtrazione e lavato abbondantemente con
acqua. Il solido ottenuto è stato cristallizzato da EtOAc, ottenendo la 3,8dibromo-6,7-diidrossi-4-metilcumarina (0.22 g, resa 61%), con p.f. 264°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.44 (s all., 2 H, 6-OH o 7-OH)
7.13
(s, 1 H, 5-H)
2.52
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.35, 151.53, 148.46, 143.38, 143.08, 111.54, 108.43, 108.34, 97,23, 19.62.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2O4 (M-–1)
(M-) –1
346.8560 (calcolato)
346.8610 (trovato)
(M-+2) –1
348.8540 (calcolato)
348.8575 (trovato)
(M-+4) –1
350.8521 (calcolato)
350.8557 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 34.32%, H 1.73%, Br 45.66%
Trovato: C 34.36%, H 1.67%, Br 45.60%
130
Sintesi di bromoderivati 7,8-diidrossi-4-metilcumarina
Sintesi della 7,8-diidrossi-4-metilcumarina
CH3
HO
OH
HO
OH
O
O
OH
Ad una miscela di pirogallolo (3.0 g, 23.8 mmoli) ed etile acetoacetato (3.6 ml,
28.5 mmoli) è stato aggiunto goccia a goccia, in bagno di ghiaccio, l’H2SO4 conc.
(35 ml). Al termine dell’aggiunta (15 minuti) la miscela di reazione è stata versata
in 200 ml di acqua e ghiaccio ed il precipitato formatosi è stato separato per
filtrazione e cristallizzato da MeOH, ottenendo la 7,8-diidrossi-4-metilcumarina
(2.7 g, resa 59%), con p.f. 236°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.10 (s all., 1 H, 7-OH o 8-OH)
9.43
(s all., 1 H, 7-OH o 8-OH)
7.10
(d, 1 H, 5-H)
6.82
(d, 1 H, 6-H)
6.08
(q, J=1.4, 1 H, 3-H)
2.35
(d, J=1.4, 3 H, 4-Me)
131
Sintesi della 3-bromo-7,8-diidrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
O
HO
OH
O
O
OH
Ad una soluzione di 7,8-diidrossi-4-metilcumarina (0.20 g, 1.0 mmoli) in acido
acetico glaciale (20 ml) è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla temperatura di
60°C, una soluzione contenente bromo (0.05 ml, 1.0 mmoli) in AcOH glaciale.
Nella miscela di reazione si ha l’immediata formazione di un precipitato che è
stato separato per filtrazione e lavato abbondantemente con acqua ed il solido
ottenuto è stato solubilizzato nella minima quantità a caldo di EtOAc e fatto
precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta di CE, ottenendo la 3-bromo7,8-diidrossi-4-metilcumarina (0.14 g, resa 51%), con p.f. 255°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.25 (s all., 1 H, 7-OH o 8-OH)
9.46
(s all., 1 H, 7-OH o 8-OH)
7.21
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
6.85
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
2.54
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.43, 152.45, 149.67, 141.72, 132.06, 116. 22, 112.74, 112.57, 107. 50, 19.44.
HRMS (ESI-TOF) per C10H6BrO4 (M- –1)
(M-) –1
268.9455 (calcolato)
268.9509 (trovato)
(M-+2) –1
270.9436 (calcolato)
270.9493 (trovato)
132
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 44.31%, H 2.60%, Br 29.48%
Trovato: C 44.32%, H 2.63%, Br 29.45%
133
Sintesi della 3,6 dibromo-7,8-diidrossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
O
Br
HO
OH
O
O
OH
Ad una soluzione di 7,8-diidrossi-4-metilcumarina (0.20 g, 1.0 mmoli) in acido
acetico glaciale (20 ml) è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla temperatura di
60°C, una soluzione contenente bromo (0.16 ml, 3.0 mmoli) in AcOH glaciale. La
miscela di reazione è stata termostata a 60°C per 1 ora (TLC: CHCl3/MeOH,
90/10). Per raffreddamento si è formato nella miscela di reazione un precipitato
che è stato separato per filtrazione e lavato abbondantemente con acqua. Il solido
ottenuto è stato cristallizzato da MeOH, ottenendo la 3,6-dibromo-7,8-diidrossi4-metilcumarina (0.18 g, resa 52%), con p.f. 264°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.54
(s, 1 H, 5-H)
2.55
(s, 3 H, 4-Me)
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2O4 (M- –1)
(M-) –1
346.8560 (calcolato)
346.8656 (trovato)
(M-+2) –1
348.8540 (calcolato)
348.8618 (trovato)
(M-+4) –1
350.8521 (calcolato)
350.8581 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 34.32%, H 1.73%, Br 45.66%
Trovato: C 34.34%, H 1.69%, Br 45.63%
134
6.3.3.2 SINTESI DI BROMO-4-METILCUMARINE SOSTITUITE IN
POSIZIONE 7
Sintesi di bromoderivati 7-amino-4-metilcumarinici
Sintesi di etile (3-idrossifenil)carbammato
H2N
EtOOC
OH
N
H
OH
Ad una soluzione di 3-aminofenolo (5.0 g, 45.8 mmoli) in THF (32 ml), è stato
aggiunto etile cloroformiato (11 ml, 115.6 mmoli). La miscela di reazione è stata
mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 1 ora (TLC: CE/EtOAc,
50/50) e successivamente concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato ripreso
con acqua ed estratto a fondo con CHCl3. La fase organica è stata anidrificata con
Na2SO4 e concentrata a secchezza, ottenendo l’etile (3-idrossifenil)carbammato
(4.7 g, resa 56%) con p.f. 97°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.44
(s, 1 H, -NH- o -OH)
9.29
(s, 1 H, -NH- o -OH)
7.04-6.99
(m, 2 H aromatici)
6.86-6.83
(m, 1 H aromatico)
6.40-6.36
(m, 1 H aromatico)
4.09
(q, J=7.1, 2 H, -COOCH2CH3)
1.22
(t, J=7.1, 3 H, -COOCH2CH3)
135
Sintesi di etile (4-metilcumarin-7-il)carbammato
CH3
EtOOC
N
H
EtOOC
OH
N
H
O
O
All’etile (3-idrossifenil)carbammato (3.0 g, 16.6 mmoli) sono stati aggiunti etile
acetoacetato (2.5 ml, 19.9 mmoli) ed H2SO4 70% (80 ml). La miscela di reazione
è stata posta in agitazione a temperatura ambiente per 5 ore (TLC: CHCl3/MeOH,
90/10). A reazione ultimata, la soluzione è stata versata in acqua e ghiaccio e
mantenuta in agitazione, ottenendo la formazione di un precipitato che è stato
recuperato mediante filtrazione e lavato abbondantemente con acqua.
Il residuo solido è stato cristallizzato da EtOH ottenendo così l’etile (4metilcumarin-7-il)carbammato (3.5 g, resa 85%) con p.f. 195°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.18 (s, 1H, -NH-)
7.68
(d, J=8.7, 1 H, 5-H)
7.55
(d, J=2.1, 1 H, 8-H)
7.40
(dd, J=8.7, J=2.1, 1 H, 6-H)
6.22
(q, J=1.3, 1 H, 3-H)
4.17
(q, J=7.1, 2 H, -COOCH2CH3)
2.38
(d, J=1.3, 3 H, 4-CH3)
1.26
(t, J=7.1, 3 H, -COOCH2CH3)
136
Sintesi di 7-amino-4-metilcumarina
CH3
EtOOC
N
H
O
CH3
O
H2N
O
O
All’etile (4-metilcumarin-7-il)carbammato (2.0 g, 8.1 mmoli) sono stati aggiunti
H2SO4 concentrato (3.3 ml) ed acido acetico glaciale (10 ml). La miscela di
reazione è stata posta a riflusso sotto agitazione per 5 ore (TLC: CE/EtOAc,
50/50). Dopo raffreddamento, la miscela di reazione è stata versata in acqua e
ghiaccio e alcalinizzata con NaHCO3, ottenendo un abbondante precipitato che è
stato recuperato per filtrazione, lavato con acqua e cristallizzato da EtOH,
ottenendo la 7-amino-4-metilcumarina (1.2 g, resa 83%) con p.f. 218°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.39
(d, J=8.6, 1 H, 5-H)
6.55
(dd, J=8.6, J=2.1, 1 H, 6-H)
6.39
(d, J=2.1, 1 H, 8-H)
6.08
(s, 2 H, -NH2)
5.89
(q, J=0.9, 1 H, 3-H)
2.29
(d, J=0.9, 3 H, 4-CH3)
137
Sintesi di 7-amino-3-bromo-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
H2N
O
O
H2N
O
O
Una soluzione di 7-amino-4-metilcumarina (0.10 g, 0.57mmoli) in acetonitrile (70
ml) è stata aggiunta, a piccole porzioni ed a temperatura ambiente, di NBS (0.1 g,
0.57 mmoli). La miscela di reazione è stata lasciata per 20 minuti sotto agitazione
(TLC: CHCl3\MeOH, 90\10), concentrata a secchezza, ed il residuo solido è stato
cristallizzato da MeOH ottenendo la 7-amino-3-bromo-4-metilcumarina (95 mg,
resa 66%), con p.f. 206°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.52
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.59
(dd, J=8.8, J=2.3, 1 H, 6-H)
6.43
(d, J=2.3, 1 H, 8-H)
6.27
(s, 2 H, -NH2)
2.48
(s, 3 H, -4Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.17, 151.66, 149.25, 146.59, 128.40, 110.98, 106.94, 103.89, 93.52, 19.52.
HRMS (ESI-TOF) per C10H9BrNO2 (M+ +1)
(M+) +1
253.9811 (calcolato)
253.9823 (trovato)
(M++2) +1
255.9791 (calcolato)
255.9834 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 47.27%, H 3.17%, Br 31.45%,N 5.51%
Trovato: C 47.25%, H 3.12%, Br 31.41%,N 5.52%
138
Sintesi di 7-amino-3,8-dibromo-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
H2N
O
O
H2N
O
O
Br
La 7-amino-4-metilcumarina (0.30 g, 1.7 mmoli) è stata solubilizzata in AcOH
glaciale (80 ml); alla soluzione è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla
temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (0.91 g, 0.17 ml, 3.4
mmoli) in AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata per 1 ora a 60°C
(TLC: CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato un precipitato che è
stato raccolto per filtrazione e purificato per cristallizzazioni successive da
EtOAc, ottenendo la 7-amino-3,8-dibromo-4-metilcumarina (80 mg, resa 14%),
con p.f. 218°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.57
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
6.79
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
6.47
(s, 2 H, -NH2)
2.51
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.40, 152.47, 150.34, 150.24, 125.70, 118.87, 109.64, 105.04, 92.51, 19.36.
HRMS (ESI-TOF) per C10H8Br2NO2 (M+ +1)
(M+) +1
331.8922 (calcolato)
331.8889 (trovato)
(M++2) +1
333.8901 (calcolato)
333.8870 (trovato)
(M++4) +1
335.8881 (calcolato)
335.8827 (trovato)
139
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 36.07%, H 2.12%, Br 47.99%, N 4.21%
Trovato: C 36.09%, H 2.14%, Br 47.91%, N 4.16%
140
Sintesi di 7-amino-3,6,8-tribromo-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
H2N
O
O
Br
H2N
O
O
Br
La 7-amino-4-metilcumarina (0.20 g, 1.1 mmoli) è stata solubilizzata in AcOH
glaciale (80 ml); alla soluzione è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla
temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (0.91 g, 0.17 ml, 3.4
mmoli) in AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata per 3 ore a 60°C
(TLC: CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato un precipitato
cristallino che è stato raccolto per filtrazione elavato abbondantemente con acqua,
ottenendo la 7-amino-3,6,8-tribromo-4-metilcumarina (0.20 g, resa 44%), con
p.f. 244°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.96
(s, 1 H, 5-H)
6.38
(s, 2 H, -NH2)
2.53
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.16, 151.66, 149.25, 146.58, 128.40, 110.98, 106.93, 103.87, 93.52, 19.52.
