Micotossine e Vacche da Latte
Micotossine: effetti sulla
funzionalità dell’apparato
digerente
ANTONIO GALLO
Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione
Facoltà di Scienze Agrarie, Alimentari ed Ambientali
Università Cattolica del Sacro Cuore
Piacenza
Organizzazione della
presentazione
• Introduzione
• Effetto delle micotossine sull’apparato digerente delle lattifere
• Effetto sinergico delle micotossine
• Micotossine Nascoste
• Come proteggersi: adsorbenti ed enzimi
• Qualità degli Insilati e Micotossine, nuovo problema?
Micotossine negli alimenti
Nuovo Problema?
2003  Aflatossine nel mais
2003 MiPAAF finanzia un progetto di filiera
2007  Aflatossine nel mais
2012  Aflatossine nel mais…e non solo
Source: Biomin Mycotoxin Survey 2013
2010  Zearalenone e T-2 / HT-2 nel Silomais
2014  Zearalenone e DON in farine e insilati
Domanda: Cosa è cambiato in questi ultimi 10 anni?
Clima, tecniche colturali, organizzazione delle filiere,
Maggiore consapevolezza del problema, etc.?
Cosa vedo quando parliamo di
Micotossine
WhatsApp, 2015. Emotions
Interesse scientifico per
Micotossine
Micotossine
Introduzione
• Metaboliti secondari prodotte da funghi filamentosi
• Tossici per gli organismi superiori
– Identificate più di 1500 micotossine
– Studiate 300
– Normate 6
• 25-30% delle commodities contaminate da micotossine
(FAO)
• «Micotossicosi» intossicazione causata da micotossine
• Più frequente effetti Indiretti:
– Immunodepressione: causa od effetto?
Micotossine e Ruminanti
• Diete per ruminanti
– Concentrati
– Foraggi
– Sottoprodotti
• Esposizione “ampia” gamma di micotossine
• Rumine: difesa attiva
– Attivo nel sequestro
– Attivo nella metabolizzazione
• Protozoi: 90%-100% del metabolismo di OTA, ZEA, T-2 e DAS (Kiesling et
al., 1984)
• Batteri: Degradano micotossine come AFLA (SI  Engel & Hagemeiser,
1997 NO  Westakle et al., 1989) e OTA (Liu Yang, 2010)
Micotossine
assunte dai ruminanti
Funghi degli Insilati
Micotossine prodotte
Penicillium roqueforti
Agroclavine, Eremofortina C;
Acido Micofenolico, PR-tossina,
PR-amide, etc.
P. Roqueforti & P. paneu
Roquefortina A, Roquefortina C,
Andrastina A, B, C, Festuclavina,
Patulina, Marcfortina, etc.
Aspergillus fumigatus
Gliotossina, Fumigatina,
Tripacidine, Sfingofungina,
Fumigaclavine, etc.
Byssochlamys nivea /
Paecilomyces niveus
Patulina, Acido Micofenolico,
Acido Byssoclamico
Monascus ruber
Citrina, Monacolina
Geotrichum candidum
??? Riduce palabilità Insilati
Alternaria alternata, A.
arborescens, A., tenuissima
AAL-tossina, Alternariolo,
Altertossina, acido Tenuazonico
Source: Storm et al., 2008 (Stewart Postharvest Review)
Source: Rasmussen et al., 2010 (Food & Chemical Toxicology)
Micotossine
Carry over nel latte
Reproduced by Johanna Fink-Gremmels, 2008 (Mycotoxins in cattle feeds and carry-over to dairy milk: A review, Food
Additives & Contaminants: Part A: Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment, 25:2, 172-180)
Metabolismo ruminale
delle principali micotossine
Mycotoxin
Estimates of
Degradation
Derivatives
AFB1
DON
ZEA
0-50 %
0-60 %
0-90 %
Aflatoxicol
DOM1
- and - Zearalenol
T-2 Toxin
0-70 %
Acetyl T-2, HT-2 acetyl HT-2
OTA
FUMO
50-100 %
0-35 %
Dihydroxyioscounmarin
Cosa significa?
