CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI POLIMORFISMI GENETICI SUL GENE
DELLA COAGULASE E SCREENING PER LA PRESENZA DEL GENE PER LA
RESISTENZA ALLA METICILLINA DI ISOLATI DI STAPHILOCOCCUS AUREUS DA
LATTE OVINO DI MASSA.
MOLECULAR CHARACTERIZATION ON COAGULASE GENE AND SCREENING FOR
METHICILLIN RESISTANCE OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATES FROM SHEEP
BULK MILK SAMPLES.
Vitale F., Vitale M., Scatassa M.L., Lo Verde V., Galioto G., Dara S. Caracappa S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, “ A.Mirri” Palermo
Parole chiave: Staphylococcus aureus, latte di massa, caratterizzazione molecolare, gene Mec A.
Key words: Staphylococcus aureus, bulk milk samples, molecular characterization, Mec A gene.
SUMMARY- Classical microbiological methods were used to isolate and characterize pathogenic
bacteria from milk samples: a high prevalence of Staphylococcus strains was showed: molecular
characterization of isolates of S.aureus strains has been performed by PCR of the coagulase gene
followed by ALU I restriction and pattern analysis. Moreover a screening for the presence of MecA
gene has been performed by PCR;
Results on 105 isolates showed the presence of 6 main different ALU I restriction patterns in the
coagulase gene. The restriction patterns were similar on isolates coming from herds located in same
areas of the region.
A preliminary screening for the presence of MEC A gene on 50 out to 105 isolates gave positive results
on 3 colonies.
INTRODUZIONE –L’applicazione di tecniche di biologia molecolare sui ceppi di S.aureus isolati da
campioni di latte ovino di massa può essere un valido strumento per la caratterizzazione di eventuali
polimorfismi genetici finalizzati ad un’indagine epidemiologica molecolare sul territorio siciliano. Un
primo semplice livello di caratterizzazione sfrutta i polimorfismi del gene della coagulasi in S.aureus
dovuti alla presenza di una serie di sequenze ripetute di 81 paia di basi. L’analisi molecolare per il gene
MecA permette inoltre uno studio sulla possibile circolazione di ceppi di S.aureus antibiotico resistenti
in ambito veterinario.
MATERIALI E METODI Sui ceppi di S.aureus isolati si è proceduto all’estrazione del DNA, mediante colonnine di affinità dopo
digestione con proteinasi K in tampone di lisi.
Il DNA degli S.aureus è stato analizzato mediante PCR del gene della coagulasi con i seguenti primers
specifici:
5’-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’
5’-GCTTCCGATTGTTCGATGC-3’
Il risultato delle amplificazioni è stato analizzato su gel di agarosio all’1% . Gli ampliconi sono stati
digeriti con l’enzima di restrizione ALU I a 37°C per 3 ore e quindi analizzati in gel di agarosio al
2,5%.
Il Gene Mec A viene amplificato con i seguenti primers
5’-CATTTTGAGTTCTGCACTACC-3’
5’GCAATACAATCGCACATACATTAATAG-3’
Lunghezza dell’amplificato è di 967 bp
Il risultato delle amplificazioni viene analizzato su gel all’1%.
RISULTATI –
I ceppi di S. aureus hanno evidenziato polimorfismi genetici del gene della coagulasi. Nella fig. 1 sono
riportati i diversi pattern di restrizione con l’enzima ALU I del prodotto di amplificazione del gene
della coagulasi che dimostrano l’alto polimorfismo del gene stesso e la sua utilità per l’epidemiologia
molecolare.
Figura 1: pattern di digestione ottenuti con
l’enzima ALU I
CONCLUSIONI- L’analisi molecolare ha evidenziato la presenza in alcuni S.aureus di bande di
amplificazione diverse nel gene della coagulasi. La successiva restrizione enzimatica con ALU I
dell’amplificato ha permesso di evidenziare dei pattern che hanno distinto isolati da aree geografiche
diverse della Sicilia; Tutto ciò può permettere una caratterizzazione epidemiologica dei ceppi circolanti
in Sicilia. Al tempo stesso un’indagine per la presenza di amplificazione del gene Mec A ha messo in
evidenza la presenza di amplificazione positiva in 3 isolati su 50 finora analizzati; i 3 isolati
provenivano da allevamenti in aree geografiche vicine.
BIBLIOGRAFIA:
1) Goh S.H., Byrne S.K.,Zhang J.L., Chow A.W. 1992 Molecular typing of Staphylococcus
aureus on the basis of coagulase gene polymorphisms. J. Clin.Microbiology 30: 1642-1645.
2) Jaffe R.I., Lane D.J., Albury V.S., and Niemeyer M.D. 2000 Rapid extraction from and direct
identificationin clinical samples of methicillin-resistant Staphylococci using PCR. J.
Clin.Microbiology 38: 3407-3412.
Ringraziamenti: Si ringraziano le Sig.re M. Piazza M. Leonardi, Elide Fascetto per il loro contributo
tecnico-scientifico.