HRMS (ESI-TOF) per C10H7Br3NO2 (M+ +1)
(M+) +1
409.8027 (calcolato)
409.7989 (trovato)
(M++2) +1
411.8006 (calcolato)
411.8028 (trovato)
(M++4) +1
413.7986 (calcolato)
413.8011 (trovato)
(M++6) +1
415.7994 (calcolato)
415.8009 (trovato)
141
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 29.16%, H 1.47%, Br 58.20%, N 3.40%
Trovato: C 29.19%, H 1.44%, Br 58.31%, N 3.39%
142
Sintesi di 3,8-dibromo-7-metossi-4-metilcumarina
Sintesi della 4-metil-7-metossicumarina
CH3
HO
O
CH3
O
H3CO
O
O
Una miscela di K2CO3 (4.5 g, 32.6 mmoli) e 7-idrossi-4-metilcumarina (5.0 g,
28.4 mmoli) in acetone (120 ml) è stata addizionata di CH3I (5.3 ml, 85.2 mmoli)
e lasciata a temperatura ambiente 3 ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela
di reazione è stata filtrata e la soluzione organica è stata concentrata a secchezza.
Il residuo solido è stato trattato a caldo con MeOH ed il solido indisciolto è stato
raccolto per filtrazione, ottenendo la 4-metil-7-metossicumarina (5.4 g, resa
quantitativa) con p.f. 170°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.69
(d, J=9.2, 1 H, 5-H)
6.98-6.94
(m, 2 H, 6-H e 8-H)
6.20
(q, J=1.2, 1 H, 3-H)
3.86
(s, 3 H, -OCH3)
2.40
(d, J=1.2, 3 H, 4-Me)
143
Tentativo di sintesi della 3,8-dibromo-7-metossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
H3CO
O
O
H3CO
O
O
Br
CH3
Br
H3CO
Br
O
O
Ad una soluzione di 4-metil-7-metossicumarina (0.50 g, 2.6 mmoli) in acido
acetico glaciale (15 ml) è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla temperatura di
60°C, una soluzione contenente bromo (0.27 ml, 5.3 mmoli) in AcOH glaciale. La
miscela di reazione è stata termostata a 60°C per 2 ore (TLC: CE/EtOAc, 50/50).
Per lento raffreddamento si è formato nella miscela di reazione un precipitato che
è stato separato per filtrazione e lavato abbondantemente con acqua. Il solido
ottenuto è stato cristallizzato da EtOH, ottenendo la 3,6-dibromo-4-metil-7metossicumarina (0.50 g, resa 76%), con p.f. 239°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.08
(s, 1 H, 5-H)
7.25
(s, 1 H, 8-H)
3.96
(s, 3 H, -OCH3)
2.58
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.12, 156.58, 152.22, 147.40, 141.49, 133.22, 119.35, 113.65, 107.11, 58.20,
19.90.
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 37.97%, H 2.32%, Br 45.92%
Trovato: C 38.04%, H 2.29%, Br 46.02%
144
Sintesi della 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilcumarina (DBC)
CH3
CH3
Br
HO
O
O
HO
O
O
Br
La 7-idrossi-4-metilcumarina (2.0 g, 11.3 mmoli) è stata sciolta nella minima
quantità di AcOH glaciale (50 ml); alla soluzione è stata aggiunta, a piccole
porzioni, alla temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (3.6 g, 1.2 ml,
22.6 mmoli) in AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata per 3 ore a
60°C (TLC: CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato un precipitato
che è stato raccolto per filtrazione e cristallizzato da EtOH, ottenendo la 3,8dibromo-7-idrossi-4-metilcumarina (1.4 g, resa 48%), con p.f. >300°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.44 (s all., 1 H, -OH)
7.64
(d, J=9.0, 1 H, 5-H)
6.95
(d, J=9.0, 1 H, 6-H)
2.51
(s, 3 H, 4-Me)
145
Sintesi della 3,8-dibromo-7-metossi-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
Br
O
H3CO
Br
O
O
Br
Una miscela di K2CO3 (0.20 g, 1.4 mmoli) e 3,8-dibromo-7-idrossi-4metilcumarina (0.40 g, 1.2 mmoli) in acetone (120 ml) è stata addizionata di CH3I
(0.22 ml, 3.6 mmoli) e lasciata a temperatura ambiente per una notte. La miscela
di reazione è stata filtrata e la soluzione organica è stata concentrata a secchezza.
Il residuo solido è stato cristallizzato da EtOH, ottenendo la 4-metil-7metossicumarina (0.42 g, resa quantitativa) con p.f. 236°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.89
(d, J=9.1, 1 H, 5-H)
7.20
(d, J=9.1, 1 H, 6- H)
3.98
(s, 3 H, -OCH3)
2.59
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.00, 156.23, 151.99, 149.75, 126.62, 114.59, 109.66, 109.44, 98.44, 57.49,
19.90.
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 37.97%, H 2.32%, Br 45.92%
Trovato: C 38.93%, H 2.18%, Br 46.02%
146
Sintesi di 3,8-dibromo-7-acetossi-4-metilcumarina
Sintesi della 7-acetossi-3,8-dibromo-4-metilcumarina
CH3
CH3
Br
HO
O
Br
O
H3COCO
Br
O
O
Br
Una soluzione di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metilcumarina (0.20 g, 0.60 mmoli) in
Ac2O (13 ml) è stata addizionata di acetato sodico fuso (0.05 g, 0.60 mmoli) e
posta a riflusso per 1 ora (TLC: CE/EtOAc, 50/50). La miscela di reazione è stata
ripresa a caldo cautamente con acqua (150 ml) per idrolizzare l’anidride acetica ed
il precipitato formatosi è stato separato per filtrazione e cristallizzato da MeOH,
ottenendo la 7-acetossi-3,8-dibromo-4-metilcumarina (0.13 g, resa 58%) con
p.f. 253°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.92
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
7.39
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
2.62
(s, 3 H, -OCOCH3)
2.39
(s, 3 H, 4-Me)
13
C-NMR (DMSO-d6)
167.90, 155.39, 150.97, 150.67, 149.09, 125.82, 119.97, 118.57, 112.29, 104.42,
20.46, 19.59.
HRMS (ESI-TOF) per C12H9Br2O4 (M+ +1)
(M+) +1
374.8862 (calcolato)
374.8802 (trovato)
(M++2) +1
376.8733 (calcolato)
376.8703 (trovato)
378.8824 (calcolato)
378.8843 (trovato)
+
(M +4) +1
147
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 38.33%, H 2.14%, Br 42.50%
Trovato: C 38.28%, H 2.13%, Br 42.61%
148
Sintesi di 3,8-dibromo-4-metil-7-tiolcumarina
Sintesi della 3,8-dibromo-4-metil-7-[(N,N-dimetil)tiocarbamoilossi]-cumarina
CH3
CH3
Br
Br
S
HO
O
O
(H3C)2NCO
Br
O
O
Br
Una miscela di K2CO3 (0.20 g, 1.4 mmoli) e 3,8-dibromo-7-idrossi-4metilcumarina (0.20 g, 0.60 mmoli) in acetone (50 ml) è stata addizionata di
dimetilcarbamoil cloruro (0.11 g, 0.90 mmoli) e posta a riflusso per 2 ore (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata filtrata e la soluzione
organica è stata concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato cristallizzato da
EtOH, ottenendo la 3,8-dibromo-4-metil-7-[(N,N-dimetil)tiocarbamoilossi]cumarina (0.47 g, resa 80%) con p.f. 232°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.95
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
7.31
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
3.40
(s , 6 H, -N(CH3)2)
2.64
(s, 3 H, 4-Me)
149
Sintesi della 3,8-dibromo-4-metil-7-[(N,N-dimetil)carbamoilmercapto]-cumarina
CH3
CH3
Br
Br
S
O
(H3C)2NCO
O
O
(H3C)2NCS
Br
O
O
Br
La 3,8-dibromo-4-metil-7-[(N,N-dimetil)tiocarbamoilossi]-cumarina (0.60 g, 1.44
mmoli) è stata posta a fusione (232°C) per 10 minuti ottenendo la 3,8-dibromo-4metil-7-[(N,N-dimetil)carbamoilmercapto]-cumarina
quantitativa).
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.89
(d, J=8.5, 1 H, 5-H)
7.63
(d, J=8.5, 1 H, 6-H)
3.10
(s all., 3 H, -CH3)
2.95
(s all., 3 H, -CH3)
2.39
(s, 3 H, 4-Me)
150
(0.60
g,
resa
Sintesi della 3,8-dibromo-4-metil-7-tiolcumarina
CH3
CH3
Br
Br
O
(H3C)2NCS
O
O
HS
Br
Una
soluzione
di
O
O
Br
3,8-dibromo-4-metil-7-[(N,N-dimetil)carbamoilmercapto]-
cumarina (0.4 g, 0.90 mmoli) in H2SO4 concentrato (15 ml) ed AcOH glaciale (70
ml). La soluzione è stata posta a riflusso per 1 ora (TLC: Toluene/Etile
formiato/Acido formico, 50/40/10). Dopo raffreddamento la miscela di reazione è
stata versata in acqua e ghiaccio (200 ml) ottenendo un abbondante precipitato che
è stato recuperato per filtrazione, ottenendo la 3,8-dibromo-4-metil-7tiolcumarina (0.25 g, resa 79%) con p.f. 240°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.78
(d, J=8.4, 1 H, 5-H)
7.60
(d, J=8.4, 1 H, 6-H)
2.57
(s, 3 H, 4-CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
155.39, 151.36, 148.57, 142.11, 124.91, 124.79, 117.08, 110.86, 107.60, 19.40.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2SO2 (M- –1)
(M-) –1
346.8382 (calcolato)
346.8342 (trovato)
-
(M +2) –1
348.8362 (calcolato)
348.8364 (trovato)
(M-+4) –1
350.8341 (calcolato)
350.8303 (trovato)
151
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 34.31%, H 1.73%, Br 45.66%, S 9.16%
Trovato: C 34.28%, H 1.75%, Br 45.61%, S 9.18%
152
6.3.3.3 SINTESI DI BROMO-7-IDROSSICUMARINE SOSTITUITE IN
POSIZIONE 4
Sintesi di bromoderivati della 4,7-diidrossicumarina
Sintesi di 4,7-diidrossicumarina
OH
HO
OH
HO
O
O
Una miscela di resorcina (20.0 g, 181.6 mmoli), acido malonico (19.8 g, 190.0
mmoli) e ZnCl2 (60 g, 440.3 mmoli) è stata aggiunta di POCl3 (40.64 ml, 436.0
mmoli) e termostata a 75°C per 3 ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di
reazione, dopo raffreddamento, è stata ripresa con 300 ml di una soluzione
acquosa al 10 % di Na2CO3 e versata lentamente in acqua con formazione di un
precipitato che è stato raccolto per filtrazione e solubilizzato nella minima
quantità a caldo di MeOH e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta
di acqua, ottenendo la 4,7-diidrossicumarina (6.0 g, resa 18%), con p.f. 262°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
12.24 (s all., 1 H, 4-OH o 7-OH)
10.53 (s all., 1 H, 4-OH o 7-OH)
7.63
(d, J=8.6, 1 H, 5-H)
6.76
(dd, J=8.6, J=2.2, 1 H, 6-H)
6.66
(d, J=2.2, 1 H, 8-H)
5.38
(s, 1 H, 3-H)
153
Sintesi di 3-bromo-4,7-diidrossicumarina
OH
OH
Br
HO
O
O
HO
O
O
La 4,7-diidrossicumarina (1.0 g, 5.6 mmoli) è stata solubilizzata in 50 ml di
AcOH glaciale ed alla soluzione è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla
temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (0.14 ml, 2.8 mmoli) in
AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata termostatata per 3 ore a 60°C (TLC:
CE/EtOAc, 50/50). Per raffreddamento si è formato un precipitato che è stato
raccolto per filtrazione e lavato abbondantemente con acqua, ottenendo la 3bromo-4,7-diidrossicumarina (0.57 g, resa 43%), con p.f. 235°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.79
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.81
(dd, J=8.8, J=2.2, 1 H, 6-H)
6.71
(d, J=2.2, 1 H, 8-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
162.71, 161.77, 158.86, 153.50, 124.84, 113.02, 107.69, 101.92, 85.55.
