CESI
Rapporto
A3/012506
Cliente:
RICERCA DI SISTEMA
Oggetto:
Vulnerabilità delle specie ittiche pregiate nei torrenti alpini
Ordine:
41/00098
Note:
COMPA/BIODIVERSA/2003/002
Pag.1/43
senza l'autorizzazione scritta del CESI questo documento può essere riprodotto solo integralmente
N. pagine: 43
N. pagine fuori testo: 0
Data:
26/05/2003
Elaborato:
CESI BU AMB - M.Laura Meloni
CESI BU AMB - E.Garofalo
Verificato:
CESI BU AMB - E.Garofalo
Approvato: CESI SFR – G.Pedroni
CESI
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Indice
1
ABSTRACT ......................................................................................................................................................3
2
INTRODUZIONE ............................................................................................................................................3
3
MATERIALI E METODI ...............................................................................................................................5
3.1 SOGGETTI SPERIMENTALI................................................................................................................................6
3.2 ESPOSIZIONE ALL’AMMONIACA ......................................................................................................................7
3.3 ESPOSIZIONE IN CONDIZIONI DI IPOSSIA ..........................................................................................................7
3.4 MISURA DI PARAMETRI FISIOLOGICI E METABOLICI ........................................................................................7
3.4.1 Analisi del sangue e dei tessuti .............................................................................................................8
3.4.2 Respirometria e capacità di nuoto ........................................................................................................8
3.4.3 Ratei metabolici ....................................................................................................................................9
3.5 ANALISI STATISTICA .....................................................................................................................................10
4
EFFETTI DELL’ESPOSIZIONE AD AMMONIACA SULLA TROTA IRIDEA..................................11
4.1 RISULTATI ....................................................................................................................................................11
4.1.1 Ammoniaca e pH nel plasma e nei tessuti ...........................................................................................11
4.1.2 Capacità natatoria ..............................................................................................................................13
4.2 DISCUSSIONE ................................................................................................................................................15
5
EFFETTI DELL’ESPOSIZIONE AD AMMONIACA SULLA TROTA FARIO ...................................18
5.1 RISULTATI ....................................................................................................................................................18
5.1.1 Ammoniaca plasmatica e tissutale ......................................................................................................18
5.1.2 pH intra- ed extracellulare..................................................................................................................20
5.1.3 Potenziale di membrana......................................................................................................................20
5.1.4 Lattato plasmatico e tissutale..............................................................................................................21
5.1.5 Respirometria e capacità di nuoto ......................................................................................................22
5.2 DISCUSSIONE ................................................................................................................................................24
6
CONFRONTO DEGLI EFFETTI DELL’ ESPOSIZIONE AD AMMONIACA SU TROTA FARIO ED
IRIDEE ....................................................................................................................................................................26
7
EFFETTI DELL’ESPOSIZIONE AD AMMONIACA IN CONDIZIONI DI IPOSSIA SU TROTA
FARIO......................................................................................................................................................................29
7.1 RISULTATI ....................................................................................................................................................29
7.1.1 Ammoniaca nel plasma e nei tessuti....................................................................................................29
7.1.2 pH intra e extracellulare .....................................................................................................................31
7.1.3 Lattato plasmatico e tissutale..............................................................................................................31
7.1.4 Respirometria......................................................................................................................................32
7.2 DISCUSSIONE ................................................................................................................................................34
7.2.1 Esposizione ad ipossia ........................................................................................................................34
7.2.2 Esposizione ad ammoniaca ed ipossia ................................................................................................34
8
CONCLUSIONI .............................................................................................................................................38
BIBLIOGRAFIA.....................................................................................................................................................40
C Copyright 2003 by CESI. All rights reserved - Activity code 30179C
Keywords: 12035F, 29110Q, 53001D, 66110P
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STORIA DELLE REVISIONI
1
Numero
revisione
Data
Protocollo
Lista delle modifiche e/o dei paragrafi modificati
0
26.5.2003
A3/012506
Prima emissione
ABSTRACT
Lo studio descritto in questo rapporto è stato condotto per valutare gli effetti dell’ammoniaca, anche in
presenza di ipossia, sulle prestazioni natatorie di specie ittiche pregiate, come la trota fario (Salmo
trutta) e la trota iridea (Oncorhynchus mykiss). Tale studio nasce in considerazione del fatto che le acque
scaricate dai serbatoi idroelettrici, sia durante il normale esercizio, sia in seguito ad operazioni di spurgo
e svaso, possono essere caratterizzate da concentrazioni elevate di ammoniaca, a cui generalmente
corrisponde un basso contenuto di ossigeno disciolto. Alle concentrazioni riscontrabili in questi ambienti
l’ammoniaca può avere sugli organismi acquatici effetti sub letali: possono essere inficiate le capacità di
sopravvivenza dei pesci in tratti di torrente con condizioni avverse, rendendoli più vulnerabili anche in
termini di competizione interspecifica. A tale proposito sono state condotte prove sperimentali
esponendo gruppi di trote fario e di trote iridee ad acque contenenti concentrazioni sub letali di
ammoniaca e misurando sui soggetti sperimentali diversi parametri metabolici, fisiologici e di
prestazioni di nuoto. Si è osservato che, per entrambe le specie, l’esposizione produce una riduzione
della massima velocità di nuoto sostenibile, con effetto maggiore nella trota fario. Nella trota iridea sono
state rilevate anche variazioni dei parametri del metabolismo aerobico, mentre nella fario sono state
osservate variazioni nel comportamento locomotorio, con un maggiore utilizzo del muscolo rosso anche
nel nuoto veloce, e una riduzione del contributo del muscolo bianco. Dalle misure fisiologiche effettuate
sulla fario risulta inoltre che l’esposizione induce una parziale depolarizzazione del muscolo bianco, del
cuore e del cervello. Le prove di esposizione ad ammoniaca in concomitanza di ipossia indicano che, pur
verificandosi una riduzione delle prestazioni natatorie, l’effetto delle due condizioni non è additivo. I
pesci hanno risposto a questo stress modificando il comportamento nel nuoto e la modalità di
ventilazione, da cui consegue una riduzione della richiesta di energia ed una maggiore possibilità di
sostenere il nuoto per allontanarsi ed evitare la condizione ad essi sfavorevole.
2
INTRODUZIONE
Nei bacini idroelettrici sono presenti spesso concentrazioni significative di ammoniaca, soprattutto in
condizioni di ipossia, che si verificano a causa dell’elevato consumo di ossigeno nella degradazione
batterica della sostanza organica.
Le acque scaricate dai serbatoi idroelettrici, sia durante il normale esercizio, in modo particolare nella
stagione estiva, sia in seguito ad operazioni di spurgo e svaso, possono essere caratterizzate da
concentrazioni elevate di ammoniaca, a cui generalmente corrisponde un basso contenuto di ossigeno
disciolto. Ciò può avere notevoli conseguenze sugli ecosistemi acquatici interessati, in particolare per
specie come le trote, che popolano tratti di torrenti, anche con ripide pendenze, soggetti a piene
improvvise. Infatti gli inquinanti, pur se presenti in concentrazioni subletali, possono dare luogo ad
alterazioni del metabolismo e ridurre la capacità natatoria dei pesci stessi; una riduzione della “forma
fisica” dei pesci si traduce in una ridotta efficienza di colonizzazione degli ambienti più difficili e in una
minore capacità di far fronte alle condizioni avverse, cui consegue la riduzione numerica della
popolazione locale. Da tali condizioni le specie meno vulnerabili, spesso rappresentate da specie
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alloctone (non originarie della fauna locale), possono trarre un vantaggio competitivo, con conseguente
alterazione della struttura della comunità biotica ed eventuale riduzione di biodiversità.
Tra gli inquinanti ad effetto subletale, l’ammoniaca è tra quelli più ampiamente diffusi nell’ambiente,
presente abbondantemente anche nelle acque superficiali, per effetto di sorgenti sia naturali sia
antropogeniche. Le sorgenti naturali sono essenzialmente legate alla degradazione della sostanza
organica, che avviene nei sedimenti superficiali dei corpi idrici, mentre quelle antropogeniche sono
rappresentate in particolare da acque reflue civili, fertilizzanti, reflui da dilavamento di aree urbane e
varie attività industriali.
L’ammoniaca è tossica per tutti i vertebrati. In soluzione acquosa essa è presente in due forme chimiche
distinte: ammoniaca libera (NH3) e ione ammonio (NH4+), le cui concentrazioni reciproche dipendono
dal pH della soluzione. La tossicità, d’altra parte, è legata unicamente all’ammoniaca libera, in quanto
solo essa è in grado di attraversare il doppio strato lipidico delle membrane biologiche e quindi di
permeare, attraverso i tessuti branchiali, all’interno dell’organismo.
Una volta raggiunto il comparto intracellulare, in cui il pH fisiologico ha valori compresi tra 7 e 8,
l’ammoniaca libera viene comunque ionizzata, ed è in tale forma che interagisce con i sistemi enzimatici
e dà quindi luogo ad effetti tossici a diversi livelli metabolici e fisiologici.
La soglia di concentrazione per la tossicità nelle acque dolci è stata stabilita in 248 µM di ammoniaca
totale per un’acqua a pH 6.5, e 17 µM per un’acqua a pH 9 (U.S. Environmental Protection Agency,
1998).
Per i pesci marini sembra invece che anche l’ammoniaca ionizzata possa essere in grado di permeare
attraverso le branchie (Wilson & Taylor, 1992), per cui in questo caso anche la concentrazione di NH4+
contribuisce in modo significativo alla tossicità complessiva.
L’ammoniaca è altresì un metabolita e in particolare rappresenta il prodotto finale del catabolismo di
purine e pirimidine; nei pesci viene escreta per diffusione passiva di NH3 attraverso l’epitelio branchiale.
In sostanza i pesci possono accumulare ammoniaca nei loro tessuti per effetto di due meccanismi:
¾ permeazione dall’ambiente esterno (Wilson & Taylor, 1992)
¾ inibizione del meccanismo di escrezione passiva (Cameron & Heisler 1983, Wilson et al., 1994b).
In acque ad elevato contenuto di ammoniaca, quindi, l’effetto tossico può in parte essere legato
all’inibizione dell’escrezione passiva, che non può avvenire contro gradiente.
Anche l’esposizione a bassi valori di pH (Day & Butler, 1996), o ad acque contenenti rame (Lauren &
McDonald, 1985; Beaumont et al., 1995, 2000a e 2000b), induce nel pesce un aumento dell’ammoniaca
plasmatica e tissutale, dovuta sia al danneggiamento dei meccanismi di escrezione, sia ad una probabile
risposta allo stress indotto (Freeman & Idler, 1973).
L’accumulo di ammoniaca nei tessuti può dare luogo a sintomi quali la distruzione del flusso sanguigno
cerebrale, coma ed eventualmente, a concentrazioni elevate, anche morte (Andersson et al., 1981).
È stato anche osservato che l’accumulo di ammoniaca comporta un affaticamento del pesce (Mutch &
Bannister, 1993) e una riduzione della capacità natatoria (Ye & Randall, 1991; Randall & Brauner,
1991; Beaumont et al., 1995b, 2000a, 2000b). Inoltre si è visto che l’accumulo di ammoniaca nel plasma
comporta, nella trota fario esposta a bassi valori di pH in presenza di rame, una riduzione della velocità
di nuoto massima sostenibile, Ucrit (Butler et al., 1992; Beaumont et al., 1995a). Ciò è dovuto al fatto
che il rame provoca un’alterazione della capacità iono-regolatoria e un danneggiamento delle membrane
branchiali (Shingles, 2002): tali processi possono contribuire all’accumulo di ammoniaca nel plasma,
inibendo la sua eliminazione attraverso le branchie.
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Sono stati identificati due meccanismi attraverso i quali si verificherebbe la riduzione della capacità
natatoria in seguito ad aumento della concentrazione plasmatica di ammoniaca:
•
•
instaurazione di uno stato metabolico alterato nel pesce, dovuto agli effetti di elevate
concentrazioni di ammoniaca su numerosi processi biochimici, che può portare ad un
affaticamento muscolare prematuro e di conseguenza alla perdita di capacità natatoria;
sostituzione progressiva dello ione potassio con lo ione ammonio all’interno delle cellule (Towle
& Holleland, 1987), dando luogo, tra l’altro, ad una progressiva depolarizzazione del potenziale
di membrana delle cellule del muscolo bianco (Binstock & Lecar, 1969).
Sebbene la maggior parte degli organismi viventi sia sensibile all’ammoniaca, i pesci sono generalmente
più tolleranti rispetto ai vertebrati terrestri, e concentrazioni di ammoniaca tra 150 e 300 µM sono
comunemente riscontrate nel plasma della maggior parte delle specie ittiche. Esistono anche casi estremi
di specie particolarmente resistenti che sopportano concentrazioni sino a 1 mM o 4 mM (Peng et al.,
1998; Ip et al., 2001; Tsui et al., 2002).
Per quanto riguarda i salmonidi, ci sono molte evidenze della loro sensibilità all’accumulo di
ammoniaca e sono stati rilevati effetti sub-letali per concentrazioni plasmatiche superiori a 300 µM
(Beaumont et al., 1995 a,b; 2000 a,b).
Obiettivo delle prove sperimentali condotte è stato quello di stimare gli effetti dell’esposizione ad
elevate concentrazioni di ammoniaca in presenza ed in assenza di ipossia sulle prestazioni natatorie di
specie pregiate di pesci, come la trota fario (Salmo trutta, autoctona italiana), la cui presenza nei corsi
d’acqua del territorio italiano è minacciata sia dalle condizioni inospitali sia dalla concorrenza di altre
specie più forti, e la trota iridea (Oncorhynchus mykiss, specie alloctona importata dal Nord America).