I dati ottenuti sono molto discordanti
Slide fornita da Duarte Diaz, 2007
Rumine difesa attiva
94.2%
Mg Bentonite/HSCAS
5 washes
84.3%
5.8%
71.9%
Rumen fluid
16 washes
Yeast wall
15 washes
15.7%
Legend
28.1%
 AB1 rilasciata
 AB1 legata
Sequestro:
fibre, lieviti, batteri, strutture porfiriniche
Moschini et al., 2008 (AFST)
Rumine difesa attiva
Mg-Bent
Yeast wall
Na-Bent
Rumen fluid
come Bolo
Mg-Bent
Na-Bent
Yeast wall
Rumen fluid
Moschini et al., 2008 (AFST)
Effetti delle AFLA sullo stato
sanitario
AFB1, DON, T-2 toxin
•
•
•
•
•
Gastroenteriti
Intestino emorragico
Riduce funzionalità ruminale
Diarrea
Chetosi
Alcaloidi dell’Ergot
• Impattano Termoregolazione
• Convulsioni
ZEA e Ergot
• Calori irregolari
• Riduce CR
• Cisti Ovariche
• Perdita di Embrioni
• Aborti
• Sviluppo testicolare ridotto
• Ridotta spermatogenesi
AFB1 effetti tossici:
•
•
•
•
Epatotossica, Epatocarginogenica
Neurotossica, Nefrotossica
Emotossica, Enterotossica
0steotossica, Immunosoppressiva
DON, T-2 toxin, Ergot
• Riduce DMI
• Riduce efficienza alimentare
DON, Ergot, Endotossine
• Laminiti
AFB1, T-2 toxin, DON
•
•
•
Metaboliti nel latte
Riduce produzione di latte
Mastiti
Report Biomin 2014 - www.mycotoxins.info
Aflatossine e Prove in vitro
Jiang et al. (2012)
Fermentescibilità ruminale e
azione antibiotico-simile delle AFLA
Rate of fermentation (1/h)
High Alfalfa diet
VFA Production (mmol)
High Ryegrass diet
High Alfalfa diet
0,25
High Ryegrass diet
110
105
0,2
100
0,15
95
0,1
90
85
0,05
80
0
75
0
320
640
ng of AFB1 / ml Liquido Ruminale
960
0
320
640
ng of AFB1 / ml Liquido Ruminale
960
Annual Review & Research in Biology, 3(4): 686-693, 2013
Aflatossine e Prove in vitro
Mojtahedi et al. (2013)
Fermentescibilità ruminale
e azione antibiotico-simile delle AFLA
Dose espressa in ng/ml o µg/L
Se Volume ruminale è 50 L e DMI 23 kg/day
Situazione statica
Conc (ng/ml)
300
600
900
Totale (µg) Dieta (µg/kg DM)
 15’000
 650 µg/kg DM
 30’000
 1300 µg/kg DM
 45’000
 1900 µg/kg DM
da 300 a 1000 reale situazione di stalla
Annual Review & Research in Biology, 3(4): 686-693, 2013
Fumonisine: effetto su Ruminanti
• Prodotte da Fusarium verticillioides e F. proliferatum
• Tutti gli alimenti (mais, frumento, orzo, etc.)
• Rumine degrada poco 10-18% (Caloni et al., 2000)
• No effetti su Microflora ruminale fino a 100 mg/kg
• Eliminata con feci, poco assorbita dagli animali (Smith &
Thakur, 1996)
• Carry over <0.05%  No rischio contaminazione
Fumonisine: caso studio
• Manze in accrescimento
• Da 18 a 42 settimane di età, alimentate con diete
contaminate
– Successivamente, stessa dieta (solo controlli)
• Contaminazione dieta
– C=
AFB1
– A=
AFB1
– A + F = AFB1
1 ppb +
12 ppb +
20 ppb +
FUMO 3 ppm
FUMO 6 ppm
FUMO 32 ppm
Micotossicosi
in manze in accrescimento
Abeni et al. (2014). Animal 8: 1667-1676
Zearalenone
• Lattone prodotto da Fusarium spp. (F. graminearium, F.
culmorum)
• Cereali: Mais (20%), frumento t. (65%), frumento d. (5%),
riso (5%), orzo (10%), Triticale (7%),
• Struttura chimica simile all’estrogeno
Estrogeno
ZEA
Effetti delle micotossine sullo
stato sanitario
AFB1, DON, T-2 toxin
• Gastroenteriti
• Intestino emorragico
• Riduce funzionalità ruminale
• Diarrea
• Chetosi
ZEA e Ergot
•
•
•
•
•
•
•
Calori irregolari
Riduce CR
Cisti Ovariche
Perdita di Embrioni
Aborti
Sviluppo testicolare ridotto
Ridotta spermatogenesi
ZEA effetti tossici:
•
Fertilità e Riproduzione
Alcaloidi dell’Ergot
• Impattano Termoregolazione
• Convulsioni
DON, T-2 toxin, Ergot
• Riduce DMI
• Riduce efficienza alimentare
DON, Ergot, Endotossine
• Laminiti
AFB1, T-2 toxin, DON
• Metaboliti nel latte
• Riduce produzione di latte
• Mastiti
Zearalenone e Insilati di Mais
ZEA
AFLA
FUMO
Borreani & Tabacco, 2010
Zea: effetti sugli animali
• Rumine (Protozoi) converte 90% di ZEA :
– α Zearalenolo (4 volte più estrogenico di ZEA)
– β Zearelenolo (meno estrogenico di ZEA)
– Altri come ZAN, α-ZAL, β-ZAL, etc.