HRMS (ESI-TOF) per C9H4BrO4 (M- –1)
(M-) –1
254.9444 (calcolato)
254.9477 (trovato)
(M- +2) –1
256.9424 (calcolato)
256.9486 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 42.05%, H 1.96%, Br 31.09%
Trovato: C 42.01%, H 1.94%, Br 31.15%
154
Sintesi di 3,8-dibromo-4,7-diidrossicumarina
OH
OH
Br
HO
O
O
HO
O
O
Br
La 4,7-diidrossicumarina (0.80 g, 4.5 mmoli) è stata solubilizzata in 40 ml di
AcOH glaciale ed alla soluzione è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla
temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (0.35 ml, 6.74 mmoli) in
AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata termostatata per 2 ore a 50°C (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). Per raffreddamento si è formato un precipitato che è stato
dapprima raccolto per filtrazione e lavato abbondantemente con acqua e
successivamente
cristallizzato
da
DCE,
ottenendo
la
3,8-dibromo-4,7-
diidrossicumarina (0.25 g, resa 40%), con p.f. 240°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.45 (s all., 2 H, 4-OH e 7-OH)
7.78
(d, J=7.8, 1 H, 5-H)
6.97
(d, J=7.8, 1 H, 6-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
1162.55, 158.65, 158.33, 150.36, 123.37, 112.48, 108.96, 96.55, 85.88.
HRMS (ESI-TOF) per C9H3Br2O4 (M-–1)
(M-) –1
332.8404 (calcolato)
332.8447 (trovato)
(M-+2) –1
334.8384 (calcolato)
334.8405 (trovato)
(M-+4) –1
336.8364 (calcolato)
336.8432 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 32.18%, H 1.20%, Br 47.57%
Trovato: C 32.43%, H 0.95%, Br 47.69%
155
Sintesi di 3,6,8-tribromo-4,7-diidrossicumarina
OH
OH
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
La 4,7-diidrossicumarina (2.0 g, 11.2 mmoli) è stata solubilizzata in 60 ml di
AcOH glaciale ed alla soluzione è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla
temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (2.3 ml, 44.91 mmoli) in
AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata termostatata per 3 ore a 60°C (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). Nella miscela di reazione si ha la formazione di un
precipitato che è stato dapprima raccolto per filtrazione e lavato abbondantemente
con acqua e successivamente cristallizzato da MeOH, ottenendo la 3,6,8tribromo-4,7-diidrossicumarina (2.2 g, resa 47%), con p.f. 257°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.70 (s all., 2 H, 4-OH e 7-OH)
8.08
(s, 1 H, 5-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
161.82, 158.10, 154.47, 149.39, 125.75, 110.91, 106.97, 99.31, 86.72.
HRMS (ESI-TOF) perC9H2Br3O4 (M- –1)
(M-) –1
410.7509 (calcolato)
410.7547 (trovato)
-
(M +2) –1
412.7489 (calcolato)
412.7468 (trovato)
(M-+4) –1
414.7469 (calcolato)
414.7462 (trovato)
(M-+6) –1
416.7450 (calcolato)
416.7462 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 26.06%, H 0.73%, Br 57.79%
Trovato: C 25.99%, H 0.74%, Br 57.73%
156
Sintesi di bromoderivati della 7-idrossicumarina
Sintesi di 3-bromo-7-idrossicumarina
Br
HO
O
O
HO
O
O
Ad una soluzione di 7-idrossicumarina (4.0 g, 24.7 mmoli) in AcOH glaciale (150
ml) termostatata a 60°C è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di Br2
(1.3 ml, 24.7 mmoli) diluito in AcOH (30 ml) fino a scomparsa del prodotto di
partenza (TLC: CE/EtOAc, 50/50). Il precipitato formatosi dopo raffreddamento è
stato raccolto per filtrazione e cristallizzato da MeOH, ottenendo la 3-bromo-7idrossi-cumarina (2.4 g, resa 40%), con p.f. 247°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.76 (s all., 1 H, -OH)
8.49
(s, 1 H, 4-H)
7.52
(d, J=8.5, 1 H, 5-H)
6.82
(dd, J=8.5, J=2.1, 1 H, 6-H)
6.74
(d, J=2.1, 1 H, 8-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
161.66, 156.84, 154.67, 145.50, 129.21, 113.66, 111.82, 105.12, 102.01.
HRMS (ESI-TOF) per C9H4BrO3 (M- –1)
(M-) –1
238.9349 (calcolato)
238.9339 (trovato)
(M- +2) –1
240.9330 (calcolato)
240.9334 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 44.85%, H 2.09%, Br 33.15%
Trovato: C 44.82%, H 2.10%, Br 33.13%
157
Sintesi di 3,6-dibromo-7-idrossicumarina e di 3,8-dibromo-7-idrossicumarina
Br
Br
O
HO
Br
Br
+
HO
O
O
O
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 3-bromo-7-idrossicumarina (1.2 g, 5.0 mmoli) in CH3CN
(150 ml) termostatata a 60°C è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di
Br2 (0.52 ml, 10.1 mmoli) diluito in CH3CN (50 ml) fino a scomparsa del prodotto
di partenza (TLC: CE/EtOAc, 50/50). La miscela di reazione è stata concentrata a
secchezza ed il solido ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su
colonna con eluente CE/EtOAc 80/20, eluendo dapprima la 3,6-dibromo-7idrossicumarina che è stata ulteriormente purificata riprendendo il residuo solido
con la minima quantità a caldo di EtOAc e fatto precipitare in forma cristallina per
lenta aggiunta a caldo di CE (0.28 g, resa 18%), con p.f. 217°C. Successivamente
è stata eluita la 3,8-dibromo-7-idrossicumarina (0.24 g, resa 15%) la quale è
stata ulteriormente purificata per cristallizzazione da MeOH, con p.f. 219°C.
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,6-dibromo-7-idrossicumarina
11.62 (s all., 1 H, -OH)
8.44
(s, 1 H, 4-H)
7.91
(s, 1 H, 5-H)
6.89
(s, 1 H, 8-H)
13
C-NMR (DMSO-d6) di 3,6-dibromo-7-idrossicumarina
157.71, 156.72, 153.65, 144.47,131.44, 113.23, 106.74, 102.91.
HRMS (ESI-TOF) per C9H3Br2O3 (M- –1) di 3,6-dibromo-7-idrossicumarina
(M-) –1
316.8454 (calcolato)
316.8446 (trovato)
(M- +2) –1
318.8434 (calcolato)
318.8438 (trovato)
(M- +4) –1
320.8415 (calcolato)
320.8413 (trovato)
158
ANALISI ELEMENTARE di 3,6-dibromo-7-idrossicumarina
Teorico: C 33.79%, H 1.26%, Br 49.95%
Trovato: C 33.82%, H 1.24%, Br 49.96%
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-7-idrossicumarina
11.53 (s all., 1 H, 7-OH)
8.51
(s, 1 H, 4-H)
7.52
(d, J=8.6, 1 H, 5-H)
6.98
(d, J=8.6, 1-H, 6-H)
13
C-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-7-idrossicumarina
158.66, 156.73, 151.68, 145.52, 127.99, 113.40, 113.03, 106.23, 96.73.
HRMS (ESI-TOF) per C9H3Br2O3 (M- –1) di 3,8-dibromo-7-idrossicumarina
(M-) –1
316.8454 (calcolato)
316.8458 (trovato)
(M- +2) –1
318.8434 (calcolato)
318.8431 (trovato)
(M- +4) –1
320.8415 (calcolato)
320.8404 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE di 3,8-dibromo-7-idrossicumarina
Teorico: C 33.79%, H 1.26%, Br 49.95%
Trovato: C 33.80%, H 1.28%, Br 49.93%
159
Sintesi di bromoderivati della 4-etil-7-idrossicumarina
Sintesi di 4-etil-7-idrossicumarina
CH2CH3
HO
OH
HO
O
O
Ad una miscela di resorcinolo (1.5 g, 14.0 mmoli) ed etile propionilacetato (2.0
ml, 14.0 mmoli) è stato aggiunto, goccia a goccia, H2SO4 concentrato e la miscela
di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora
fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La
miscela di reazione è stata versata in acqua (150 ml) con formazione di un
precipitato che è stato filtrato e lavato con acqua, ottenendo la 4-etil-7idrossicumarina (2.4 g, resa 90%), con p.f. 175°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.51 (s all., 1 H, -OH)
7.63
(d, J=8.7, 1 H, 5-H)
6.80
(dd, J=8.7, J=2.4, 1 H, 6-H)
6.71
(d, J=2.4, 1 H, 8-H)
6.08
(s, 1 H, 3-H)
2.37
(q, J=7.4, 2 H, -CH2CH3)
1.21
(t, J=7.4, 3 H, -CH2CH3)
160
Sintesi di 3-bromo-4-etil-7-idrossicumarina
CH2CH3
CH2CH3
Br
HO
O
O
HO
O
O
Una soluzione di 4-etil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.6 mmoli) in AcOH glaciale
(20 ml) è stata aggiunta, goccia a goccia, di una soluzione di Br2 (0.13 ml, 2.6
mmoli) diluito in AcOH (15 ml) e termostatata a 60°C per 2 ore fino a scomparsa
del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). La miscela di reazione è
stata versata in 100 ml di acqua, neutralizzata con NaHCO3 e poi estratta con
EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 anidro e
concentrata a secchezza. Il residuo solido è stato cristallizzato da EtOH, ottenendo
la 3-bromo-4-etil-7-idrossicumarina (0.41 g, resa 58%), con p.f. 174°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.69 (s all., 1 H, -OH)
7.73
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
6.85
(dd, J=8.9, J=2.4, 1 H, 6-H)
6.76
(d, J=2.4, 1 H, 8-H)
2.96
(q, J=7.6, 2 H, -CH2CH3)
1.16
(t, J=7.6, 3 H, -CH2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
161.59, 157.12, 153.83, 127.25, 114.06, 110.82, 106.71, 102.54, 26.00, 12.46.
HRMS (ESI-TOF) per C11H8BrO3 (M- –1)
(M-) –1
266.9662 (calcolato)
266.9709 (trovato)
(M- +2) –1
268.9643 (calcolato)
268.9687 (trovato)
161
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 49.10%, H 3.37%, Br 29.69%
Trovato: C 49.08%, H 3.36%, Br 29.66%
162
Sintesi di 3,6-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina e di 3,8-dibromo-4-etil-7idrossicumarina
CH2CH3
CH2CH3
Br
CH2CH3
Br
Br
+
HO
O
O
HO
O
O
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 4-etil-7-idrossicumarina (0.40 g, 2.1 mmoli) in AcOH
glaciale (20 ml), termostatata a 60°C, è stata aggiunta una soluzione di Br2 (0.22
ml, 4.2 mmoli) diluito in AcOH (2 ml) fino a scomparsa del prodotto di partenza
(TLC: CE/EtOAc, 80/20). La miscela di reazione, versata in acqua e neutralizzata
con NaHCO3, è stata estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata
anidrificata con Na2SO4 anidro e concentrata a secchezza. Il solido ottenuto è stato
purificato mediante cromatografia su colonna con eluente CE/EtOAc, 95/5,
eluendo dapprima la 3,6-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina (0.13 g, resa 18%),
con p.f. 184°C, e successivamente la 3,8-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina (80
mg, resa 11%), con p.f. 166°C. I prodotti eluiti sono stati purificati mediante
cristallizzazione da MeOH.
1
H-NMR(DMSO-d6) di 3,6-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina
11.58 (s all., 1 H, -OH)
8.04
(s, 1 H, 5-H)
6.92
(s, 1 H, 8-H)
2.98
(q, J=7.5, 2 H, -CH2CH3)
1.15
(t, J=7.5, 3 H, -CH2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6) di 3,6-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina
159.25, 154.89, 156.01, 154.36, 124.32, 115.18, 110.21, 106.34, 98.81, 26.40,
12.35.