Nel contempo si è voluto fornire un contributo alla comprensione dei meccanismi biochimici alla base
dell’espressione di effetti sub letali dovuti all’accumulo intracorporeo di ammoniaca negli organismi
acquatici.
L’attività di ricerca è stata condotta esponendo le trote iridee e fario a livelli di ammoniaca, e a
condizioni chimico-fisiche dell’acqua, riscontrabili nelle acque torrentizie a valle degli sbarramenti.
Nello specifico l’esposizione ad ammoniaca è stata associata a valori di pH basici (livelli ambientali),
allo scopo di eliminare gli eventuali effetti tossici dovuti all’acidità e alla solubilizzazione di metalli
pesanti; la prova è stata ripetuta, per le trote fario, anche in presenza di ipossia. Le fasi sperimentali
seguite e i risultati ottenuti sono di seguito riportati.
3
MATERIALI E METODI
Sono stati condotti tre set di prove sperimentali, riguardanti l’esposizione ad ammoniaca su trota iridea e
fario e l’esposizione concomitante di ammoniaca e ipossia su trota fario.
La valutazione degli effetti dell’esposizione sugli animali è stata basata sulla misura di parametri
fisiologici e metabolici, rilevati sugli animali esposti e su quelli di controllo.
In linea generale le prove sono state eseguite secondo le fasi di seguito elencate:
1. esposizione dei soggetti sperimentali ad ammoniaca (e/o ipossia) per un tempo definito;
2. esecuzione di prove di nuoto con incremento della velocità di corrente (sino ad esaurimento
dell’animale) e contestuale monitoraggio del consumo di ossigeno;
3. prelievi di sangue, a intervalli definiti e/o al termine della prova, per la misura di parametri
fisiologici nel sangue;
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4. sacrificio dei soggetti sperimentali e prelievo di tessuti per la misura di parametri fisiologici di
alcuni organi (fegato, cervello, muscoli, branchie).
Tutte le prove sono state eseguite anche su un gruppo di animali di controllo, sottoponendo pesci
provenienti dallo stesso stock a tutte le fasi tranne la fase 1.
3.1
Soggetti sperimentali
Per ogni set sono stati utilizzati gruppi di soggetti sperimentali aventi peso e lunghezza omogenei, così
distribuiti:
Specie
Esposizione
Trota iridea
Trota fario
Trota fario
ammoniaca
ammoniaca
ammoniaca/ipossia
Lunghezza media
(cm)
33.8 ± 0.8
32.5 ± 0.4
32.5 ± 0.4
Peso medio
(g)
559 ± 33
448 ± 10
448 ± 10
I pesci, acquistati presso una pescicoltura commerciale, sono stati stabulati presso la Stazione CESI di
Idrobiologia Sperimentale di La Casella, in vasche di 4 m2 in vetroresina, per 2 settimane. Come acqua
di alimentazione della vasca (volume di circa 1000 litri) è stata impiegata acqua di pozzo deferrizzata,
avente una temperatura di 16±0.1 °C.
Le principali caratteristiche chimiche dell’acqua erano le seguenti:
[Ca++]
[Mg++]
[Na+]
[K+]
[Cl-]
Durezza totale
pH
2.3 mM
0.6 mM
2.3 mM
0.9 mM
0.7 mM
240 mg/l
8.39
Durante la stabulazione le trote sono state alimentate a piacere con mangime commerciale fino a quattro
giorni dall’inizio della sperimentazione, periodo nel quale sono state mantenute a digiuno per evitare
qualsiasi possibilità di interferenza dell’alimentazione sulle concentrazioni di ammoniaca nel plasma
(Brett & Zala, 1975) o sul metabolismo respiratorio e quindi sulle capacità natatorie (Alsop & Wood,
1997).
I pesci sono stati anestetizzati, quindi trasferiti su un tavolo operatorio, dove si è proceduto ad ulteriore
anestesia mediante irrigazione delle branchie con soluzione anestetica contenente 0.075 g/L di MS222
(tricaina metansolfonato), tamponato con 0.15 g/L di NaHCO3. Quindi è stato inserito un catetere
nell’aorta dorsale, secondo il metodo descritto (Sovio et al., 1972); dopo l’operazione i pesci incannulati
sono stati messi a recuperare in acqua corrente ben ossigenata.
Le prove sono state allestite in modo da minimizzare le differenze di peso e lunghezza tra i gruppi
sperimentali esposti e quelli di controllo.
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3.2
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Esposizione all’ammoniaca
Le trote iridee sono state esposte in camere di plexiglas ad acqua contenente 288 ± 15 µmol l-1 di
ammoniaca totale, concentrazione ottenuta iniettando con una pompa peristaltica una soluzione
concentrata di NH4Cl in un flusso noto di acqua corrente. Le concentrazioni di ammoniaca sono state
monitorate ogni 15 minuti attraverso analisi chimica con analizzatore Applikon ADI 2013. La
concentrazione di esposizione è stata fissata pari a circa il 50 % della LC50 a 96 ore per trotelle iridee di
massa pari a 0.5 g ed è quindi a tutti gli effetti da considerare un’esposizione a concentrazioni subletali.
La concentrazione di ammoniaca libera in queste condizioni di pH (8.39), calcolata usando l’equazione
di Henderson-Hasselbach a 16 °C, è pari a 20±1 µmol/L.
Le trote fario sono state esposte a tre concentrazioni di ammoniaca espressa come NH4Cl:
concentrazione ambiente (2 ± 1 µmol l-1), bassa (98 ± 6 µmol l-1) e alta (210 ± 11 µmol l-1). La
concentrazione massima di esposizione per le fario è stata fissata ad un livello inferiore a quella
utilizzata per le iridee in quanto, per quella concentrazione (288 µmol l-1), le fario presentavano effetti di
tossicità acuta, con elevata mortalità. Anche in questo caso le concentrazioni sono state ottenute per
iniezione di volumi noti di una soluzione concentrata di NH4Cl nel flusso di acqua di alimentazione e
monitorate ogni 15 minuti.
L’esposizione è stata protratta per 24 ore perché i pesci raggiungessero lo stato stazionario prima di
nuotare.
3.3
Esposizione in condizioni di ipossia
Sulla trota fario sono state condotte anche prove di esposizione all’ammoniaca in condizioni di ipossia.
La concentrazione di ossigeno nell’acqua è stata ridotta per gorgogliamento di azoto nell’acqua di
alimentazione delle camere in plexiglas e/o del respirometro, ed è stata monitorata in continuo, facendo
fluire una porzione d’acqua, ad una velocità costante, in una piccola cella dotata di un microelettrodo. Il
flusso di azoto veniva mantenuto attivo fino al raggiungimento del 50 % della saturazione. Quando la
concentrazione nelle camere di esposizione o nel respirometro scendeva al di sotto del 50% della
saturazione, in seguito al consumo dei pesci, veniva attivato automaticamente un flusso d’aria per
riportare la concentrazione al 55 %: in questo modo, i pesci sono stati esposti per un’ora ad una
concentrazione compresa tra il 50 e il 55 % della saturazione. Immediatamente dopo, i pesci mantenuti a
riposo sono stati sacrificati e gli altri sono stati trasferiti individualmente nel respirometro e dopo, le
prove di prestazione, sacrificati anch’essi. Da tutti gli individui sono stati effettuati i prelievi di tessuti
come sopra riportato.
3.4
Misura di parametri fisiologici e metabolici
Per la valutazione degli effetti dell’esposizione all’ammoniaca in condizioni di normossia e ipossia sono
stati presi in considerazione alcuni parametri che rendono conto dello stato metabolico e fisiologico dei
pesci sottoposti ai diversi trattamenti. Le diverse determinazioni effettuate sono descritte nei paragrafi
che seguono.
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3.4.1 Analisi del sangue e dei tessuti
Sono stati raccolti campioni di sangue, tramite il catetere, ad ogni velocità di nuoto e dopo
collassamento. Il pH del sangue arterioso è stato misurato con un elettrodo capillare (Radiometer BMS3
Blood-Gas Analyser) termostatato alla stessa temperatura in cui veniva mantenuto il pesce (16°C) e
collegato ad un pHmetro digitale (Radiometer PHM 74).
La pressione parziale di ossigeno arterioso (PaO2) è stata misurata con un elettrodo ad ossigeno
termostatato a 16°C e collegato ad un analizzatore acido-base (Radiometer PHM 73). Il contenuto totale
di ossigeno nel sangue arterioso (CaO2) è stato misurato con un elettrodo ad ossigeno Radiometer
termostatato a 37 °C.
Il plasma è stato separato per centrifugazione e i campioni, conservati in azoto liquido per un periodo
non superiore a due settimane, sono stati sottoposti ad analisi delle concentrazioni di lattato (kit analitico
Sigma lactate 826-B) e ammoniaca (kit analitico Sigma ammonia 171). Le concentrazioni di NH3 e
NH4+ sono state calcolate dai dati sperimentali di ammoniaca totale e pH del plasma, utilizzando
l’equazione di Henderson-Hasselbach e il valore di pK’amm, stimato pari a 9.62 per il plasma della trota a
16°C dal nomogramma fornito da Boutilier et al. (1984).
Al collassamento, da ogni pesce sono stati immediatamente effettuati prelievi da fegato, branchie e
muscolo, conservati in azoto liquido sino al momento dell’analisi.
I campioni di tessuto sono stati ridotti in polvere fine sotto azoto liquido e sottoposti a
deproteinizzazione in PCA 0.6 N. I campioni sono stati centrifugati per 5 minuti a 13000 rpm e il
surnatante, dopo neutralizzazione con tampone Tris, è stato utilizzato per la determinazione
dell’ammoniaca totale mediante kit analitico Sigma ammonia 171 e con il metodo della glutammato
deidrogenasi (Kun & Kearney, 1974). La determinazione del lattato è stato effettuata mediante kit
analitico Sigma lactate 826-B su campioni di tessuto deproteinizzato e centrifugato per 10 minuti.
Il pH intracellulare (pHi) è stato determinato attraverso il metodo dell’inibizione metabolica, utilizzando
il sistema Cameron BGM200 a 16°C (Portner et al., 1990).
Di seguito viene riportato uno schema delle determinazioni effettuate.
Matrice
Sangue
Plasma
Tessuti
Determinazioni
Pressione parziale O2 arterioso
Conc. totale O2 arterioso
pH
Ammoniaca
Lattato
Ammoniaca
Lattato
pH intracellulare
3.4.2 Respirometria e capacità di nuoto
Gli studi di capacità natatoria sono stati effettuati utilizzando un respirometro in PVC a tunnel (Brett,
1964): un flusso di acqua a circuito chiuso viene generato all’interno della camera di nuoto dal
movimento di un’elica in materiale plastico, trascinata da un motore a velocità variabile. Una frazione
trascurabile dell’acqua di riempimento del respirometro veniva sifonata in continuo e fatta fluire in una
cuvetta per la misura potenziometrica (Radiometer E5041) della pressione parziale di ossigeno (PwO2).
Tutti i dati di pressione parziale di ossigeno sono stati memorizzati durante l’intera fase di circolazione a
circuito chiuso dell’acqua e successivamente sono stati elaborati con regressione delle pressioni parziali
contro il tempo: le pendenze risultanti sono state utilizzate per quantificare il rateo di consumo di
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ossigeno, MO2 (Boutilier et al., 1984). La camera chiusa del respirometro era immersa in un grande
bagno termostatico di acqua ben ossigenata: quando la pressione parziale dell’ossigeno all’interno della
camera di nuoto scendeva al di sotto del 90 % della saturazione (per il consumo dovuto al metabolismo
del soggetto sperimentale) automaticamente il software del respirometro attivava una pompa che
prelevava acqua dal bagno termostatico esterno e riportava la PwO2 al 95 % della saturazione.
Ogni soggetto sperimentale, dopo 24 ore di riposo a seguito dell’intervento chirurgico, veniva trasferito
individualmente nella camera di nuoto, in cui sia aveva la concentrazione di ammoniaca stabilita, e
lasciato nuotare per una notte ad una velocità pari a 0.75 lunghezze del corpo per secondo (bl s-1, body
lenght per second). Dopo un’esposizione di 24 ore, la velocità dell’acqua nella camera di nuoto veniva
incrementata di 0.25 bl s-1 ogni 30 minuti fino a collassamento per stanchezza del soggetto sperimentale,
momento in cui veniva calcolata la massima velocità di nuoto sostenibile (Ucrit, vedi par. successivo)
(Brett, 1964).
Per ogni velocità di nuoto, infine, sono stati conteggiati i battiti della coda, che rappresentano un
indicatore della forza muscolare propulsiva, e calcolate le velocità medie di consumo di ossigeno.
3.4.3
Ratei metabolici
Per ogni pesce sono stati calcolati i seguenti parametri:
Parametro
Unità di misura
Ucrit
Massima velocità di nuoto sostenibile
MO2
MMR
AMR
AMR/MMR
COS
Rateo del consumo di ossigeno
Rateo di mantenimento metabolico
Rateo metabolico attivo
Capacità aerobica
Costo del nuoto (MO2 -MMR)
bl s-1 (body lenght per second,
lunghezze del corpo per secondo)
mmol O2 kg-1 h-1
mmol O2 kg-1 h-1
mmol O2 kg-1 h-1
mmol O2 kg-1 h-1
mmol O2 kg-1 h-1
Il rateo di mantenimento metabolico (MMR), altrimenti definito rateo standard metabolico, viene
calcolato applicando la regressione dei minimi quadrati alla relazione tra velocità di nuoto e consumo di
ossigeno: l’intercetta sull’asse delle ordinate dell’equazione di regressione rappresenta il rateo teorico di
consumo di ossigeno in condizioni stazionarie, considerato una stima affidabile del parametro MMR.