• Potente azione estrogenica
• Alterazione performance produttive
–
–
–
–
Riduce il CR e PR
Riduce sopravvivenza degli embrioni
Riduce produzione LH e progesterone
Ipertrofia uterina
• No effetti dello ZEA su produzione di latte
ZEA caso studio
• Lavoro di Towers et al. (1995) field trial (stalle)
• Misurazione biomarcatori (ZEA e zearalenone plasmatici)
• EFFETTI:
– Alti livelli di biomarcatori  ridotta fertilità delle mandrie
• Conclusioni
«The reproductive problems in dairy cattle were associated
with dietary ZEA concentrations of about 400 ppb (nota:
sulla ss della dieta)»
ZEA: monitoraggio in azienda
• Quantificare α,β-Zearalenone nelle urine
• Biomarket dell’ingestione di ZEA
• Test conducibile con ELISA
Takagi et al., 2011
Tricoteceni
• Prodotti da Fusarium spp.
• Princiali tricoteceni:
• Gruppo A
– DAS (Diacetilscirperolo)
– Tossina T-2 & HT-2
• Gruppo B
– DON (Deossinivalenolo o vomitossina)
– NIV (Nivalenolo)
DON
• Contaminazione in Mais, cereali autunno-vernini e sottoprodotti
• Nei suini causa:
–
–
–
–
Rifiuto degli alimenti, problemi GI, diarrea, vomito
Immunosoppressione
Turbe riproduttive
Morte??
• Nei ruminanti:
– ???
– Riduce Immunità umorale (sintesi anticorpi) riduce IgM, IgG, aumenta IgA, altera
attività dei linfociti T e delle citochine
– Deprime produzione latte (Diaz et al., 2001)
• Biomarker: DON glucuronide (DON-GlcA) nelle urine
Effetti delle micotossine sullo
stato sanitario
AFB1, DON, T-2 toxin
• Gastroenteriti
• Intestino emorragico
• Riduce funzionalità ruminale
• Diarrea
• Chetosi
ZEA e Ergot
• Calori irregolari
• Riduce CR
• Cisti Ovariche
• Perdita di Embrioni
• Aborti
• Sviluppo testicolare ridotto
• Ridotta spermatogenesi
DON effetti tossici:
•
•
Ematotossica
Immunodepressiva
Alcaloidi dell’Ergot
• Impattano Termoregolazione
• Convulsioni
DON, T-2 toxin, Ergot
•
•
Riduce DMI
Riduce efficienza alimentare
DON, Ergot, Endotossine
• Laminiti
AFB1, T-2 toxin, DON
• Metaboliti nel latte
• Riduce produzione di latte
• Mastiti
DON: caso studio 1
• Charmley et al. (1993) Vacche in lattazione (≈20 kg/capo/giorno)
• Contaminazione dieta
– 0, 2.7 e 6,4 ppm di DON
• Effetti sugli animali
– Nessun effetto su DMI e MY
– Riduzione del Grasso del latte
• Conclusion: «Further studies are required to confirm the apparent
lack of effect of deoxynivalenol on milk production»
DON: caso studio 2
• Korosteleva et al. (2009) vacche in lattazione (≈35 kg/capo/giorno)
• Contaminazione dieta
– 3.5 ppm di DON
• Effetti sugli animali
– Effetto blando su DMI e MY
– Riduzione Neutrofili
• Conclusion: «Feed naturally contaminated with Fusarium mycotoxins
can affect metabolic parameters and immune function of dairy cows»
Micotossine ed effetto
sull’apparato digerente
• A livello ruminale
– Attività antimicrobica, antiprotozoica e antifunginea
(Finr-Gremmels, 2008)
– ↓ Mobilità ruminale, IVOMD, dNDF e 7h IVSD
• A livello intestinale
– Impatta attività microflora intestinale
– Riduce assorbimento nutrienti
– Causa diarrea
– Emorragie ed ulcere
Assorbimento delle
micotossine nel GIT
«Mycotoxins can compromise the intestinal epithelium either before absorption in the upper part or throughout the
entire intestine by non-absorbed toxins»
«Nothing is known about mycotoxin effect on enterocyte differentiation or migration rates along the length of the
villus, but many studies reported adverse effects of these fungal metabolites on morphology of intestinal villi»
«…low or moderate levels of DON in feed, as well as its combination with other Fusarium toxins were able to lower the
absorptive surface area through a decrease of villus height in the duodenum and jejunum»
Reproduced by Grenier and Applegate, 2013. Toxins 5: 369-430
Assorbimento delle
micotossine nel GIT
Reproduced by Antonnisen et al., 2014. Toxins 6: 430-452
Livelli di contaminazione delle
diete considerati problematici
X 20/30
limite
X 5/15
limite
X 1/2
X 5/10
(Rivedere?)