163
ANALISI ELEMENTARE di 3,6-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina
Teorico: C 37.97 %, H 2.32 %, Br 45.92 %
Trovato: C 37.98 %, H 2.30 %, Br 45.89 %
HRMS
(ESI-TOF)
per
C11H7Br2O3
(M-
–1)
di
3,6-dibromo-4-etil-7-
idrossicumarina
(M-) –1
344.8767 (calcolato)
344.8900 (trovato)
-
(M +2) –1
346.8747 (calcolato)
346.8822 (trovato)
(M- +4) –1
348.8728 (calcolato)
348.8796 (trovato)
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina
11.50 (s all., 1 H, -OH)
7.77
(d, J=8.9; 1 H, 5-H)
7.02
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
2.98
(q, J=7.5, 2 H, -CH2CH3)
1.16
(t, J=7.5, 3 H, -CH2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina
161.60, 158.51, 156.92, 150.45, 125.84, 113.42, 112.06, 102.57, 97.27, 26.12,
12.54.
HRMS
(ESI-TOF)
per
C11H7Br2O3
(M-
–1)
di
3,8-dibromo-4-etil-7-
idrossicumarina
(M-) –1
344.8767 (calcolato)
344.8780 (trovato)
-
(M +2) –1
346.8747 (calcolato)
346.8717 (trovato)
(M- +4) –1
348.8728 (calcolato)
348.8814 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE di 3,8-dibromo-4-etil-7-idrossicumarina
Teorico: C 37.97%, H 2.32%, Br 45.92%
Trovato: C 37.95%, H 2.33%, Br 45.90%
164
Sintesi di 3,6,8-tribromo-4-etil-7-idrossicumarina
CH2CH3
CH2CH3
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
Una soluzione di 4-etil-7-.idrossicumarina (0.20 g, 1.1 mmoli) in AcOH glaciale
(15 ml); è stata addizionata di una soluzione di Br2 (0.16 ml, 3.2 mmoli) diluito in
AcOH (2 ml) e termostatata a 60°C per 1 ora fino a scomparsa del prodotto di
partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). La miscela di reazione è stata versata in
acqua (50 ml) con formazione di un precipitato che è stato filtrato, lavato con
acqua
e
cristallizzato
da
DCE,
ottenendo
il
3,6,8-tribromo-4-etil-7-
idrossicumarina (0.42 g, resa 89%), con p.f. 235°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.10
(s, 1 H, 5-H)
3.00
(q, J=7.5, 2 H, -CH2CH3)
1.14
(t, J=7.5, 3 H, -CH2CH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
155.77, 155.38, 154.21, 149.41, 127.68, 113.08, 108.94, 107.93, 99.59, 25.70,
12.06.
HRMS (ESI-TOF) per C11H6Br3O3 (M- –1)
(M-) –1
422.7873 (calcolato)
422.7969 (trovato)
(M- +2) –1
424.7852 (calcolato)
424.7937 (trovato)
(M- +4) –1
426.7833 (calcolato)
426.7915 (trovato)
(M- +6) –1
428.7814 (calcolato)
428.7931 (trovato)
165
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 30.95%, H 1.65%, Br 56.15%
Trovato: C 30.95%, H 1.63%, Br 56.17%
166
Sintesi di bromoderivati della 4-bromometil-7-idrossicumarina
Sintesi di 4-bromoacetoacetato di etile
O
H3C
O
O
Br
OC2H5
O
OC2H5
Ad una soluzione di etile acetoacetato (13.0 g, 100.0 mmoli) in CHCl3 (90 ml) è
stata aggiunta a temperatura ambiente, goccia a goccia, una soluzione di Br2 (5.1
ml, 100.0 mmoli) in 30 ml di CHCl3 (TLC: CE). La miscela di reazione è stata
insufflata per 20 minuti con N2, versata in 100 ml di acqua e quindi estratta con
EtOAc. La fase organica è stata anidrificata con Na2SO4 anidro e concentrata
evaporando il solvente organico, ottenendo il 4-bromoacetoacetato di etile (20.0
g, resa 96%).
1
H-NMR (CDCl3)
4.23
(q, 2 H, J=7.2, -CH2CH3)
3.44
(s, 2 H alifatici)
2.25
(s, 2 H alifatici)
1.14
(t, J=7.2, 3 H, -CH2CH3)
167
Sintesi di 4-bromometil-7-idrossicumarina
CH2Br
HO
HO
OH
O
O
Ad una sospensione di resorcinolo (5.0 g, 45.4 mmoli) in 4-bromoacetoacetato di
etile (10.5 g, 50.2 mmoli) è stato aggiunto H2SO4 concentrato (20 ml) e la miscela
di reazione è stata mantenuta a temperatura ambiente per 1 ora fino a scomparsa
del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 95/05). La miscela di reazione è
stata versata in acqua e ghiaccio (200 ml) ed il precipitato formatosi è stato
recuperato mediante filtrazione e lavato con acqua. Il residuo solido è stato
solubilizzato nella minima quantità a caldo di MeOH e fatto precipitare in forma
cristallina per lenta aggiunta di acqua, ottenendo la 4-bromometil-7idrossicumarina (5.2 g, resa 45%), con p.f. 191°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.69 (s all., 1 H, -OH)
7.70
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.84
(dd, J=8.8, J=2.3, 1 H, 6-H)
6.74
(d, J=2.3, 1 H, 8-H)
6.45
(s, 1 H, 3-H)
4.79
(s, 2 H, -CH2Br)
168
Sintesi di 8-bromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
CH2Br
HO
O
CH2Br
O
HO
O
O
Br
METODO A
Ad una soluzione di 4-bromometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.0 mmoli) in
AcOH glaciale (30 ml) termostatata a 60°C è stata aggiunta, goccia a goccia, una
soluzione di Br2 (0.10 ml, 2.0 mmoli) diluito in AcOH (10 ml). Dopo 30 minuti
(TLC: CE/EtOAc, 50/50) la miscela di reazione è stata fatta raffreddare fino a
temperatura ambiente, versata in 100 ml di acqua e, dopo neutralizzazione con
NaHCO3, estratta a fondo con EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata
con Na2SO4 e concentrata a secchezza, ottenendo una miscela di prodotti
complessa che è stata abbandonata.
METODO B
Ad una soluzione di 4-bromometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.0 mmoli) in
AcOH glaciale (30 ml) è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di Br2
(0.10 ml, 2.0 mmoli) diluito in AcOH (10 ml) a temperatura ambiente fino a
scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CE/EtOAc, 50/50). La miscela di
reazione è stata versata in acqua, neutralizzata con NaHCO3, ed estratta a fondo
con EtOAc. La fase organica è stata anidrificata e concentrata a secchezza. Da
analisi 1H-NMR il solido ottenuto è risultato una miscela complessa di prodotti
che non sono stati identificati e separati.
169
METODO C
Ad una soluzione di 4-bromometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.0 mmoli) in
CH3CN (50 ml) è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di Br2 (0.10 ml,
2.0 mmoli) diluito in CH3CN (20 ml) e la miscela di reazione è stata mantenuta
sotto agitazione ad una temperatura compresa tra 0°C e 5°C per 5 ore (TLC:
CE/EtOAc, 50/50). La soluzione è stata concentrata a secchezza ed il residuo
solido è stato cristallizzato da DCE, ottenendo la 8-bromo-4-bromometil-7idrossicumarina (0.16 g, resa 24%), con p.f. 249°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.72
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
7.02
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
6.55
(s, 1 H, 3-H)
4.82
(s, 2 H, -CH2Br)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.44, 158.34, 152.04, 151.44, 125.17, 112.44, 111.86, 110.85, 97.14, 58.98.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2O3 (M- –1)
(M-) –1
330.8611 (calcolato)
330.8680 (trovato)
(M- +2) –1
332.8591 (calcolato)
332.8595 (trovato)
(M- +4) –1
334.8572 (calcolato)
334.8589 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 35.96%, H 1.81%, Br 47.85%
Trovato: C 35.94%, H 1.82%, Br 47.81%
170
Sintesi di 3,6-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina e di 3,8-dibromo-4bromometil-7-idrossicumarina
CH2Br
CH2Br
Br
CH2Br
Br
Br
+
HO
O
O
HO
O
O
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 4-bromometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.0 mmoli) in
CH3CN (50 ml) è stata aggiunta a temperatura ambiente, goccia a goccia, una
soluzione di Br2 (0.25 ml, 4.9 mmoli) diluito in CH3CN (210 ml) (TLC:
CE/EtOAc, 50/50). La miscela di reazione è stata concentrata a secchezza ed il
residuo solido è stato purificato mediante cromatografia su colonna con eluente
CHCl3, eluendo dapprima la 3,6-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina che
è stata ulteriormente purificata per cristallizzazione a caldo da DCE (0.13 g, resa
17%), con p.f. 213°C, e successivamente la 3,8-dibromo-4-bromometil-7idrossicumarina, che è stata ulteriormente purificata mediante cristallizzazione
da MeOH (0.30 g, resa 25%), con p.f. 217°C.
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,6-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
8.10
(s, 1 H, 5-H)
6.63
(s, 1 H, 8-H)
4.90
(s, 2 H, -CH2Br)
13
C-NMR (DMSO-d6) di 3,6-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
156.24, 155.18, 149.85, 146.34, 124.81, 113.60, 111.01, 109.67, 96.84, 60.93.
171
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br3O3 (M- –1) di 3,6-dibromo-4-bromometil-7idrossicumarina
(M-) –1
408.7716 (calcolato)
408.7741 (trovato)
(M- +2) –1
410.7696 (calcolato)
410.7689 (trovato)
(M- +4) –1
412.7676 (calcolato)
412.7697 (trovato)
(M- +6) –1
414.7657 (calcolato)
414.7694 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE 3,6-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
Teorico: C 29.09%, H 1.22%, Br 58.06%
Trovato: C 29.12%, H 1.23%, Br 58.08%
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
11.62 (s all., 1 H, -OH)
7.82
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
7.05
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
4.89
(s, 2 H, -CH2Br)
13
C-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
156.78, 155.39, 150.64, 149.47, 125.59, 113.30, 110.56, 109.70, 97.27, 60.74.
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br3O3 (M- –1) di 3,8-dibromo-4-bromometil-7idrossicumarina
(M-) –1
408.7716 (calcolato)
408.7870 (trovato)
(M- +2) –1
410.7696 (calcolato)
410.7831 (trovato)
(M +4) –1
412.7676 (calcolato)
412.7851 (trovato)
(M- +6) –1
414.7657 (calcolato)
414.7852 (trovato)
-
ANALISI ELEMENTARE di 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
Teorico: C 29.09%, H 1.22%, Br 58.06%
Trovato: C 29.07%, H 1.20%, Br 58.05%
172
Sintesi di 3,6,8-tribromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
CH2Br
CH2Br
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 4-bromometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 1.96 mmoli) in
AcOH glaciale (30 ml), termostatata a 50°C, è stata aggiunta, goccia a goccia, una
soluzione di Br2 (0.3 ml, 6.0 mmoli) in AcOH (35 ml) (TLC: CE/EtOAc, 50/50).
Al termine dell’aggiunta la miscela di reazione è stata fatta raffreddare, quindi
versata in 100 ml di acqua, ottenendo un precipitato che è stato separato per
filtrazione e lavato abbondantemente con acqua. Il solido ottenuto è stato
cristallizzato
da
MeOH,
ottenendo
la
3,6,8-tribromo-4-bromometil-7-
idrossicumarina (0.87 g, resa 89%), con p.f. 230°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.21
(s, 1 H, 5-H)
4.95
(s, 2 H, -CH2Br)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.96, 154.60, 151.27, 149.98, 129.31, 113.63, 110.06, 107.97, 99.42, 61.07.