Il rateo metabolico attivo (AMR) viene determinato per ogni pesce come il consumo di ossigeno (MO2)
massimo misurato durante l’esercizio di nuoto (Fry, 1971).
Il rapporto AMR/MMR dà una stima della capacità aerobica di ogni pesce.
Il parametro relativo al costo netto del nuoto, COS, viene calcolato sottraendo dal valore di MO2 quello
di MMR, per ogni velocità di nuoto considerata (Beamish, 1978).
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Analisi statistica
Per descrivere le relazioni tra prestazioni di nuoto e consumo di ossigeno durante gli esperimenti
effettuati sono state applicate funzioni lineari ed esponenziali, identificando la funzione con il maggiore
coefficiente di correlazione. Tutte le variabili sono state correlate mediante test ANOVA ad una via e T
test. I risultati sono stati considerati significativi quando P risultava superiore a 0.05.
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EFFETTI DELL’ESPOSIZIONE AD AMMONIACA SULLA TROTA IRIDEA
In questo capitolo vengono riportati i risultati della prova di esposizione di 6 trote iridee alla
concentrazione di ammoniaca totale di 288 ± 15 µmol/L (ammoniaca libera: 20±1 µmol/L), contro un
gruppo di controllo di 6 individui posti in acqua senza aggiunta di ammoniaca.
4.1
Risultati
4.1.1 Ammoniaca e pH nel plasma e nei tessuti
La concentrazione di ammoniaca nel plasma degli individui esposti a 288 ± 15 µmol l-1 di ammoniaca
totale è risultata, dopo 24 ore di nuoto a 0.75 bl s-1, significativamente elevata (tab.1); durante le prove
di nuoto le concentrazioni tendono a ridursi a velocità di nuoto eccedenti 0.75 bl s-1 (fig.1).
Fig. 1:
ammoniaca totale nel plasma a diverse velocità di nuoto per diversi individui. I simboli
vuoti si riferiscono a trote esposte ad ammoniaca, i simboli pieni a trote di controllo.
Rapporto
Fig. 2:
CESI
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contenuto di ammoniaca totale (A), pH (B) ed ammoniaca libera nel plasma, a diverse
velocità di nuoto per le trote esposte (barra vuota) e di controllo (barra piena). I dati si
riferiscono alla velocità di nuoto di esposizione (0.75 bl s-1), a quella in cui hanno
mostrato il valore minimo di ammoniaca nel plasma (lowest) e alla velocità critica
(Ucrit). Il simbolo * indica una differenza significativa rispetto ai valori durante il nuoto
a 0.75 BL s-1, mentre ‡ indica una differenza significativa rispetto ai valori di minima
concentrazione di ammoniaca plasmatica.
Il pH del plasma non è influenzato dall’esposizione ad ammoniaca (tab.1), ma diminuisce sensibilmente
in entrambi i gruppi alla Ucrit (fig.2).
Le concentrazioni di ammoniaca nel fegato e nelle branchie sono risultate superiori negli individui
esposti rispetto al gruppo di controllo, mentre non sono state rilevate differenze significative né tra le
concentrazioni di ammoniaca nel muscolo bianco dei due gruppi né nei valori di pHi dei tessuti (tab. 2).
CESI
Rapporto
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Tab. 1: Concentrazioni medie di ammoniaca nel plasma e pH nelle trote dopo 24 ore di nuoto a 0.75
bl s-1. La media è stata ottenuta su 6 individui sperimentali per entrambi i gruppi. * indica
differenze significative degli individui esposti rispetto al controllo (t-test, p <0.05).
Gruppo
Controllo
Gruppo
Esposto
182.81 ± 29.78
435.85 ± 33.91*
Plasma [NH3] (µmol l-1)
2.66 ± 0.60
7.01 ± 0.53*
Plasma [NH4+] (µmol l-1)
180.15 ± 29.29
428.84 ± 33.57*
7.80 ± 0.05
7.87 ± 0.03
Ammoniaca totale nel plasma (µmol l-1)
Plasma pH
Tab. 2: Concentrazioni medie di ammoniaca (µmol g-1) e pH intracellulare in individui esposti e di
controllo dopo nuoto a velocità Ucrit. La media è stata ottenuta su N = 6 in entrambi i casi.
* indica una differenza significativa rispetto al controllo (t-test, p <0.05).
Gruppo
Controllo
Gruppo
Esposto
Ammoniaca
pHi
Ammoniaca
pHi
Branchie
1.51 ± 0.39
6.987 ± 0.01
2.37 ± 0.11*
6.935 ± 0.03
Fegato
2.31 ± 0.34
6.800 ± 0.05
3.67 ± 0.24*
6.762 ± 0.04
Muscolo Bianco
1.75 ± 0.36
6.709 ± 0.04
1.95 ± 0.24
6.679 ± 0.08
4.1.2 Capacità natatoria
Le trote esposte all’ammoniaca hanno mostrato una riduzione significativa, pari al 28%, della Ucrit
rispetto al gruppo di controllo (tab.3). Gli aumenti progressivi della velocità di nuoto hanno portato ad
un aumento esponenziale di MO2 sia nelle trote esposte sia in quelle di controllo, anche se vi sono
differenze evidenti tra i due gruppi. Infatti i pesci esposti ad ammoniaca hanno mostrato un maggiore
MO2 a tutte le velocità fino a 2 bl s-1, sebbene questa differenza non risulti statisticamente significativa
(fig.3).
CESI
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Assorbimento di O2 (mmol l-1)
Rapporto
Velocità di nuoto (bl s-1)
Fig. 3:
relazione tra velocità di nuoto e consumo di ossigeno per le trote esposte (cerchi) e il gruppo
di controllo (quadrati).
I valori di MMR sono maggiori nel gruppo esposto ad ammoniaca rispetto al gruppo di controllo.
Tuttavia, l’AMR è significativamente inferiore nel gruppo esposto ad ammoniaca, a causa della minore
Ucrit, evidenziando così una netta riduzione della capacità aerobica (tab.3). Entrambi i gruppi mostrano
una relazione lineare tra la frequenza di battito della coda e la velocità di nuoto, ma complessivamente le
frequenze sono pressoché uguali a tutte le velocità testate. E’ necessario comunque sottolineare che i
controlli raggiungono in valore assoluto una frequenza maggiore, in virtù del fatto che raggiungono una
maggiore Ucrit.
Tab. 3: Valori medi dei parametri metabolici, di respirazione e di prestazioni di nuoto in fase di
esercizio per la trota iridea alla velocità critica sia del gruppo di controllo sia di quello
esposto ad ammoniaca. MMR, rateo di mantenimento metabolico; AMR, rateo metabolico
attivo come massimo MO2 misurato; Ucrit, massima velocità di nuoto sostenibile. N = 6 in tutti i
casi. * denota una differenza statisticamente significativa dal gruppo di controllo (t-test, p <
0.05).
Gruppo
Gruppo
Controllo
Esposto
MMR (mmol O2 kg-1 h-1)
3.04 ± 0.86
5.65 ± 0.59*
AMR (mmol O2 kg-1 h-1)
19.39 ± 1.68
13.63 ± 1.42*
Capacità aerobica (mmol O2 kg-1 h-1)
6.38 ± 2.58
2.41 ± 0.61*
Massima frequenza di battiti della coda
(battute s-1 )
3.77 ± 0.04
3.47 ± 0.12*
Ucrit (bl s-1 )
2.23 ± 0.15
1.61 ± 0.17*
CESI
Rapporto
4.2
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Discussione
E’ noto che gli stress ambientali possano interferire con il metabolismo aerobico delle trote sia come
fattori di carico, che aumentano MMR (rateo di mantenimento metabolico) e riducono quindi la
frazione di energia totale disponibile per il lavoro muscolare, sia come fattori limitanti, che riducono la
capacità di aumentare la velocità metabolica e la possibilità di compiere lavoro muscolare, riducendo
quindi AMR (rateo metabolico attivo, ovvero il massimo consumo di ossigeno durante l’attività di
nuoto) (Brett, 1958).
L’esposizione ad ammoniaca nel presente studio provoca in realtà effetti ben evidenti sul metabolismo
aerobico della trota, che è associabile ad una riduzione della massima velocità sostenibile di nuoto
(Ucrit). Le misure di metabolismo respiratorio e di frequenza di battiti della coda durante il nuoto hanno
mostrato che l’esposizione per 24 ore a concentrazioni subletali di ammoniaca danno luogo sia ad effetti
di carico sia ad effetti limitanti nella trota, con conseguente rilevante riduzione delle capacità aerobiche
e delle prestazioni natatorie.
E’ stato dimostrato che nei salmonidi MMR aumenta in seguito ad esposizione a concentrazioni tossiche
subletali, come, ad esempio, bassi valori di pH (Wilson et al., 1994a) e di rame (Waiwood & Beamish,
1978, Beaumont et al., 1995a), o condizioni di salinità non ottimale (Morgan & Inawa, 1991). Tale
incremento può essere dovuto a diversi fattori: risposta allo stress, aumento di meccanismi attivi e stato
metabolico alterato dei tessuti. Tra l’altro, si è visto che nei salmonidi l’esposizione ad ammoniaca porta
al rilascio di cortisolo (Knoph & Olsen, 1994), il cui aumento nel plasma si riflette in un’attivazione del
metabolismo basale (Morgan & Inawa, 1996).
E’ stato inoltre riportato che l’esposizione a bassi valori di pH porta ad un aumento di MMR e ad una
diminuzione di Ucrit nella trota iridea, e ciò potrebbe essere una conseguenza dei costi metabolici per la
iono-regolazione, in quanto l’aumento dell’escrezione attiva di ammoniaca può richiedere un aumento
della velocità metabolica omeostatica (Wilson et al., 1994b); d’altra parte, studi recenti hanno
dimostrato che i costi metabolici dello scambio attivo di ioni sono energeticamente molto bassi in acqua
dolce (Kirschner, 1995; Morgan & Inawa, 1999).
La riduzione di AMR, che rappresenta un fattore limitante, verificatasi nel gruppo di trote esposte ad
ammoniaca, può essere una conseguenza del danneggiamento delle branchie, che ostacola lo scambio di
gas attraverso un aumento della distanza di diffusione e una riduzione dell’area disponibile per
l’assorbimento di ossigeno.
Inoltre è stato dimostrato che l’ammoniaca limita le prestazioni di nuoto in seguito agli effetti dello ione
ammonio sullo stato metabolico ed elettrofisiologico dei muscoli (Beaumont et al. 2000a, 2000b), in
quanto esso sostituisce lo ione potassio nei meccanismi di scambio ionico (Towle & Holleland, 1987).
Tali effetti si basano su una parziale depolarizzazione del muscolo, che è stata valutata determinando i
potenziali di membrana (EM) per l’ammoniaca intra- ed extracellulare attraverso l’equazione di Nernst:
EM
[
[
+
 RT   NH 4
= −
 ln
+
 zF   NH 4
] 
] 
i
e
dove R è la costante dei gas, T è la temperatura in gradi Kelvin, z è la valenza, F è la costante di Faraday
e i pedici “i” ed “e” indicano le concentrazioni interne ed esterne rispettivamente. L’uso delle
concentrazioni intracellulari ed extracellulari dello ione ammonio per il calcolo del potenziale di
membrana è basato sull’assunzione che la permeabilità della membrana all’ammoniaca libera sia
relativamente alta rispetto a quella per lo ione ammonio e che esse siano inalterate in seguito
all’esposizione ad ammoniaca. Beaumont et al. (2000b) hanno misurato direttamente EM nei muscoli e
hanno confermato sperimentalmente la predetta depolarizzazione. Il verificarsi di una depolarizzazione
Rapporto
CESI
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del muscolo rosso nelle trote esposte ad ammoniaca nel presente studio può aver limitato la capacità di
lavoro aerobico e la riduzione di AMR.
Beaumont et al. (2000a) hanno misurato un potenziale di membrana in condizioni di riposo pari a – 86.5
± 2.9 mV e -52.2 ± 4.9 mV rispettivamente in pesci di controllo e pesci esposti a rame in ambiente
acido. Calcolando i potenziali di membrana dalle concentrazioni di ammoniaca nel plasma e nel
muscolo bianco con l’equazione di Nernst nel nostro caso, otteniamo che alla Ucrit i potenziali sono -60.3
± 6.8 mV e -34.9 ± 2.8 mV rispettivamente nei pesci di controllo e nei pesci esposti, valori differenti in
modo significativo e che indicano che il muscolo bianco dei pesci esposti era notevolmente
depolarizzato. Deve essere tuttavia notato che le misure di Beaumont già citate sono state effettuate in
condizioni di riposo mentre nel presente studio sono state rilevate a Ucrit.
E’ necessario considerare, comunque, che quando il muscolo è sotto sforzo l’ammoniaca viene
probabilmente prodotta in seguito a processi catabolici all’interno delle cellule muscolari, e ciò pone
delle limitazioni all’applicazione dell’equazione di Nernst, dato che quest’ultima presuppone uno stato
di equilibrio. D’altra parte, date le notevoli differenze dei potenziali di membrana calcolati ad Ucrit, si
può sostenere che si sia verificata una effettiva depolarizzazione del muscolo.