Gallo&Masoero, 2011
Effetto Sinergico
• Quando sono presenti 2 o + micotossine
– Effetto sinergico
– Effetto additivo
– Effetto antagonista
(2+2 = 10!)
(2+2 = 4)
(2+2 = 2!)
• Alcuni Esempi:
–
–
–
–
–
AFB1 + OTA
AFB1 + OTA
AFB1 + T-2
AFB1 + FB1
Citrina + OTA
polli
polli
suini
suini
polli
effetto sinergico
effetto additivo
effetto sinergico
effetto sinergico
effetto antagonista
Effetto Sinergico
• Alcuni esempi da CAST (2003)
Effetto Sinergico
• Harvey et al. (1995) Prova condotta su agnelli (38 kg) x 14 giorni
• Contaminazione dieta
–
–
–
–
CTR
AF: 2.5 ppm (riso contaminato)
DAS: 5.0 ppm (standard)
AF+DAS: 2.5 ppm + 5.0 ppm
• Effetto sugli animali
– Ingestione alimenti
– Peso finale – peso iniziale
CTR
AF
DAS
AF+DAS
2.74a
+2.4a
2.56b
+0.1ab
2.48bc
-0.6bc
2.42c
-2.7c
• Conclusion: «When AF & DAS were fed in combination, significant
synergism interaction occurred»
Micotossine nascoste
• Cosa sono?
– Micotossine che si coniugano a zuccheri, proteine e grassi
– Non vengono quantificate dai metodi analitici
«convenzionali»
– Vengono rilasciate dai processi digestivi del tratto GI
– Anche trattamenti termici (fioccatura, pellettatura,
estrusione) sono in grado di liberarle
– Quando libere, esplicano le loro caratteristiche di tossicità
Micotossine nascoste
• Tricoteceni (DON)
– Si stima che negli alimenti, il 30% (fino a 76%) del DON è in forma coniugata (D3G, DON 3
glucoside)
• Zearalenone
– Si stima che negli alimenti, il 27% di ZEA è in forma coniugata (Z14G, ZON 14 glucoside)
• FUMO
– Dopo idrolisi, la quantificazione di FUMO è aumentata di 2.6 volte (legame debole)
• Questione aperta: «la coniugazione riduce o meno la biodisponibilità della
molecola per gli organismi superiori?»
– Z14G è scomposto durante digestione, rilasciando ZEA
– D3G non viene rilasciato dopo idrolisi acida (stomaco). Cmq, batteri lattici intestinali sono in
grado di de-coniugare il composto
– Nessuna informazione su masked FUMO
Berthiller et al., 2012
Agenti Adsorbenti
• Riducono la disponibilità e/o l’assorbimento delle Micotossine, il
livello plasmatico e la presenza negli organi bersaglio
• Principali classi di adsorbenti:
– Alluminosilicati
•
•
•
•
•
–
–
–
–
–
Bentoniti
Montmorilloniti
Zeoliti
Illiti
HSCAS
Carboni attivati
Pareti di lievito
Fibre micronizzate
Batteri (LAB)
Polimeri
Agenti Biotrasformatori
• Convertono le molecole delle Micotossine
• Batteri
Gram + (anaerobi, es: Eubacterium)
Gram + (aerobi, es: Nocardia spp.,
Micobatteri, Streptomyces)
Gram – (aerobi, es: Pseudomonas,
Flavobacterium, etc.)
• Funghi
Aspergillus spp.
Eurotium herbariorum
Rizopus spp.