HRMS (ESI-TOF) per C10H3Br4O3 (M- –1)
(M-) –1
486.6821 (calcolato)
486.7071 (trovato)
-
(M +2) –1
488.6801 (calcolato)
488.7024 (trovato)
(M- +4) –1
490.6781 (calcolato)
490.6970 (trovato)
(M- +6) –1
492.6761 (calcolato)
492.6952 (trovato)
(M- +8) –1
494.6743 (calcolato)
494.6939 (trovato)
173
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 24.42%, H 0.82%, Br 65.00%
Trovato: C 24.40%, H 0.85%, Br 65.03%
174
Sintesi di bromoderivati della 4-clorometil-7-idrossicumarina
Sintesi di 4-clorometil-7-idrossicumarina
CH2Cl
HO
OH
HO
O
O
Ad una sospensione di resorcinolo (5.0 g, 45.4 mmoli) in 4-cloroacetoacetato di
etile (6.1 ml, 45.4 mmoli) è stato aggiunto H2SO4 concentrato (7 ml) e la
soluzione ottenuta è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 1
ora fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La
miscela di reazione è stata versata a filo in acqua e ghiaccio (400 ml) ottenendo un
precipitato che è stato separato per filtrazione e lavato con acqua. Il residuo solido
è stato cristallizzato da MeOH, ottenendo la 4-clorometil-7-idrossicumarina (4.6
g, resa 48%), con p.f. 181°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
9.49
(s all., 1 H, -OH)
7.73
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.91
(dd, J=8.8, J=2.4, 1 H, 6-H)
6.79
(d, J=2.4, 1 H, 8-H)
6.40
(t, J=0.8, 1 H, 3-H)
4.92
(d, J=0.8, 2 H, -CH2Cl)
175
Sintesi di 8-bromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
CH2Cl
HO
O
CH2Cl
O
HO
O
O
Br
METODO A
Ad una soluzione di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.30 g, 1.4 mmoli) in AcOH
glaciale (30 ml) termostatata a 40°C è stata aggiunta, goccia a goccia, una
soluzione di Br2 (0.07 ml, 1.4 mmoli) diluita in AcOH (30 ml) fino a scomparsa
del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è
stata versata in acqua (100 ml), neutralizzata con NaHCO3 ed estratta a fondo con
EtOAc. La fase organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 anidro e
concentrata a secchezza, ottenendo una miscela complessa di prodotti che non
sono stati identificati e separati.
METODO B
Ad una soluzione di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.30 g, 1.4 mmoli) in
CH3CN (40 ml) è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di Br2 (0.17 ml,
3.3 mmoli) diluito in CH3CN (160 ml) fino a scomparsa del prodotto di partenza,
mantenendo la temperatura compresa tra 0°C e 5°C (TLC: CE/EtOAc, 50/50). La
miscela di reazione è stata concentrata a secchezza ed il residuo solido è stato
cristallizzato da MeOH, ottenendo la 8-bromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
(0.16 g, resa 39%), con p.f. 247°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.48 (s all., 1 H, 7-OH)
7.70
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
7.01
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
6.51
(s, 1 H, 3-H)
4.97
(s, 2 H, -CH2Cl)
176
13
C-NMR (DMSO-d6)
160.47, 158.35, 152.43, 151.62, 124.36, 112.55, 111.21, 107.39, 96.84, 59.43.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5BrClO3 (M- –1)
(M-) –1
286.9116 (calcolato)
286.9126 (trovato)
(M- +2) –1
288.9094 (calcolato)
288.9097 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 41.49%, H 2.09%, Br 27.60%, Cl 12.25%
Trovato: C 41.52%, H 2.08%, Br 27.57%, Cl 12.23%
177
Sintesi di 6,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
CH2Cl
CH2Cl
Br
HO
O
O
HO
O
O
Br
Una soluzione di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.4 mmoli) in CHCl3
(200 ml) è stata addizionata, goccia a goccia, di una soluzione di Br2 (0.30 ml, 5.9
mmoli) in CHCl3 (100 ml). La miscela di reazione è stata mantenuta sotto
agitazione a temperatura ambiente fino a scomparsa del prodotto di partenza
(TLC: CE/EtOAc, 10/90) e quindi concentrata a secchezza. Il residuo solido è
stato cristallizzato da MeOH, ottenendo la 6,8-dibromo-4-clorometil-7idrossicumarina (0.57 g, 65%), con p.f. 212°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
8.08
(s, 1 H, 5-H)
6.57
(t, J=0.8, 1-H, 3-H)
5.02
(d, J=0.8, 2 H, -CH2Cl)
13
C-NMR (Acetone-d6)
160.58, 146.03, 153.42, 151.58, 129.49, 115.34, 114.29, 107.89, 100.81, 42.85.
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br2ClO3 (M- –1)
(M-) –1
364.8221 (calcolato)
364.8247 (trovato)
-
(M +2) –1
366.8200 (calcolato)
366.8197 (trovato)
(M- +4) –1
368.8178 (calcolato)
368.8189 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 32.60%, H 1.37%, Br 43.38%, Cl 9.62%;
Trovato: C 32.62%, H 1.36%, Br 43.36%, Cl 9.64%.
178
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina a partire dalla
4-clorometil-7-idrossicumarina.
CH2Cl
CH2Cl
CH2Br
Br
Br
+
HO
O
O
HO
O
Br
O
HO
O
O
Br
METODO A
Ad una soluzione di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.4 mmoli) in
CH3CN (50 ml) è stata aggiunta lentamente (una settimana) una soluzione di Br2
(0.36 ml, 7.1 mmoli) diluito in CH3CN (300 ml) (TLC: CE/EtOAc, 10/90). Dopo
aver concentrato a secchezza la miscela di reazione il residuo solido è stato
cromatografato su colonna con eluente CHCl3, ottenendo però una miscela di 3,8dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina e di 3,8-dibromo-4-bromometil-7idrossicumarina, che non è stato possibile separare ulteriormente ma identificare
mediante NMR ed MS.
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
11.62 (s all., 1 H, 7-OH)
7.82
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
7.05
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
5.02
(s, 2 H, -CH2Cl)
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br2ClO3 (M- –1)
(M-) –1
364.8220 (calcolato)
364.8386 (trovato)
(M- +2) –1
366.8200 (calcolato)
366.8232 (trovato)
(M- +4) –1
368.8178 (calcolato)
368.8219 (trovato)
179
1
H-NMR (DMSO-d6) di 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina
11.62 (s all., 1 H, -OH)
7.82
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
7.05
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
4.89
(s, 2 H, -CH2Br)
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br3O3 (M- –1)
(M-) –1
408.7716 (calcolato)
408.7906 (trovato)
(M- +2) –1
410.7696 (calcolato)
410.7720 (trovato)
(M- +4) –1
412.7676 (calcolato)
412.7720 (trovato)
(M- +6) –1
414.7656 (calcolato)
414.7670 (trovato)
180
METODO B
Una soluzione di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.4 mmoli) in CH3CN
(50 ml) è stata addizionata, goccia a goccia, di una soluzione di Br2 (0.36 ml, 7.1
mmoli) in CH3CN (300 ml). La miscela di reazione è stata mantenuta in
agitazione a temperatura ambiente per 2 giorni (TLC: CE/EtOAc, 10/90). La
miscela di reazione è stata concentrata a secchezza, ottenendo una miscela
complessa di prodotti che non sono stati identificati e separati.
METODO C
Ad una soluzione di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.50 g, 2.4 mmoli) in
CH3CN (50 ml) è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di Br2 (0.36 ml,
7.1 mmoli) in CH3CN (300 ml). La miscela di reazione è stata mantenuta in
agitazione ad una temperatura compresa fra 0°C e 5°C per 3 giorni fino a
scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CE/EtOAc, 10/90). La miscela di
reazione è stata concentrata a secchezza. Da analisi 1H-NMR il solido ottenuto è
risultato una miscela complessa di prodotti che non sono stati identificati e
separati.
181
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina a partire dalla
8-bromo-4-clorometil-7-idrossicumarina.
CH2Cl
CH2Cl
Br
HO
O
O
HO
Br
O
O
Br
Ad una miscela di 8-bromo-4-clorometil-7-idrossicumarina (0.30 g, 1.0 mmoli) ed
CH3CN (400 ml) è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di Br2 (0.15 ml,
2.9 mmoli) in CH3CN (200 ml), mantenendo una temperatura compresa fra 0°C e
5°C fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CE/EtOAc, 10/90). La
miscela di reazione è stata concentrata a secchezza ed il residuo solido è stato
purificato mediante cromatografia su colonna con eluente CHCl3, ottenendo la
6,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina (64 mg, resa 16%).
182
Sintesi di 3,6,8-tribromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
CH2Cl
CH2Cl
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
Una miscela di 4-clorometil-7-idrossicumarina (0.20 g, 1.0 mmoli) e di NBS (0.65
g, 3.6 mmoli) solubilizzata in CH3CN (200 ml) è stata posta a riflusso per 2 ore
fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 80/20). La
miscela di reazione è stata concentrata a secchezza ed il residuo solido è stato
trattato a caldo con acqua. Il residuo indisciolto è stato dapprima separato per
filtrazione e successivamente purificato mediante cromatografia su colonna con
eluente CH2Cl2, ottenendo la 3,6,8,-tribromo-4-clorometil-7-idrossicumarina
(0.58 g, resa 92%), con p.f. 215°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.21
(s, 1 H, 5-H)
5.08
(s, 2 H, -CH2Cl)
13
C-NMR (DMSO-d6)
155.98, 154.70, 149.69, 147.61, 127.90, 112.12, 108.10, 99.72, 60.80.
HRMS (ESI-TOF) per C10H3Br3ClO3 (M- –1)
(M-) –1
442.7326 (calcolato)
442.7413 (trovato)
-
(M +2) –1
444.7305 (calcolato)
444.7365 (trovato)
(M- +4) –1
446.7284 (calcolato)
446.7321 (trovato)
(M- +6) –1
448.7262 (calcolato)
448.7325 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 26.85%, H 0.90%, Br 53.59%, Cl 7.93%
Trovato: C 26.87%, H 0.92%, Br 53.55%, Cl 7.90%
183
Sintesi di bromoderivati della 4-idrossimetil-7-idrossicumarina
Sintesi di 8-bromo-7-idrossi-4-idrossimetilcumarina
CH2Cl
HO
O
CH2OH
O
HO
O
Br
O
Br
Una sospensione di 8-bromo-4-clorometil-7-idrossicumarina (0.10 g, 0.35 mmoli)
in acqua (20 ml) è stata irradiata per 15 minuti a 100 W, mantenendo la
temperatura a 150°C (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). Il solido indisciolto cristallino è
stato
separato
per
filtrazione,
ottenendo
la
8-bromo-7-idrossi-4-
idrossimetilcumarina (94 mg, resa quantitativa), con p.f. >300.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.32 (s all., 1 H, -OH)
7.54
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
6.95
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
6.30
(s, 1 H, 3-H)
5.64
(s all., 1 H, -CH2OH)
4.71
(s, 2 H, -CH2OH)
13
C-NMR (DMSO-d6)
160.07, 158.01, 157.00, 151.59, 124.09, 112.49, 110.66, 106.99, 97.05, 59.11.