I potenziali ottenuti nel presente studio, calcolati ad Ucrit, sono, in valore assoluto, nettamente inferiori
rispetto a quelli riportati in letteratura, ottenuti in condizione di riposo (Beaumont et al., 2000a); ciò è
probabilmente dovuto ad un incremento del flusso di K+ dallo spazio intracellulare del muscolo in
contrazione durante l’attività, che può portare sino al dimezzamento del potenziale rispetto ai valori di
riposo (Sjogaard, 1991). La depolarizzazione può anche essere generata dall’acidificazione dei tessuti
durante l’attività motoria, in quanto l’aumento della concentrazione degli idrogenioni intracellulari dà
luogo ad un progressivo aumento dei potenziali di membrana.
Nel caso di esposizione a valori subletali di pH, in cui si verifica, come sopra riportato, un accumulo di
ammoniaca nelle trote esposte e una diminuzione della capacità di nuoto, è stato evidenziato che il
muscolo bianco non viene utilizzato (Day & Butler, 1996). Poiché dati pregressi indicano che nella trota
iridea il muscolo bianco interviene nell’attività quando il nuoto raggiunge almeno l’80% della Ucrit
(Taylor et al., 1995), la depolarizzazione delle membrane delle fibre di tale muscolo può aver inibito
qualsiasi suo contributo alle prestazioni, con conseguente riduzione della velocità massima sostenibile e
della frequenza dei battiti della coda.
E’ interessante notare che, in accordo con questa ipotesi, le concentrazioni di ammoniaca al
raggiungimento delle Ucrit nelle fibre del muscolo bianco erano molto simili tra esposti e controlli.
Sembra che l’ammoniaca si possa accumulare nel muscolo, durante l’esercizio, fino ad una
concentrazione limite che interferisce con il suo funzionamento, ostacolando quindi la capacità del pesce
di mantenere il nuoto a velocità superiori. E’ possibile che i pesci esposti abbiano raggiunto questo
valore limite, in risposta all’aumento di concentrazione dello ione ammonio nel plasma, prima dei
controlli e, in seguito, non siano stati in grado di raggiungere le stesse velocità massime.
Anche il sistema nervoso può essere vulnerabile alla depolarizzazione indotta dagli ioni NH4+; d’altra
parte, se ciò si fosse verificato nel presente studio, si avrebbe potuto dedurre che la trasmissione nervosa
sia influenzata a tutti i livelli di attività e non solo nel range superiore, come nel caso della Ucrit. Studi
recenti sulla trota fario esposta a rame a bassi valori di pH (con elevate concentrazioni di ammoniaca nel
plasma) hanno dimostrato che una stimolazione elettrica periferica induce una contrazione muscolare,
facendo quindi supporre la piena funzionalità del sistema nervoso fosse funzionale (dati non mostrati).
Dai dati sperimentali si può notare una diminuzione della concentrazione di ammoniaca nel plasma
durante la fase di nuoto sia nel controllo che nel gruppo esposto (fig.2). In particolare ben 5 individui su
6, tra quelli esposti, evidenziavano questo andamento, mentre il sesto pesce manteneva una
concentrazione di ammoniaca costante fino alla velocità critica (tutti gli individui indagati hanno
evidenziato un aumento di concentrazione ad Ucrit). Le velocità alle quali si è verificata la massima
diminuzione di concentrazione erano differenti da individuo a individuo, probabilmente dipendenti dalla
variabilità biologica naturale. Nell’ipotesi che con le misure effettuate siano state determinate realmente
le concentrazioni minime per ogni pesce, la diminuzione media dei valori massimi risulta pari a
Rapporto
CESI
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12.64±4.01 µmol l-1 per il gruppo esposto e a 36.42±10.68 µmol l-1 per il gruppo di controllo. Nel
gruppo esposto la diminuzione di concentrazione è statisticamente significativa rispetto ai valori
misurati a 0.75 bl s-1 (fig.2a).
Nei controlli, la riduzione di concentrazione di ammoniaca nel plasma durante l’esercizio aerobico può
essere dovuta all’aumento della vasodilatazione nelle branchie, del flusso di sangue nelle branchie e del
flusso di acqua che scorre sulle branchie, e, di conseguenza, della diffusione di ammoniaca stessa.
D’altra parte la riduzione di ammoniaca plasmatica negli individui esposti sembra essere contro un
gradiente diffusivo; secondo il calcolo delle concentrazioni di ammoniaca libera, infatti, tali pesci
potrebbero aver escreto ammoniaca contro un gradiente di 12.83 µmol l-1, in seguito ad attività di nuoto
per una notte a 0.75 bl s-1, e di 13.44 µmol l-1 quando si aveva la minore concentrazione di ammoniaca
plasmatica. La riduzione di quest’ultima può essere legata ad un aumento dell’escrezione attiva dello
ione ammonio, che in acque dolci può essere scambiato con un H+ (Wilson et al., 1992); è tuttavia
possibile che nel microambiente acido delle branchie l’escrezione avvenga anche sotto forma di NH3
(Wilson et al., 1994b). Ciò comporta che il procedimento del calcolo dei gradienti sia inadeguato,
perché è basato sia sulle condizioni acido-base del sistema acquatico complessivo, anziché
all’interfaccia branchie-ambiente esterno, sia sul pH del sangue arterioso e non di quello venoso.
Su questo argomento c’è comunque, nell’ambito della comunità scientifica, un dibattito aperto, in
quanto vi sono prove sperimentali che confermano escrezione di NH4+ ed NH3 contro un gradiente di
concentrazione esterno (Salama et al., 1999; Randall et al., 1999).
I risultati ottenuti da questa prova indicano che:
-
-
-
l’esposizione della trota iridea a concentrazioni sub-letali di ammoniaca provoca una
diminuzione della capacità natatoria del pesce attraverso effetti multipli, e probabilmente
interattivi, dovuti all’accumulo di ammoniaca in diversi tessuti del pesce stesso;
l’incremento di MMR e il decremento di AMR provocano una netta riduzione della capacità
aerobica dei pesci: ciò indica che si verifica una riduzione della frazione di energia totale
disponibile per il lavoro muscolare e l’impossibilità di aumentare la velocità metabolica. In
particolare la riduzione di AMR può indicare uno stato alterato del muscolo rosso, che limita il
lavoro massimo e quindi l’assorbimento di ossigeno;
lo ione ammonio induce una depolarizzazione della membrana delle fibre del muscolo bianco e
ne inibisce il funzionamento al raggiungimento delle massime velocità sostenibili
i pesci esposti risultano in grado, durante il nuoto, di espellere attivamente ammoniaca contro un
gradiente di concentrazione, probabilmente allo scopo di migliorare le proprie capacità di nuoto.
Qualunque sia la spiegazione di tutti questi effetti, i fenomeni osservati sono comunque di grande
rilevanza ambientale, perché la capacità di nuoto dei pesci è fondamentale per la loro presenza
nell’ambiente, in modo particolare per le trote che colonizzano normalmente tratti torrentizi in cui, in
coincidenza con precipitazioni meteoriche o discioglimento delle nevi, le velocità del flusso delle acque
richiede al pesce di essere in “perfetta forma” per poter resistere nel proprio habitat.
Rapporto
5
CESI
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EFFETTI DELL’ESPOSIZIONE AD AMMONIACA SULLA TROTA FARIO
Come riportato nel paragrafo precedente, è stato verificato che l’esposizione ad alte concentrazioni di
ammoniaca riduce le prestazioni di nuoto nella trota iridea. Si è quindi proseguita la sperimentazione
con una serie di prove finalizzate alla verifica degli effetti del medesimo fattore di pressione sulla trota
fario (Salmo trutta), specie autoctona dei torrenti alpini italiani. In questo caso le prove sono state
organizzate in modo da ottenere elementi per approfondire la conoscenza dei meccanismi che sono alla
base della tossicità associata all’ammoniaca. Nello specifico sono state utilizzate diverse concentrazioni
di esposizione, in modo da evidenziare l’esistenza di relazioni lineari nei confronti della concentrazione
plasmatica di ammoniaca e delle prestazioni di nuoto. Inoltre sono stati rilevati parametri metabolici e
fisiologici di plasma e tessuti sia in condizioni di riposo sia sotto sforzo.
Gruppi sperimentali di 6 pesci ciascuno sono stati esposti a tre diverse concentrazioni di ammoniaca
espresse come NH4Cl:
¾ 2 ± 1 µmol l-1 (fondo=controllo)
¾ 98 ± 6 µmol l-1 (Bassa Ammoniaca=BA)
¾ 210 ± 11 µmol l-1 (Alta Ammoniaca=AA)
La concentrazione massima di esposizione per le fario è stata fissata ad un livello inferiore a quella
utilizzata per le iridee, in quanto, per quella concentrazione (288µmol/L), le fario presentavano effetti di
tossicità acuta, con elevata mortalità.
Inoltre, nel caso delle trote fario, vista la loro apparente maggiore sensibilità alla manipolazione, le
misure respirometriche sono state eseguite su un gruppo a parte, rispetto ai soggetti utilizzati per i
prelievi di plasma. In tale gruppo, i pesci non sono stati incannulati per evitare una possibile inibizione
nelle prestazioni di nuoto o riduzione del consumo di ossigeno in seguito allo stress dovuto
all’operazione chirurgica. Durante l’esposizione, i pesci sono stati mantenuti in un contenitore di
plexiglas. Dopo la prova di nuoto, una volta raggiunta la velocità critica, tutti i pesci sono stati sacrificati
per il prelievo dei tessuti da analizzare.
I risultati ottenuti sono di seguito riportati.
5.1
5.1.1
Risultati
Ammoniaca plasmatica e tissutale
Nei pesci esposti per 24 ore ad ammoniaca si raggiungevano, per entrambi i livelli di esposizione,
concentrazioni di ammoniaca plasmatica significativamente elevate (tab. 4).
Nei tessuti, prelevati sia da pesci esposti a riposo, sia da pesci esposti e sottoposti a prove di nuoto, sono
state evidenziate variazioni significative rispetto al controllo solo per:
pesci a riposo:
aumento di ammoniaca nel muscolo bianco solo per l’esposizione ad AA
pesci portati ad Ucrit: aumento di ammoniaca nel muscolo bianco, analogo per AA e BA
aumento di ammoniaca nel muscolo rosso, più marcato per AA rispetto a BA.
Nel cuore e nel cervello, invece, non si sono riscontrate variazioni correlabili alle differenti esposizioni o
allo stato di attività dei pesci (fig. 4).
CESI
Rapporto
Tab.4:
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Valori di concentrazioni di ammoniaca, lattato e pH plasmatici, pressione parziale di
ossigeno nel sangue e contenuto totale di ossigeno, espressi come media ± ds, in trote fario a
riposo, dopo esposizione ad acqua normossica senza aggiunta di ammoniaca (controlloconcentrazione di fondo), a 98 ± 6 (bassa ammoniaca) e 210 ± 11 µmoli l-1 (alta ammoniaca).
Il simbolo ° indica una differenza significativa rispetto al controllo.
Ammoniaca
plasmatica
(µmol l-1)
Lattato
plasmatico
(mmol l-1)
pH
plasmatico
PaO2
(mmHg)
CaO2
(vol.%)
Controllo
133.6 ± 29.2
0.55 ± 0.20
7.825 ± 0.060
104.2 ± 13.9
8.5 ± 1.4
Bassa Ammoniaca
386.0 ± 41.5 º
1.72 ± 0.53
7.844 ± 0.062
102.3 ± 8.6
8.8 ± 0.9
Alta Ammoniaca
771.3 ± 92.2 º
1.30 ± 0.49
7.933 ± 0.065
96.2 ± 9.4
10.4 ± 1.0
6
a
*
Concentrazione ammoniaca
(µmol l-1)
5
4
º
3
2
1
0
Muscolo bianco
Muscolo rosso
Cuore
Cervello
Fig. 4: concentrazione di ammoniaca (media ± ds) in vari tessuti delle trote fario a riposo (barre lisce)
e dopo sforzo (portate alla Ucrit,, barre punteggiate) ed esposizione a: bianco (controllo, barre
bianche); 98 ± 6 µmol l-1 di ammoniaca (barre rosse); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca (barre
a
blu). Il simbolo ° indica differenze significative rispetto al controllo , il simbolo indica
differenze significative tra i pesci a riposo e dopo sforzo, il simbolo * indica differenze
significative rispetto ai pesci esposti a bassa ammoniaca.
CESI
Rapporto
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L’aumento di ammoniaca plasmatica, inoltre, è stato concomitante ad una riduzione lineare della
velocità massima di nuoto, Ucrit (fig.5).
Ucrit (BL s-1)
3.
presente studio
S. trutta
2.
2.
1.
1.
0.
0.
20
40
60
80
100
Ammoniaca plasmatica
(µmol l-1)
Fig. 5:
relazione lineare tra Ucrit e ammoniaca plasmatica nelle trote fario nel presente studio (cerchi
neri, linea di tendenza nera) confrontata con dati pregressi di letteratura (Beaumont et al.,
1995b; linea rossa).
5.1.2 pH intra- ed extracellulare
Il pH plasmatico e intracellulare non veniva influenzato dall’esposizione alle diverse concentrazioni di
ammoniaca e dallo stato di attività dei pesci (tab.4).
5.1.3 Potenziale di membrana
In seguito ad esposizione all’ammoniaca si è verificata una parziale ma significativa depolarizzazione di
tessuti quali muscolo bianco, cuore e cervello del pesce a riposo. Il potenziale di membrana del muscolo
rosso, sempre nel pesce a riposo, sembra invece non modificarsi in seguito ai differenti trattamenti
(fig.6).