Penicillum raistricki
Rhicocladiella atrovirens
• Lieviti
Trichsporon mycotoxinivorans
Phaffia rhodozyma
Xanthophyllomyces dendrorhous
• Enzimi
Proteasi
Pancreatina
Carbossipeptidasi
Epossidasi
Lactono-idrolasi
Agenti Adsorbenti
test su AFLA e DON
Reproduced by Kong et al. 2014. Evaluation of mycotoxin sequestering agents for aflatoxin and deoxynivalenol:
an in vitro approach. SpringerPlus 2014, 3:346
Agenti Biotrasformanti
Enzimi
Enzimi Batterici per FUMO
Enzimi Fungino per AFLA
J.F. Alberts et al. (2009) International Journal of Food Microbiology 135: 47–52
S. Heinl et al. (2010) Journal of Biotechnology 145: 120–129
EFSA Journal 2014;12(5):3667
Strategie vaccinali
innovative
• Vaccinare gli animali contro le AF
• Lavoro svolto da ISAN (Pc) e Ist. Microbiologia e
Virologia (Pr)
-41%
Possibilità future
• Riduzione con SA
(Masoero et al., 2010)
-44% nell’escrezione di AFM1 nel latte
• Riduzione Vacche Vaccinate
(Polonelli et al., 2011)
-41% nell’escrezione di AFM1 nel latte
• Effetto additivo???
-85%??? Da verificare…
Qualità degli Insilati
Progetto FILIGRANA
«Valorizzazione della produzione del Grana Padano per il controllo di filiera e l’ottimizzazione dei processi produttivi»
Valutazione qualitativa degli Insilati e Fieni in Pianura Padana
42%
Area esposta a rischio
12%
22%
26%
Informazioni raccolte in azienda
Tipologia di insilamento, Dimensioni trincea, copertura e tipologie di film plastici,
appesantimento della superficie, presenza di teli laterali, densità della massa, uso di
additivi, procedure di insilamento, avanzamento sul fronte
Gallo et al., 2015. JSFA, accepted
Micotossine di P. roqueforti
• Tossicità su animali – DATI INCERTI
• Acido Micofenolico (Incidenza Campionie 8%, Incidenza Trincee 33%)
– Attività antimicrobica, Forte immunodepressione (Bentley, 2000)
• Roquefortina C (Incidenza Campionie 5%, Incidenza Trincee 17%)
– Attività antimicrobica
– In manze ha causato Inappetenza, paralisi e chetosi (Häggblom, 1990)
• PR Tossina
– Attività antimicrobica
– Paralisi, aborti e ritenzioni di placenta (Boysen et al., 2000)
Micotossine da P. roqueforti
Prove in vitro :
Effetto della presenza di Micotossine sull’attività
fermentativa ruminale
Parametro
Effetto
Acido
Roquefortina
singercico
Micofenolico
(Myco x Roque)
Fermentescibilità
(Vf, ml/g OM)
-7%
-7%
Produzione di VFA
(mmol/l)
-19%
-12%
-14%
(additivo)
-33%
(più che additivo)
Gallo et al. (2015). Journal of Agricultural Science (2015), 153, 163–176.
Effetto dell’Ingestione di Acido Micofenolico e
Roquefornita sull’efficienza Alimentare
0.45 ppm
1.5 ppm
-0,7%
Contaminazione della Dieta
(mg/kg DM)
2.5 ppm
-1,5%
5 ppm
-2%
4%
-4%
-8%
-8%
-16%
Effetto della Micotossina Pura
vs. Estratti «naturalmente» contaminati
Predicted Vf
Gas Production ml
500
400
Campione Naturalmente
Contaminato
Fermentazione inferiore
300
- 25 %
200
100
00
00
100
200
300
Observed Vf
400
Gas Production ml
500
Micotossine da Aspergillus
fumigatus
• Contamina foraggi, sprtt Insilati
• Gliotossina
– Attività antimicrobica, immunosoppressiva,
genotossica
• Campionati 68 insilati di mais
– Ritrovata in 2 casi (ISAN)
– Concentrazioni < 1 ppm
Micotossine da Aspergillus
fumigatus
• Effetto della presenza di Gliotossina su produzione
di Gas e VFA
Gas production (ml)
80
9
70
8
60
7
6
5
4
3
2
1
0
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
Gas production (ml)
VFA production (mmol/L)
VFA production (mmol/L)
10
Gliotossina incubata
Morgavi et al., 2004
Grazie per l’attenzione
Antonio Gallo
EM: [email protected]
Feed&Food Science and Nutrition Institute
Facoltà di Scienze Agrarie, Alimentari e Ambientali
Università Cattolica del Sacro Cuore
Via Emilia Parmense, 84
29100 Piacenza, Italy
Tel. +39 0523 599 433
Fax. +39 0523 599 259