HRMS (ESI-TOF) per C10H6BrO4 (M- –1)
(M-) –1
268.9455 (calcolato)
268.9483 (trovato)
(M- +2) –1
270.9436 (calcolato)
270.9458 (trovato)
184
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 44.31%, H 2.60%, Br 29.48%
Trovato: C 44.34%, H 2.63%, Br 29.47%
185
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-idrossimetilcumarina
CH2Br
CH2OH
Br
HO
O
Br
O
HO
Br
O
O
Br
Una sospensione di 3,8-dibromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (50 mg, 0.12
mmoli) in acqua (30 ml) è stata irradiata per 15 minuti a 100 W, mantenendo la
temperatura a 150°C (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). Il solido indisciolto cristallino è
stato
separato
per
filtrazione,
ottenendo
la
3,8-dibromo-7-idrossi-4-
idrossimetilcumarina (42 mg, resa quantitativa), con p.f. 219°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.49 (s all., 1 H, 7-OH)
7.87
(d, J=8.9, 1 H, 5-H)
7.02
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
5.74
(s, 1 H, -CH2-OH)
4.82
(s, 2 H, -CH2-OH)
13
C-NMR (DMSO-d6)
158.50, 157.16, 152.40, 150.50, 126.86, 113.37, 112.27, 108.64, 96.98, 60.91.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2O4 (M- –1)
(M-) –1
346.8560 (calcolato)
346.8565 (trovato)
-
(M +2) –1
348.8540 (calcolato)
348.8576 (trovato)
(M- +4) –1
350.8521 (calcolato)
350.8530 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 34.32%, H 1.73%, Br 45.66%
Trovato: C 34.33%, H 1.75%, Br 45.69%
186
Sintesi di 6,8-dibromo-7-idrossi-4-idrossimetilcumarina
CH2Cl
CH2OH
Br
Br
HO
O
O
HO
Br
O
O
Br
Una sospensione di 6,8-dibromo-4-clorometil-7-idrossicumarina (0.50 ml, 1.4
mmoli) in acqua (40 ml) è stata irradiata per 15 minuti a 100W, mantenendo la
temperatura a 150°C (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). Il solido indisciolto è stato
separato
per
filtrazione,
ottenendo
la
6,8-dibromo-7-idrossi-4-
idrossimetilcumarina (0.49 g, resa quantitativa) con p.f. 222°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
7.92
(s, 1 H, 5-H)
6,46
(t, J=1.5, 1 H, 3-H)
4.92
(d, J=1,5, 2 H, -CH2-OH)
13
C-NMR (DMSO-d6)
158.24, 155.18, 149.85, 146.34, 124.81, 113.60, 111.01, 109.67, 96.84, 60.93.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2O4 (M- –1)
(M-) –1
346.8560 (calcolato)
346.8521 (trovato)
(M- +2) –1
348.8540 (calcolato)
348.8596 (trovato)
(M- +4) -–1
350.8521 (calcolato)
350.8548 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 34.32%, H 1.73%, Br 45.66%
Trovato: C 34.30%, H 1.72%, Br 45.62%
187
Sintesi di 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-idrossimetilcumarina
CH2Br
Br
HO
O
CH2OH
Br
Br
O
HO
Br
Br
O
O
Br
Una sospensione di 3,6,8-tribromo-4-bromometil-7-idrossicumarina (0.15 g, 0.30
mmoli) in acqua (40 ml) è stata irradiata per 15 minuti a 100 W, mantenendo la
temperatura a 150°C (TLC: CHCl3/MeOH, 95/5). Il solido indisciolto ottenuto è
stato
separato
per
filtrazione,
ottenendo
la
3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-
idrossimetilcumarina (0.13 g, resa quantitativa), con p.f. 226°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.20
(s, 1 H, 5-H)
4.82
(s, 2 H, -CH2-OH)
13
C-NMR (DMSO-d6)
156.21, 154.51, 150.89, 149.45, 128.99, 113.58, 109.61, 107.55, 99.30, 60.84.
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br3O4 (M- –1)
(M-) –1
424.7665 (calcolato)
424.7745 (trovato)
(M- +2) –1
426.7645 (calcolato)
426.7706 (trovato)
(M- +4) –1
428.7625 (calcolato)
428.7693 (trovato)
(M- +6) –1
430.7607 (calcolato)
430.7685 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 28.01%, H 1.18%, Br 55.90%
Trovato: C 28.03%, H 1.19%, Br 55.87%
188
Sintesi di bromoderivati della 7-idrossi-4-metossicumarina
Sintesi di 7-idrossi-4-metossicumarina
OH
HO
O
OCH3
O
HO
O
O
Una soluzione di 4,7-diidrossicumarina (1.0 g, 5.6 mmoli), in MeOH (56 ml) e
H2SO4 concentrato (5.6 ml) è stata posta a riflusso per 3 ore fino a scomparsa del
prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 80/20). Dopo raffreddamento si è
formato nella miscela di reazione un precipitato che è stato separato per filtrazione
e lavato abbondantemente con acqua, ottenendo la 7-idrossi-4-metossicumarina
(0.65 g, resa 60%), con p.f. 259°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
10.56 (s all., 1 H, -OH)
7.61
(d, J=8.7, 1 H, 5-H)
6.79
(dd, J=8.7, J=2.4, 1 H, 6-H)
6.69
(d, J=2.4, 1 H, 8-H)
5.67
(s, 1 H, 3-H)
3.96
(s, 3 H, -OCH3)
189
Sintesi di 8-bromo-7-idrossi-4-metossicumarina
OCH3
HO
O
OCH3
O
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 7-idrossi-4-metossicumarina (0.30 g, 1.6 mmoli) in AcOH
glaciale (130 ml), termostatata a 60°C, è stata aggiunta una soluzione di Br2 (0.12
ml, 2.3 mmoli) diluito in AcOH (50 ml) e la soluzione è stata mantenuta a questa
temperatura per 2 ore fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). Dopo raffreddamento la miscela di reazione, versata in
acqua e neutralizzata con NaHCO3, è stata estratta a fondo con EtOAc. La fase
organica è stata quindi anidrificata con Na2SO4 anidro e concentrata a secchezza.
Il residuo solido è stato cristallizzato da EtOAc, ottenendo la 8-bromo-7-idrossi4-metossicumarina (73 mg, resa 19%), con p.f. 259°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
7.69
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
7.02
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
5.66
(s, 1 H, 3-H)
4.07
(s, 3 H, -OCH3)
13
C-NMR (Acetone-d6)
163.38, 159.21, 157.60, 149.82, 124.13, 113.71, 111.08, 97.81, 95.23, 61.34.
HRMS (ESI-TOF) per C10H6BrO4 (M- –1)
(M-) –1
268.9455 (calcolato)
268.9487 (trovato)
(M- +2) –1
270.9436 (calcolato)
270.9462 (trovato)
190
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 44.31%, H 2.60%, Br 29.48%
Trovato: C 44.33%, H 2.63%, Br 29.45%
191
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-metossicumarina
OCH3
OCH3
Br
HO
O
O
HO
O
O
Br
METODO A
Ad una soluzione di 7-idrossi-4-metossicumarina (0.20 g, 1.0 mmoli) in AcOH
glaciale (70 ml), termostatata a 60°C, è stato aggiunto Br2 (0.10 ml, 2.0 mmoli)
diluito in AcOH (20 ml). Dopo 2 ore a scomparsa del prodotto di partenza (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10) la miscela di reazione è stata fatta raffreddare, quindi
versata in acqua e neutralizzata con NaHCO3. La miscela di reazione è stata
estratta a fondo con EtOAc e la fase organica, anidrificata con Na2SO4, è stata
concentrata a secchezza, ottenendo una complessa miscela di prodotti. La reazione
è stata abbandonata.
METODO B
Ad una soluzione di 7-idrossi-4-metossicumarina (0.50 g, 2.6 mmoli) in AcOH
glaciale (150 ml) è stata aggiunta una soluzione di Br2 (0.27 ml, 5.2 mmoli) in
AcOH (60 ml) e la soluzione è stata mantenuta a temperatura ambiente per 2 ore
fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La
miscela di reazione è stata versata in acqua, neutralizzata con NaHCO3 ed estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata andrificata con Na2SO4 e concentrata
a secchezza ed il residuo solido è stato purificato mediante cromatografia su
colonna
con
eluente
CH2Cl2,
ottenendo
la
metossicumarina (0.21 g, resa 23%), con p.f. 222°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.58 (s all., 1 H, -OH)
7.67
(d, J=8.8, 1 H, 5-H)
7.02
(d, J=8.8, 1 H, 6-H)
192
3,8
dibromo-7-idrossi-4-
4.11
(s, 3 H, -OCH3)
13
C-NMR (DMSO-d6)
165.53, 159.09, 158.64, 150.58, 123.61, 113.13, 110.13, 96.88, 95.02, 62.07.
HRMS (ESI-TOF) per C10H5Br2O4 (M- –1)
(M-) –1
346.8560 (calcolato)
346.8635 (trovato)
-
(M +2) –1
348.8540 (calcolato)
348.8594 (trovato)
(M- +4) –1
350.8521 (calcolato)
350.8571 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 34.32%, H 1.73%, Br 45.66%
Trovato: C 34.31%, H 1.75%, Br 45.68%
193
Sintesi di 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-metossicumarina
OCH3
OCH3
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
Una miscela di 7-idrossi-4-metossicumarina (0.20 g, 1.0 mmoli) ed NBS (0.73 g,
4.1 mmoli) solubilizzata in CH3CN (200 ml) è stata mantenuta a temperatura
ambiente per 1 ora (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata
concentrata a secchezza ed il residuo solido è stato cristallizzato da DCE,
ottenendo la 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-metossicumarina (0.40 g, resa 88%),
con p.f. 227°C.
1
H-NMR (Acetone-d6)
8.03
(s, 1 H, 5-H)
4.28
(s, 3 H, -OCH3)
13
C-NMR (Acetone-d6)
166.13, 159.75, 156.89, 151.75, 127.76, 113.80, 108.63, 100.32, 97.69, 63.57.
HRMS (ESI-TOF) per C10H4Br3O4 (M- –1)
(M-) –1
424.7665 (calcolato)
424.7774 (trovato)
(M- +2) –1
426.7645 (calcolato)
426.7725 (trovato)
(M- +4) –1
428.7625 (calcolato)
428.7714 (trovato)
430.7607 (calcolato)
430.7705 (trovato)
-
(M +6) –1
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 28.01%, H 1.18%, Br 55.90%
Trovato: C 28.03%, H 1.20%, Br 55.91%
194
Sintesi di bromoderivati della 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
Sintesi di 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
HO
OH
HO
O
O
Una soluzione di resorcina (4.0 g, 36.3 mmoli) in etile trifluorometilacetoacetato
(6.4 ml, 43.59 mmoli) e TFA (10 ml) è stata posta a riflusso per 3 ore (TLC:
CHCl3\MeOH, 90\10). Dopo raffreddamento la miscela di reazione è stata versata
in acqua (100 ml) con formazione di un precipitato che è stato separato per
filtrazione, solubilizzato a caldo in MeOH e fatto precipitare in forma cristallina
per lenta aggiunta d’acqua, ottenendo la 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (4.8
g, resa 56%), con p.f. 180°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
10.98 (s, 1 H, -OH)
7.54
(dq, J=9.0, J=1.9, 1 H, 5-H)
6.89
(dd, J=9.0, J=2.4, 1 H, 6-H)
6.82
(d, J =2.4, 1 H, 8-H)
6.73
(s, 1 H, 3-H)
195
Sintesi di 8-bromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
HO
O
CF3
O
HO
O
O
Br
Ad una soluzione di 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.50 g, 2.2 mmoli) in
AcOH glaciale (50 ml) è stata aggiunta una soluzione di Br2 (0.16 ml, 3.3 mmoli)
in AcOH (60 ml) e la soluzione è stata mantenuta a temperatura ambiente per 2
ore fino a scomparsa del prodotto di partenza (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La
miscela di reazione è stata versata in acqua, neutralizzata con NaHCO3 ed estratta
a fondo con EtOAc. La fase organica è stata andrificata con Na2SO4, concentrata a
secchezza, ed il residuo solido è stato purificato mediante cromatografia su
colonna
con
eluente
CHCl3,
ottenendo
la
8-bromo-7-idrossi-4-
trifluorometilcumarina (0.20 g, resa 30%), con p.f. 214°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
11.75 (s, 1 H, -OH)
7.57
(dq, J=8.9, J=1.9, 1 H, 5-H)
7.08
(d, J=8.9, 1 H, 6-H)
6.85
(s, 1 H, 3-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
159.03, 158.20, 152.46, 139.40 (q, J=32.1), 124.55, 121.54 (q, J=275.6), 113.27,
112.69 (q, J=5.7), 106.36, 97.69.
HRMS (ESI-TOF) per C10H3BrF3O3 (M- –1)
(M-) –1
306.9223 (calcolato)
306.9229 (trovato)
(M- +2) –1
308.9204 (calcolato)
308.9233 (trovato)
196
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 38.87%, H 1.30%, Br 25.86%, F 18.44%
Trovato: C 38.90%, H 1.34%, Br 25.88%, F 18.48%
197
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
Br
HO
O
O
HO
O
O
Br
CF3
Br
HO
O
O
Br
La 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.3 g, 1.3 mmoli) è stata solubilizzata in
AcOH glaciale (20 ml) ed alla soluzione è stata aggiunta, a piccole porzioni, alla
temperatura di 60°C, una soluzione contenente bromo (0.35 ml, 4.2 mmoli) in
AcOH glaciale. La miscela di reazione è stata lasciata per 1 ora a 60°C (TLC:
CHCl3\MeOH, 90\10). La miscela di reazione è stata versata in acqua (50 ml) ed il
precipitato formatosi è stato raccolto per filtrazione ed il solido ottenuto è stato
sciolto a caldo in EtOAc e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta
di CE, ottenendo la 6,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.28 g,
resa 55%), con p.f. 216°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.72
(q, J=1.5, 1 H, 5-H)
6.94
(s, 1 H, 3-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
157.76, 155.23, 151.57, 138.13 (q, J=138.13), 126.26, 121.34 (q, J=275.61),
114.64, 107.80, 107.85, 100.42.