CESI
Rapporto
Muscolo bianco
Muscolo rosso
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Cuore
Pag.21/43
Cervello
EM (mV)
0
-30
º
-60
º
º
º
º
-90
Fig. 6
Potenziale di membrana calcolato (media ± ds) ) in vari tessuti delle trote fario a riposo ed
esposte per 24 ore a : bianco (controllo, barre bianche); 98 ± 6 µmol l-1 di ammoniaca (barre
blu); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca (barre rosse). Il simbolo ° indica differenze significative
rispetto al controllo.
5.1.4 Lattato plasmatico e tissutale
Il lattato plasmatico non viene influenzato dall’esposizione all’ammoniaca (tab.4), mentre si assiste ad
un suo aumento significativo nel muscolo bianco, nel cuore e nel cervello in seguito ad esposizione a
210 µmol l-1 di NH3 . Dopo il nuoto, tutti i pesci mostravano concentrazioni simili di lattato nel muscolo
bianco e rosso e nel cervello, e solo nel cuore si verificavano incrementi significativi (fig.7).
Non si sono verificate differenze nei trattamenti per quanto riguarda la PaO2 e la CaO2 (tab. 4).
CESI
Rapporto
Concentrazione di lattato
(mmol g-1)
30
A3/012506
Pag.22/43
a
25
20
15
º
10
º
º
5
0
Muscolo bianco
Muscolo rosso
Cuore
Cervello
Fig. 7: concentrazione di lattato (media ± ds) ) in vari tessuti delle trote fario a riposo (barre lisce)
e dopo sforzo (barre punteggiate) esposte per 24 ore a : bianco (controllo, barre bianche);
98 ± 6 µmol l-1 di ammoniaca (barre blu); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca (barre rosse). Il
simbolo ° indica differenze significative rispetto al controllo, il simbolo a indica differenze
significative tra i pesci a riposo e dopo sforzo.
5.1.5
Respirometria e capacità di nuoto
Gli incrementi della velocità di nuoto si riflettevano in un aumento del consumo di ossigeno in tutti i
pesci considerati. A parità di velocità di nuoto, l'esposizione a 98 µmol l-1 aumentava MO2 rispetto ai
controlli e alla concentrazione superiore l’aumento era più consistente. Analogamente, l’esposizione ad
entrambe le concentrazioni di ammoniaca aumentava il costo dell’attività natatoria rispetto ai controlli e
provocava una diminuzione della Ucrit (tab.5). Come si osserva dai dati, i parametri MMR, AMR e
capacità aerobica non subiscono variazioni; in particolare il valore di AMR (consumo metabolico
corrispondente alla massima velocità sostenibile di nuoto) risulta inalterato per effetto della minore
velocità di nuoto raggiunta negli individui esposti (fig. 8).
CESI
Rapporto
Tab.5
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Valori relativi a parametri metabolici, respiratori e di abilità natatoria in trote fario portate
alla Ucrit in seguito ad esposizione ad acqua normossica senza aggiunta di ammoniaca
(controllo), a 98 ± 6 e 210 ± 11 µmoli l-1 di ammoniaca. Il simbolo ° indica una differenza
significativa rispetto al controllo.
Ucrit (bl s-1)
MMR
(mmol O2
kg-1 h-1)
AMR
(mmol O2
kg-1 h-1)
Capacità
aerobica
Massima
frequenza battiti
coda (battiti s-1)
Controllo
2.24 ± 0.15
2.62 ± 0.39
12.32 ± 2.50
4.81 ± 0.54
4.90 ± 0.31
Bassa ammoniaca
1.46 ± 0.09 º
2.43 ± 0.49
10.82 ± 1.87
4.60 ± 0.58
2.85 ± 0.40 º
Alta ammoniaca
1.08 ± 0.16 º
3.15 ± 1.50
13.82 ± 7.18
3.95 ± 0.53
2.60 ± 0.25 º
L’esame delle frequenze dei battiti della coda indica che non vi sono variazioni significative tra i pesci
sottoposti ai differenti trattamenti. La massima frequenza ottenuta viene ridotta notevolmente in seguito
ad esposizione ad entrambe le concentrazioni di ammoniaca, probabilmente perchè i controlli
raggiungono una maggiore Ucrit (tab.5).
a
-1
-1
MO2 (mmol O2 kg h )
45
b
30
b
15
0
0,00
0,33
0,67
1,00
1,33
1,67
2,00
2,33
2,67
3,00
-1
Velocità di nuoto (BL s )
Fig.8: relazione tra velocità di nuoto e consumo di ossigeno (MO2) in trote fario esposte per 24 ore a:
bianco in normossia (controllo, cerchi scuri); 98 ± 6 µmol l-1 di ammoniaca (triangoli verdi);
210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca (quadrati rossi). I gruppi sperimentali erano composti da sei
individui, tranne nel caso di esposizione ad alta concentrazione di ammoniaca, in cui erano
cinque. Il simbolo a denota una differenza significativa tra controllo e bassa ammoniaca e b tra
controllo e alta ammoniaca.
Rapporto
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Il comportamento nel nuoto era significativamente differente nei pesci esposti a 210 µmol l-1 di
ammoniaca rispetto a tutti gli altri, evidenziando una sorta di adattamento allo stress indotto. Infatti in
tali condizioni i pesci, a velocità relativamente basse, tendono a riposarsi nella parte posteriore del
respirometro e, quando spinti a farlo, nuotano per un breve periodo, prima di riposarsi nuovamente.
Quando la velocità di nuoto aumenta, il periodo di nuotata sembra ridursi e quelli di riposo diventano
più frequenti.
Non è possibile evidenziare lo stesso andamento nella frequenza dei battiti della coda, anche perché le
conte non discriminavano i periodi di nuoto e riposo; ciò infatti sarebbe difficilmente attuabile in
maniera accurata soprattutto quando il nuoto è portato ad alte velocità.
5.2
Discussione
Questo studio dimostra che esiste una relazione lineare tra ammoniaca plasmatica e prestazioni di nuoto
nella trota fario esposta a elevate concentrazioni di ammoniaca. Tale relazione era già stata
precedentemente riportata, oltre che nel paragrafo precedente relativo alle trote iridee, anche per trote
fario esposte a rame a bassi valori di pH, e conferma che la riduzione osservata può derivare da un
accumulo di ammoniaca (Beaumont et al., 1995b).
La riduzione di Ucrit di pesci esposti ad ammoniaca non sembra essere conseguenza né di fattori
limitanti, né di fattori di carico: ciò risulta in contrasto con quanto sopra riportato per la trota iridea,
dove invece si verificano una riduzione di AMR (che rappresenta un fattore limitante), e un incremento
di MMR (che rappresenta un fattore di carico).
La riduzione della capacità di nuoto è stata precedentemente associata ad un aumento della
concentrazione dell’ammoniaca plasmatica in seguito ad esposizione a bassi valori di pH (Day & Butler,
1996), a rame associato a bassi valori di pH (Beaumont et al., 1995b, 2000a e 2000b), e, come riportato
nel capitolo precedente, ad ammoniaca, relativamente alla trota iridea. Si può ipotizzare che tale
riduzione sia dovuta a due fattori principali: da una parte la depolarizzazione del potenziale di
membrana delle fibre del muscolo bianco, che interviene nell’attività natatoria, e dall’altra l’effetto
distruttivo dello ione ammonio su diverse vie metaboliche.
Il potenziale di membrana dipende dall’instaurarsi di concentrazioni differenti di potassio e sodio intraed extracellulari, grazie all’attività della pompa Na/K ATPasi, presente in tutte le membrane cellulari.
La parziale depolarizzazione di tale potenziale può essere il risultato della sostituzione dello ione
potassio con lo ione ammonio nella pompa sopra citata, che altera l’equilibrio nel gradiente di
concentrazione di potassio attraverso la membrana cellulare e di conseguenza il potenziale di membrana
stesso (Randall et al., 1999). E’ stato dimostrato che una depolarizzazione compresa tra –55 e –45 mV
provoca la perdita dell’eccitabilità elettrica (Jenerick, 1956); sulla base di tale considerazione, dai valori
di potenziali di membrana calcolati in questo studio si può dedurre che il muscolo bianco dei soggetti
esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca abbia una eccitabilità praticamente nulla e, di conseguenza,
vi sia un suo minore coinvolgimento, rispetto ai controlli, nell’attività di nuoto.
Durante l’esercizio, l’ammoniaca potrebbe essere prodotta dalle cellule del muscolo in attività in seguito
a deaminazione dell’AMP (adenosina 5’-monofosfato) nel ciclo della degradazione dei nucleotidi
purinici (Weicker et al., 1990; Mommsen & Hochachka, 1988). In effetti, i pesci del gruppo del
controllo sottoposti ad esercizio del presente studio sono caratterizzati da concentrazioni di ammoniaca
tissutale superiore rispetto a quelli mantenuti a riposo: la concentrazione di ammoniaca nei tessuti può
quindi dare un’indicazione del lavoro muscolare durante l’attività di nuoto. Il muscolo bianco dei pesci
esposti alle due concentrazioni di ammoniaca e fatti nuotare alla Ucrit era caratterizzato da valori simili di
ammoniaca, mentre nei pesci mantenuti a riposo si aveva una concentrazione maggiore in seguito ad
esposizione a 210 µmol l-1. Questo suggerisce che il muscolo bianco in attività dei pesci esposti alla
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concentrazione inferiore di ammoniaca potrebbe aver prodotto una maggiore quantità di ammoniaca
endogena rispetto a pesci esposti a quella superiore, e che quindi il muscolo bianco sia stato
maggiormente utilizzato per il nuoto. E’ possibile che l’ammoniaca venga prodotta sino ad una
concentrazione soglia, quando il muscolo è in condizioni di affaticamento o di depolarizzazione, e che i
pesci esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca potrebbero raggiungere tale soglia prima dei controlli.
Il fatto che l’esposizione all’ammoniaca provochi un incremento nel costo del nuoto e del consumo di
ossigeno può essere indicativo di un utilizzo maggiore del muscolo rosso, in gran parte aerobico, per
tutta la durata del test Ucrit. Questo comportamento, piuttosto insolito nel pesce in condizioni normali,
probabilmente permette un recupero dall’affaticamento e dall’instaurarsi di processi anaerobici nel
muscolo rosso, che impedirebbero al pesce di continuare a nuotare. Tra l’altro, i periodi brevi ma ripetuti
in cui il pesce si riposa potrebbero in qualche modo ripristinare lo stato metabolico bilanciato del
tessuto. L’evidenza sperimentale indica che il muscolo rosso non viene depolarizzato significativamente
rispetto ai controlli; d’altra parte è necessario considerare che ciò potrebbe essere una conseguenza
dell’alta variabilità del potenziale di membrana calcolato nei controlli stessi.
Questo studio ha anche evidenziato una parziale ma significativa depolarizzazione del cuore e del
cervello dei pesci esposti all’ammoniaca, i cui effetti sulle capacità di nuoto sarebbero evidenti. In
particolare la depolarizzazione del cuore limiterebbe le prestazioni, in misura minore probabilmente per
le basse velocità, ma in modo marcato quando aumenta la richiesta di energia.
I dati presentati indicano che la depolarizzazione delle fibre muscolari è il fattore che controlla la
capacità di nuoto. In ogni caso, indagini ulteriori in relazione allo stato metabolico dei tessuti rivelano
che l’ammoniaca può agire su diverse vie metaboliche, interferendo così nelle prestazioni natatorie. In
condizioni aerobiche, i prodotti della glicolisi nel muscolo rosso seguono normalmente la via metabolica
del ciclo di Krebs, venendo quindi completamente ossidati a CO2, senza dare luogo ad accumuli di
lattato. E’ improbabile che la limitazione della disponibilità di ossigeno, dovuta al danneggiamento
branchiale indotto, sia la causa, in quanto non si assiste a riduzioni di PaO2 e CaO2, anche se ciò
potrebbe avvenire nel caso in cui il cuore non sia in condizioni fisiologiche ottimali in seguito alla
depolarizzazione delle sue fibre muscolari. In alternativa, l’elevata concentrazione di lattato nel muscolo
rosso dei pesci a riposo esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca potrebbe essere una conseguenza
degli effetti dello ione ammonio sui processi metabolici di questo tessuto.
L’accumulo di lattato infatti potrebbe risultare anche da un incremento della glicolisi, in quanto è stato
dimostrato che lo ione ammonio ha un effetto stimolante sulla fosfofruttochinasi (Sudgen &
Newsholme, 1975; Beaumont et al., 2000a). In questo modo si verificherebbe una produzione di
piruvato in eccesso rispetto a quanto viene ossidato nei mitocondri, che quindi verrebbe convertito a
lattato, dando luogo ad accumulo nelle cellule.
Un’altra possibilità deriva dall’effetto inibitore dello ione ammonio sul ciclo di Krebs. Infatti esso può
interferire nella conversione del piruvato ad acetil-Coenzima A, e quindi nell’avvio del ciclo, per
inibizione del complesso enzimatico della piruvato deidrogenasi (Katunuma et al., 1996); inoltre
inibisce anche i complessi isocitrato e α-chetoglutarato deidrogenasi, da cui risulta una limitazione della
produzione di energia e dell’efficienza del ciclo stesso, con effetti negativi sul metabolismo aerobico.
In conclusione, questo studio ha rivelato che esiste una relazione lineare tra la concentrazione di
ammoniaca plasmatica e la riduzione delle prestazioni di nuoto nella trota fario, dovuta ad un insieme di
fattori:
-
la depolarizzazione del cervello, che può impedire il controllo nervoso;
la depolarizzazione del muscolo bianco, che può limitare il suo intervento alle alte velocità di
nuoto, costringendo il pesce a continuare ad utilizzare il muscolo rosso per il nuoto;
Rapporto
-
6
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la depolarizzazione del cuore, che può limitare la capacità di nuoto attraverso la riduzione del
rilascio di ossigeno ai tessuti locomotori e dare luogo all’instaurarsi di affaticamento muscolare;
la riduzione dell’efficienza delle vie metaboliche aerobiche e anaerobiche, che può
compromettere l’abilità del tessuto muscolare.
CONFRONTO DEGLI EFFETTI DELL’ ESPOSIZIONE AD AMMONIACA SU
TROTA FARIO ED IRIDEE
Come già evidenziato nei capitoli precedenti, sia nella trota fario sia nella trota iridea esiste una
relazione inversa tra concentrazione di ammoniaca plasmatica e massima velocità di nuoto sostenibile.
E’ possibile, d’altra parte, evidenziare alcune differenze nel comportamento delle trote considerate in
seguito ad esposizione ad ammoniaca, come si evince dai diagrammi riportati in Fig. 9.
Nella Fig. 9A si osserva che la trota iridea necessita di una maggiore concentrazione di ammoniaca
nell’acqua di esposizione per ottenere lo stesso grado di riduzione della capacità di nuoto, indicando una
maggiore tolleranza alla presenza di ammoniaca nell’ambiente esterno.
Nella Fig. 9B è riportato l’andamento della concentrazione di ammoniaca nel plasma al variare della
concentrazione di ammoniaca totale nell’acqua: si osserva che, a parità di concentrazione esterna, la
trota iridea presenta livelli di ammoniaca plasmatica inferiori rispetto alla trota fario.
Inoltre, riportando i dati di concentrazione in termini di ammoniaca libera (Fig. 9C), si rileva che nel
plasma delle trote iridee essa è inferiore anche a quella dell’acqua di esposizione (7.01 rispetto a 20
µmol l-1), mentre nella trota fario le concentrazioni sono in equilibrio; ciò rivela la presenza, nelle prime,
di un processo di regolazione della concentrazione dell’ammoniaca plasmatica contro un gradiente di
concentrazione. Tale processo può verificarsi grazie a due diversi meccanismi: una maggiore capacità di
escrezione attiva dello ione ammonio (Wilson & Taylor, 1992; Randall et al., 1999), da una parte, e
dall’altra la possibilità di modificare il microambiente branchiale, creando, ad esempio, uno strato
superficiale più acido e quindi riducendo la concentrazione di ammoniaca plasmatica nelle cellule
epiteliali delle branchie stesse (Wilson et al. 1994b; Salama et al. 1999).
CESI
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Ucrit (bodylengths s-1)
2.5
2.0
1.5
1.0
(A)
0.5
plasma [ammonia] (µmol l-1)
0
100
200
300
acqua [ammonia] (µmol l-1)
800
600
400
200
(B)
0
0
100
200
300
plasma [ NH3 ] (µmol l-1)
acqua[ammonia] (µmol l-1)
15
10
5
(C)
0
0
10
20
acqua [ NH3 ] (µmol l-1)
Fig. 9: relazione tra concentrazione di ammoniaca nell’acqua di esposizione e Ucrit (A), ammoniaca
totale plasmatica arteriosa (B) e ammoniaca libera plasmatica (C) in trota fario (simboli chiari)
e trota iridea (simboli scuri).
Per quanto riguarda i parametri fisiologici e metabolici, si notano delle variazioni sostanziali tra le due
specie dopo esposizione ad ammoniaca. Infatti, se da una parte aumenta per entrambe il costo del nuoto
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e diminuisce la massima velocità sostenibile, dall’altra si assiste per la trota iridea ad una variazione dei
parametri AMR e MMR e per la fario ad una maggiore diminuzione della velocità massima sostenibile e
della frequenza dei battiti della coda (tab. 6).
Tab. 6: Valori medi dei parametri metabolici, di respirazione e di prestazioni di nuoto in fase di
esercizio per trota iridea e fario alla velocità critica sia del gruppo di controllo sia di quello
esposto ad alte concentrazioni di ammoniaca. MMR, rateo di mantenimento metabolico; AMR,
rateo metabolico attivo come massimo MO2 misurato; Ucrit, massima velocità di nuoto
sostenibile. * denota una differenza statisticamente significativa dal gruppo di controllo (t-test,
p < 0.05).
Trota iridea
MMR
(mmol O2 kg-1 h-1)
AMR
(mmol O2 kg-1 h-1)
Capacità aerobica (mmol O2
kg-1 h-1)
Massima frequenza di battiti
della coda (battute s-1 )
Ucrit (bl s-1 )
Trota fario
Gruppo
Controllo
Gruppo
Esposto
Gruppo
Controllo
Gruppo
Esposto
3.04 ± 0.86
5.65 ± 0.59*
2.62 ± 0.39
3.15 ± 1.50
19.39 ± 1.68
13.63 ± 1.42*
12.32 ± 2.50
13.82 ± 7.18
6.38 ± 2.58
2.41 ± 0.61*
4.81 ± 0.54
3.95 ± 0.53
3.77 ± 0.04
3.47 ± 0.12*
4.90 ± 0.31
2.60 ± 0.25*
2.23 ± 0.15
1.61 ± 0.17*
2.24 ± 0.15
1.08 ± 0.16*
È stata dunque rilevata una diversa abilità natatoria delle due specie quando esposte a concentrazioni
subletali di ammoniaca: in particolare le migliori performance di nuoto della trota iridea sono collegate a
una maggiore capacità di limitare l’accumulo di ammoniaca, presumibilmente grazie a un efficiente
meccanismo di escrezione attiva.
Il diverso comportamento evidenziato indicherebbe quindi delle differenze interspecifiche nella
permeabilità e nel trasporto dell’ammoniaca e, in particolare, una maggiore vulnerabilità della trota fario
rispetto alla iridea.
Rapporto
7
CESI
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Pag.29/43
EFFETTI DELL’ESPOSIZIONE AD AMMONIACA IN CONDIZIONI DI
IPOSSIA SU TROTA FARIO
Se da una parte è già stato dimostrato, in letteratura e nei precedenti paragrafi, come l’ammoniaca riduca
la capacità di nuoto dei pesci attraverso la distruzione dello stato metabolico ed elettrofisiologico dei
tessuti, dall’altra è noto che l’ipossia influenzi le prestazioni limitando la capacità aerobica, ovvero
attraverso la riduzione della capacità di incrementare il processo di fosforilazione ossidativa quando
aumenta la richiesta di energia (Dahlberg et al., 1968).
Dato che spesso nell’ambiente concentrazioni elevate di ammoniaca sono associate a fenomeni di
ipossia, soprattutto a causa della degradazione batterica della sostanza organica, questo studio ha come
obiettivo quello di verificare se l’esposizione ad entrambe le condizioni abbia effetti additivi sulle
capacità di nuoto di pesci migratori come le trote.
Di seguito vengono riportati le fasi sperimentali seguite e i risultati ottenuti.
7.1
Risultati
Lo studio è stato suddiviso in quattro diverse prove di sei gruppi di trote fario:
1. Esposizione in acqua ben ossigenata, avente valori “ambientali” di ammoniaca (2 µm mol l-1)
(controllo)
2. Esposizione in acqua ben ossigenata con concentrazioni “ambientali” di ammoniaca (2 µmol l-1), in
cui la pressione parziale (PwO2) dell’ossigeno è stata ridotta tra il 50-55% durante l’ora finale di
esposizione (ipossia).
3. Esposizione in acqua ben ossigenata con concentrazione di 98±1 µmol l-1 di NH4Cl per 24 ore, in cui
la pressione parziale (PwO2) dell’ossigeno è stata ridotta tra il 50-55% durante l’ora finale di
esposizione (bassa ammoniaca - ipossia)
4. Esposizione in acqua ben ossigenata con concentrazione di 210±4 µmol l-1 di NH4Cl per 24 ore, in
cui la pressione parziale (PwO2) dell’ossigeno è stata ridotta tra il 50-55% durante l’ora finale di
esposizione (alta ammoniaca - ipossia).
Le prove sono state ripetute su sei ulteriori gruppi che, dopo l’esposizione, sono stati fatti nuotare fino al
raggiungimento della velocità massima sostenibile (Ucrit), secondo le modalità descritte nel paragrafo
3.4.2.
7.1.1 Ammoniaca nel plasma e nei tessuti
Nelle trote a riposo l’esposizione a 210 µmol l-1 di ammoniaca concomitante ad 1 ora di debole ipossia
aumenta la concentrazione di ammoniaca plasmatica in misura maggiore rispetto alle altre condizioni,
mentre l’esposizione alla concentrazione inferiore, sempre in presenza di ipossia, dà luogo ad un
aumento di proporzioni non significative rispetto al controllo. L’esposizione alla sola ipossia, in ogni
caso, non ha effetti sulla concentrazione dell’ammoniaca plasmatica (tab.7).
I pesci esposti ad entrambe le concentrazioni di ammoniaca e portati a nuotare alla Ucrit accumulano alti
livelli di ammoniaca nel cervello, mentre negli altri tessuti i valori sono simili per tutti i trattamenti
esaminati (fig. 10).
CESI
Rapporto
Tab.7
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Valori di concentrazioni di ammoniaca, lattato e pH del plasma arterioso, pressione parziale
di ossigeno nel sangue e contenuto totale di ossigeno, espressi come media ± ds, in trote fario
a riposo, dopo esposizione ad acqua normossica senza aggiunta di ammoniaca (controllo),
acqua con PWO2 ridotta a 50-55% di saturazione di aria per 1 ora (ipossia), a 98 ± 6 (BA
ipossia) e 210 ± 11 µmoli l-1 (AA ipossia) entrambe con PWO2 ridotta a 50-55% di saturazione
di aria per 1 ora. Il simbolo ° indica una differenza significativa rispetto al controllo.
pH
plasmatico
Lattato
plasmatico
(mmol l-1)
PaO2
(mmHg)
CaO2
(vol.%)
Controllo
133.6 ± 29.2
7.825 ± 0.060
0.55 ± 0.20
104.2 ± 13.9
8.5 ± 1.4
Ipossia
182.9 ± 52.7
7.884 ± 0.061
0.54 ± 0.18
64.1 ± 7.6º
10.0 ± 0.9
BA ipossia
341.9 ± 19.5 º
7.975 ± 0.063
0.81 ± 0.27
80.3 ± 15.4
8.1 ± 1.3
AA ipossia
841.4 ± 93.5 º
7.919 ± 0.025
3.17 ± 1.04º
34.8 ± 3.8º
6.1 ± 1.3
-1
Concentrazione ammoniaca (umol g )
Ammoniaca
plasmatica
(µmol l-1)
7
º
†
6
º
†
5
4
3
2
1
0
Muscolo bianco
Muscolo rosso
Cuore
Cervello
Fig. 10: concentrazione di ammoniaca (media ± ds) in vari tessuti delle trote fario dopo sforzo (portate
alla Ucrit) ed esposizione a: bianco in normossia (controllo, barre bianche); ipossia (barre
blu); 98 ± 6 µmol l-1 di ammoniaca in ipossia (barre verdi); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca in
ipossia (barre rosse). Il simbolo ° indica differenze significative rispetto al controllo, il
simbolo † indica differenze significative rispetto al gruppo esposto alla sola ipossia.
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7.1.2 pH intra e extracellulare
L’esposizione alla concentrazione inferiore di ammoniaca aumenta il pH del sangue arterioso rispetto al
controllo (tab. 7).
Nei pesci esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca in condizioni di ipossia, il pH intracellulare del
cervello si riduce, dopo il nuoto, rispetto a quello dei pesci esposti alla concentrazione inferiore, e ciò è
probabilmente dovuto all’effetto distruttivo dell’ammoniaca sul metabolismo altamente aerobico del
tessuto cerebrale. Il pH misurato dopo l’attività di nuoto negli altri tessuti risulta simile per tutti i
trattamenti a cui sono stati sottoposti i pesci.
7.1.3 Lattato plasmatico e tissutale
L’esposizione a 210 µmol l-1 di ammoniaca concomitante ad ipossia aumenta la concentrazione di lattato
nel plasma del pesce a riposo, in misura maggiore rispetto ai pesci sottoposti a tutte le altre condizioni
Inoltre per lo stesso trattamento si ha una riduzione della PaO2 del sangue arterioso rispetto agli altri
trattamenti, mentre la CaO2 non viene ridotta in nessun caso (tab. 7).
-1
Concentrazione di lattato (mmol l )
Nei pesci sottoposti a Ucrit si è evidenziata una differenza significativa solo per il muscolo cardiaco, nel
trattamento BA + ipossia (barra verde nel grafico di Fig. 11).
Fig. 11:
30
20
10
º
0
Muscolo bianco
Muscolo rosso
Cuore
Cervello
concentrazione di lattato (media ± ds) in vari tessuti delle trote fario esposte per 24 ore
a: bianco in normossia (controllo, barre bianche); ipossia (barre grigio chiaro); 98 ± 6
µmol l-1 di ammoniaca in ipossia (barre grigio scuro); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca
in ipossia (barre nere). Il simbolo ° indica differenze significative rispetto al controllo,
il simbolo † indica differenze significative rispetto al gruppo esposto alla sola ipossia.
CESI
Rapporto
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7.1.4 Respirometria
L’esposizione a tutti i trattamenti riduce la Ucrit rispetto al controllo (tab.8). Non vi sono variazioni in
MO2 associati all’ipossia e gli incrementi nella velocità di nuoto danno luogo ad aumenti simili a quelli
osservati nel controllo.