198
HRMS (ESI-TOF) per C10H2Br2F3O3 (M- –1)
(M-) –1
384.8323 (calcolato)
384.8297 (trovato)
(M-+2) –1
386.8302 (calcolato)
386.8382 (trovato)
(M-+4) –1
388.8282 (calcolato)
386.8400 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 30.96%, H 0.78%, Br 41.19%, F 12.80%
Trovato: C 40.01%, H 0.76%, Br 41.23%, F 12.75%
199
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina da 8bromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
Br
HO
O
O
HO
O
O
Br
Br
CF3
Br
HO
O
O
Br
La 8-bromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.30 g, 0.97 mmoli) è stata
solubilizzata in CH3CN (30 ml) ed alla soluzione è stata aggiunta, goccia a goccia,
a temperatura ambiente, una soluzione contenente bromo (0.05 ml, 0.97 mmoli) in
CH3CN. La miscela di reazione è stata lasciata per 1 ora a temperatura ambiente
(TLC: CHCl3\MeOH, 90\10). La miscela di reazione, concentrata a secchezza, è
stata ripresa con acqua (50 ml) ed estratta con EtOAc. La fase organica è stata
andrificata con Na2SO4, concentrata a secchezza, ed il residuo solido è stato
sciolto a caldo in EtOAc e fatto precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta
di CE, ottenendo la 6,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.24 g,
resa 77%).
200
Sintesi di 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
Br
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
Una miscela di 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.51 g, 2.2 mmoli) ed NBS
(1.2 g, 6.6 mmoli) solubilizzata in CH3CN (200 ml) è stata posta a riflusso per 2
ore (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata concentrata a
secchezza, ripresa con acqua ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica,
anidrificata con Na2SO4, è stata concentrata a secchezza ed il residuo solido è
stato
cristallizzato
da
DCE,
ottenendo
la
3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-
trifluorometilcumarina (0.86 g, resa 83%), con p.f. 185°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.81
(q, J=1.8, 1 H, 5-H)
13
C-NMR (DMSO-d6)
164.85, 156.40, 155.70, 153.45, 141.27, 114.77, 109.86, 108.60, 102.51, 100.59.
HRMS (ESI-TOF) per C10HBr3F3O3 (M- –1)
(M-) –1
462.7433 (calcolato)
462.7489 (trovato)
(M-+2) –1
464.7413 (calcolato)
464.7489 (trovato)
(M +4) –1
466.7393 (calcolato)
466.7403 (trovato)
(M-+6) –1
468.7375 (calcolato)
468.7420 (trovato)
-
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 25.73%, H 0.43%, Br 51.35%, F 12.21%
Trovato: C 25.71%, H 0.44%, Br 51.32%, F 12.18%
201
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina da 3,6,8tribromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
Br
CF3
Br
HO
O
Br
O
HO
O
O
Br
Br
CF3
Br
HO
O
O
Br
Una sospensione di 3,6,8-tribromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.40 g,
0.86 mmoli) in acqua (20 ml) e MeOH (30 ml) è stata aggiunta di una soluzione di
Na2SO3 (11 mg, 0.86 mmoli), NaOH (4 mg, 0.86 mmoli) in acqua (5 ml) e
mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 30 minuti (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La miscela di reazione è stata quindi acidificata con HCl
4M, ottenendo la formazione di un precipitato che è stato separato per filtrazione,
ottenendo la 6,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.34 g, resa
quantitativa).
202
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina da 2bromoresorcinolo
Sintesi di 2,4,6-tribromoresorcinolo
HO
OH
Br
Br
HO
OH
Br
Una soluzione di resorcina (6.0 g, 54.5 mmoli) Br2 (8.4 ml, 163.5 mmoli) in
AcOH (100 ml) è stata termosatata a 60 °C per 4 ore (TLC: CE/EtOAc, 50/50).
Per raffreddamento si è ottenuto un precipitato che è stato separato per filtrazione
e lavato abbondantemente con acqua, ottenendo il 2,4,6-tribromoresorcinolo
(13.5 g, resa 71%) con p.f. 111°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
9.98
(s all., 2 H, -OH)
7.68
(s, 1 H, 5-H)
203
Sintesi di 2-bromoresorcinolo
Br
Br
HO
OH
HO
Br
OH
Br
Ad una soluzione di NaOH (2.8 g, 69.2 mmoli) e Na2SO3 (8.7 g, 69.2 mmoli) in
acqua (125 ml) e MeOH (25 ml) è stato addizionato il 2,4,6-tribromoresorcinolo
(12 g, 34.6 mmoli). La miscela di reazione è stata mantenuta a temperatura
ambiente per 15 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10) e successivamente è stata
acidificata con HCl 4M. Dalla soluzione è stato rimosso per evaporazione il
MeOH e la fase acquosa è stata estratta a fondo cone dietil etere. La fase organica,
anidrificata con Na2SO4, è stata concentrata a secchezza ed il residuo solido è
stato cristallizzato da CHCl3, ottenendo il 2-bromoresorcinolo (12.0 g, resa
92%), con p.f. 102°C.
1
H-NMR (CDCl3)
7.11
(d, J=8.2, 1 H, 5-H)
6.60
(d, J=8.2, 2 H, 4-H e 6-H)
5.42
(s, 2 H, -OH)
204
Sintesi di etile 2-bromotrifluoroacetacetato
O
F3C
O
O
O
O
F3C
O
Br
Una sospensione di NaH (0.26 g, 11 mmoli) in THF è stata termostatata a 0°C ed
aggiunta lentamente di trifluoroacetoacetato d’etile (2.0 g, 10.9 mmoli). Al
termine dell’aggiunta la miscela di reazione è stata portata a temperatura ambiente
ed aggiunta di una soluzione di Br2 (0.56 ml, 10.86 mmoli) in CH2Cl2 (20 ml) e
lasciata a tale temperatura per 3 ore (TLC: CHCl3/MeOH, 85/15). La miscela di
reazione è stata filtrata su gel di silice e successivamente concentrata per
evaporazione, ottenendo l’ etile 2-bromotrifluoroacetacetato (2.7 g, resa 94%).
1
H-NMR (CDCl3)
4.54
(s, 1 H, H-2)
4.31
(q, J=7.1, 2 H, -CH2CH3)
1.32
(t, J=7.1, 3 H, -CH2CH3)
HRMS (ESI-TOF) per C6H5BrF3O3 (M- –1)
(M-) –1
260.9380 (calcolato)
260.9387 (trovato)
(M-+2) –1
262.9360 (calcolato)
262.9358 (trovato)
205
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
Br
HO
OH
HO
Br
O
O
Br
METODO A
Una
soluzione
di
2-bromoresorcinolo
(0.4
g,
2.1
mmoli),
etile
2-
bromotrifluoroacetacetato (0.6 g, 2.2 mmoli) in H2SO4 conc. (10 ml) è stata
lasciata overnight a temperatura ambiente e successivamente la temperatura è
stata incrementata di 10°C ogni 30 minuti fino a raggiungere i 95°C (TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La reazione è stata abbandonata in quanto nella miscela di
reazione si è osservata la sola presenza dei reattivi di partenza.
METODO B
Una
soluzione
di
2-bromoresorcinolo
(0.4
g,
2.1
mmoli),
etile
2-
bromotrifluoroacetacetato (0.6 g, 2.2 mmoli) in H2SO4 conc. (10 ml) è stata
irradiata con microonde a 100 W, raggiungendo la temperatura di 80°C in 1
minuto. Tale temperatura è stata mantenuta, fornendo microonde con
contemporaneo raffreddamento, per 10 minuti (TLC: CHCl3/MeOH, 90/10). La
reazione è stata abbandonata in quanto nella miscela di reazione si è osservata la
sola presenza dei reattivi di partenza.
METODO C
Una
soluzione
di
2-bromoresorcinolo
(0.4
g,
2.1
mmoli),
etile
2-
bromotrifluoroacetacetato (0.6 g, 2.2 mmoli) in H2SO4 conc. (10 ml) ed EtOH
assoluto (20 ml) è stata irradiata con microonde a 150 W, raggiungendo la
temperatura di 130°C in 2 minuti. Tale temperatura è stata mantenuta, fornendo
microonde
con
contemporaneo
raffreddamento,
per
10
minuti
(TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La reazione è stata abbandonata in quanto nella miscela di
reazione si è osservata la sola presenza dei reattivi di partenza.
206
METODO D
Una sospensione di 2-bromoresorcinolo (0.4 g, 2.1 mmoli), etile 2bromotrifluoroacetacetato (0.6 g, 2.2 mmoli) e ZnCl2 anidro (0.84 g, 6.2 mmoli)
in EtOH assoluto (20 ml) è stata irradiata con microonde a 150 W, raggiungendo
la temperatura di 130°C in 2 minuti. Tale temperatura è stata mantenuta, fornendo
microonde
con
contemporaneo
raffreddamento,
per
20
minuti
(TLC:
CHCl3/MeOH, 90/10). La reazione è stata abbandonata in quanto nella miscela di
reazione si è osservata la sola presenza dei reattivi di partenza.
207
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina da 7idrossi-4-trifluorometilcumarine 6 sostituite
Sintesi di 7-idrossi-6-iodo-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
I
HO
O
O
HO
O
O
Una soluzione di 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.50 g, 2.17 mmoli) in
NH4OH 20% (40 ml) è stata aggiunta di I2 (0.27 g, 1.09 mmoli) solubilizzato in
una soluzione acquosa 10% di KI (30 ml). La miscela di reazione è stata
mantenuta a temperatura ambiente per 1 ora (TLC: EtOc) ed è stata quindi
acidificata con HCl 4M ottenendo la formazione di un precipitato che è stato
raccolto per filtrazione e lavato con acqua, ottenendo la 7-idrossi-6-iodo-4trifluorometilcumarina (0.33 g, resa 43%), con p.f. 156°C.
1
H-NMR (CDCl3)
8.01
(q, J=1.6, 1 H, H-5)
7.02
(s, 1 H, H-8)
6.64
(s, 1 H, H-3)
HRMS (ESI-TOF) per C10H3IF3O3 (M- –1)
(M-) –1
354.9072 (calcolato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 33.73%, H 1.13%, I 35.64%, F 16.01%
Trovato: C 33.71%, H 1.14%, I 35.60%, F 16.02%
208
354.8960 (trovato)
Tentativo di sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-6-iodo-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
I
I
HO
O
O
Br
HO
O
O
Br
CF3
Br
HO
O
O
Br
Una soluzione di 7-idrossi-6-iodo-4-trifluorometilcumarina (0.20 g, 0.56 mmoli)
in AcOH (25 ml) è stata mantenuta a temperatura ambiente ed addizionata, goccia
a goccia, di una soluzione di Br2 (0.06 ml, 1.2 mmoli). Al termine dell’aggiunta
(TLC: EtOAc) la miscela di reazione è stata versata in acqua (60 ml) ed il
precipitato formatosi è stato separato per filtrazione e lavato abbondantemente con
acqua, ottenendo la 6,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (0.18 g,
resa 83%).
209
Sintesi
di
7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina
e
7-idrossi-8-nitro-4-
trifluorometilcumarina
CF3
CF3
CF3
O2N
+
HO
O
O
HO
O
O
HO
O
O
NO2
Una soluzione di 7-idrossi-4-trifluorometilcumarina (4.0 g, 17.4 mmoli) in H2SO4
conc. (70 ml) è stata termostata a 0°C ed aggiunta, goccia a goccia, di una
soluzione di HNO3 65% (1.0 ml) in 6 ml di H2SO4 conc. mantenendo la
temperatura della miscela di reazione a 0°C.