Durante l’esposizione a basse concentrazioni di ammoniaca in condizioni di ipossia MO2 aumenta
significativamente rispetto al controllo; alle alte concentrazioni, sempre in condizioni di ipossia, essa
aumenta in misura maggiore rispetto agli altri pesci sino a velocità di nuoto pari a 1.33 bl s-1 (fig.12).
I pesci esposti ad ipossia ottengono il minore AMR, mentre ad entrambe le concentrazioni di ammoniaca
in condizioni di ipossia tale parametro non subisce riduzioni. Ad alte concentrazioni di ammoniaca, in
presenza di ipossia, si ottiene un MMR elevato e una ridotta capacità aerobica (tab. 8).
L’esame della frequenza dei battiti della coda rivela che alle basse velocità di nuoto essa è maggiore per
i controlli rispetto ai pesci esposti alle due concentrazioni in ipossia, probabilmente perché i primi
raggiungono una maggiore Ucrit (fig.13).
Tab.8
Valori relativi a parametri metabolici, respiratori e di abilità natatoria, espressi come media ±
ds, in trote fario portate alla Ucrit in seguito ad esposizione ad acqua normossica senza
aggiunta di ammoniaca (controllo), acqua con PWO2 ridotta a 50-55% di saturazione di aria
per 1 ora (ipossia), a 98 ± 6 (BA ipossia) e 210 ± 11 µmoli l-1 (AA ipossia) entrambe con PWO2
ridotta a 50-55% di saturazione di aria per 1 ora. Il simbolo ° indica una differenza
significativa rispetto al controllo.
Controllo
2.24 ± 0.15
MMR
(mmol O2
kg-1 h-1)
2.62 ± 0.39
Ipossia
1.23 ± 0.09 º
1.97 ± 0.41
7.62 ± 1.80 º
3.94 ± 0.43
2.98 ± 0.11 º
BA Ipossia
1.03 ± 0.10 º
2.68 ± 1.37
9.48 ± 1.33 º
4.00 ± 0.55
2.92 ± 0.35 º
AA Ipossia
1.17 ± 0.13 º
6.18 ± 0.45 º
12.19 ± 1.00
1.98 ± 0.11º
2.44 ± 0.26 º
Ucrit
(BL s-1)
AMR
(mmol O2
kg-1 h-1)
12.32 ± 2.50
Capacità
aerobica
4.81 ± 0.54
Massima frequenza battiti
della coda
(battiti s-1)
4.90 ± 0.31
CESI
Rapporto
-1
30
-1
MO2 (mmol O2 kg h )
35
25
b
A3/012506
Pag.33/43
b
a
b
b
20
15
10
5
0
0,00
0,33
0,67
1,00
1,33
1,67
2,00
-1
Velocità di nuoto (BL s )
2,33
2,67
3,00
Fig.12: relazione tra velocità di nuoto e consumo di ossigeno (MO2) in trote fario esposte per 24 ore a:
bianco in normossia (controllo, cerchi grigi); ipossia (triangoli blu); 98 ± 6 µmol l-1 di
ammoniaca in ipossia (rombi verdi); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca in ipossia (quadrati
rossi). I gruppi sperimentali erano composti da sei individui, tranne nel caso di esposizione a
basse concentrazioni di ipossia, in cui erano cinque. Il simbolo a denota una differenza
significativa tra controllo e bassa ammoniaca in ipossia e b una differenza significativa tra
alta ammoniaca in ipossia e gli altri gruppi.
12
b
a
a
-1
-1
(mmol O2 kg h )
Costo dell'attività di nuoto
16
8
b
4
0
0,00
0,33
0,67
1,00
1,33
1,67
2,00
-1
2,33
2,67
3,00
Velocità di nuoto (BL. s )
Fig. 13: relazione tra costo del nuoto e velocità di nuoto nelle trote fario esposte per 24 ore a: bianco
in normossia (controllo, cerchi grigi); ipossia (triangoli blu); 98 ± 6 µmol l-1 di ammoniaca in
ipossia (triangoli verdi); 210 ± 11 µmol l-1 di ammoniaca in ipossia (quadrati rossi). I gruppi
sperimentali erano composti da sei individui, tranne nel caso di esposizione a basse
concentrazioni di ipossia, in cui erano cinque. Il simbolo a denota una differenza significativa
tra controllo e bassa ammoniaca in ipossia e b una differenza significativa tra alta ammoniaca
in ipossia e gli altri gruppi.
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Come già osservato (par 5.1.5), il comportamento nel nuoto è significativamente differente nei pesci
esposti a 210 µmol l-1 di ammoniaca rispetto a tutti gli altri, evidenziando una sorta di adattamento allo
stress indotto. Infatti in tali condizioni i pesci, a velocità relativamente basse, tendono a riposarsi nella
parte posteriore del respirometro e, quando spinti a farlo, nuotano per un breve periodo, prima di
riposarsi nuovamente. Quando la velocità di nuoto aumenta, il periodo di nuotata sembra ridursi e quelli
di riposo diventano più frequenti.
Non è possibile evidenziare lo stesso andamento nella frequenza dei battiti della coda, probabilmente
perché le conte non discriminavano i periodi di nuoto e riposo; ciò infatti sarebbe difficilmente attuabile
in maniera accurata soprattutto quando il nuoto è portato ad alte velocità.
I pesci esposti alla concentrazione maggiore di ammoniaca virano verso una ventilazione ram (passiva, a
bocca aperta e opercoli fermi) quando nuotano ad alte velocità.
7.2
Discussione
7.2.1 Esposizione ad ipossia
L’ipossia limita le prestazioni di nuoto, come atteso e già dimostrato da dati di letteratura. Ciò è
probabilmente dovuto al fatto che la bassa disponibilità di ossigeno limita la capacità del pesce di
incrementare il metabolismo aerobico e quindi limita la capacità aerobica.
E’ probabile che le prestazioni di nuoto dei pesci in condizioni di ipossia verificate nel presente studio
siano limitate dalla disponibilità di ossigeno in quanto questi pesci ottengono MO2 simili ai controlli, e
l’AMR ottenuta è inferiore a quella di tutti gli altri pesci sottoposti ai differenti trattamenti
Quando questi pesci iniziano a nuotare, la loro richiesta di energia aumenta e la disponibilità di ossigeno
risulta insufficiente per sostenere la fosforilazione ossidativa e quindi per soddisfare il consumo di
energia; di conseguenza vengono attivati processi anaerobici. Ciò è evidenziato dall’alta concentrazione
di lattato nei muscoli rosso e bianco, in quest’ultimo superiore a quella riscontrata in tutti gli altri
trattamenti, fenomeno plausibile quando la disponibilità di ossigeno è limitata, in quanto il muscolo
bianco è un sito spesso associato a metabolismo anaerobico.
Il pesce a riposo esposto al 50-55% di saturazione di aria è improbabile che sopporti effetti limitanti
dovuti alla bassa concentrazione di ossigeno: in queste condizioni si deve assumere che sia attiva la
fosforilazione ossidativa e che il pesce stesso sia in grado di estrarre sufficiente ossigeno dall’acqua per
sostenere il metabolismo aerobico e soddisfare quindi la richieste di energia. Ciò è dimostrato anche dal
fatto che il pesce in condizioni di ipossia non incorre in carichi di lattato plasmatico prima di nuotare.
7.2.2 Esposizione ad ammoniaca ed ipossia
Entrambe le condizioni separate, ovvero ammoniaca e ipossia, riducono le prestazioni di nuoto; nel
primo caso attraverso la distruzione dello stato elettrofisiologico e metabolico dei tessuti, nel secondo
attraverso la limitazione della capacità aerobica. Quando si ha l’esposizione ad entrambe le condizioni
non si assiste ad effetti additivi sulla Ucrit: nonostante essa venga ridotta, rispetto al controllo, in seguito
all’esposizione alle due concentrazioni di ammoniaca in condizioni di ipossia, le prestazioni di nuoto
sono paragonabili a quelle dei pesci esposti ad ipossia o ad ammoniaca separatamente.
La riduzione delle prestazioni di nuoto di pesci esposti alla concentrazione maggiore di ammoniaca
sembra essere, almeno in parte, dovuta ad un fattore di carico. Ciò è evidenziato dall’alta concentrazione
di lattato e dall’elevato MMR dei pesci che incorrono in un forte carico metabolico prima del nuoto. Il
fatto che ad alte concentrazioni di ammoniaca e in condizioni di ipossia non vi siano effetti additivi sulla
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Ucrit è singolare, poiché questi pesci, pur avendo una ridotta capacità aerobica, nuotano come gli altri
pesci esposti ad ammoniaca in presenza o in assenza di ipossia.
Anche l’elevato carico di lattato plasmatico nei pesci mantenuti a riposo e quindi esposti ad alte
concentrazioni di ammoniaca e ipossia è in qualche modo singolare, in quanto il livello di ipossia
impiegato in questo studio era sufficiente per ridurre la PaO2 del pesce a riposo ma non il contenuto
globale di ossigeno e, di conseguenza, il metabolismo basale non sarebbe dovuto incorrere in alcuna
limitazione. Inoltre, è necessario considerare che questi pesci, essendo a riposo, avrebbero dovuto avere
una ridotta richiesta di energia. L’accumulo di lattato nei tessuti è in parte probabilmente dovuto
all’effetto distruttivo dell’ammoniaca sul metabolismo; l’alta concentrazione di ammoniaca riscontrata
nel cervello di pesci esposti e la riduzione del pH intracellulare del tessuto cerebrale possono infatti
essere indicative di disturbi metabolici. Non è chiaro se l’accumulo di ammoniaca riflette uno squilibrio
del metabolismo degli aminoacidi, ovvero un aumento di liberazione di ammoniaca nel cervello dal
glutammato, per azione dell’enzima glutammato deidrogenasi, o una riduzione del suo utilizzo per la
conversione da glutammato a glutammina, attraverso la glutamina sintetasi.
L’accumulo di ammoniaca nei cervelli di questi pesci non è accompagnato da accumuli di lattato, che
invece si accumula nel sangue di pesci esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca. Ciò può essere
correlato alla depolarizzazione del cuore indotta dall’ammoniaca stessa, che può impedire il rilascio di
ossigeno ai tessuti e quindi dare luogo ad ipossia tissutale. La riduzione della disponibilità di ossigeno
concomitante alla ridotta funzionalità del cuore e ad una ridotta PaO2 nel sangue può aver dato luogo ad
ipossia su larga scala ed accumulo di lattato.
Il lattato prodotto nel tessuto generalmente passa nel fluido extracellulare e viene trasportato attraverso il
flusso sanguigno in tutto il corpo, in modo che sia convertito in piruvato e convogliato verso la
fosforilazione ossidativa nei mitocondri, oppure utilizzato per sintetizzare glucosio nel fegato, attraverso
la gluconeogenesi.
Probabilmente il lattato viene prodotto nelle stesse quantità ad alte concentrazioni di ammoniaca in
condizioni di ipossia o di normossia, ma nel primo caso esso viene rilasciato nel fluido extracellulare e
non si accumula nelle cellule. La ragione di ciò non è nota, anche se può riflettere le variazioni nella
circolazione periferica nei pesci sottoposti a condizioni differenti: in caso di ipossia, ad esempio, è stato
dimostrato che si ha un accumulo di sangue ai tessuti locomotori.
L’accumulo di lattato può anche riflettere l’effetto inibente dell’ammoniaca sulla gluconeogenesi.
L’ammoniaca infatti è nota inibire la piruvico decarbossilasi, per cui il lattato che si accumula (dovuto
all’effetto stimolante sulla fosfofruttochinasi, che aumenta il flusso glicolitico, e a quello inibente sul
complesso enzimatico della piruvico deidrogenasi, riducendo la conversione ad acetil-Coenzima A e
quindi l’attività del ciclo di Krebs) non può essere convertito in glucosio e glicogeno nel fegato.
La variazione nel comportamento locomotorio del pesce esposto ad alte concentrazione di ammoniaca in
condizioni di ipossia è stato precedentemente osservato in trote fario esposte alle stesse concentrazioni
ma in normossia. Questo fenomeno è stato descritto anche per trote fario iperammoniemiche esposte a
bassi pH, in cui gli elettromiografi rivelarono che i pesci in queste condizioni non utilizzano il muscolo
bianco per nuotare ma si basano su un maggiore utilizzo del muscolo rosso. Ciò può essersi verificato
anche nel presente studio, anche se le differenze nelle modalità di nuoto tra pesci esposti e controlli
erano chiaramente visibili solo per velocità di nuoto relativamente basse.
E’ stato suggerito che la trota iridea utilizzi il muscolo bianco della parte anteriore e mediana per le
basse velocità di nuoto, e quello della parte caudale quando le velocità raggiungono la Ucrit. Di contro, i
pesci esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca si suppone utilizzino per il nuoto, in misura
predominante, il muscolo aerobico rosso, dando luogo ad aumenti di MO2, AMR e COS.
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E’ possibile che l’esposizione ad ammoniaca ed ipossia insieme provochi una risposta generale di stress,
oltre a quella dovuta all’esposizione a solo una delle due condizioni, rendendo il pesce più determinato a
nuotare, probabilmente per allontanarsi ed evitare tale condizione. La risposta di stress può coinvolgere
sostanze quali le catecolamine, che vengono liberate nel flusso sanguigno dando luogo ad un aumento di
uptake di ossigeno nelle branchie e del rilascio ai tessuti in attività. Inoltre ormoni quali il cortisolo,
prodotti in queste condizioni, sono noti per provocare un aumento del tasso metabolico basale, e ciò
giustificherebbe l’aumento riscontrato di MMR (Morgan & Iwama, 1996).
L’esposizione all’ammoniaca sembra quindi migliorare gli effetti negativi indotti dalla sola ipossia. Gli
AMR raggiunti dai pesci esposti ad entrambe le concentrazioni di ammoniaca in condizioni di ipossia
non vengono ridotti rispetto ai controlli, ai pesci esposti alla sola ipossia e a quelli esposti alle stesse
concentrazioni di ammoniaca ma in condizioni di buona ossigenazione. Nella tabella 9 si riporta un
confronto dei parametri misurati per le diverse condizioni di esposizione.
Tab. 9 Valori relativi a parametri metabolici, respiratori e di abilità natatoria in trote fario portate
alla Ucrit in seguito ad esposizione ad acqua normossica senza aggiunta di ammoniaca
(controllo), a 98 ± 6 e 210 ± 11 µmoli l-1 di ammoniaca in condizioni normossiche (BA, AA) e
ipossiche (BA ipossia, AA ipossia) rispettivamente. Il simbolo ° indica una differenza
significativa rispetto al controllo.
Ucrit (bl s-1)
MMR
(mmol O2
kg-1 h-1)
AMR
(mmol O2
kg-1 h-1)
Capacità
aerobica
Massima frequenza
battiti della coda
(battiti s-1)
Controllo
2.24 ± 0.15
2.62 ± 0.39
12.32 ± 2.50
4.81 ± 0.54
4.90 ± 0.31
BA
1.46 ± 0.09 º
2.43 ± 0.49
10.82 ± 1.87
4.60 ± 0.58
2.85 ± 0.40 º
BA Ipossia
1.03 ± 0.10º
2.68 ± 1.37
9.48 ± 1.33º
4.00 ± 0.55
2.92 ± 0.35 º
AA
1.08 ± 0.16 º
3.15 ± 1.50
13.82 ± 7.18
3.95 ± 0.53
2.60 ± 0.25 º
AA Ipossia
1.17 ± 0.13 º
6.18 ± 0.45º
12.19 ± 1.00
1.98 ± 0.11º
2.44 ± 0.26 º
Un’altra importante osservazione è che i pesci esposti ad alte concentrazioni di ammoniaca in condizioni
di ipossia, quando nuotano alle velocità maggiori, si riposano verso il retro del respirometro con la bocca
spalancata. Le bocche rimangono tali anche quando i pesci ricominciano a nuotare. Non è chiaro se
questo indichi una progressione da una ventilazione attiva a una ram; in ogni caso, se lo fosse, potrebbe
parzialmente spiegare la capacità di questi pesci di mantenere l’attività natatoria.
La ventilazione ram è già stata osservata in trote iridee, e può essere giustificata dal fatto che basse pO2
richiedono maggiori velocità dell’acqua stessa per sollecitare una transizione alla modalità ventilatoria.
In questo caso è stato visto che si ha una riduzione del consumo di ossigeno del 10.2% concomitante
all’utilizzo della ventilazione ram rispetto a quella attiva, dovuta probabilmente al trasferimento del
lavoro dalla bocca e dalle pompe opercolari ai muscoli natatori. In tal modo una maggiore proporzione
di ossigeno inalato è in grado di raggiungere i muscoli natatori invece che quelli respiratori craniali. Non
è noto perché un simile comportamento non si verifichi in pesci esposti ad ipossia.
Studi precedenti hanno riguardato la valutazione di questo potere adattativo della trota in condizioni di
stress. E’ stata dimostrata l’assenza di effetti additivi di ipossia e pentaclorofenolo (PCP) in relazione
alle prestazioni natatorie di sockeye salmon (Oncorhynchus nerka), rispetto alle singole condizioni che
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avevano entrambe profondi effetti sia sulla fisiologia sia sull’abilità natatoria (Farrell et al., 1998).
L’esposizione a ipossia e PCP aumentava, rispetto ai controlli, la MO2 nei pesci durante il nuoto; tali
pesci avevano notevoli carichi di lattato prima e durante il nuoto, anche se esibivano la stessa abilità
natatoria dei controlli. Gli autori suggerivano a tale proposito che il trattamento con PCP sembrava
migliorare gli effetti negativi dell’ipossia.
In conclusione i risultati di questo studio dimostrano l’assenza di effetti additivi sulla Ucrit in seguito ad
esposizione ad ammoniaca ed ipossia. Ciò indica che il peggioramento delle prestazioni di nuoto indotto
dall’ammoniaca non è correlato, nella trota fario, alla disponibilità di ossigeno. E’ possibile che l’attività
degli enzimi chiave del ciclo di Krebs venga ridotta dalla presenza di ammoniaca e, di conseguenza,
anche se viene assunto ossigeno in quantità sufficiente, tale ciclo metabolico sia inefficiente e non si
produca ATP in quantità sufficiente per supportare alte velocità di nuoto, ovvero un aumento della
richiesta di energia.
Per stabilire il ruolo della diminuita efficienza del ciclo di Krebs nella prestazione natatoria sarà
necessario misurare lo stato metabolico dei tessuti e l’attività degli enzimi coinvolti, oltre alla verifica
dell’accumulo di eventuali intermedi del ciclo stesso.
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CONCLUSIONI
Nel presente lavoro sono state condotte prove sperimentali aventi come obiettivo quello di stimare gli
effetti dell’ammoniaca in presenza ed in assenza di ipossia sulle prestazioni natatorie di specie pregiate
di pesci, come la trota fario (Salmo trutta, autoctona italiana), la cui presenza nei corsi d’acqua del
territorio italiano è minacciata sia dalle condizioni inospitali sia dalla concorrenza di altre specie più
forti, e la trota iridea (Oncorhynchus mykiss, alloctona importata dal Nord America). Ciò in
considerazione del fatto che nei bacini idroelettrici sono presenti spesso concentrazioni significative di
ammoniaca; in particolare le acque scaricate dai serbatoi idroelettrici, sia durante le normali fasi di
produzione, soprattutto nella stagione estiva, sia in seguito ad operazioni di spurgo e svaso, possono
essere caratterizzate da concentrazioni elevate, a cui generalmente corrisponde un basso contenuto di
ossigeno disciolto. Gli ecosistemi acquatici interessati possono risentire di tali condizioni, in quanto si
possono verificare alterazioni del metabolismo degli organismi presenti e riduzione della capacità di
nuoto dei pesci, in particolare per specie come le trote, che popolano tratti di torrenti con ripide
pendenze e soggetti a piene improvvise.
Nella trota iridea, l’esposizione ad ammoniaca provoca effetti ben evidenti sul metabolismo aerobico,
che è associabile ad una riduzione della massima velocità sostenibile di nuoto (Ucrit). Le misure di
metabolismo respiratorio e di frequenza di battiti della coda durante il nuoto hanno mostrato che
l’esposizione per 24 ore a concentrazioni subletali di ammoniaca danno luogo sia ad effetti di carico sia
ad effetti limitanti nella trota, con conseguente rilevante riduzione delle capacità aerobiche e delle
prestazioni natatorie.
I risultati ottenuti da questa prova indicano che:
-
-
la diminuzione della capacità natatoria del pesce è dovuta ad effetti multipli, e probabilmente
interattivi, causati dall’accumulo di ammoniaca in diversi tessuti del pesce stesso;
l’incremento del rateo di mantenimento metabolico (MMR) e il decremento del rateo metabolico
attivo (AMR) provocano una netta riduzione della capacità aerobica dei pesci. In particolare la
riduzione di AMR può indicare uno stato alterato del muscolo rosso, che limita il lavoro
massimo e quindi l’assorbimento di ossigeno;
lo ione ammonio induce una depolarizzazione della membrana delle fibre del muscolo bianco e
ne inibisce il funzionamento al raggiungimento delle massime velocità sostenibili;
i pesci esposti risultano in grado, durante il nuoto, di espellere attivamente ammoniaca contro un
gradiente di concentrazione, probabilmente allo scopo di migliorare le proprie capacità di nuoto.
Anche nella trota fario esposta all’ammoniaca si nota una riduzione lineare della Ucrit, ma in questo caso
l’effetto è più intenso. Per questa specie sono stati esaminati ulteriori parametri fisiologici biochimici, da
cui risulta che l’esposizione induce una parziale depolarizzazione del muscolo bianco, del cuore e del
cervello. A livello metabolico si evidenzia un accumulo di lattato e incrementi nel consumo di ossigeno
e del costo dell’attività natatoria.
E’ interessante notare che nella trota fario il valore di AMR risulta inalterato in seguito all’esposizione
ad ammoniaca, contrariamente alla trota iridea; ciò può essere tuttavia riconducibile alla minore velocità
raggiunta dalla fario in tali condizioni.
Infine, nelle trote fario si osservano variazioni nel comportamento locomotorio, in quanto quelle esposte
alla concentrazione maggiore di ammoniaca utilizzano il muscolo rosso anche per il nuoto ad alte
velocità, riducendo così il contributo del muscolo bianco.
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Sulla sola trota fario sono state effettuate anche prove di esposizione ad ammoniaca in concomitanza di
debole ipossia. I dati sperimentali ottenuti indicano anche in questo caso una riduzione lineare della
Ucrit, anche se l’effetto delle due condizioni non è additivo.
In caso di ipossia, le prestazioni di nuoto sono limitate dalla disponibilità di ossigeno e dalla
conseguente impossibilità di aumentare la capacità aerobica; l’ammoniaca invece, come già visto
precedentemente, induce sia una parziale depolarizzazione di muscolo bianco, cuore e cervello, sia
effetti distruttivi sul metabolismo.
I pesci esposti accumulano notevoli quantità di lattato e sono caratterizzati da un elevato rateo di
mantenimento metabolico (MMR) e da una ridotta capacità aerobica. Il rateo metabolico attivo (AMR,
ovvero il massimo consumo di ossigeno alla Ucrit) non viene ridotto, fatto che invece si verifica quando
si espone il pesce alla sola ipossia. Sembra che in queste condizioni i pesci rispondano allo stress indotto
modificando il comportamento nel nuoto, attraverso un maggiore utilizzo del muscolo rosso, e passando
da una ventilazione attiva ad una ram (passiva, a bocca aperta), che può ridurre la richiesta di energia.
Rispetto alla mancanza di effetti sinergici o additivi, risultati opposti sono stati ottenuti da altri Autori
(Magaud et al., 1997) in uno studio sulla valutazione della probabilità di soppravvivenza di trote iridee
esposte simultaneamente ad ammoniaca ed ipossia: la sperimentazione in questo caso ha evidenziato
l’instaurarsi di un effetto sinergico, in quanto la probabilità di sopravvivenza risultava inferiore a quella
predetta dalla somma di ciascun effetto considerato separatamente.
Le due specie di salmonidi considerate e messe a confronto in questo studio sembrano differire dunque
nelle modalità metaboliche e fisiologiche con le quali reagiscono agli specifici fattori di pressione.
La trota iridea sembra in grado di contrastare l’accumulo di ammoniaca attivando meccanismi di
escrezione contro gradiente e nel complesso riesce a raggiungere velocità critiche di nuoto superiori, pur
mostrando in queste condizioni un netto calo delle capacità aerobiche.
La trota fario al contrario sembra suscettibile ad un maggiore accumulo di ammoniaca, a cui reagisce,
durante l’imposizione del nuoto veloce, con l’attivazione della muscolatura rossa invece di quella
bianca, la cui fisiologia è stata alterata dall’ammonio tissutale. Inoltre, in condizioni deficitarie di
ossigeno, la fario modifica anche il comportamento locomotorio e le modalità di respirazione, soluzioni
che probabilmente le consentono di risparmiare energia e mantenere una buona attività natatoria.
Sarebbe necessario tuttavia valutare l’effetto che tale tipo di esposizione può avere sul lungo periodo: la
modificazione del comportamento natatorio (respirazione ram) potrebbe essere sostenibile solo per brevi
periodi. Se così non fosse non sarebbe osservato solo come comportamento di emergenza: il fatto che
venga messo in atto solo per situazioni estreme indica che è una soluzione a cui l’animale ricorre in
extremis.
L’effetto dell’ipossia associata all’ammoniaca può essere considerata, sulla base delle evidenze
sperimentali ottenute, una condizione qualitativa dell’acqua tollerabile solo in occasione di eventi
temporanei e brevi, come le operazioni di manutenzione dei bacini. Gli effetti sulle popolazioni che
devono vivere o colonizzare acque caratterizzate da periodi prolungati di elevata ammoniaca e con
frequenti deficit di ossigeno necessitano di ulteriori approfondimenti; tuttavia, da quanto rilevato nella
sperimentazione, si può ipotizzare che i livelli di alterazioni del metabolismo e della fisiologia dei pesci
non possano essere sostenuti a lungo senza ripercussioni, quali ad esempio una diminuzione del tasso di
sopravvivenza, con conseguenti effetti sulla struttura e numerosità della comunità ittica.
Per quanto riguarda il confronto tra le due specie esaminate, il diverso comportamento evidenziato in
risposta all’esposizione all’ammoniaca indica sostanzialmente una maggiore vulnerabilità della trota
fario rispetto alla iridea, che origina da differenze interspecifiche nella permeabilità e nel trasporto di
tale molecola attraverso i tessuti branchiali.
In quest’ottica, il contenimento del livello di ammoniaca e del deficit di ossigeno delle acque scaricate a
valle degli sbarramenti deve essere posto in rilievo tra gli obiettivi gestionali, ancor più per quelle dighe
ubicate in settori fluviali a vocazione salmonicola interessati da interventi di rinaturalizzazione e di
reintroduzione della fauna autoctona.
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