Al termine dell’aggiunta la miscela di reazione è stata versata in acqua (200 ml)
ed il precipitato formatosi è stato separato per filtrazione e purificato mediante
cromatografia su colonna con eluente EtOAc/CE 80/20, eluendo dapprima la 7idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina che è stata cristallizzata da MeOH (1.9
g, resa 40%), con p.f. 181°C, e successivamente la 7-idrossi-8-nitro-4trifluorometilcumarina che è stata solubilizzata a caldo in MeOH e fatta
precipitare in forma cristallina per lenta aggiunta di CE (1.5 g, resa 31%), con p.f.
208°C.
1
H-NMR (DMSO-d6) di 7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina
8.15
(q, J=1.6, 1 H, 5-H)
8.48
(s, 1 H, 8-H)
7.08
(s, 1 H, 3-H)
HRMS
(ESI-TOF)
per
C10H3F3NO5
(M-
–1)
di
7-idrossi-6-nitro-4-
trifluorometilcumarina
(M-) –1
273.9963 (calcolato)
210
273.9921 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE di 7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina
Teorico: C 43.65%, H 1.47%, F 20.72%, N 5.09%
Trovato: C 43.63%, H 1.43%, F 20.75%, N 5.06%
1
H-NMR (DMSO-d6) di 7-idrossi-8-nitro-4-trifluorometilcumarina
7.73
(dq, J=9.0, J=1.6, 1 H, 5-H)
7.10
(d, J=9.0, 1 H, 6-H)
67.03 (s, 1 H, 3-H)
HRMS
(ESI-TOF)
per
C10H3F3NO5
(M-
–1)
di
7-idrossi-8-nitro-4-
trifluorometilcumarina
(M-) –1
273.9963 (calcolato)
274.0058 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE di 7-idrossi-8-nitro-4-trifluorometilcumarina
Teorico: C 43.65%, H 1.47%, F 20.72%, N 5.09%
Trovato: C 43.62%, H 1.49%, F 20.74%, N 5.11%
211
Sintesi di 3,8-dibromo-7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
O2N
HO
O2N
O
O
Br
HO
O
O
Br
Una soluzione di 7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina (0.40 g, 1.5 mmoli)
Br2 (0.22 ml, 4.2 mmoli) in AcOH (15 ml) è stata termosatata a 60 °C per 1 ore
(TLC: CE/EtOAc, 50/50). Dopo raffreddamento la miscela di reazione è stata
versata in acqua (100 ml) ed il precipitato formatosi è stato separato per filtrazione
e lavato abbondantemente con acqua, ottenendo la 3,8-dibromo-7-idrossi-6nitro-4-trifluorometilcumarina (0.44 g, resa 94%) con p.f. 178°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
8.28
(q, J=1.4, 1 H, 5-H)
HRMS (ESI-TOF) per C10HBr2F3NO5 (M- –1)
(M-) –1
429.8174 (calcolato)
429.8102 (trovato)
-
(M +2) –1
431.8153 (calcolato)
431.7984 (trovato)
(M-+4) –1
433.8133 (calcolato)
433.8189 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 27.74%, H 0.47%, Br 36.91, F 13.17%, N 3.24%
Trovato: C 27.73%, H 0.47%, Br 36.93, F 13.15%, N 3.22%
212
Tentativo di sintesi di 6-amino-3,8-dibromo-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina
CF3
O2N
HO
O
CF3
Br
H2N
O
HO
Br
Br
O
O
Br
METODO A
Una soluzione di 3,8-dibromo-7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina (0.20 g,
0.62 mmoli), SnCl2 (0.28 g, 1.3 mmoli), in EtOH (15 ml) è stata posta a riflusso
per 1 ora (TLC: CHCl3/MeOH, 80/20). La miscela di reazione è stata concentrata
a secchezza e versata in acqua (50 ml). La soluzione è stata alcalinizzata con
NaHCO3 ed estratta a fondo con EtOAc. La fase organica , anidrificata con
Na2SO4, è stata concentrata a secchezza ed il residuo solido da spettroscopia 1HNMR è risultato essere una miscela complessa di prodotti per cui la reazione è
stata abbandonata.
METODO B
Una miscela di 3,8-dibromo-7-idrossi-6-nitro-4-trifluorometilcumarina (0.20 g,
0.62 mmoli), Na2S2O4 (0.11 g, 0.62 mmoli) solubilizzato in una soluzione acquosa
di NH4OH al 10%, e MeOH (30 ml) è stata posta a riflusso per 1 ora (TLC:
CHCl3/MeOH, 80/20). Nella miscela di reazione, diluita con acqua (100 ml), per
raffreddamento si è ottenuto un precipitato che è stato separato per filtrazione
ottenendo la 6-amino-7-idrossi-4-trifluorometilcumarina in miscela con il
prodotto di partenza.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.51
(s all., 1 H, 5-H)
6.97
(s, 1 H, 8-H)
6.85
(s, 1 H, 3-H)
213
HRMS (ESI-TOF) per C10H7F3NO3 (M+ +1)
(M+) +1
246.0378 (calcolato)
246.0415 (trovato)
METODO C
Una sospensione di Pd/C (10 mg) in EtOH assoluto è stata saturata in flusso di H2.
Alla sosospensione è stata aggiunta una soluzione di 3,8-dibromo-7-idrossi-6nitro-4-trifluorometilcumarina (0.20 g, 0.62 mmoli) in EtOH assoluto. Al termine
dell’aggiunta (TLC: CHCl3/MeOH, 80/20) la miscela di reazione è stata filtrata e
concentrata a secchezza, ottenendo con resa quantitativa la 6-amino-7-idrossi-4trifluorometilcumarina.
214
Tentativo di sintesi di 3-bromo-7-idrossi-8-nitro-4-trifluorometilcumarina
CF3
CF3
Br
HO
O
O
HO
O
O
NO2
NO2
CF3
Br
HO
O
O
NO2
Una soluzione di 7-idrossi-8-nitro-4-trifluorometilcumarina (0.50 g, 1.8 mmoli) in
AcOH (25 ml) è stata addizionata di una soluzione di Br2 (0.09 ml, 1.8 mmoli) in
AcOH (3 ml) e termostatata a 50°C per 2 ore (TLC: CHCl3/MeOH, 80/20). Dopo
raffreddamento la miscela di reazione è stata versata in acqua (120 ml) ed il
precipitato formatosi è stato separato per filtrazione, lavato abbondantemente con
acqua, e cristallizzato da MeOH, ottenendo il 6-bromo-7-idrossi-8-nitro-4trifluorometilcumarina (0.40 g, resa 62%) con p.f. 172°C.
1
H-NMR (DMSO-d6)
7.69
(q, J=1.7, 1 H, 5-H)
6.64
(s, 1 H, 3-H)
HRMS (ESI-TOF) per C10H2BrF3NO5 (M- –1)
(M-) –1
351.9064 (calcolato)
351.9011 (trovato)
(M-+2) –1
353.9044 (calcolato)
353.8988 (trovato)
ANALISI ELEMENTARE
Teorico: C 33.93%, H 0.85%, Br 22.57, F 16.10%, N 3.96%
Trovato: C 33.95%, H 0.86%, Br 22.59, F 16.07%, N 3.97%
215
216
7.
BIBLIOGAFIA
1.
J.L. Nitiss, Biochimica et Biophysica Acta, 1400, 63-81 (1998).
2.
J.C. Wang, Annu. Rev. Biochem., 65, 635-692 (1996).
3.
L. Stewart, M.R. Redinbo, X. Qui, W.G.J. Hol, J.J. Champoux, Science,
279, 1535-1540 (1998).
4.
J.M. Berger, S.J. Gamblin, S.C. Harrison, J.C. Wang, Nature, 379, 225-232
(1996).
5.
J.L. Nitiss, W.T. Beck, Eur. J. Cancer, 32A, 958-966 (1996).
6.
Z. Topcu, J. Clin. Pharm. Therap., 26, 405-416 (2001).
7.
S. Moro , G.L. Beretta , D. Dal Ben , J. Nitiss , M. Palumbo, G. Capranico,
Biochemistry, 43, 7503-7513 (2004).
8.
F. Meggio, M.A. Pagano, S. Moro, G. Zagotto, M. Ruzzene, S. Sarno, G.
Cozza, J. Bain, M. Elliott, A. A.D. Deana, A.M. Brunati and L. Pinna,
Biochem., 43, 12931-12936 (2004).
9.
D.W. Litchfield, Biochem J., 369, 1-15 (2003).
10.
S. Sarno, S. Moro, F. Meggio, G. Zagotto, D. Dal Ben, P. Ghibellini, R.
Battistutta, G. Zanotti, L.A. Pinna, Pharmacol. Ther., 93, 159-168 (2002).
11.
K. Ahmed, D.A. Gerber, C. Cochet, Trends in Cell Biology, 12, (2002).
12.
G. Unger, A. Davis, J.W. Slaton, K. Ahmed, Curr. Cancer Drug Targets, 4,
77-84 (2004).
13.
a) K. Bojanowski, O. Filhol, C. Cochet, E.M. Chambaz, A.K. Larsen, J.
Biol. Chem., 268, 30, 22920-22926 (2003), b) N.J. Wells, C.M. Addison,
A.M. Fry, R. Ganapathi, I.D.Hickson, J. Biol. Chem., 269, 47, 29746-29751
(1994).
14.
H. Yim, Y.H. Lee, C.H. Lee, S.K. Lee, Planta Med., 65, 9-13 (1999).
15.
S. Sarno, H. Reddy, F. Meggio, M. Ruzzene, S.P. Davies, A. DonellaDeana, D. Shugar, L.A. Pinna, FEBS Letters, 496, 44-48 (2001).
16.
R. Battistutta, E. De Moliner, S. Sarno, G. Zanotti, L.A. Pinna, Protein Sci.,
10, 2200-2206 (2001).
217
17.
a) C.O.Kappe, Angew. Chem. Int. Ed., 43, 6250-6284 (2004), b) C.O.Kappe,
A. Stadler, Microwaves in Organic and Medicinal Chemistry, 2005, c) B.
Wathey, J. thierney, P. Lindstrom, J. Westman, Drug discovery Today, 7,
373-380 (2002).
18.
S.T. Brennan, N.L. Colbry, R.L. Leeds, B. Leja, S.R. Priebe, M.D. Reilj,
H.D. Hollis Showalter, S.E. Uhlenford, J. Heterocyclic Chem., 26, 14691476 (1989).
19.
a) A. Chilin, G. Marzaro, S. Zanatta, V. Barbieri, G. Pastorini, P. Manzini,
A. Guiotto, Tetrahedron, 62, 12351-12356 (2006). b) G. Marzaro, A. Chilin,
G. Pastorini, A. Guiotto, Org. Lett., 8, 255-256 (2006).
20.
V. Barbieri, Tesi di Dottorato in Scienze Farmaceutiche, Università degli
Studi di Padova (2006).
21.
A. Chilin, P. Rodighiero, G. Pastorini, G. Pastorini, A. Guiotto, Org. Chem.,
56, 3, 980-983 (1991).
22.
Adriana Chilin, Roberto Battistutta, Andrea Bortolato, Giorgio Cozza,
Samuele Zanatta, Giorgia Poletto, Giuseppe Zagotto, Eugenio Uriarte,
Adriano Guiotto, Lorenzo A. Pinna, Flavio Meggio and Stefano Moro, J.
Med. Chem, accepted (2007).
23.
G. Zagotto, O. Gia, F. Baccichetti, E. Uriarte, M. Palumbo, Photochem.
Photobiol., 58, 4, 486-491 (1993).
24.
Y. Takeuchi, L. Xie. L.M. Casentino, K.H. Lie, Bioorg. Med. Chem. Lett., 7,
20, 2573-2578 (1997).
25.
U. Luning, M. Abbass, F. Fahrenkrug, Eur. J. Org. Chem., 19, 3294-3303
(2002).
26.
D.T. Vistica, P. Skehan, D.A. Scudiero, A. Monks, A. Pittman, M.R. Boyd,
Cancer Res., 51, 2515 (1991).
218